UA120335C2 - METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES - Google Patents
METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES Download PDFInfo
- Publication number
- UA120335C2 UA120335C2 UAA201812992A UAA201812992A UA120335C2 UA 120335 C2 UA120335 C2 UA 120335C2 UA A201812992 A UAA201812992 A UA A201812992A UA A201812992 A UAA201812992 A UA A201812992A UA 120335 C2 UA120335 C2 UA 120335C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- mesenchymal
- cells
- stromal cells
- medium
- extra
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 title description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 15
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 11
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 16
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002161 passivation Methods 0.000 claims description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 claims description 2
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 claims description 2
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 abstract description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 abstract 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 5
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 5
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 5
- 208000034423 Delivery Diseases 0.000 description 4
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 1
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101100310622 Mus musculus Soga1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 238000001266 bandaging Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical group 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Винахід належить до способу отримання клітинної культури мезенхімних стовбурних клітин для лікування захворювань нервової системи, шляхом виділення з амніотичної оболонки або пупкових судин з периваскулярного простору пуповини алогенних мезенхімно-стромальних клітин, ферментативну дисоціацію з колагеназою NB 6 GMP Grade, інкубацію у середовищі DMEM, без сироватки у присутності колагенази NB 6 GMP Grade, і культивування у культуральному середовищі CTSTM Stem Pro MSC SEM з додаванням 2 мМ L-глутаміну та 1% пеніцилін/стрептоміцину в атмосфері 5 % вуглекислого газу при температурі 37 ˚C. 7The invention relates to a method of obtaining cell culture of mesenchymal stem cells for the treatment of diseases of the nervous system, by isolation from the amniotic membrane or umbilical vessels from the perivascular umbilical space of allogeneic mesenchymal stromal cells, enzymatic dissociation with collagenase NB 6 GMba Grade, GMP Grade in the presence of collagenase NB 6 GMP Grade, and cultivation in culture medium CTSTM Stem Pro MSC SEM with the addition of 2 mm L-glutamine and 1% penicillin / streptomycin in an atmosphere of 5% carbon dioxide at a temperature of 37 ˚C. 7
Description
Винахід належить до біотехнології, а саме до отримання клітинної культури генетично не модифікованих мезенхімних стовбурних клітин, і може бути використаний у клітинній біотехнології для одержання мезенхімно-стромальних клітин та у медицині при лікуванні захворювань нервової системи, таких як енцефалопатії, хвороба Альцгеймера та інших, пов'язаних з неврологічними патологіями різного генезу.The invention belongs to biotechnology, namely to obtaining a cell culture of genetically non-modified mesenchymal stem cells, and can be used in cellular biotechnology to obtain mesenchymal-stromal cells and in medicine in the treatment of diseases of the nervous system, such as encephalopathies, Alzheimer's disease and others, associated with neurological pathologies of various genesis.
У зв'язку з високим ступенем складності організації нервової системи, невисоким ступенем Її захищеності та складними наслідками порушень нервової системи, лікуванню неврологічним захворюванням приділяється особлива увага. Проте, необхідність в ефективних засобах і методах лікування не зменшується.In connection with the high degree of complexity of the organization of the nervous system, the low degree of its protection and the complex consequences of disorders of the nervous system, special attention is paid to the treatment of neurological diseases. However, the need for effective means and methods of treatment does not diminish.
В дійсний час набуває популярності застосування мезенхімних стовбурних клітин при лікуванні ішемічних станів головного мозку. Механізм дії клітинних трансплантатів стовбурних клітин можна пояснити нейропротективним ефектом самих клітин або замкнутих у екзосомах різних тканинних факторів росту як засобу захисту власних клітин реципієнта і стимуляції нейропластичності Мап Мекпомеп С., КамеїЇаагє А., Неїпеп С. Мезепспута! 5їет сеїЇ5 а5 а іїгеаїтепі ог пеопаїа! ізспетіа. Редіайніс Незеагсп. 2012. 71:Р. 474-481 ДПІ). Відомо, що клітини пуповинної крові людини можуть зменшити загибель клітин у пошкодженому мозку новонародженого шляхом послаблення реактивного гліозу (ММазівіемуєКкі В., Уепзеп А., Коїн-Currently, the use of mesenchymal stem cells in the treatment of ischemic conditions of the brain is gaining popularity. The mechanism of action of cell transplants of stem cells can be explained by the neuroprotective effect of the cells themselves or various tissue growth factors enclosed in exosomes as a means of protecting the recipient's own cells and stimulating neuroplasticity. 5iet seiYi5 a5 a iigeaitepi og peopaia! izspetia Rediainis Nezeagsp. 2012. 71:R. 474-481 DPI). It is known that human umbilical cord blood cells can reduce cell death in the damaged brain of a newborn by weakening reactive gliosis (MMaziviemuekki V., Uepzep A., Koin-
Нагег А., єї аІ. Мешгодіїа! асіїмайоп апа СхХ4З ехргеззіоп аге гедисей ироп ігапзріапіайоп ої питап итріїсаї! сога ріоса сеї апег регіпагза! пурохіс-ізспетіс іпішгу. Вгаіп Резеагсі. 2012. 1487: Р. 39- 53 І2Ї)Ї. Повідомлялось також, що мезенхімно-стромальні клітини сприяють перебудові мереж кортикальних нейронів |(Мап Мейпомеп С., мап де І! осі) У., Камаїааг»5 А., еї аі. Мезепспутаї «ет сеїїв гевіоге сопісаї гем/гіпуд апйег пеопаїа! ізспетіа іп тісе. Аппа!ї5 ої МешигоЇоду. 2012. 71: Р. 785- 796 ІЗІЇ.Nageg A., her AI. Mashgodia! asiimayop apa ShX4Z ehrgezziop age gedisei irop igapzriapiaiop oi pitap itriisai! soga riosa sei apeg regipagza! purohis-izspetis ipishgu. Vgaip Rezeagsi. 2012. 1487: R. 39-53 I2Й)Й. It was also reported that mesenchymal-stromal cells contribute to the reconstruction of networks of cortical neurons | (Map Meipomep S., map de I! axis) U., Kamaiaag»5 A., ei ai. Mezepsputai «et seiiv gevioge sopisaii hem/hipud apyeg peopaia! izspetia ip tese. Appa!i5 oi MeshigoYodu. 2012. 71: R. 785-796 IZII.
Більшість дослідників надають перевагу використанню аутологічних стовбурних клітин (кістковий мозок, клітини периферичної крові, мезенхімні стовбурні клітини жирової тканини).Most researchers prefer the use of autologous stem cells (bone marrow, peripheral blood cells, mesenchymal stem cells of adipose tissue).
Переваги власних мезенхімних клітин не визивають сумнів, проте застосування їх обмежено.The advantages of own mesenchymal cells are not in doubt, but their use is limited.
Зокрема, тривалість вирощування клітинних культур - більше 2-х місяців, а клітини похилих людей мають низьку здатність до проліферації.In particular, the duration of growing cell cultures is more than 2 months, and the cells of elderly people have a low ability to proliferate.
Донорські клітини мають ряд переваг мезенхімно-стромальні клітини пуповиниDonor cells have a number of advantages over mesenchymal-stromal cells of the umbilical cord
Зо новонароджених добре вивчені і швидко проліферують, здатні до диференціювання, функціонально активні і продукують різні фактори росту. Також ці клітини у достатній кількості можуть бути виготовлені за вимогою.From newborns, they are well studied and rapidly proliferate, are capable of differentiation, are functionally active and produce various growth factors. Also, these cells in sufficient quantity can be produced on demand.
Найбільш близьким є спосіб отримання клітинної культури для лікування захворювань нервової системи, що включає виділення з тканин позазародкових органів новонароджених після нормальних пологів алогенних мезенхімно-стромальних клітин та їх культивування, відомий з патенту КО, 2347579 С1, опублікований 27.02.2009 |4)Ї. У відомому способі як позазародкову тканину використовують пуповину, звільнену від залишків крові і промиту у розчині Версена з додаванням антибіотиків: 100 од./мл пеніциліну, 100 од./мл стрептоміцину, 100 од./мл амфотерицину, - протягом години при кімнатній температурі на шейкері. Далі, вени спочатку канюлюють з обох сторін і промивають розчином Хенкса, а потім 0,1 У5-ним розчином колагенази | типу, приготовленим на середовищі ОМЕМ, і інкубують при температурі 37 "С протягом 30 хв. Далі здійснюють механічний вплив на тканини пуповини, збирають і промивають розчином Хенкса клітини, що відділилися. Отриману після механічного впливу і промивання суспензію клітин центрифугують при 1000 об/хв протягом 5 хв. При культиваванні отриманий осад клітин ресуспензують у ростовому середовищі ОМЕМ, що містить 10 У5-ну фетальну сироватку великої рогатої худоби, 100 од./мл пеніциліну, 100 од./мл стрептоміцину, 2 мМ глютаміну, 1 мМ пірувату натрію. Ресуспензований осад клітин у ростовому середовищі ОМЕМ переноситься до культуральних чашок, де відбувається культивування до формування моношару при зміні ростового середовища ЮОМЕМ двічі на тиждень. При досягненні моношару проводять пасирування шляхом пересівання клітин з використанням ростового середовищаThe closest is the method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, which includes the selection of allogeneic mesenchymal-stromal cells from the tissues of the extra-embryonic organs of newborns after a normal delivery and their cultivation, known from the KO patent, 2347579 C1, published on 27.02.2009 |4)Y. In a known method, the umbilical cord, freed from blood residues and washed in Versen's solution with the addition of antibiotics, is used as extraembryonic tissue: 100 units/ml of penicillin, 100 units/ml of streptomycin, 100 units/ml of amphotericin - for an hour at room temperature at shakers Next, the veins are first cannulated on both sides and washed with Hanks' solution, and then with 0.1 U5 solution of collagenase | of the type prepared on OMEM medium, and incubated at a temperature of 37 "C for 30 min. Next, the umbilical cord tissues are subjected to mechanical impact, separated cells are collected and washed with Hanks' solution. The cell suspension obtained after mechanical impact and washing is centrifuged at 1000 rpm for 5 min. During cultivation, the resulting cell sediment is resuspended in the OMEM growth medium containing 10 U5 fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, 100 units/ml streptomycin, 2 mM glutamine, 1 mM sodium pyruvate. The resuspended cell sediment in the OMEM growth medium is transferred to culture plates, where cultivation takes place until a monolayer is formed by changing the UOMEM growth medium twice a week. When the monolayer is reached, passivation is carried out by reseeding the cells using the growth medium
ОМЕМ у співвідношенні 1:3. Отриману клітинну культуру використовують для лікування захворювань нервової системи. Причому, перед проведенням клітинної терапії моношар клітин переводять до суспензії шляхом обробки сумішшю розчинів Версена і 0,25 У6-ним розчином трипсину у співвідношенні 1: 1 протягом 20 хв при температурі 37 оС, яку потім тричі промивають фізіологічним розчином з рН 7,2, потім суспензію осаджують центрифугуванням при 1000 об/хв протягом 5 хв, осад клітин ресуспензують у стерильному фізіологічному розчині з отриманням алогенних мезенхімно-стромальних клітин у кількості (1-5)х107 клітин у 5 мл фізіологічного розчину.OMEM in a ratio of 1:3. The resulting cell culture is used to treat diseases of the nervous system. Moreover, before cell therapy, a monolayer of cells is transferred to a suspension by treatment with a mixture of Versen solutions and a 0.25 U6 solution of trypsin in a ratio of 1: 1 for 20 minutes at a temperature of 37 oC, which is then washed three times with a physiological solution with a pH of 7.2. then the suspension is precipitated by centrifugation at 1000 rpm for 5 min, the cell sediment is resuspended in sterile physiological solution to obtain allogeneic mesenchymal-stromal cells in the amount of (1-5)x107 cells in 5 ml of physiological solution.
Суттєвим недоліком відомого способу отримання клітинної культури для лікування бо захворювань нервової системи є використання при культивуванні ксеногенної сироватки, с саме: сироватки великої рогатої худоби. Використання такого компонента у ростовому середовищі при культивуванні не забезпечує повне відтворення характеристик культури тканин і може викликати сенсибілізацію у пацієнтів при використанні отриманих за відомим способом алогенних мезенхімно-стромальних клітин. Крім того, сенсибілізації сприяє також використання антибіотиків із групи бета-лактамів при експансії клітин.A significant drawback of the known method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system is the use of xenogenic serum during cultivation, namely: bovine serum. The use of such a component in the growth medium during cultivation does not ensure a complete reproduction of the characteristics of tissue culture and may cause sensitization in patients when using allogeneic mesenchymal stromal cells obtained by a known method. In addition, sensitization is also facilitated by the use of antibiotics from the beta-lactam group during cell expansion.
Задачею винаходу є удосконалення способу отримання клітинної культури для лікування захворювань нервової системи, в якому за рахунок використаних тканин, підібраних засобів і умов виділення та культивування клітинної культури, забезпечується повне відтворення характеристик культури тканин, що усуває ризики виникнення сенсибілізації при лікуванні пацієнтів з застосуванням отриманої клітинної культури.The objective of the invention is to improve the method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, in which, due to the used tissues, selected means and conditions for the selection and cultivation of the cell culture, a complete reproduction of the characteristics of the tissue culture is ensured, which eliminates the risks of sensitization in the treatment of patients with the use of the obtained cell culture cultures
Поставлена задача вирішується запропонованим способом отримання клітинної культури для лікування захворювань нервової системи, що включає виділення з тканин позазародкових органів новонароджених після нормальних пологів алогенних мезенхімно-стромальних клітин та їх культивування, в якому як позазародкову тканину використовують амніотичну оболонку або пупкові судини з периваскулярного простору пуповини, перев'язані на кінцях. Згідно винаходу, позазародкову тканину піддають ферментативній дисоціації з колагеназою МВ 6 ЗМР сгаде, інкубацію подрібненої позазародкової тканини проводять у середовищі ОМЕМ, І--глутамін 2 мМ (ПМ), без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази МВ 6 СМР сСгаде при температурі 37 С при постійному похитуванні протягом 3-4 годин. Виділені клітини промивають двічі ОМЕМ середовищем і висівають у культуральному середовищі СТ5"М 5(ет Рго М5С 5ЕМ з додаванням 2 мМ І-глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину на флакони з площею дна 175 сме, покриті субстратом СТ5"М СЕЇ І вїап "М Бибрзігаїє. Культивування проводять в атмосфері 5 95 вуглекислого газу при температурі 37 "С, при цьому, незакріплені клітини змивають наступної доби шляхом заміни середовища і культивують до формування конфлюентного моношару мезенхімно-стромальних клітин шляхом заміни культурального середовища кожні дві доби.The task is solved by the proposed method of obtaining a cell culture for the treatment of diseases of the nervous system, which includes the selection of allogeneic mesenchymal stromal cells from the tissues of the extra-embryonic organs of newborns after normal delivery and their cultivation, in which the amniotic membrane or umbilical vessels from the perivascular space of the umbilical cord are used as extra-embryonic tissue. tied at the ends. According to the invention, the extraembryonic tissue is subjected to enzymatic dissociation with collagenase MV 6 CMP cSgade, the incubation of the chopped extraembryonic tissue is carried out in OMEM medium, I-glutamine 2 mM (PM), without serum in the presence of 1 mg/ml collagenase MV 6 CMP cSgade at a temperature of 37 With constant shaking for 3-4 hours. The isolated cells are washed twice with OMEM medium and sown in the culture medium ST5"M 5(et Pgo M5C 5EM with the addition of 2 mM I-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin in vials with a bottom area of 175 cm, covered with the substrate ST5"M SEI I viap " M. Bybrzigaie. Cultivation is carried out in an atmosphere of 5 95 carbon dioxide at a temperature of 37 "C, at the same time, unattached cells are washed away the next day by changing the medium and cultivated until the formation of a confluent monolayer of mesenchymal-stromal cells by changing the culture medium every two days.
Як варіант виконання винаходу, можуть бути використані пупкові судини з периваскулярного простору пуповини новонароджених, перев'язані на кінцях, після нормальних пологів. В цьому варіанті додатково здійснюють опасирування, що включає проведення серії пасажів культивованих мезенхімно-стромальних клітин з використанням ростового середовища ТКУрі ЕAs a variant of the invention, umbilical vessels from the perivascular space of the umbilical cord of newborns, tied at the ends, after a normal delivery, can be used. In this variant, bandaging is additionally carried out, which includes carrying out a series of passages of cultured mesenchymal-stromal cells using the growth medium TKUri E
Зо зеїІесі при об'ємному співвідношенні мезенхімно-стромальні клітини до ростового середовища як 1: З відповідно при щільності мезенхімно-стромальних клітини (1х107У/сме, причому, пасирування проводять на нових флаконах з площею дна 175 см?, покритих субстратом СТ5ТМFrom zeiIesi at the volume ratio of mesenchymal-stromal cells to the growth medium as 1: C, respectively, at the density of mesenchymal-stromal cells (1x107U/sme, moreover, pasteurization is carried out on new vials with a bottom area of 175 cm?, covered with the ST5TM substrate
СЕ іа М Бубзігаге до отримання мезенхімно-стромальних клітини у кількості (1,5-2)х107,SE ia M Bubzigage to obtain mesenchymal-stromal cells in the amount of (1.5-2)x107,
Як варіант виконання винаходу, може бути використана амніотична оболонка новонароджених після нормальних пологів.As an embodiment of the invention, the amniotic membrane of newborns after normal childbirth can be used.
Експериментально були встановлені засоби і умови виділення та культивування мезенхімних стовбурних клітин для патогенетичного лікування захворювань нервової системи.Means and conditions for selection and cultivation of mesenchymal stem cells for pathogenetic treatment of diseases of the nervous system were established experimentally.
Спосіб здійснюється наступним чином.The method is carried out as follows.
Відсікають 10-12 см пуповини з периваскулярного простору пуповини, за допомогою пінцета і скальпеля виділяють судини, перев'язують їх на кінцях і проводять ферментативну дисоціацію з колагеназою МВ 6 СМР Сгаде (фірма Могтагк Віоспетіса!5). Інкубація подрібненої пуповини у середовищі ОМЕМ, І-глутамін 2 мМ (сірсо) без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази МВ 6 СМР Сгаде проводиться протягом 3-4 годин при температурі 37 "С і постійному похитуванні.Cut off 10-12 cm of the umbilical cord from the perivascular space of the umbilical cord, use tweezers and a scalpel to isolate the vessels, tie them at the ends and carry out enzymatic dissociation with collagenase MV 6 CMR Sgade (Mogtagk Viospetisa!5 company). Incubation of the chopped umbilical cord in the medium of OMEM, I-glutamine 2 mM (sirso) without serum in the presence of 1 mg/ml collagenase MV 6 CMP Sgade is carried out for 3-4 hours at a temperature of 37 "C and constant shaking.
Далі виділені клітини промиваються двічі ОМЕМ середовищем і висіваються до культурального середовища СТ5"М 5іет Рго М5С 5ЕМ (бірсо, США) з додаванням 2 мМ І -глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину (сібсо, США) на флакони з площею дна 175 см, покриті субстратомNext, the isolated cells are washed twice with OMEM medium and seeded into the culture medium ST5"M 5iet Rgo M5S 5EM (Birso, USA) with the addition of 2 mM I-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin (Sibso, USA) in vials with a bottom area of 175 cm, covered with a substrate
СТ"М СЕ іа М Зиубзігаге (сірсо, США). Культивування проводиться при температурі 37 "С в атмосфері 5-95-ого вуглекислого газу. Наступної доби незакріплені клітини змивають шляхом заміни середовища. Подальшу заміну культурального середовища здійснюють кожні дві доби до моменту формування конфлюентного моношару мезенхімно-стромальних клітин.ST"M SE and M. Ziubzigage (Sirso, USA). Cultivation is carried out at a temperature of 37 "C in an atmosphere of 5-95% carbon dioxide. The next day, unattached cells are washed away by changing the medium. Further replacement of the culture medium is carried out every two days until the formation of a confluent monolayer of mesenchymal-stromal cells.
Після досягнення конфлюентного моношару мезенхімно-стромальні клітини, отримані з судин периваскулярного простору пуповини, пасирують з використанням ростового середовищаAfter reaching a confluent monolayer, mesenchymal-stromal cells obtained from the vessels of the perivascular space of the umbilical cord are passaged using a growth medium
ТКУрРІЕ Зеїесі (сірсо, США) на нових флаконах у об'ємному співвідношенні мезенхімно- стромальні клітини до ростового середовища як 1: З відповідно, щільність (1х107/см-. Наступні пасажі проводять у такому самому режимі. Такий спосіб отримання клітинної культури дозволяє до кінця четвертого-п'ятого тижня отримати популяцію мезенхімних стовбурних клітин у кількості (1,5-2)х107 клітин, необхідній для трансплантації.TCURRIE Zeiesi (Sirso, USA) on new vials in the volume ratio of mesenchymal-stromal cells to the growth medium as 1: C, respectively, density (1x107/cm-. The following passages are carried out in the same mode. This method of obtaining a cell culture allows for by the end of the fourth-fifth week, to obtain a population of mesenchymal stem cells in the amount of (1.5-2) x 107 cells required for transplantation.
Отримані мезенхімно-стромальні клітини складаються з фібробластоподібних клітин веретеноподібної форми, що адгезуються до пластикової поверхні культуральних флаконів, з бо незмінним каріотипом від пасажу до пасажу, здатні диференціюватися у хондрацитарному,The resulting mesenchymal-stromal cells consist of spindle-shaped fibroblast-like cells that adhere to the plastic surface of the culture vials, with an unchanged karyotype from passage to passage, capable of differentiating into chondrocyte,
остеогенному адипоцитогенному напрямках. Маркерний склад характеризується наявністю ср105, 2073 і СО90 у 98 95 клітин культури. За методом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) встановлено відсутність у клітинній лінії інфекційних агентів.osteogenic adipocytogenic directions. The marker composition is characterized by the presence of srp105, 2073 and СО90 in 98 95 culture cells. The PCR (polymerase chain reaction) method established the absence of infectious agents in the cell line.
Мезенхімно-стромальні клітини, отримані з периваскулярного простору пуповини, використовувалися для інтраназального введення при лікуванні захворювань нервової системи, зокрема, енцефалопатій.Mesenchymal-stromal cells obtained from the perivascular space of the umbilical cord were used for intranasal administration in the treatment of diseases of the nervous system, in particular, encephalopathies.
При лікуванні енцефалопатій використовували препарат, що містить мезенхімно-стромальні клітини, що виділені з пупкових судин з периваскулярного простору пуповини і культивовані у середовищі СТ5'М Зіет Рго М5С 5ЕМ з додаванням 2 мМ І-глутаміну та 195 пеніцилін/стрептоміцину, та пасировані у ростовому середовищі ТКурі Е 5еїесї. При цьому, введення препарату пацієнту здійснюють інтраназально підслизово струмино у кількості (1- 4)х107 мезенхімно-стромальних клітин у 1 мл у середовищі введення. Як середовище введення препарат може містити фізіологічний розчин з 2,495 мас. альбуміну людини та З 95 мас. реополіглюкіну.In the treatment of encephalopathies, a preparation was used containing mesenchymal-stromal cells isolated from umbilical vessels from the perivascular space of the umbilical cord and cultured in medium ST5'M Ziet Rgo M5C 5EM with the addition of 2 mM I-glutamine and 195 penicillin/streptomycin, and passaged in growth environment TKuri E 5eiesi. At the same time, the drug is administered to the patient intranasally by submucosal jet in the amount of (1-4)x107 mesenchymal-stromal cells in 1 ml of the injection medium. As an administration medium, the drug may contain a saline solution with 2.495 wt. human albumin and with 95 wt. rheopolyglukin.
Застосування клітинного препарату з мезенхімно-стромальних клітин, виділених з пупкових судин з периваскулярного простору пуповини описаним вище способом, при інтразональному його введені дозволило суттєво підвищити ефективність лікування енцефалопатій, зокрема, дисциркуляторної енцефалопатії, і забезпечило відсутність ризиків виникнення сенсибілізації.The use of a cell preparation from mesenchymal-stromal cells isolated from umbilical vessels from the perivascular space of the umbilical cord in the above-described manner, when administered intrazonally, allowed to significantly increase the effectiveness of the treatment of encephalopathies, in particular, dyscirculatory encephalopathy, and ensured the absence of risks of sensitization.
Аналогічним чином проводиться виділення алогенних мезенхімно-стромальних клітин з амніотичної оболонки новонароджених, отриманої після нормальних пологів. А саме, амніотичну оболонку піддають ферментативній дисоціації з колагеназою МВ 6 СМР Огавде; проводять інкубацію подрібненої амніотичної оболонки у середовищі ОМЕМ, І-глутамін 2 мМ (сібсо) без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази МВ 6 СМР сСгаде протягом 3-4 годин при температурі 37 "С і постійному похитуванні. Далі виділені клітини промиваються двічі ОМЕМ середовищем і висіваються до культурального середовища СТ5'"М Біет Рго М5С 5ЕМ з додаванням 2 мМ І-глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину (ібсо, США) на флакони з площею дна 175 см?, покриті субстратом СТ5"М СЕ І вїай'М Зиурзігаїє (сірсо, США).In a similar way, allogeneic mesenchymal stromal cells are isolated from the amniotic membrane of newborns, obtained after a normal delivery. Namely, the amniotic membrane is subjected to enzymatic dissociation with collagenase MV 6 SMP Ogavde; the chopped amniotic membrane is incubated in OMEM medium, I-glutamine 2 mM (sibso) without serum in the presence of 1 mg/ml collagenase MV 6 CMP cSgade for 3-4 hours at a temperature of 37 "C and constant shaking. Then the selected cells are washed twice with OMEM medium and are sown into the culture medium ST5'"M Biet Rgo M5S 5EM with the addition of 2 mM I-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin (ibso, USA) in flasks with a bottom area of 175 cm?, covered with the substrate ST5"M SE I viai' M. Ziurzigaie (Sirso, USA).
Культивування проводиться при температурі 37 "С в атмосфері 5-9у5-ного вуглекислого газу.Cultivation is carried out at a temperature of 37 "C in an atmosphere of 5-9u5 carbon dioxide.
Наступної доби незакріплені клітини змивають шляхом заміни середовища. Подальшу замінуThe next day, unattached cells are washed away by changing the medium. Further replacement
Зо культурального середовища здійснюють кожні дві доби до моменту формування конфлюентного моношару мезенхімно-стромальних клітин.From the culture medium, it is carried out every two days until the moment of formation of a confluent monolayer of mesenchymal-stromal cells.
Отримані мезенхімно-стромальні клітини складаються з фібробластоподібних клітин веретеноподібної форми, що адгезуються до пластикової поверхні культуральних флаконів, з незмінним каріотипом, здатні диференціюватися у хондрацитарному, остеогенному адипоцитогенному напрямках. Маркерний склад характеризується наявністю СО105, СО7З іThe resulting mesenchymal-stromal cells consist of spindle-shaped fibroblast-like cells that adhere to the plastic surface of culture vials, with an unchanged karyotype, capable of differentiating in chondrocyte, osteogenic, and adipocytogenic directions. The marker composition is characterized by the presence of СО105, СО7З and
СО у 98 95 клітин культури. За методом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) встановлено відсутність у клітинній лінії інфекційних агентів.CO in 98 95 culture cells. The PCR (polymerase chain reaction) method established the absence of infectious agents in the cell line.
Мезенхімно-стромальні клітини, отримані з амніотичної оболонки, використовувалися для ендолюмбального введення при лікуванні захворювань нервової системи, зокрема хворобиMesenchymal stromal cells obtained from the amniotic membrane have been used for endolumbar administration in the treatment of diseases of the nervous system, in particular
Альцгеймера. Використовували мезенхімно-стромальні клітини, отримані культивуванням виділених мезенхімно-стромальних клітин з амніотичної оболонки і культивовані у середовищіAlzheimer's Mesenchymal stromal cells were used, obtained by culturing isolated mesenchymal stromal cells from the amniotic membrane and cultured in the medium
СТ5"М ет Рго М5С 5ЕМ з додаванням 2 мМ І-глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину.ST5"M et Rgo M5S 5EM with the addition of 2 mM I-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin.
Введення препарату пацієнту здійснюють ендолюмбально у кількості (5-6)х107 мезенхімно- стромальних клітин, ресуспендованих в лікворі пацієнта Ендолюмбальне введення здійснювали між остистими відростками ПІ-ІМ поперекових хребців за допомогою встановленої пункційної голки. Використання зазначеного клітинного препарату при лікуванні хворобиThe drug is administered to the patient endolumbally in the amount of (5-6)x107 mesenchymal stromal cells resuspended in the patient's cerebrospinal fluid. Endolumbar injection was performed between the spinous processes of the 1st and 2nd lumbar vertebrae using an established puncture needle. The use of the specified cellular drug in the treatment of the disease
Альцгеймера сприяло суттєвому підвищенню ефективності лікування захворювання |і забезпечило відсутність ризиків виникнення сенсибілізації.Alzheimer's contributed to a significant increase in the effectiveness of the treatment of the disease and ensured the absence of risks of sensitization.
Приклад 1Example 1
Амніотичну оболонку піддали ферментативній дисоціації з колагеназою МВ 6 СМР сгааєе.The amniotic membrane was subjected to enzymatic dissociation with collagenase MV 6 CMP sgaaee.
Подрібнену амніотичну оболонку інкубували у середовищі ЮОМЕМ, І-глутамін 2 мМ без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази МВ 6 ЗМР Сгаде протягом 4 годин при температурі 37 Сб і постійному похитуванні. Виділені клітини після дворазової промивки ОМЕМ середовищем висіяли до культурального середовища СТ5"М біет Рго М5С 5ЕМ, до якого додали 2 мМ ІГ-глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину, на флаконах з площею дна 175 см, покритих субстратом СТ5"М СЕ віїан"М Бибрзігаїе. Культивування проводили при температурі 37 "С в атмосфері 5-95-ного вуглекислого газу зі змиванням незакріплених клітин зазначеним середовищем за добу після початку культивування і заміною культурального середовища через кожні дві наступні доби. Отримали конфлюентний моношар мезенхімних стовбурних клітин у 60 кількості 5 х107 клітин.The chopped amniotic membrane was incubated in the medium of UOMEM, I-glutamine 2 mM without serum in the presence of 1 mg/ml of collagenase MV 6 ZMP Sgade for 4 hours at a temperature of 37 °C and constant shaking. The isolated cells, after being washed twice with OMEM medium, were seeded into the culture medium ST5"M biet Rgo M5S 5EM, to which 2 mM IG-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin were added, on vials with a bottom area of 175 cm, covered with the substrate ST5"M SE viyan" M. Bybrzigaie. Cultivation was carried out at a temperature of 37 "C in an atmosphere of 5-95% carbon dioxide with washing of unattached cells with the indicated medium one day after the start of cultivation and replacement of the culture medium every two subsequent days. A confluent monolayer of mesenchymal stem cells in the amount of 5 x 107 cells was obtained.
Отримані мезенхімно-стромальні клітини мають веретеноподібну форму, здатні диференціюватися у хондрацитарному, остеогенному адипоцитогенному напрямках. Інфекційні агенти відсутні.The obtained mesenchymal-stromal cells have a spindle-like shape, capable of differentiating in chondrocyte, osteogenic and adipocytogenic directions. There are no infectious agents.
Приклад 2Example 2
З фрагменту у вигляді 10-сантиметрового відрізку периваскулярного простору пуповини виділили судини, перев'язали їх на кінцях і провели ферментативну дисоціацію з колагеназоюFrom a fragment in the form of a 10-centimeter segment of the perivascular space of the umbilical cord, vessels were isolated, they were tied at the ends and enzymatic dissociation with collagenase was carried out
МВ 6 СМР сСгаде. Подрібнену пуповину інкубували у середовищі ОМЕМ, І -глутамін 2 мМ без сироватки у присутності 1 мг/мл колагенази МВ 6 ЗМР Сгаде протягом З годин при температурі 37 Сб і постійному похитуванні. Виділені клітини після дворазової промивки ОМЕМ середовищем висіяли до культурального середовища СТ5"М біт Рго М5С 5ЕМ, до якого додали 2 мМ ІГ-глутаміну та 1 95 пеніцилін/стрептоміцину, на флаконах з площею дна 175 см, покритих субстратом СТ5"М СЕ вїан"М Бибрзігаїе. Культивування проводили при температурі 37 "С в атмосфері 5-95-ного вуглекислого газу зі змиванням незакріплених клітин зазначеним середовищем за добу після початку культивування і заміною культурального середовища через кожні дві наступні доби. Отримали конфлюентний моношар мезенхімних стовбурних клітин и провели серію пасирувань на нових флаконах з ростовим середовищем ТКурі Е зеїесі при щільності (1х107У/сме. На 28-у добу отримати популяцію мезенхімних стовбурних клітин у кількості 1,5 х107 клітин.MV 6 SMR cSgade. Chopped umbilical cord was incubated in OMEM medium, I-glutamine 2 mM without serum in the presence of 1 mg/ml collagenase MV 6 ZMP Sgade for 3 hours at a temperature of 37 °C and constant shaking. The isolated cells, after being washed twice with OMEM medium, were seeded into the culture medium ST5"M bit Pgo M5S 5EM, to which 2 mM IG-glutamine and 1 95 penicillin/streptomycin were added, on vials with a bottom area of 175 cm, covered with the substrate ST5"M SE vian" M. Bybrzigaie. Cultivation was carried out at a temperature of 37 "C in an atmosphere of 5-95% carbon dioxide with washing of unattached cells with the indicated medium one day after the start of cultivation and replacement of the culture medium every two subsequent days. A confluent monolayer of mesenchymal stem cells was obtained and a series of passivations was carried out on new vials with TKuri E zeyesi growth medium at a density of 1x107U/sme. On the 28th day, a population of mesenchymal stem cells in the amount of 1.5x107 cells was obtained.
Отримані мезенхімно-стромальні клітини мають веретеноподібну форму, здатні диференціюватися у хондрацитарному, остеогенному адипоцитогенному напрямках. Інфекційні агенти відсутні.The obtained mesenchymal-stromal cells have a spindle-like shape, capable of differentiating in chondrocyte, osteogenic and adipocytogenic directions. There are no infectious agents.
Таким чином, запропонований спосіб дозволяє отримати клітинні культури, що мають характеристики вихідної культури клітин, і є ефективними і безпечними при лікуванні захворювань нервової системи.Thus, the proposed method makes it possible to obtain cell cultures that have the characteristics of the original cell culture, and are effective and safe in the treatment of diseases of the nervous system.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA201812992A UA120335C2 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAA201812992A UA120335C2 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA120335C2 true UA120335C2 (en) | 2019-11-11 |
Family
ID=71112706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201812992A UA120335C2 (en) | 2018-12-27 | 2018-12-27 | METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA120335C2 (en) |
-
2018
- 2018-12-27 UA UAA201812992A patent/UA120335C2/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8697048B2 (en) | Peptide amphiphile suspension to prevent or reduce tumor formation from administered embryonic stem cells | |
| ES2444548T3 (en) | Renovation and repopulation of cadaveric tissues and organs decellularized by stem cells | |
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| US20130330306A1 (en) | Composition containing human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells | |
| KR20140006014A (en) | Method for producing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation, composition containing regenerative organ primordium provided with guide for transplantation produced thereby, and method for transplanting regenerative organ primordium provided with guide for transplantation | |
| CN108865986B (en) | Mesenchymal stem cell preparation for repairing articular cartilage damage/defect and preparation method and application thereof | |
| JP6993026B2 (en) | Regenerative therapeutic composition | |
| JP6958846B1 (en) | Method for producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells and method for producing cell preparation for joint treatment | |
| KR102104120B1 (en) | 3D bioprinting construct using human nasal inferior turbinate derived mesenchymal stem cell and uses thereof | |
| CN106497872B (en) | Skeletal muscle stem Cells serum free medium and its preparation method and application | |
| Mouli et al. | stem cells in dentistry-A review | |
| KR20120127468A (en) | Cell homogenate from stem cells derived from growing deer antlers, a method of obtaining it and its use | |
| UA120335C2 (en) | METHOD OF OBTAINING CELL CULTURE FOR TREATMENT OF NERVOUS SYSTEM DISEASES | |
| BRPI0708039A2 (en) | feeder cells derived from tissue stem cells | |
| Mathur et al. | Stem cell research: applicability in dentistry. | |
| JP6958847B1 (en) | Method for producing synovial membrane-derived mesenchymal stem cells and method for producing cell preparation for joint treatment | |
| KR20180075808A (en) | Method for the differentiation of mesenchymal stem cells into cardiomyocytes | |
| Hussein et al. | Dental stem cells (concepts and applications) | |
| RU2455357C1 (en) | Cell product for auto- and allografting prepared of human umbilical cord, and method for preparing thereof | |
| KR100876536B1 (en) | Cells originated from antler of deer and culture method for the same | |
| Deschner et al. | In vitro culture of Ehrlich ascites tumor cells | |
| RU2455353C1 (en) | Cell product for auto- and allografting prepared of human umbilical cord, and method for preparing thereof | |
| CN115418341B (en) | Method for transdifferentiation of fibroblast to hair papilla cell and application thereof | |
| Karimi et al. | Stem Cells in Dentistry | |
| RU2676142C2 (en) | Method for obtaining lining cells from the olfactory lining of mammals for the treatment of spinal cord injuries |