UA118785C2 - Композиції для лікування механічних пошкоджень нервів - Google Patents

Композиції для лікування механічних пошкоджень нервів Download PDF

Info

Publication number
UA118785C2
UA118785C2 UAA201609808A UAA201609808A UA118785C2 UA 118785 C2 UA118785 C2 UA 118785C2 UA A201609808 A UAA201609808 A UA A201609808A UA A201609808 A UAA201609808 A UA A201609808A UA 118785 C2 UA118785 C2 UA 118785C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
nerve
sho
prodrugs
enantiomers
drink
Prior art date
Application number
UAA201609808A
Other languages
English (en)
Inventor
Даніель Коен
Сєргєй Набірочкін
Ілья Чумаков
Original Assignee
Фарнекст
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/187,841 external-priority patent/US9393241B2/en
Application filed by Фарнекст filed Critical Фарнекст
Publication of UA118785C2 publication Critical patent/UA118785C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/485—Morphinan derivatives, e.g. morphine, codeine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Даний винахід стосується композицій і способів лікування механічних пошкоджень нервів.

Description

Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід стосується композицій і способів лікування хвороби Шарко-Марі-Тута й споріднених захворювань, зокрема, механічних пошкоджень нервів.
Попередній рівень техніки
Хвороба Шарко-Марі-Тута (СМТ) - рідкісна генетична периферійна поліневропатія. Ця хвороба зустрічається приблизно у 1 з 2500 індивідуумів і є найпоширенішим спадковим захворюванням периферійної нервової системи. Вона виникає, як правило, протягом перших десяти або двадцяти років життя, хоча може проявлятися й у дитинстві. Хвороба має хронічний перебіг з поступовою нервово-м'язовою дегенерацією. Захворювання спричиняє інвалідність і супроводжується неврологічним болем і сильною м'язовою атрофією. СМТ є однією з найбільш вивчених генетичних патологій приблизно з 30000 випадків у Франції. Хоча більшість хворих на
СМТ мають дуплікацію фрагмента хромосоми 17, яка містить ген мієліну РМР22 (форма
СМТ1А), у різних формах СМТ задіяні два десятки генів. Відповідно, хоча вона є моногенною за походженням, ця патологія проявляє клінічну гетерогенність через можливі гени-модулятори.
Мутантні гени у хворих СМТ групуються навколо тісно пов'язаних молекулярних шляхів, які задіяні у диференціюванні швановських клітин або нейронів або, що змінюють взаємодію цих клітин у периферійних нервах.
Відсортування загальнодоступних даних, які описують молекулярні механізми й патологічні прояви хвороби СМТ1ТА, дозволило нам визначити кілька пріоритетних функціональних клітинних модулів - регуляцію транскрипції гена РМР22, укладання/деградацію білка РМР22, проліферацію й апоптоз шванівських клітин, загибель нейронів, відкладання й ремоделювання позаклітинного матрикса, імунні реакції - як потенційно законних мішеней для терапевтичних заходів при СМТ. Сукупний вплив цих дерегульових функціональних модулів на виникнення й прогресування патологічних проявів хвороби Шарко-Марі-Тута виправдовує потенційну ефективність комбінованого лікування СМТ.
У міжнародній патентній заявці РСТ/ЕР2008/066457 описаний спосіб ідентифікації препаратів-кандидатів для лікування хвороби Шарко-Марі-Тута шляхом створення динамічної моделі цієї патології й впливу на функціональні клітинні шляхи, задіяні в регуляції хвороби СМТ.
У міжнародній патентній заявці РСТ/ЕР2008/066468 описані композиції для лікування
Зо хвороби Шарко-Марі-Тута, які містять щонайменше дві сполуки, обрані із групи декількох лікарських засобів-кандидатів.
Сутність винаходу
Метою даного винаходу є одержання нових терапевтичних комбінацій для лікування СМІ і споріднених захворювань, зокрема, травматичних невропатій, за допомогою певних комбінацій препаратів.
Зокрема, предметом даного винаходу є композиції, які містять баклофен, сорбітол і сполуку, обрану з поміж пілокарпіну, метимазолу, міфепристону, налтрексону, рапаміцину, флурбіпрофену й кетопрофену, їхніх солей або форм проліків, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам-ссавцям.
Кращим предметом даного винаходу є композиції, які містять баклофен, сорбітол і налтрексон, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам-ссавцям.
Наступним предметом винаходу є композиції, наведені вище, що додатково містять один або декілька фармацевтично прийнятних наповнювачів або носіїв (тобто фармацевтичні композиції).
Іншим предметом даного винаходу є композиції, наведені вище, для застосування при лікуванні механічних пошкоджень нервів або травматичних невропатій.
Наступним предметом винаходу є застосування комбінацій сполук, наведених вище, для виготовлення медикаментів для лікування механічних пошкоджень нервів або травматичних невропатій.
Наступним предметом винаходу є спосіб лікування травматичної невропатії або механічного пошкодження нервів, який передбачає введення суб'єктам, які цього потребують, ефективної кількості композиції, яку визначено вище.
Наступним предметом винаходу є спосіб приготування фармацевтичних композицій, який передбачає змішування вищенаведених сполук у відповідному наповнювачі або носії.
Більш конкретним предметом винаходу є спосіб посилення або поліпшення регенерації нервів у пацієнтів, які страждають від травматичної невропатії або механічного пошкодження нервів, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб посилення регенерації нервів у суб'єктів із травматичною невропатією, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує, ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Іншим предметом даного винаходу є композиції, наведені вище, для застосування їх для лікування травматичної невропатії.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб посилення або поліпшення регенерації нервів у суб'єктів, які цього потребують, який передбачає введення даному суб'єктові ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб посилення або поліпшення мієлінізації нервів у суб'єктів, які цього потребують, який передбачає введення даному суб'єктові ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб відновлення морфології, росту або електрофізіологічної функції аксонів у суб'єктів, які цього потребують, який передбачає введення даному суб'єктові ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Винахід особливий придатний для лікування суб'єктів з нейроапраксією, аксонотмезисом або нейротмезисом, а також суб'єктів із черепно-мозковою травмою, травмою спинного мозку або механічним пошкодженням периферійних нервів.
Будь-які з поміж різних способів застосування або способів лікування, наведених тут, можуть включати необов'язкову стадію діагностики пацієнта як такого, що одержав механічне пошкодження.
У зв'язку із цим наступним предметом винаходу є спосіб лікування механічного пошкодження нервів, який передбачає (1) установлення того, чи зазнав суб'єкт механічного пошкодження нерва і (2) лікування суб'єкта з механічним пошкодженням нерва за допомогою ефективної кількості комбінації сполук, як описано вище, причому лікування приводить до регенерації нерва. Визначення того, чи зазнав суб'єкт механічного пошкодження нерва, може проводитися за допомогою різних тестів, власне відомих в даній галузі.
Винахід може застосовуватися до будь-яких суб'єктів-ссавців, зокрема, до людей.
Короткий опис фігур
Фіг. 1. Синергійний ефект комбінації лікарських засобів, доза 1: вплив А) суміші Міх7 (доза 1,
Зо 10-й день), В) О-сорбіту (5ЕВ, 500 мкМ, 10-й день), С) (Е/5)-баклофену (ВСІ, 5 мкМ, 10-й день) і
О) налтрексону (МТХ, 5 мкМ, 10-й день) на експресію МВР. " р «0,05, значима відмінність від контролю (- аскорбінова кислота) (однобічний метод АМОМА з наступним критерієм Фішера розі-пос); пе: немає статистичних відмінностей.
Фіг. 2. Синергійний ефект комбінації лікарських засобів, доза 6: А) суміш Міх7 (доза 6, 10-й день), В) ЗКВ (160 нм, 10-й день), 3) ВСІ. (1,6 нм, 10-й день) і Б) МТХ (1,6 нм, 10-й день) на експресію МВР. " р«е0,05, значима відмінність від контролю (-х аскорбінова кислота) (однобічний метод АМОМА з наступним критерієм Фішера розі-пос); пе: немає статистичних відмінностей.
Фіг. 3. Позитивний ефект суміші Міх7 (7 доз) А) на 10-й день і В) на 11-й день при інкубації разом з аскорбіновою кислотою на експресію МВР у спільних культурах РМР22 ТО у відсотках від контролю (- аскорбінова кислота). Однобічний метод АМОМА з наступним критерієм Фішера розі-пос.
Фіг. 4. Позитивний ефект на самців пацюків після З і б-тижневого застосування суміші Міх1 при визначенні в тесті на перекладині. Латентність вимірювали як середнє із двох перших визначень (білі стовпчики: контрольні пацюки, які одержували плацебо; чорні стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували плацебо; сірі стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували
Міх1). 7" р «0,01. Статистика за двостороннім І-критерієм Стьюдента.
Фіг. 5. Позитивний вплив на ходу в самців пацюків після З і б-тижневого (лівий і правий графік, відповідно) застосування композиції Міх! (білі стовпчики: рівна хода; сірі стовпчики: нерівна хода; чорні стовпчики: пацюка з важкою нездатністю ходити). Статистика за двостороннім І-критерієм Стьюдента.
Фіг. 6. Позитивний ефект композиції Міх! на самців пацюків за тестом на похилій площині (257). Пацюків перевіряли після 3, 6, 9 і 12-тижневого застосування (білі стовпчики: контрольні пацюки, які одержували плацебо; чорні стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували плацебо; сірі стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували Міх1). " р «0,05. Статистика за двостороннім 1- критерієм Стьюдента.
Фіг. 7. Позитивний ефект на самок пацюків після З-тижневого застосування композиції Міх2 за тестом на похилій площині (білі стовпчики: контрольні пацюки, які одержували плацебо; чорні стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували плацебо; сірі стовпчики: трансгенні пацюки, які одержували Міх2). 7" р «0,01. Статистика за двостороннім І-критерієм Стьюдента.
Фіг. 8. Захисний ефект суміші Міх! на самців пацюків при індукованій оксаліплатином невропатії (білі стовпчики: пацюки дикого типу, які одержували плацебо; чорні стовпчики: пацюки дикого типу, які одержували контрольний препарат габапентин; сірі стовпчики: пацюки дикого типу, які одержували Міх1). "7 р'« 0,05; р «0,01. Статистика за двостороннім І-критерієм
Стьюдента.
Фіг. 9. Значне зниження експресії РНК ртр22 у оброблених трансгенних тварин у порівнянні із трансгенними пацюками РМР22 після 9 - тижневої обробки Міх7 у дозі З (МР як контрольний ген, Зегеда еї аї., 1996) (р-0,0015). Також перевіряли вбудовування трансгена й гіперекспресію гена ртр22; РНК ртр22 у трансгенних пацюків РМР22 експресувалась в 1,8 рази сильніше у порівнянні з контрольними пацюками дикого типу з того ж приплоду (р «1х10-. Екстракцію РНК ртра22 проводили із сідничних нервів 1б6-тижневих самців пацюків (п-18 для дикого типу, п-20 для трансгенних пацюків і п-18 для ТО, які одержували Міх7 у дозі 3). Статистичний аналіз проводили за І-критерієм Умеїсп.
Фіг. 10. Проводили кластерний аналіз за показниками тесту на похилій площині при 35" для розподілу на класи поганих, середніх і гарних показників у всіх оцінюваних точках часу (дані про 3, 6 і 9-тижневу обробку зведені разом). Значна відмінність спостерігалася між диким типом (МЛ) і трансгенами (ТС) із плацебо: 68 95 УМТ відносилися до групи з гарними показниками й тільки 5 95 ТО із плацебо відносилися до цієї групи (р-0,0003). Міх7 у дозі 2 і дозі З поліпшувала показники в ТО пацюків. Статистичний аналіз проводили, застосовуючи тренд-тест на рівні значимості 5 95 (п-18 для пацюків У/Т і плацебо, п-20 для ТО пацюків і плацебо, п-17 для ТО, які одержували Міх7 у дозі 2, п-18 для ТО, які одержували Міх?7 у дозі 3).
Фіг. 11. Латентність до падіння в ТО пацюків у тесті на перекладині після 9-тижневої обробки сумішшю Міх7 у дозі З аналізували на моделі Кокса з оцінкою дисперсії методом "сендвіч" і порівнювали з ТО ж плацебо, застосовуючи лог-ранговий критерій на рівні значимості 5 95. Міх7 у дозі З значно підвищувала латентність до падіння в ТО пацюків після 9-тижневої обробки.
Фіг. 12. Сила хватання в групах дикого типу, трансгенних із плацебо й трансгенних тварин, які одержували Міх7 у дозі З щодня протягом 9 тижнів, на моделі Кокса с оцінкою дисперсії методом "сендвіч" у кожен момент часу після обробки (3, б і 9 тижнів) і в порівнянні з контрольними ТО із плацебо із застосуванням лог-рангового критерію на рівні значимості 5 95.
Зо Відповідні значення р представлені на кривих Каплана-Мейера. Спостерігалося значне зниження сили хватання передніх лап у трансгенних пацюків із плацебо (чорна проста лінія, п-21) у порівнянні з пацюками МЛ (сіра проста лінія, р-1,45х1075, п-19). Обробка сумішшю Міх7 у дозі З значно підвищувала силу хватання передніх лап (чорна пунктирна лінія; р-0,03, п-18).
Фіг. 13. Кореляційний тест Пірсона показав істотну кореляцію між латентністю до падіння в тесті на перекладині (після 9-тижневої обробки) і рівнем експресії РНК ртр22: р-1,6х10-7 (МТ,
ТО із плацебо й ТО, які одержували Міх7 у дозі 3, зведені разом); р-0,07 (ТО із плацебо й ТО, які одержували Міх7 у дозі 3, зведені разом). Чим меншою була експресія РНК рітпр22, тим кращими були показники в тесті на перекладині. Вік самців пацюків становив 16 тижнів (п-18 для пацюків УТ, білі кружечки; п-20 для ТО із плацебо, чорні кружечки; і п-18 для ТО, які одержували Міх7 у дозі 3, білі трикутники).
Фіг. 14. Кореляційний тест Пірсона показав істотну кореляцію між латентністю до падіння в тесті на перекладині (після 9-тижневої обробки) і швидкістю проведення чутливого нерва (МСМ): р-1,34х10-5 (М/7, ТО із плацебо й ТО, які одержували Міх7 у дозі 3, зведені разом) і р-0,04 (То із плацебо й ТО, які одержували Міх7 у дозі 3, зведені разом). Чим вищою була швидкість проведення, тем кращими були показники в тесті на перекладині. Вік самців пацюків становив 16 тижнів (п-18 для пацюків М/Т, білі кружечки; п-20 для ТО із плацебо, чорні кружечки; і п-18 для ТО, які одержували Міх?7 у дозі 3, білі трикутнички).
Фіг. 15. Обробка мишей з передавленим нервом сумішшю Міх/7 (доза 3) відновлює фізіологію нервів і поліпшує цілісність аксонів і мієліну. А) З-тижневий прийом Міх7 підвищував амплітуду СМАР (сідничний нерв/литковий нерв) у самців мишей з передавленим сідничним нервом (п-10 для кожної із груп несправжньої обробки, передавлювання/носій й передавлювання/тіх7). В) б-тижневий прийом Міх/ значно поліпшує товщину аксонів. С)
Розподіл С-співвідношення (співвідношення внутрішнього діаметра аксонів до загального зовнішнього діаметра аксонів і мієліну) відповідно до діаметра аксонів у мишей з розривом нерва показало гіпермієлінізацію більш дрібних і гіпомієлінізацію більших аксонів. б-тижневий прийом Міх7 значно поліпшував розподіл з-співвідношення в мишей з передавлюванням нерва (В) ї (С), п-б для кожної групи; І-критерій, "р '« 0,05, р« 001, р « 0,001). Усі дані представлені у вигляді середнього значення х 5.е.т.
Фіг. 16. Міх7 значно поліпшує (р «0,05) невропатичу інвалідність у хворих на СМІТА при 12- бо місячному випробуванні (середнє хз 5.е.т). У групі, яка одержувала Міх7 (суцільна лінія), ОМІ 5 збільшилася більше ніж на 10 95 у порівнянні з вихідним показником, тоді як у групі плацебо (пунктирна лінія) ОМІ 5 знижувалася приблизно на 5 95 у порівнянні з вихідним показником.
Фіг. 17. Обробка Міх7 мишей з передавленим нервом відновлює функціональну поведінку.
А) Прооперовані миші не здатні правильно поставити пошкоджену лапу для виконання звичайних рухів, що приводить до зменшення співвідношення несучих поверхонь. В) Після 13- денного прийому Міх7 (баклофен (ВСІ) 600 мкг/кг, налтрексон (МТХ) 70 мкг/кг, О-сорбітол (5КВ) 21 мг/кг) цей функціональний дефект повністю нормалізувався, тоді як поодинці ці препарати не впливали на співвідношення несучих поверхонь (С, ОО, Е). п-10 для кожної групи. Дані представлені у вигляді середнього значення ж5.е.т." р «0,05, р «0,01 у порівнянні з носієм при пошкодженні нерва (І-критерій); п5: немає статистичних відмінностей.
Докладний опис винаходу
Даним винаходом передбачені нові терапевтичні підходи до лікування СМТ або споріднених з СМТ захворювань. У винаході розкриті нові комбінації лікарських засобів, які дозволяють ефективну корекцію таких захворювань і можуть застосовуватися для будь-яких ссавців.
У контексті даного винаходу СМТ включає СМІТА, СМТІВ, СМТ1С, СМТ10, СМІХ,
СМТ2А, СМТ2В, СМТ2О, СМТ2Е, СМТ2-РО, СМТ4А, СМТаВІ1, СМТ482, СМТ40, СМТАЕ, СМТ або АК-СМТ2А, найкраще СМІТА.
У контексті даного винаходу, термін "споріднене з СМТ захворювання" позначає інші захворювання, пов'язані з аномальною експресією РМР22, що приводить до аномальної мієлінізації й втрати нейронів. Зокрема, термін "споріднене з СМТ захворювання" охоплює хворобу Альцгеймера (АЮ), слабоумство старих за типом АЮ (5ОАТ), хворобу Паркінсона, деменцію з тільцями Леві, судинну деменцію, аутизм, легкі когнітивні порушення (МС), вікове погіршення пам'яті (ААМІ) і проблеми, пов'язані зі старінням, паркінсонізм після енцефаліту, шизофренію, депресію, біполярний розлад та інші афективні розлади, хворобу Хантінгтона, захворювання рухових нейронів, включаючи бічний аміотрофічний склероз (А! 5), розсіяний склероз, глаукому, синдром Гійена-Баре, аксональну дистрофію тонкого (дгасіїє) пучка, невропатії, у тому числі ідіопатичні невропатії, діабетичні невропатії, токсичні невропатії, включаючи невропатії, викликані лікарською терапією, невропатії й деменції, спровоковані ВІЛ, опроміненням, важкими металами або авітамінозом і травматичні невропатії (напр., при
Зо механічному пошкодженні нервів), пріонові нейродегенерації, у тому числі хворобу
Крейтцфельда-Якоба (СО), губчату енцефалопатію великої рогатої худоби (В5Е), 555, ЕРНІ, куру й синдром Альперса.
У кращому втіленні "споріднене з СМТ захворювання" позначає токсичні або травматичні невропатії, особливо лікарські невропатії, А! 5 або невропатії в результаті механічного пошкодження нервів.
У контексті винаходу "механічне пошкодження нервів" означає пряме фізичне пошкодження нерва в центральній нервовій системі (ЦНС) або в периферійній нервовій системі (РМ5).
Пошкодження в ПНС можна класифікувати відповідно до ступеня пошкодження нервів. Даний винахід придатний для лікування пошкоджень нервів відповідно до ступенів від нейроапраксії (стан, при якому порушується тільки передача сигналів нервом), аксонотмесиса (пошкодження, при якому пошкоджуються аксони, без пошкодження навколишніх сполучних тканин нервів) до невротмесиса (пошкодження, при якому пошкоджуються як аксони, так і оточуючі тканини).
Механічні пошкодження нервів можуть мати випадковими або виникати при хірургічних втручаннях або за інших обставин, таких, наприклад, як пов'язане з пологами нетримання сечі.
Пошкодження ЦНС охоплюють як черепно-мозкові травми, так і травми спинного мозку.
Черепно-мозкові травми можуть бути первинними (тобто безпосередньо в результаті травми) або вторинними (тобто бути наслідком травми). Пошкодження спинного мозку можна класифікувати за ступенем сенсорних і моторних порушень, як викладено в Іпіегпайбопаї!
Зіапаагаз ог Мешгоіодіса! Сіавзвітісайноп ої Зріпа! Сога Іпіигу (Кіквпрішт еї аї., 2011).
У даному винаході термін "лікування" захворювання включає терапію, профілактику, уповільнення перебігу або зменшення болю, викликаного захворюванням. Зокрема, термін "лікування" включає контроль перебігу захворювання й пов'язаних з ним симптомів. Зокрема, лікування СМТ або спорідненої невропатії відповідно до даного винаходу включає запобігання або уповільнення або зниження або ослаблення рухових, вегетативних і/або сенсорних порушень, спричинених такими захворюваннями. Рухові симптоми включають мимовільні скорочення, посмикування, слабість або повну відсутність реакції м'язів, іннервованих пошкодженими нервами. Вегетативні симптоми можуть торкатися серцево-судинної системи, потовиділення, терморегуляції, сечовидільної системи, шлунково-кишкового тракту й/або репродуктивної системи. Сенсорні симптоми включають біль, оніміння або втрату чутливості в бо області іннервації пошкодженими нервами.
"Регенерація нерва" охоплює посилення мієлінізації, ріст аксонів і/або відновлення морфологічних або функціональних характеристик нерва.
Крім того, термін "сполука" позначає хімічні сполуки, спеціально перераховані в заявці, а також будь-які фармацевтичні композиції із прийнятними солями, гідратами, складними ефірами, простими ефірами, ізомерами, рацематами, кон'югатами, їхніми формами проліків.
Перераховані в даній заявці сполуки також можна ідентифікувати за відповідними номерами
САБ.
Так, кращими сполуками в даному винаході є баклофен (СА 1134-47-0) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; сорбітол (САБ-50-70-4) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; налтрексон (СА 16590-41-3) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; міфрепристон (СА 84371-65-3) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; пілокарпін (САБ-54-71-7) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; метимазол (САБ5-60-56-0) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; кетопрофен (САБ5 22071-15-4) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; флурбіпрофен (5104-49-4) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні; і рапаміцин (СА5 53123-88-9) і його можливі солі, енантіомери, рацемати, проліки й похідні.
Інші сполуки, які використовуються у винаході: ацетазоламід (САБ-59-66-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; альбутерол (САБ 18559-94-93 і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; амілорид (СА5-2016-88-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; аміноглютетимід (СА5 125-84-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; аміодарон (СА5Б-1951-25-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; азтреонам (СА 78110-38-0) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; баклофен (САБ-1134-47-0) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; балсалазид (СА5 80573-04- 2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; бетаїн (СА 107-43-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; бетанхол (СА 674-38-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки і похідні; бикалутамід (САЗ 90357-06-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; бромокриптин (САБ 25614-03-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; буметанід (СА5 28395-03-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; буспірон (СА5
Зо 36505-84-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; карбахол (СА5З-51-83-2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; карбамазепін (СА5 298-46-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; карбимазол (САЗ 22232-54-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; цевімелін (САБ 107233-08-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; ципрофлоксацин (СА5 85721-33-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; клонідин (САБ-4205-90-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; куркумін (СА5 458- 37-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; циклоспорин А (САБ5 59865-13-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; діазепам (САБ 439-14-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; диклофенак (СА 15307-86-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; динопростон (САБ 363-24-6) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; дисульфірам (САБ-97-77-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; О- сорбітол (САБ-50-70-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; дутастерид (СА5 164656-23-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; естрадіол (САБ-50-28-2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; екземестан (СА5 107868-30-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; фелбамат (САЗ 25451-15-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; фенофібрат (СА 49562-28-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; фінастерид (СА 98319-26-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; флумазеніл (САБ 78755-81-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; флунітразепам (СА5Б-1622-62-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; флурбіпрофен (СА5З-5104-49-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; фуросемид (САБ-54-31-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; габапентин (САЗ 60142-96-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; галантамін (СА5 357-70-0) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; галоперидол (СА5Б-52-86-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; ібупрофен (СА 15687-27-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; ізопротеренол (СА5Б-7683-59-2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; кетоконазол (СА5 65277-42-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; кетопрофен (САБ5 22071-15-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; І -карнітин (САЗ 541-15-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; ліотіронін «Т3) (СА5 6893-02-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; літій (СА5 7439-93-2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; лозартан (СА5 114798-26-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й 60 похідні; локсапін (СА5Б-1977-10-2) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні;
мелоксикам (САБ 71125-38-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метапротеренол (САБ 586-06-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метарамінол (САБ-54-49-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метформін (СА5 657-24-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метахолін (СА5Б-55-92-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метимазол (САБ-60-56-0) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метилергоновін (СА 113-42-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метопролол (САБ 37350-58-6) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; метирапон (СА5Б-54-36-4) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; міконазол (СА5 22916-47-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; міфепристон (САЗ 84371- 65-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; надолол (САБ5 42200-33-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; налоксон (СА5 465-65-6) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; налтрексон (СА5 16590-41-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; норфлоксацин (СА5 70458-96-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; пентазоцин (САбБ 359-83-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; феноксибензамін (САБЗ-59-96-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; фенілбутират (СА5-1821-12-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; пілокарпін (САБ-54-71-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; піоглітазон (СА5 111025-46-8) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; празозин (СА5 19216-56-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; пропілтіоурацил (СА5Б-51-52-5) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; ралоксифен (СА5 84449-90-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; рапаміцин (СА5 53123-88-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; рифампіцин (САБ 13292-46-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; симвастатин (СА 79902-63-9) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; спіронолактон (САБ-52-01-7) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; такролімус (СА5 104987-11-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; тамоксифен (СА5 10540-29-1) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; трегалоза (СА5Б-99-20-7) і її можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; трилостан (СА5 13647-35-3) і його можливі солі, енантіомери, проліки й похідні; вальпроєва кислота (СА5-99-66-1) та її можливі солі, енантіомери, проліки і похідні.
Термін "комбінація" означає таке лікування, при якому суб'єктові вводиться кілька
Зо препаратів одночасно з метою викликати біологічний ефект. При комбінованій терапії препарати можуть уводитися разом або окремо, у той самий час або послідовно. Крім того, препарати можуть уводитися різними способами й поза різними схемами.
Далі у винаході представлена ідентифікація й активність певних комбінацій лікарських засобів, які забезпечують ефективне лікування травматичних невропатій і механічних пошкоджень нервів. Зокрема, у винаході представлені нові потрійні комбінації, які забезпечують значний ефект іп міїго і іп мімо на регенерацію нервів.
У цьому зв'язку винахід стосується композицій, які містять баклофен, сорбітол і сполуку, обрану з поміж пілокарпіну, метимазолу, міфепристону, налтрексону, рапаміцину, флурбіпрофену й кетопрофену та їх солей, енантіомерів, рацематів або проліків.
В кращому варіанті винахід стосується композицій, які містять баклофен, сорбітол і сполуку, обрану з поміж пілокарпіну, метимазолу, міфепристону, налтрексону й кетопрофену.
У найкращому втіленні даний винахід стосується композицій, які містять налтрексон, баклофен і сорбітол, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам- ссавцем.
Бажано в даних композиціях сорбітол представлений Ю-сорбітолом, а баклофен представлений К5-баклофеном або 5-баклофеном, краще К5-баклофеном.
Іншим кращим предметом винаходу є композиції, які включають: (а) рапаміцин, (5) міфепристон або налтрексон, і (с) модулятор РМР22, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам-ссавцем.
Іншим кращим предметом винаходу є композиції, які включають: (а) рапаміцин, (в) міфепристон і (с) модулятор РМР22, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам-ссавцем.
Модулятором РМР22 може бути будь-яка сполука, яка модулює шлях РМР22 у клітинах і в основному викликає або сприяє нормалізації організації мієліну й/або інгібуванню втрати нейронів. Модулятор РМР22 може бути обраний з поміж ацетазоламіду, альбутеролу, 60 амілориду, аміноглютетиміду, аміодарону, азтреонаму, баклофену, балсалазиду, бетаїну,
бетанохолу, бикалутаміду, бромокриптину, буметаниду, буспирону, карбахолу, карбамазепіну, карбімазолу, цевімеліну, ципрофлоксацину, клонідину, куркуміну, циклоспорину А, діазепаму, диклофенаку, динопростону, дисульфіраму, Ю-сорбітолу, дутастериду, естрадіолу, екземестану, фелбамату, фенофибрату, финастериду, флумазенілу, флунітразепаму, флурбіпрофену, фуросемиду, габапентину, галантаміну, галоперидолу, ібупрофену, ізопротеренолу, кетоконазолу, кетопрофену, І-карнітину, ліотироніну (Т3), літію, лозартана, локсапіну, мелоксикаму, метапротеренолу, метарамінолу, метформіну, метахоліну, метимазолу, метилергоновіну, метопрололу, метирапону, міконазолу, міфепристону, надололу, налоксону, налтрексону, норфлоксацину, пентазоцину, феноксибензаміну, фенілбутирату, пілокарпіну, піоглітазону, празозину, пропілтіоурацилу, ралоксифену, рапаміцину, рифампіцину, римвастатину, спіронолактону, такролимусу, тамоксифену, трегалози, трилостану, солей або проліків вальпроєвої кислоти.
У кращому втіленні сполуку (с) обирають з поміж пілокарпіну, метимазолу й баклофену. У цьому зв'язку найкраща композиція запропонована даним винаходом містить: (а) рапаміцин, (в) міфепристон і (с) сполуку, обрану з поміж пілокарпіну, метимазолу й баклофену, для одночасного, роздільного або послідовного введення суб'єктам-ссавцем.
Конкретні приклади таких композицій включають композиції, які містять: - рапаміцин, міфепристон і пілокарпін, - рапаміцин, міфепристон і баклофен, - рапаміцин, міфепристон і метимазол, або - рапаміцин, налтрексон і метимазол.
В експериментальному розділі показано, що ці конкретні комбінації препаратів здатні ефективно виправляти експресію РМР22 іп мійго, відновлювати нормальну мієлінізацію й цілісність нейронів і тим самим послабляти СМТ у тварин іп мімо. Результати також показують, що ці комбінації можуть захищати тварин від спричинених хіміотерапією або травматичних невропатій. Внаслідок цього ці композиції можуть застосовуватися для запобігання або ослаблення спричиненої хіміотерапією невропатії тим самим дозволяючи пацієнтам
Зо одержувати хіміотерапію протягом більш тривалого часу. Також в експериментальному розділі представлені властивості запропонованих винаходом композицій, які сприяють регенерації нервів. Так, автори винаходу продемонстрували нейротропну активність комбінацій запропонованих винаходом, яка характеризується посиленням росту аксонів і мієлінізації, що приводить до істотного відновлення передачі нервових імпульсів до м'язів. Отже, запропоновані винаходом композиції можуть застосовуватися для поліпшення й/або прискорення відновлення після будь-якого пошкодження нервів, чи то генетичного, хімічного або механічного походження (напр., травматичного).
Іншим предметом винаходу є композиції, які містять налтрексон, баклофен і ще один інший інгібітор РМР22, як визначено вище.
Наступним предметом винаходу є композиції, наведені вище, які додатково містять один або декілька фармацевтично прийнятних наповнювачів або носіїв (тобто фармацевтичні композиції).
Іншим предметом винаходу є спосіб посилення регенерації нервів у суб'єктів, які цього потребують, який передбачає введення суб'єктові ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Іншим предметом винаходу є композиції, наведені вище, для лікування СМТ або споріднених СМТ захворювань.
Наступним предметом винаходу є застосування комбінацій сполук, наведених вище, для виготовлення медикаменту для лікування СМТ або споріднених з СМТ захворювань.
Наступним предметом винаходу є спосіб лікування СМТ або споріднених з СМТ захворювань, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості композиції, описаної вище.
Наступним предметом винаходу є спосіб одержання фармацевтичних композицій, який передбачає змішування наведених вище сполук у відповідному наповнювачі або носії.
Більш конкретним предметом винаходу є спосіб лікування СМТТА у суб'єкта, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Іншим конкретним предметом винаходу є спосіб лікування токсичної невропатії в суб'єкта, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості сполуки або бо комбінації сполук, описаних вище.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб лікування АЇ5 у суб'єкта, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
Наступним конкретним предметом винаходу є спосіб лікування травматичної невропатії в суб'єкта, який передбачає введення суб'єкту, який цього потребує ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
У кращому втіленні суб'єкт, який потребує посилення регенерації нерва, страждає або постраждав від механічного пошкодження нерва, наприклад, черепно-мозкової травми, травми спинного мозку або пошкодження периферійних нервів.
Іншим предметом винаходу є спосіб поліпшення й/або прискорення відновлення від пошкодження нерва в суб'єкта, який цього потребує, який передбачає введення суб'єктові ефективної кількості сполуки або комбінації сполук, описаних вище.
У кращому втіленні суб'єкт, який потребує поліпшення й/або прискорення відновлення від механічного пошкодження нерва, страждає або постраждав від черепно-мозкової травми, травми спинного мозку або пошкодження периферійних нервів.
Запропонована винаходом терапія може проводитися у вигляді комбінації лікарських засобів і/або у поєднанні з будь-якою іншою терапією. Вона може проводитися вдома, у кабінеті лікаря, клініці, амбулаторному відділенні лікарні або в лікарні для того, щоб лікар міг ретельно спостерігати ефекти терапії й робити будь-які необхідні зміни.
Тривалість терапії залежить від стадії захворювання, яке підлягає лікуванню, віку й стану пацієнта й того, як пацієнт реагує на лікування.
Крім того, особа з більшим ризиком розвитку додаткового невропатичого розладу (напр., особа, яка генетично схильна або страждає, наприклад на діабет, або проходить лікування від онкологічного захворювання тощо) може одержувати профілактичне лікування для того, щоб послабити або уповільнити можливе виникнення невропатії.
Дозування, частоту й спосіб уведення кожного компонента комбінації можна контролювати незалежно одне від одного. Наприклад, один препарат можна вводити перорально, а другий - внутрішньом'язево. Комбінована терапія може проводитися окремими циклами, які включають періоди відпочинку, так що організм пацієнта буде мати шанс на відновлення від будь-яких
Зо непередбачених побічних ефектів. Препарати також можуть бути об'єднані разом для того, щоб при одному введенні вводилися обидва препарати.
Складання фармацевтичних композицій
Уведення кожного препарату з комбінації може здійснюватися будь-яким придатним чином, що дає таку концентрацію препарату, яка, у комбінації з іншими компонентами, може полегшити стан пацієнта (що можна встановити, напр., іп міго за його дією на підвищену експресію РМР22 при досягненні периферійних нервів).
Хоча активні інгредієнти з комбінації можна вводити і в вигляді хімічно чистих речовин, проте бажано представити їх у вигляді фармацевтичної композиції, яка в даному контексті також називається лікарською формою. Можливі композиції включають ті, що придатні для перорального, ректального, топічного (в тому числі трансдермального, трансбукального і сублінгвального) або парентерального (в тому числі підшкірного, внутрішньом'язового, внутрішньовенного і внутрішньошкірного) введення.
Найчастіше ці лікарські форми призначаються пацієнтам в "упаковках для пацієнта", що містять кілька дозових одиниць або інших засобів для введення відміряних одиниць дози для використання протягом окремого періоду лікування в одній упаковці, зазвичай блістерній упаковці. Готові упаковки мають перевагу перед традиційними рецептами, коли фармацевт виділяє порцію фармацевтичного препарату з оптової партії, тим, що пацієнт завжди має доступ до вкладки в упаковці, чого зазвичай не буває при традиційних рецептах. Як виявилося, включення вкладки покращує дотримання пацієнтом вказівок лікаря. Так, винахід додатково включає описані тут лікарські форми, в комбінації з пакувальним матеріалом, придатним для даних форм. У такій упаковці для пацієнта можна судити про призначення лікарської форми для комбінованої терапії за інструкціями, пристроїв, вкладенням, пристосуванням і/або інших засобів, які допомагають використовувати препарат для лікування найкращим чином. Такі заходи роблять упаковки для пацієнта особливо придатними і пристосованими для застосування при лікуванні за допомогою комбінацій запропонованих даним винаходом.
Препарат може утримуватися в будь-якій придатній кількості, у будь-якій придатній речовині носія і може бути присутнім у кількості 1-9995 за вагою від загальної маси композиції.
Композиції можуть бути представлені у вигляді дозових форм, придатних для перорального, парентерального (напр., внутрішньовенного, внутрішнм'язового), ректального, шкірного, бо назального, вагінального, інгаляційного, нашкірного (пластирі) або очного способу введення.
Так, композиції можуть мати вигляд, напр., таблеток, капсул, пігулок, порошків, гранул, суспензій, емульсій, розчинів, гелів, включаючи гідрогелі, паст, мазей, кремів, пластирів, вливань, обладнань для осмотичної доставки, свічок, клізм, препаратів для ін'єкцій, імплантатів, спреїв або аерозолів.
Фармацевтичні композиції можуть бути складені відповідно до звичайної фармацевтичної практики (напр., див. Кетіпоїоп: Те Зсіеєпсе апа Ргасіїсе ої Рпагтасу (2011 еа.), ей. А. К.
Сеппаго, Іірріпсой М/ПШіатве 4 УМіКіп5, 2000; і Епсусіоредіа ої Рпаппасеціїса! Тесппоїоду, едв. ). змагьгіск апа у). С. Воуїап, 1988-1999, Магсе! ОекКег, Мем/ МогК).
Запропоновані винаходом фармацевтичні композиції можуть бути складені так, щоб вони вивільняли активні сполуки практично відразу ж після введення або ж у будь-який заданий час або період часу після введення.
Лікарські форми з контрольованим вивільненням включають: (ї) форми, які створюють практично постійну концентрацію препарату в організмі протягом тривалого часу; (ії) форми, які після закінчення заданого часу затримки створюють практично постійну концентрацію препарату в організмі протягом тривалого часу; (ії) форми, які підтримують дію препарату протягом заданого періоду часу за рахунок підтримування відносно постійного, ефективного рівня препарату в організмі із одночасною мінімізацією небажаних побічних ефектів, пов'язаних з коливаннями рівня активної лікарської речовини в плазмі; (м) форми, які локалізують дію препарату, напр., шляхом просторового розміщення композиції з контрольованим вивільненням поруч із або у хворому органі або тканині; і (м) форми, які направляють дію препарату за допомогою носіїв або хімічних похідних, доставляючи препарат у клітини мішені певного типу.
Уведення ліків у вигляді форм із контрольованим вивільненням особливо бажано в тих випадках, коли препарат у комбінації () має вузький терапевтичний індекс (тобто в нього невелика різниця між концентрацією в плазмі, що дає шкідливі побічні ефекти або токсичні реакції, і концентрацією в плазмі, що дає терапевтичний ефект); взагалі терапевтичний індекс (ТІ) визначається, як співвідношення середньої летальної дози (І О5хо) до середньої ефективної дози (ЕбОрБо); (ії) вузьке вікно усмоктування в шлунково-кишковому тракті; або (ії) дуже короткий біологічний період напіврозпаду, так що потрібне часте введення дози протягом дня для того, щоб підтримувати його рівень у плазмі на терапевтичному рівні.
Зо Для того, щоб одержати контрольоване вивільнення, при якому швидкість вивільнення перевищує швидкість метаболізму даного препарату, можна застосовувати кожну із цілого ряду стратегій. Контрольоване вивільнення може бути отримане шляхом належного вибору різних параметрів та інгредієнтів лікарської форми, включаючи, напр., різні типи композицій і покриттів для контрольованого вивільнення. Так, препарат уводять до складу фармацевтичної композиції з придатними наповнювачами, які при введенні виділяють препарат контрольованим чином (таблетки або капсули з однією або багатьма одиницями композиції, олійні розчини, суспензії, емульсії, мікрокапсули, мікросфери, наночасточки, пластирі й ліпосоми).
Тверді дозовані форми для приймання усередину
Лікарські форми для приймання усередину включають таблетки, які містять активні інгредієнти в суміші з нетоксичними фармацевтично прийнятними наповнювачами. Такими наповнювачами можуть бути, наприклад, інертні розріджувачі або наповнювачі (напр., сахароза, мікрокристалічна целюлоза, крохмаль, включаючи картопляний крохмаль, карбонат кальцію, хлорид натрію, фосфат кальцію, сульфат кальцію або фосфат натрію); гранулюючі та дезінтегруючі речовини (напр., похідні целюлози, у тому числі мікрокристалічна целюлоза, крохмаль, включаючи картопляний крохмаль, кроскармелоза натрієва, альгінати або альгінова кислота); зв'язуючі речовини (напр., гуміарабік, альгінова кислота, альгінат натрію, желатин, крохмаль, прежелатинізований крохмаль, мікрокристалічна целюлоза, карбоксиметилцелюлоза натрієва, метилцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза, етилцелюлоза, полівінілпіролідон або поліетиленгліколь); і змащувальні речовини, речовини, які полегшують ковзання й антиадгезиви (напр., стеаринова кислота, діоксиди кремнію або тальк). Іншими фармацевтично прийнятними наповнювачами можуть бути барвники, ароматизатори, пластифікатори, зволожувачі, буферні речовини тощо.
Таблетки можуть бути без покриття або ж вони можуть бути покриті відомими методами, необов'язково для того, щоб уповільнити розпад і усмоктування в шлунково-кишковому тракті й тим самим забезпечити пролонговану дію протягом тривалого часу. Покриття може бути пристосоване для вивільнення активної речовини препарату за заданою схемою (напр., для одержання лікарської форми з контрольованим вивільненням) або ж так, щоб активна речовина не вивільнялася до проходження через шлунок (ентеросолюбільне покриття). Покриття може бути цукровим покриттям, плівковим покриттям (напр., на основі гідроксипропілметилцелюлози, бо метилцелюлози, метил-гідроксиетилцелюлози, гідроксипропілцелюлози,
карбоксиметилцелюлози, співполімерів акрилату, поліеєтиленгліколів і/або полівінілпіролідону) або ентеросолюбільним покриттям (напр., на основі співполімеру метакрилової кислоти, ацетату-фталату целюлози, фталату гідроксипропілметилцелюлози, ацетату-сукцинату гідроксипропілметилцелюлози, фталату полівінілацетату, шелаку й/або етилцелюлози). Можна використовувати матеріали, які викликають затримку за часом, такі, напр., як гліцерилмоностеарат або гліцерилдистеарат.
Тверді композиції у вигляді таблеток можуть мати покриття, пристосоване для захисту композиції від небажаних хімічних змін (напр., від хімічної деградації перед виділенням активної лікарської речовини). Покриття можна наносити на тверду дозовану форму в такий же спосіб, як описано в Епсусіоредіа ої Рпагтасеціїса! Тесппоіоду.
Препарати можуть бути змішані разом у таблетках або можуть бути розділені. Наприклад, перший препарат міститься на внутрішній стороні таблетки, а другий препарат перебуває на зовнішній стороні, при цьому значна частина другого препарату виділяється до вивільнення першого препарату.
Лікарські форми для прийому усередину також можуть бути представлені у вигляді жувальних таблеток або у вигляді твердих желатинових капсул, у яких активний інгредієнт змішаний з інертним твердим розріджувачем (напр., картопляним крохмалем, мікрокристалічною целюлозою, карбонатом кальцію, фосфатом кальцію або каоліном), або ж у вигляді м'яких желатинових капсул, у яких активний інгредієнт змішаний з водою або олійним середовищем, наприклад, рідким парафіном або маслиновою олією. Порошки й гранули можуть бути отримані з використанням інгредієнтів, наведених вище для таблеток і капсул, стандартним способом.
Композиції з контрольованим вивільненням для приймання усередину, наприклад, можуть бути сконструйовані так, щоб вивільнення активного агента контролювалося розчиненням і/або дифузією активної речовини препарату.
Контрольоване розчиненням або дифузією вивільнення може здійснюватися шляхом відповідного покриття таблеток, капсул, гранул або гранульованих форм препаратів або шляхом поміщенням препарату у відповідний матрикс. Покриття для контрольованого вивільнення може включати одне або декілька із зазначених вище оболонкових речовин і/або, напр., шелак, бджолиний віск, гліковоск, касторовий віск, карнаубский віск, стеариловий спирт, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, гліцерилпальмітостеарат, етилцелюлозу, акрилові смоли, діІ-полілактид, ацетат-бутират целюлози, полівінілхлорид, полівінілацетат, вінілпіролідон, поліетилен, поліметакрилат, метилметакрилат, 2-гідроксиметакрилат, гідрогелі метакрилату, 1,3-бутиленгликоль, етиленгліколь-метакрилат і/або поліетиленгліколь. У форм (із контрольованим матриксом вивільненням матеріал матрикса також може включати, напр., гідратовану метилцелюлозу, карнаубский віск і стеариловий спирт, карбопол 934, силікон, гліцерилтристеарат, метилакрилат-метилметакрилат, полівінілхлорид, поліетилен і/або галогенований фторуглерод.
Композиції з контрольованим вивільненням, що містять один або кілька препаратів із заявлених комбінацій, також можуть мати вигляд плавучих таблеток або капсул (тобто таких таблеток або капсул, які при прийманні усередину плавають поверх умісту шлунка протягом певного часу). Склади плавучих таблеток препаратів можуть бути отримані шляхом гранулювання суміші препаратів з наповнювачами й 20-75905 мас. таких гідроколоїдів, як гідроксиетилцелюлоза, гідроксипропілцелюлоза або гідроксипропілметилцелюлоза. Отримані гранули можна потім пресувати в таблетки. При контакті зі шлунковим соком таблетка утворює практично вологонепроникний гелевий бар'єр навколо своєї поверхні. Цей гелевий бар'єр бере участь у підтриманні густини меншої від 1, що дозволяє таблетці залишатися на плаву в шлунковому соку.
Рідкі форми для приймання усередину
Порошки, дисперговані порошки або гранули, придатні для приготування водних суспензій при додаванні води, є зручними дозованими формами для приймання усередину. Рецептура у вигляді суспензії дає активний інгредієнт у суміші з диспергуючим або зволожуючим засобом, суспендуючою речовиною й одним або декількома консервантами. Придатними суспендирующими засобами є, наприклад, натрієва карбоксиметилцелюлоза, метилцелюлоза, альгінат натрію тощо.
Парентеральні композиції
Фармацевтичні композиції також можуть уводитися парентерально шляхом ін'єкції, інфузії або імплантації (внутрішньовенно, внутрішньом'язево, підшкірно тощо) у дозових формах, складах або через придатні обладнання доставки або імплантати, які містять стандартні,
нетоксичні фармацевтично прийнятні носії й допоміжні речовини. Складання й виготовлення таких композицій добре відоме фахівцям в галузі фармацевтичних рецептур.
Композиції для парентерального застосування можуть бути представлені у вигляді стандартних дозових форм (напр., в ампулах з одноразовою дозою) або у флаконах, які містять кілька доз, у які може бути доданий придатний консервант (див. нижче). Композиції можуть мати вигляд розчинів, суспензій, емульсій, інфузійних обладнань або обладнань для доставки для імплантації або ж можуть бути представлені у вигляді сухого порошку, який відновлюють водою або іншим придатним носієм перед застосуванням. Крім активних речовин, композиції можуть містити придатні для парентерального введення носії й/або наповнювачі. Активні речовини можуть бути поміщені в мікросфери, мікрокапсули, наночасточки, ліпосоми тощо. Для контрольованого вивільнення. Композиції можуть включати суспендуючі, солюбілізуючі, стабілізуючі, регулючі рН речовини й/або диспергуючі засоби.
Фармацевтичні запропоновані винаходом композиції можуть мати вигляд, придатний для стерильних ін'єкцій. Для приготування таких композицій придатні активні речовини розчиняють або суспендують у прийнятному для парентерального введення рідкому носії. До прийнятних носіїв і розчинників, які можна використовувати, відноситься вода, вода, доведена до потрібного рН додаванням відповідного кількості соляної кислоти, гідроксида натрію або придатного буфера, 1,3-бутандіол, розчин Рінгера й ізотонічний розчин хлориду натрію. Водні форми також можуть містити один або кілька консервантів (напр., метиловий, етиловий або н-пропіловий п- гідроксибензоат). У тих випадках, коли одна з речовин лише важко або слабко розчиняється у воді, можна додавати посилюючі розчинення або солюбілізуючі засоби або ж розчинник може включати 10-60 95 мас. пропіленгликолю тощо.
Парентеральні композиції з контрольованим вивільненням можуть мати вигляд водних суспензій, мікросфер, мікрокапсул, магнітних мікросфер, олійнних розчинів, олійних суспензій або емульсій. З іншого боку, активні речовини можуть бути поміщені в біосумісні носії, ліпосоми, наночасточки, імплантати або інфузійне обладнання. Матеріали для застосування при одержанні мікросфер і/або мікрокапсул є, напр., здатні до біологічного розкладання/ерозії полімери, такі як полігалактин, полі(ізобутилціанакрилат), полі(2-гидроксизтил-і -глутамін).
Біосумісні носії, які можна використовувати при одержанні парентеральних форм із
Зо контрольованим вивільненням, це вуглеводи (напр., декстрани), білки (напр., альбумін), ліпопротеїни або антитіла. Матеріали для застосування в імплантатах можуть бути не здатними до біологічного розкладання (напр., полідиметилсилоксан) або здатними до біологічного розкладання (напр., полікапролактон, полі(гліколева кислота) або полі(орто-ефіри)).
Композиції для ректального введення
Придатні для ректального застосування дозовані форми для композицій включають свічки (типу емульсій або суспензій) і ректальні желатинові капсули (розчини або суспензії). У типовій рецептурі свічок активні речовини змішують із відповідною фармацевтично прийнятною основою свічок типу масла какао, етерифікованих жирних кислот, обробленого гліцерином желатину й різних водорозчинних або диспергованих основ типу поліетиленгліколів. Можна включати різні добавки, підсилювачі або поверхнево-активні речовини.
Композиції для трансдермального й місцевого застосування
Фармацевтичні композиції також можуть уводитися топічно на шкіру для усмоктування через шкіру в дозових формах або лікарських формах, які містять звичайно нетоксичні фармацевтично прийнятні носії й наповнювачі, включаючи мікросфери й ліпосоми. Лікарські форми включають креми, мазі, лосьони, рідкі мазі, гелі, гідрогелі, розчини, суспензії, палички, спреї, пасти, пластирі та інші види трансдермальних систем доставки ліків. Фармацевтично прийнятні носії або наповнювачі можуть включати емульгатори, антіоксиданти, буферні речовини, консерванти, зволожувачі, підсилювачі проникності, хелатуючі речовини, гелеоутворюючі засоби, основи мазей, віддушки й засоби, які захищають шкіру.
Емульгатори можуть бути природними камедями (напр., гуміарабіком або трагакантовою камеддю).
Консерванти, зволожувачі, підсилювачі проникності можуть бути представлені парабенами типу метил- або пропіл-п-гідроксибензоату, а також хлоридом бензалконію, гліцерином, пропіленгликолем, сечовиною тощо.
Фармацевтичні композиції, описані вище для місцевого введення на шкіру, також можуть застосовуватися у зв'язку з місцевим уведенням на поверхню тіла або біля тієї частини, яка підлягає обробці. Композиції можуть бути пристосовані для прямого нанесення або для нанесення за допомогою спеціальних обладнань для доставки ліків типу пов'язок або ж пластирів, прокладок, губок, смужок або інших форм придатного гнучкого матеріалу. бо Дозування й тривалість лікування
Слід мати на увазі, що комбінації препаратів можуть уводитися одночасно, в одній і тієї ж або в різних лікарських формах, або ж послідовно. При послідовному уведенні затримка при введенні одного з активних інгредієнтів не повинна бути такою, щоб втрачалась вигода від ефективної дії комбінації активних інгредієнтів. Мінімальною вимогою для комбінацій запропонованих даним описом є те, що комбінація повинна призначатись для комбінованого застосування з користю від ефективної дії комбінації активних інгредієнтів. Про призначення комбінації можна судити із обладнань, вкладок, пристосувань і/або інших засобів, які допомагають використовувати комбінації запропоновані винаходом.
Терапевтично ефективні кількості лікарських засобів запропонованих винаходом можуть використовуватися разом для одержання медикаменту, який може бути застосований для зниження ефекту підвищеної експресії гена РМР22; відновлення нормальної мієлінізації й цілісності нерва, запобігання або зниження ризику виникнення хвороби СМТ, припинення або уповільнення перебігу хвороби СМТ, як тільки вона виявиться клінічно, і запобігання або зниження ризику першого або наступної появи невропатичих явищ.
Хоча активні препарати даного винаходу можуть уводитися дробовими дозами, наприклад, два або три рази на день, однак більш бажаною є одноразова добова доза кожної сполуки в комбінації причому найкращою є одноразова добова доза всіх препаратів в одній фармацевтичній композиції (стандартній дозованій формі).
Уведення може застосовуватися один або кілька разів на день протягом від декількох днів до декількох років, а може тривати навіть протягом усього пацієнта життя. У більшості випадків показане хронічне або принаймні періодично повторюване тривале введення.
Термін "стандартна дозована форма" відноситься до фізично дискретних одиниць (як то капсули, таблетки або заповнені циліндри шприців), які можна застосовувати як одиниці дозування для людини, причому кожна одиниця містить задану кількість активного матеріалу або матеріалів, розраховану на надання необхідного терапевтичного ефекту, у комбінації з необхідним фармацевтичним носієм.
Кількість кожного препарату в кращій одиниці дози композиції залежить від декількох факторів, у тому числі способу введення, маси тіла й віку пацієнта, тяжкості невропатичих пошкоджень, викликаних захворюванням СМТ, або ризику можливих побічних ефектів з
Зо урахуванням загального стану здоров'я особи, яка підлягає лікуванню.
Крім того, на дозування може вплинути фармакогеномна (вплив генотипу на фармакокінетичний, фармакодинамічний профіль або профіль ефективності терапевтичного засобу) інформація про даного конкретного пацієнта.
За винятком випадків реагування на особливо сильні порушення при захворюванні СМТ, 35 коли можуть знадобитися більш високі дозування, або при лікуванні дітей, коли слід вибирати більш низькі дози, кращі дози для кожного препарату в комбінації звичайно перебувають у межах доз, що не перевищують дозування, які звичайно призначаються для тривалого підтримуючого лікування або виявилися безпечними в 3-й фазі клінічних випробувань.
Наприклад, 40 "- для рапаміцину: від 1 до 100 мкг/кг на день, звичайно від 1 до 50 мкг/кг, наприклад, між 5 і мкг/кг/день; "- для міфепристону: від 1 до 300 мкг/кг на день, звичайно від 10 до 200 мкг/кг, наприклад, між 10 і 80 мкг/кг/день; "- для налтрексону: від 1 до 100 мкг/кг на день, звичайно від 1 до 50 мкг/кг, наприклад, між 1 і 20 мкг/кг/день; "- для пілокарпіну: від 1 до 100 мкг/кг на день, звичайно від 1 до 50 мкг/кг, наприклад, між 1 і 20 мкг/кг/день; "- для баклофену: від 1 до 300 мкг/кг на день, звичайно від 10 до 200 мкг/кг, наприклад, між 20 і 100 мкг/кг/день; "- для метимазолу: від 1 до 100 мкг/кг на день, звичайно від 1 до 50 мкг/кг, наприклад, між 1 і 20 мкг/кг/день; "- для сорбітолу: від 17 мкг/кг до 17 мг/кг на день, звичайно від 167 мкг/кг до 7 мг/кг на день, наприклад, між 333 мкг/кг на день і 3,5 мг/кг на день.
Як правило дози, що вводяться, відповідають тим, що застосовуються для людини вагою 60
Кг.
Найкраще дозування відповідає кількостям від 195 до 1095 від тих, що звичайно призначаються для тривалого підтримуючого лікування.
Слід мати на увазі, що кількість, що фактично вводиться, препарату повинна визначатися лікарем у світлі відповідних обставин, включаючи захворювання, яке чи які підлягають бо лікуванню, яка саме композиція вводиться, вік, вага й реакцію конкретного пацієнта, тяжкість симптомів пацієнта й обраний спосіб уведення. Таким чином, вищевказані дозовані інтервали служать для загального керівництва й підтримки викладених тут положень, але не повинні обмежувати обсяг винаходу.
Наступні приклади приводяться з метою ілюстрації, а не для обмеження.
ПРИКЛАДИ
А. Приготування комбінацій лікарських засобів
Готували наступні комбінації препаратів.
Міх!
Міхз
Міха
Міх5
Міхб
Міх7
В. Експерименти іп міго 1. Аналіз експресії РМР22 у шванівських клітинах, оброблених Міх 1-6 1.1. Культивування клітин 1.1.1. Комерційно доступні первинні культури шванівських клітин пацюків
Флакони з первинною культурою шванівських клітин (52) пацюків (Зсіепсеїй Ж К1700) розморожували й висівали при щільності 10000 клітин/см2 в "середовищі для шванівських клітин зсієпсеї!" (основне середовище фірми 5сієпсеї! Ж К1701) у покриті полі-І -лізином чашки на 75 см". Культуральне середовище складається з основного середовища, 5 96 фетальной телячої сироватки (ЗН-Віотеаісаї, АВ Яй1701-0025), 195 добавки для росту шванівських клітин (ЗН
Віотедіса! АВ й1701-1752), 1 95 гентаміцину (Зідта Ж (1397) і 10 мкм форсколіну (бідта й
Е6886), що сприяє їхній проліферації.
Після досягнення конфлюентності (від 4 до 10 днів залежно від партії клітин) виділяли шванівські клітини шляхом обережного струшування або методом імунопенінга з їШу1.1, що
Зо дозволяє відокремити 5С від прилиплих фібробластів, одержуючи культури із чистотою не менше 9595. Потім підраховували 5С (за допомогою трипанового синього) і висівали в попередньо покриті полі-І -лізином чашки на 75 см? у такому ж середовищі 5С. Після досягнення конфлюентності клітини промивали, обробляли трипсином (1 х трипсин-ЕДТА фірми Іпмігодеп Ж 1540054, розведений в РВ5 без кальцію й магнію), підраховували й висівали в 12-коміркові планшети (140 000 клітин на комірку) у середовищі для шванівських клітин 5сіепсеї! з 5 95 ЕВ5, 1 95 добавки для росту клітин (СО5), 40 мкг/мл гентаміцину й 4 мкМ форсколіну. 1.1.2. Власні первинні культури шванівських клітин пацюків
Первинні культури шванівських клітин (5С) одержували із сідничних нервів новонароджених пацюків Зргадне-Оаулеу (між РО ї Рг). Усіх новонароджених пацюків забивали й поміщали в чашки Петрі. Препарування проводили за стерильних умов.
Видаляли шкіру із задньої поверхні задніх лап і нижньої частини тулуба. Виділяли сідничний нерв і переносили в чашку для культивування, яка містить крижане середовище Лейбовіца (І 15,
Іпмігодеп Ж 11415) з додаванням 1 95 розчину пеніциліну/стрептоміцину (50 МО/мл і 50 мкг/мл, відповідно, Іпмігодеп Ж 15070) і 1 95 бичачого сироваткового альбуміну (ВБА, Зідта АбОО3).
Обидва нерви пацюка переносили в 15 мл пробірку, яка містить крижане середовище І 15. Потім середовище 15 видаляли й заміняли на 2,4 мл ОМЕМ (Іпмігодеп Ж 21969035) з 10 мг/мл колагенази (Зідта Ж АбО003). Нерви інкубували в цьому середовищі 30 хвилин при 37 "С. Потім середовище видаляли й обидва нерви дисоціювали трипсином (1095 трипсин-ЕДТА 1 х,
Іпмігодеп Ж 15400054), розведеним в РВ5З без кальцію й магнію (Іпмйгодеп Ж 2007-03), протягом хв. при 37 "С. Реакцію зупиняли додаванням ОМЕМ, що містить ДНКазу І класу ІІ (0,1 мг/мл, 20 Воспе Оіадповіїс 2104159) і фетальну телячу сироватку (ЕС5 10 95, Іпмігодеп Ж 10270). Потім клітинну суспензію розтирали піпеткою на 10 мл і пропускали через фільтр у пробірку на 50 мл (блок фільтрів Зу/ппех на 13 мм, Мійїроге, з фільтрами з нейлонової сітки на 20 мкм, Різпег).
Суспензію клітин центрифугували при 350 д протягом 10 хв. за кімнатної температури (КТ), а осад суспендували в ОМЕМ з додаванням 10 95 ЕСЗ5 і 1 95 пеніциліну/стрептоміцину. Клітини підраховували (за допомогою трипанового синього) і висівали в чашки РаЇсоп для тканинної культури Ргітагіа на 100 мм при щільності від 5х10» до 105 клітин на чашку.
Після 1-денного культивування середовище заміняли на ОМЕМ з 1095 ЕС5, 195 пеніциліну/стрептоміцину й 10 мкм цитозин-В-О-арабінофуранозиду (бідта Ж С1768). Через 48 годин середовище видаляли й промивали клітини три рази середовищем ОМЕМ. Потім додавали культуральне середовище для 5С, яке складається з ЮМЕМ, 1095 ЕС5, 1 95 пеніциліну/стрептоміцину, 2 мкм форсколіну (Зідта Ж Е6886) і 10 мкг/мл бичачого гіпофизарного екстракту (РЕХ, Іпмігодеп Ж 13028). Середовище міняли кожні 2-3 дня.
Після 8-денного культивування (від 4 до 10 днів залежно від партії клітин) шванівські клітини досягали конфлюентності й культури, які містять велику кількість примісних фібробластів, очищали методом імунопенінга з їйу1.1. Після такого очищення клітини суспендували в середовищі росту при 10000 клітин/см2 у чашках на 75 сме покритих полі-І -лізином. Після досягнення конфлюентності клітини промивали, обробляли трипсином (трипсин-ЕДТА), підраховували й пересіювали в 12-коміркові планшети (100000 клітин на комірку). 1.1.3. Інкубація із препаратами
Після пересіювання клітин в 12 коміркові планшети середовище заміняли середовищем певного складу, яке складається із суміші ОМЕМ-Е12 (Іпмйгодеп Я 21331020) з додаванням 1 95 добавки Ме (Іпийгодеп Я 17502), 1 95 І -глутаміну (Іпмігодеп Ж 25030024), 2,5 95 ЕВ5 (Зсієпсеї! Ж 0025), 0,02 мкг/мл кортикостерону (Зідта Ж С2505), 4 мкМ форсколіну й 50 мкг/мл гентаміцину.
Для посилення диференціювання 5С у це середовище не додавали фактори росту.
Через 24 години середовище заміняли середовищем певного складу (ОМЕМ-Е12) з додаванням 1 95 інсуліну-трансферину-селену -Х (ІТ5, Іпмігодеп Ж 51300), 16 мкг/мл путресцина (Зідта Ж Р5780), 0,02 мкг/мл кортикостерону й 50 мкг/мл гентаміцину. На цій стадії в середовищі не були присутні ні прогестерон, ні форсколін.
Через один день шванівські клітини стимулювали різними комбінаціями препаратів протягом 24 год. (3 комірки на 1 стан). Препарати кожної сполуки готовили безпосередньо перед його додаванням у середовище для культивування клітин.
Препарати вносили в середовище певного складу, яке складається з ЮОМЕМ-Е12 з додаванням 1 95 інсуліну-трансферину-селену-Х (ІТ5, Іпмігодеп Ж 51300), 16 мкг/мл путресцину, 0,02 мкг/мл кортикостерону, 10 нм прогестерону й 50 мкг/мл гентаміцину. Відсутність форсколіну під час стимуляції препаратами запобігає насиченню аденилатциклази. 1.2. Очищення шванівських клітин методом імунопенінга з Тпуї1.1
Для того, щоб запобігти забрудненню культури фібробластами, шванівські клітини очищали методом імунопенінга з використанням клону Тпу1.1 (АТСС ТІВ-103 М),
Покриті антитілом чашки Петрі на 100 мм одержували в такий спосіб: ці чашки промивали бо три рази РВЗ і обробляли 20 мл 50 мМ розчину трис-НСЇ, рН 9,5, з 10 мкг/мл козячого антитіла
МИ проти І9М миші (даскзоп Іттипогезеагспй Ж 115-005-020) протягом ночі при 4 "С, а потім промивали З рази РВ5 і обробляли розчином РВЗ з 0,02 95 бичачого сироваткового альбуміну й супернатантом, отриманим з культури гібридоми Т1107е2 (АТСС й ТІВ-103), що містять антитіло ІЯМ до Тпу1.1, протягом 2 годин за кімнатної температури. Нарешті, чашки три рази промивали РВ5 перед додаванням суспензії клітин.
С відокремлювали за допомогою трипсина-ЕДТА. Як тільки більшість клітин переходила в суспензію, трипсин нейтралізували за допомогою ЮОМЕМ-10 90 ЕВ5З ї центрифугували клітини.
Осад дисоційованих клітин ресуспендували в 15 мл середовища з 0,02 956 В5А при щільності 0,66х105 клітин на мл (максимум) і переносили в чашки Петрі (близько 6,6 млн. клітин/10 мл на чашку в 100 мм).
Суспензію клітин інкубували в покритій антитілом до Тпу1.1 чашці Петрі протягом 45 хв. при 37"С з легким струшуванням кожні 15 хв., щоб запобігти неспецифічному зв'язуванню.
Більшість клітин фібробластів, які експресують Тпу1.1, прилипали на чашку. По закінченню інкубації суспензію клітин витягали й центрифугували. Ця клітинна суспензія по теорії містить тільки шванівськиє клітини. Клітини центрифугували, а осад клітин суспендували в середовищі росту з 10 мкМ форсколіну при 16000 клітин/см? в обробленій полі-І -лізиному чашці 1775 см". 1.3. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскриптазою (2-8Т-РСВ)
Використовували кількісний метод ЗТ-ПЛР для порівняння рівнів МмМРНК РМР22 після стимуляції препаратами відносно "домашньої" рибосомної мРНК І/13 у первинній культурі шванівських клітин пацюків.
Після промивання холодним стерильним РВ5З з кожного зразка клітин екстрагували тотальну
РНК і очищали від 5С за допомогою набору Оіадеп Кпеазу Місго КИ (Оіадеп Ж 74004). Нуклеїнові кислоти визначали на спектрофотометрі МапоЮгор, використовуючи 1 мкл зразка РНК.
Цілісність РНК визначали на приладі ВіоапАПулег (АдіїепО.
РНК піддавали зворотній транскрипції в КДНК за стандартною методикою. Матриці кКДНК для
ПЛР-ампліфікації синтезували з 200 нг тотальної РНК за допомогою зворотної транскриптази зирегзсапрі ІП (Іпийгодеп Ж 18064-014) протягом 60 хв. при 42 "С у присутності оліго (ат) у кінцевому об'ємі 20 мкл.
КДНК піддавали ПЛР-ампліфікації за допомогою системи "Гідпісусіег 480" (Коспе МоїІесшіаг
Зо Бузіетв5 Іпс.). Кожну кКДНК розбавляли в 5 раз перед використанням для ПЛР-ампліфікації. По 2,5 мкл цієї КДНК вносили в розчин для реакції ПЛР (кінцевий об'єм 10 мкл). Попередні експерименти підтвердили, що визначення було кількісним в експонентній фазі процесу ампліфікації для обох послідовностей і що експресія контрольного гена була однорідною за різних умов культивування.
ПЛР-реакцію проводили шляхом ампліфікації РМР22 пацюків з 500 нм прямого праймера (ММ 017037) 5-24СААДАСасСпААТОадОао-3 (5ЕО ІЮ МО: 1) і 500 нм зворотного праймера 5- стстатттаатттаастт-3 (5ЕО ІЮО МО: 2) (ампліфікація 148 п.о.). Паралельно в окремих реакціях проводили ампліфікацію фрагмента КРІТЗА рибосомальної РНК в 152 п.о. (ММ 173340) для нормалізації результатів, використовуючи 500 нМ прямого праймера 5- СтТаСССТСААсатТатоа-3 (5БО ОО МО: 3) і 500 НМ зворотного опраймера 5- сто СсТТоСОатААТОааАТ-З' (ЗЕО ІО МО: 4).
Для проведення аналізу 20-8Т-РСК використовували хімію ЕКЕТ. Зонди для ЕКЕТ складалися з 0,3 мкМ Рітр22-РІ -5-ССТСТОАОСОТОСАТАССОСТАС (ЗЕО ІЮ МО: 5) або Крі13А-
ЕГ-5-ТСООСТОСААСТАССАССС (5ЕО І МО: 6), мічених на 3'"-кінці флуорофором барвника- донора (Ріногеб5сеїіп). Зонди Кедб40 по 0,15 мкМ визначаються в такий спосіб: Рітр22-тед-5'- дасадоссадапйАдааАААССАаАДА (ЗЕО ІО МО: 7) або Крі13А-гед-5'-
ТОАСАССТАСТСТОСАССАСАДАСООБАА (5ЕО ІО МО: 8), позначені по 5'-кінцю флуорофором барвника-акцептора (Кподатіпе Кей 640).
Кожна реакція ПЛР містила 2,5 мкл матриці кКкДНК у кінцевому об'ємі 10 мкл суміші з основного набору (Коспе Ж 04-887301001).
Використовували наступні умови ПЛР: 10 с при 95 "С, 10 спри 63 "С і 12 с при 72"Сізос при 40"С (40 циклів ампліфікації). Відносні рівні експресії гена РМР22 вимірювали за співвідношенням між продуктами, отриманими з гена-мішені РМР22 і ендогенного внутрішнього стандарту КРІ1ЗА. 1.4. Аналіз експресії білка РМР22 методом проточної цитометрії (ГАС)
Через 8 год., 24 год. і 48 год. після інкубації із препаратами виділяли супернатанти, центрифугували й заморожували. 5С відокремлювали за допомогою трипсину-ЕДТА. Як тільки більшість клітин переходила в суспензію, трипсин нейтралізували за допомогою ОМЕМ з 10 95
ЕС5.
Витягали супернатанти із клітинами й центрифугували. Осад клітин переносили в мікропробірки, промивали один раз в РВ5З і фіксували спеціальним розчином (Кеадепі А, Абсу5
ЯвВиРО9В). Через 10 хвилин клітини промивали один раз РВЗ5 і зберігали при 4 "С.
Через 5 днів після фіксації клітин усі препарати клітин з різним часом інкубації мітили за наступною методикою.
Клітини центрифугували при 7000 об./хв. протягом 5 хв., а осад суспендували в розчині для пермеабілізації (Кеадепі В, Абсух ЖВИОРО9В) і мітили первинним антитілом до РМР22 (Арсат Ж абб1220, 1/50) 1 година за кімнатної температури. Потім клітини центрифугували при 7000 об./хв. протягом 5 хв., а клітинні осад промивали один раз в РВ5. Додавали вторинне антитіло, кон'юговане з АІеха Ріног 488 (козяче проти до кролика, МоіІесшаг Ргорез Ж А11008, 1/100), на 1 годину за кімнатної температури. Потім клітини центрифугували при 7000 об./хв. протягом 5 хв., а клітинні осад промивали один раз в РВ5. Мічення підсилювалося при додаванні третинного антитіла, кон'югованого з АІеха Рісог 488 (куряче проти дос кози, МоІесшіаг Ргоре5 Ж А21467, 1/100), на 1 годину інкубації за кімнатної температури. Потім клітини промивали один раз в РВ5.
Для визначення рівня автофлуоресценції ставили контроль без будь-яких антитіл (немічені клітини) і набудовували чутливість фотомультиплікаторів. Для оцінки неспецифічного зв'язування антитіл ставили контроль із вторинним і третинним антитілами, але без первинного антитіла.
Одержання й аналіз даних проводили на цитометрі БАС5З Аттау із програмним забезпеченням ЕАС5 Аітау (Весіоп ОісКіпзоп) на 5000 клітин. Аналізували пряме розсіювання світла (Е5С), яке корелює з об'ємом (розміром) клітин, і бічне розсіювання (5550), яке залежить від внутрішньої складності клітин (гранулярності). Аналіз на експресію РМР22 проводили на загальній кількості клітин і обчислювали відсоток позитивних клітин. Позитивні клітини - це клітини, у яких інтенсивність флуоресценції вища, чим у контролі із вторинним антитілом.
Для кількісного визначення 5С аналізували клітини в контрольному середовищі за допомогою антитіла проти білка 5100.
Клітини готовили за наступною методикою: шванівські клітини фарбували антитілом проти білка 5100 (Оако Ж50311, 1/100) протягом 1 години за кімнатної температури. Це антитіло мітили за методикою, описаною вище для імунного фарбування РМР22, але без інкубації із третинним антитілом. 1.5. Інкубація із препаратами й активність
Препарати інкубували протягом 24 год. або 48 год. у тому ж середовищі певного складу, що й описане вище (по З комірки на 1 стан), за відсутності форсколіну, щоб уникнути насичення стимуляції аденілатциклази, але в присутності 10 нм прогестерону. Після інкубації із препаратами виділяли супернатанти й заморожували шванівські клітини для аналізу методом
О-ВТ-РСВ.
Ці експерименти зведені в табл. 1.
Таблиця 1 2. Оцінка синергійного ефекту сполук в Міх7 на моделі СМТ у спільній культурі
Використовували модель на спільній культурі як модель СМІТА іп міго. Ця модель мієлінізації полягає в спільному культивуванні сенсорних нейронів і шванівських клітин з дисоційованих спинальних гангліїв (ОКО) самців пацюків, трансгенних (ТО) по РМР22.
Метою даного дослідження є оцінка впливу 3-х досліджуваних сполук (- баклофену, налтрексону й сорбітолу) і Міх7 (суміші із цих 3-х препаратів) на процес мієлінізації. Ефект 3-х досліджуваних сполук, а також їх суміші на мієлінізацію оцінювали шляхом визначення експресії основного білка мієліну (МВР) у присутності аскорбінової кислоти. 2.1. Матеріали й методи
Вагітних самок пацюків на 15-й день вагітності забивали шляхом зміщення шийних хребців.
З матки видаляли ембріони, які були на однаковій стадії зародкового розвитку.
2.1.1. Генотипування
Шматочок голови кожного ембріона (3 мм3) поміщали в пробірку на 2 мл, вільну від ДНКази.
ДНК екстрагували за допомогою набору 5УВЕК Сгееп Ехігасі-М-Атр іізвие РОСА Кії (бБідта, Я
ХМАТа-1КТ). На кожний шматочок голови ембріона наносили 120 мкл розчину (з набору Зідта,
Ж ХМАТа-1КТ). Голови інкубували протягом 10 хв. за кімнатної температури. По закінченню цієї інкубації голови інкубували ще 5 хв. при 95 "С у розчині для екстракції. Відразу ж після цієї останньої інкубації додавали 100 мкл нейтралізуючого розчину, кожний екстракт ДНК розбавляли 1/40 стерильною водою ийгариге (ВіозоїЇме, й 91589) і зберігали за температури -47С до використання. Генотипування ембріонів самок (Р) і самців (М) проводили під час препарування ОКО за допомогою набору Разі ЗУВЕ Сгееп Мабзхіег Міх (Арріїєй Віозузіетв, Ж 4385612). Стать кожного ембріона визначали за геном чоловічої статі ЗКУ. Праймери для ЗКУ одержували від Рпагпехі (ЗКУ-Е (ЗЕО Ір МО:9): У-ЧАлсСАпСАаспаСАСААаТтТасао-3 ЗКУ-В (5ЕО
ІЮ МО: 10): 5-4ССТОоСТапАААААсас(асос-3). Праймери для 5КУ розбавляли до 3 мкм стерильною водою иїгариге (Віозоїме, 2 91589). Суміш для ПЛР готували на воді ишйгариге (4 мкл на пробу), праймери при З мкм (2 мкл на пробу) і Мавіег Міх (по 10 мкл на пробу). В 96-коміркові планшети для ПЛР вносили по 16 мкл суміші для ПЛР у кожну комірку. Додавали по 4 мкл кожної розведеної ДНК відповідно до схеми внесення. ПЛР проводили на установці 7500 Раві
ВТ-РСК 5зузіет (Арріїеа Віозуєіетв) за наступною програмою: початок: 20 с при 9570 45 циклів: 10 с при 95 "С, 10 с при 65 "С, 30 с при 72 "С (збір даних).
Крива плавлення: 15 с при 95 "С, 1 хв. при 64 "С, 30 с при 90 "С (безперервний збір даних), 15 с при 60 "С. Графіки ампліфікації й криві плавлення аналізували за допомогою програмного забезпечення 7500 (Арріїей Віозувзіетв).
Результати для кожного зразка порівнювали з негативним контролем (вода иїЇгариге) і позитивним контролем (ТОб/самці й УМТ/самки), щоб зробити висновок про генотип кожного ембріона. 2.1.2. Спільні культури сенсорних нейронів і шванівських клітин
Спинальні ганглії пацюків культивували, як описано в Создауа еї а!., 2002; і Капдага)и еї аї., 2008.
Зо Кожний ембріон поміщали на пронумеровану чашку Петрі (діаметром 35 мм). Відрізали голову зародка, поміщали у вільну від ДНКази пробірку на 1,5 мл; ДНК екстрагували за допомогою набору Ехігасі-М-Атр Тібхзце Кії (Зідта Аїагіст). Проводили генотипування (самці (М) і самки (Р) дикого типу й трансгенні за РМР22) за допомогою набору Разі 5УВК Огееп Махіег
Міх (Аррієй Віозузіет5). Це генотипування проводили паралельно із препаруванням спинальних гангліїв (ОКС), так що після препарування одержували тільки один тип культури (ОКО із трансгенних самців). У кожного ембріона видаляли ОКО і поміщали в крижане середовище Лейбовіца (І 15, Іпмігодеп). По закінченню препарування ОКО з ТОМ поєднували й дисоціювали шляхом обробки трипсином (трипсин-ЕДТА, 0,05 95; Іпмийгодеп) протягом 20 хв. при 37 "С. Реакцію зупиняли додаванням ОМЕМ, що містить 10 96 фетальної телячої сироватки (ЕВ5), у присутності ДНКази І (Коспе). Суспензію ретельно розтирали за допомогою піпетки на 10 мл. Потім клітини центрифугували при 350х9 протягом 10 хв. за кімнатної температури. Осад дисоційованих клітин ресуспендували в середовищі Менигобазаї (Іпмігодеп), що містить 2 Фо В27 (Іпмігодеп), 1 9о пеніциліну-стрептоміцину (Іпмігодеп), 1 95 І -глутаміну й 50 нг/мл МОБ (5ідта).
Це середовище є середовищем для нейронів. Життєздатні клітини підраховували на цитометрі
Мешибрацег за виключенням трипанового синього (5ідта) і висівали по 10000 клітин на комірку в 96-коміркові планшети (Сгеїіпег), оброблені полі-І -лізином. Планшети інкубували при 37 "С в інкубаторі зі зволоженням, в атмосфері 95 95 повітря-5 95 СО». Щодня в культурах нейронів заміняли половину стандартного середовища. Культури підтримували в стандартному середовищі Меигораза! протягом 7 днів, що дає можливість шванівським клітинам заселити аксони сенсорних нейронів. На 7-й день культури заповнювали стандартним нейронним середовищем з додаванням або без 50 мкг/мл аскорбінової кислоти для запуску формування базальної пластинки й мієлінізації. 2.1.3. Інкубація із препаратами
На 7-й день у середовище з 50 мкг/мл аскорбінової кислоти додавали наступні досліджувані сполуки (окремо або в комбінації): " (К5)-баклофен "- налтрексон " О-сорбітол " Міх7 - комбінація з З окремих сполук. 60 Ці сполуки або комбінації сполук тестували за наступних концентрацій (табл. 2).
Таблиця 2
Концентрації окремих препаратів або в комбінації, використовуваної для дослідження експресії МВР іп міїго у спільних культурах ОКО/5С ТО
Налтрексон | 5мкМ | їмкм |2гоонмМ | 40нмМ | 8нмМ / 1.6нм | зголм
Окремі пе п я ПО ПОЛЯ ПОЛЯ ПООЛЯ ПОХОН КОН /Налтрексон | 5мкМ | їмкм |2гоонмМ | 40нмМ | 8нмМ / 16нм | згонм
Міху сашюфен | 5 | тякм | оонм | чонм| вм | тенм | заонм
Досліджувані сполуки інкубували протягом 5 різних відрізків часу: 5, 9, 10, 11 їі 13 днів.
Ставили З окремі й незалежні культури ОКО (з ембріонів самців Тд-пацюків). Ці умови оцінювали в присутності аскорбінової кислоти, по 6 комірок на кожна умову. Робочі розчини всіх досліджуваних сполук готовили ех їетрого з вихідного розчину, що зберігався при -20 "С. Цей розчин готували один раз на тиждень. Половину стандартної нейронального середовища з додаванням досліджуваних сполук і аскорбінової кислоти (кожні в концентрації 1 х) міняли щодня. 2.1.4. Методика фарбування
Після інкубації протягом 5, 9, 10, 11 і 13 днів клітини фіксували холодним розчином етанолу (95 95) і оцтової кислоти (5 95) протягом 10 хв. Клітини пермеабиілізували й блокували РВ5, що містить 0,1 95 сапоніну й 10 95 козячої сироватки, протягом 15 хв. Потім клітини інкубували зі специфічним маркером мієліну: поліклональним антитілом проти основного білка мієліну (МВР) (бідта 118КО431).
Це антитіло виявляли за допомогою міченого АІеха РіІйог 568 козячого антитіла проти дО кролика й міченого Аїеха Рішог 488 козячого антитіла проти ДО миші (Моїесшціаг Ргобе5 687621, 623962). Ядра нейронів мітили флуоресцентним маркером (розчин Ноеспв5і, Зідта Ж В1155). 2.1.5. Обробка даних
Робили по 20 знімків на комірку за допомогою ІпсеїЇ Апаїулег"м 1000 (СЕ Неайсаге) з 20- разовим збільшенням. Усі знімки робили за тих самих умов. Аналіз загальної довжини мієлінізованних аксонів проводився автоматично (довжина й площа навколо аксонів) за допомогою програмного забезпечення ЮемеІорег (ЗЕ Неайпсаге). Усі значення виражали у вигляді середнього значення х 5.е.т. Проводили статистичний аналіз за різних умов (АМОМА з наступним критерієм Фішера РІ 50, коли можна). 2.2. Результати
Синергійний ефект препаратів при дії Міх7
Спостерігався важливий синергійний ефект препаратів, які входять до складу комбінації
Міх7, на експресію МВР. Так, на 10-й день (- 17 день культивування), комбінація (К5)-
Зо баклофену, налтрексону й Ю-сорбітолу значно підвищувала експресію МВР при дозах 1 і 6, як видно з Фіг. ТА ї 2А. Напроти, вищевказані препарати при використанні їх окремо не мали істотного ефекту в порівнянні з контролем (Фіг. 18-00 і 28-0).
Істотний вплив на експресію МВР також відзначалося після 10 днів інкубації при дозах 2, 3, 4, 5 і 7 суміші Міх7 (Фіг. ЗА). Цей ефект також спостерігався на 11-й день при дозах 2-7 (Фіг. ЗВ) у вигляді чіткої кривої у вигляді дзвона.
С. Експерименти іп мімо на моделі СМТ у тварин
Тестували сполуки щодо терапевтичного ефекту на моделі в пацюків.
Експериментальні групи складали з молодих пацюків обох статей окремо. Пацюків розподіляли по групам після рандомізації виходячи з маси тіла. У деяких експериментах рандомізація грунтувалася на показниках пацюків у тесті з перекладиною. Обидві статі були представлені окремими контрольними групами, які за чисельністю були рівними або більшими, ніж дослідні групи.
Пацюків піддавали хронічній обробці препаратами шляхом примусової годівлі або введення за допомогою осмотичного підшкірного насоса Аї2еї (Юигесі Согрогайоп, Сирегіпо, СА), залежно від біодоступності кожного препарату, протягом 3 або б тижнів. У всіх експериментах, які проводилися іп мімо, Міх7 уводили гаважем.
Тварин зважували два рази на тиждень, щоб підганяти дози до зростаючої ваги тіла. Якщо для введення препаратів був обраний осмотичний насос, то дози препаратів розраховували на основі розрахункової середньої ваги тіла тварин, очікуваної для їхнього віку протягом строку роботи насоса (б тижнів). За необхідності насоси повторно імплантували, із проведенням належної анестезії.
Поведінкові тести
Кожні три або чотири тижні тварин піддавали поведінковим тестам. Кожний тест проводився тим самим дослідником у тій же самій кімнаті і у той ж саме час доби; ця однорідність зберігалася протягом усього експерименту. Усі процедури й визначення генотипу були сліпими для дослідника. В основному для оцінки показників протягом всього дослідження використовувався "тест на перекладині" і тест на "силу хватання". Графік проведення тесту на перекладині міг змінюватися відповідно до росту тварин (щоб уникнути зсуву, наприклад, через навчання).
Визначення сили хватання дозволяє виявляти тонкі відмінності в показниках хватання, які полягають у м'язовій силі, ступеню чутливості (наприклад, больові тактильні відчуття можуть змінювати вимірювані значення сили), поведінковому компоненті ("мотивація"). Значення для передніх і задніх кінцівок відрізняються й сильно залежать від віку тварин.
У тесті на силу хватання вимірюється сила, з якою тварина тримається за захват передніми або задніми лапами окремо. До захвату прикріплений динамометр для вимірювання сили (Рогсе
Сацдє ГС-5000А). Експериментатор тримає пацюка таким чином, що він тримається за захват передніми або задніми лапами, і обережно тягне його назад доти, допоки він не відпустить захвату. Реєструється сила, зафіксована при відпусканні захвату твариною.
Проводили два послідовні випробування для вимірювання сили передніх лап і два послідовні випробування для вимірювання сили задніх лап в однієї тварини; відзначалися (в М) тільки максимальні показники (один для передніх лап і один для задніх).
Тест на перекладині
У тесті на перекладині оцінюється здатність пацюків утримуватися на закріпленому стрижні.
Зо Пацюки Рітр22, у яких проявляється м'язова слабість, демонструють погані показники в цьому тесті (Зегеда еї аіІ., 1996). Пацюка поміщають на всіх чотирьох лапах на середині стрижня (діаметр: 2,5 см, довжина: 50 см, на 30 см вище столу). Випробування проводяться послідовно; кількість і тривалість випробувань в експериментах залежить від партії тварин. Така варіабельність при тестуванні була введена для того, щоб визначити належну схему для найкращого виявлення рухових дефектів у пацюків з СМТ у ході експериментів.
У кожному сеансі відзначали наступні показники: - кількість випробувань, необхідна для утримання на стрижні протягом 60 с (або 30 с для партії 1, сесія 1 і2); - час, проведений на перекладині (тобто латентність до падіння) у кожному випробуванні й у середньому за сеанс. У тих експериментальних процедурах, коли сеанс закінчується після того, як пацюк протримається на перекладині протягом граничного часу, тобто 30 або 60 с, незавершеним випробуванням присвоюються показники граничного часу (30 с або 60 с) (напр., для партії 8, у тварин, які протрималися на перекладині менше 10 с при 1, 2 і З випробуванні, а потім 60 с при 4 і 5 випробуванні, випробуванням від Є до 10 привласнюється значення 60 с); - кількість падінь.
Оцінка загального стану здоров'я
У тварин протягом усього експерименту відслідковували вагу тіла й зовнішні ознаки (шерстний покрив, постава, хода, тремор та ін.). Для оцінки використовували наступну шкалу: 0 - у нормі, 1 - не в нормі.
Хода
Кожного пацюка спостерігали в новій щурячій клітці (розміром 55х33х18 см) без підстилки протягом 5 хвилин. Ходу пацюків оцінювали за 4-бальною шкалою: - 0 балів: нормальна хода (рівна) - 1 бал: аномальна хода (нерівна або ж пацюк трохи кульгає) - 2 бала: помірна нездатність (пацюк волочить лапу, але здатний поставити її правильно й ходити) - З бали: серйозна нездатність (пацюк волочить одну або обидві задні лапи й не здатний поставити ї/їх правильно).
Тест на похилій площині
Обладнання для ковзання має пластину 30х50 см з оргскла, яка може нахилятися під кутом від 0" (горизонтально) до 60". Кожного пацюка спочатку поміщали на похилу пластину під кутом 257 у положенні вгору головою (орієнтація головою вгору); проводили два випробування з інтервалом в 1 хв. Через 30 хв. той же самий експеримент проводили на похилій пластині під кутом 35, а потім на похилій пластині під кутом 40". На цей час пацюка повертали в клітку.
Пластину чистили після кожного випробування.
Показники пацюків оцінювали за 4-бальною шкалою: - О балів: немає ковзання - 1 бал: невелике ковзання (одна або дві лапи) - 2 бала: помірне ковзання (4 лапи), але не до самого кінця пластини - З бали: пацюк сковзує до самого низу пластини.
Інші випробування
Коли потрібно, пацюків піддавали електрофізіологічній оцінці, гістологічному дослідженню й визначали рівень експресії РНК ртра22 у сідничних нервах.
Визначення РНК рітр22 у сідничних нервах кількісним методом ЗТ-ПЛР
Виділяли тотальну РНК із лівих сідничних нервів за допомогою Оіа7о! (Ж 79306, Оіадеп
Стр, Німеччина), а потім одностадійним методом очищення за допомогою набору Кпеазу Міпі
КИ (Ж 74106, Оіадеп Стр, Німеччина) відповідно до протоколу виробника (Оіадеп-гтеазу
ЕРіргои5 Тіззце Напароок). Домішку ДНК видаляли шляхом розщеплення вільної від РНКази
ДНКазою І за допомогою набору ЮОМА-їїтєе Кіїї (Оіадеп-тпавзе-їтеє Опабзе зеї 1500 Кипіїв, й 1023460).
Концентрацію РНК визначали на приладі МапоОгор МО-1000, а перевірку на контроль якості проводили за допомогою наночипів Адіїепі КМА 6000 на приладі Адіїепі 2100 ВіоапАТуег.
Зворотна транскрипція й ПЛР у реальному часі: проводили кількісний ЗТ-ПЛР (КТ-О-РСЕ) у такий спосіб: 80 нг тотальної РНК піддавали зворотній транскрипції за допомогою зворотної транскриптази Зирегзогірі м || (Іпмігодеп, Сагізрайд, СА) з оліго(дТ)12-18 (Іпийтодеп, Сапзраа,
СА) у реакційному об'ємі 20 мкл.
ПЛР у реальному часі проводили за допомогою системи швидкого термоциклера (Сідпсусіего 480 ІІ, 384-меїіЇ, Коспе, Швейцарія). Ампліфікація проводилася в загальному об'ємі
Зо 10 мкл при оптимізованій концентрації праймерів від 130 нМ до 1 мкМ. Разом із праймерами й матрицею додавали І ідпісусіеєг 480 5УВК Огееп І Мавіег (конц. 2х, Коспе, Ж 04 887 352 001).
До складу суміші входили нуклеотиди, МасСі», ДНК-полімераза Тад і буфер. Методика ампліфікації включала початкову інкубацію при 95"С протягом 10 хв. для активації ДНК- полімерази Тад, а потім 45 циклів, що складаються із денатурації при 95 "С протягом 10 с, відпалювання при 60 "С протягом 40 с і нарощування при 72 "С протягом 10 с (після закінчення періоду нарощування при 72 "С проводили детектування флуоресцентного продукту в режимі одноразової реєстрації), і закінчувалася циклом кривої плавлення з денатурацією при 957 протягом 5 с, віджигом при 63 "С протягом 60 с і далі до 95 "С (від 63 "С до 95 "С швидкість зростання становила 0,11 "С/с, а детектування флуоресцентного продукту було безперервним).
Для перевірки специфічності ампліфікації продукти ПЛР від кожної пари праймерів піддавали аналізу за кривою плавлення. Відносну кількісну оцінку проводили на основі точки перетину (значення Ср) для кожного зі зразків ПЛР. "Точкою перетину (Ср) зразка" називається точка, у якій флуоресценція зразка піднімається вище фонової флуоресценції. Для нормалізації використовували ген білка 7его мієліну (МР) Кайниє5 погмедісиє (Зегеда еї аї., 2006).
Послідовності праймерів (синтезованих на фірмі Еигоїйп5 МУУС Орегоп, Німеччина), які використовувалися для аналізу ЕТ-О-РСВ:
РМР22 - пряма: 5 -ТаТтТАССАСАТССОЯССТТОИса-3' (ЗБОЮ МО: 11) і
РМР22 - зворотня: 5 -САЛСаСТасйсСАсСААсСААСАСИААС-З3 (ЗЕО ІЮ МО: 12);
МРА - пряма: 5 - ТОТТИаСТОСТаттастотто-3' (5ЕО ІЮ МО: 13) і
МРА - зворотня: 5 - ІПОаТаАААТТТОСССТТОТОО-3 (ЗЕО ІЮ МО: 14).
Результати
Композиція Міх1 поліпшує показники в тесті на перекладині протягом всієї обробки (Фіг. 4).
Міх1 поліпшує показники ходи в трансгенних пацюків після З і 6 тижнів обробки, як видно з
Фіг. 5.
Міх1 підвищує показники в трансгенних пацюків після 3, 6, 9 і 12 тижнів обробки в тесті на похилій площині при 25, представленому на Фіг. 6.
На Фіг. 7 представлений позитивний ефект Міх2 на показники трансгенних пацюків у тесті на похилій площині при 25, 35 і 40".
Міх7 (доза 3) значно знижує експресію РНК гена ртр22 у сідничних нервах пацюків, бо трансгенних за ртр22 (Фіг. 9).
У пацюків ртр22, які одержували Міх7 (доза 2 і доза 3), поліпшуються показники в тесті на похилій площині при 35" (Фіг. 10). Зокрема, 29 і 33 95 пацюків відноситься до групи з гарними показниками в порівнянні з 5 95 у групи ТО із плацебо, а 29 і 11 95 пацюків відноситься до групи з поганими показниками в порівнянні з 60 95 у групи ТО із плацебо. Значення р (при порівнянні з
ТО ж плацебо) дорівнювало 0,0152 в ТО пацюків, які одержували Міх7 у дозі 2, і воно дорівнювало 0,002 в ТО пацюків, які одержували Міх?7 у дозі 3, у порівнянні з ТО ж плацебо).
Міх7 у дозі З значно підвищує латентність до падіння в пацюків ртр22 у тесті на перекладині після 9 тижнів обробки (Фіг. 11): чорна пунктирна лінія, р - 4,56-10-7, пе18. Також спостерігається значна відмінність між ТО пацюками з плацебо (чорна проста лінія, п-20) і пацюками М/Т з плацебо (сіра проста лінія, р-3,82-10-7, п-18).
На Фіг. 12 представлене поліпшення сили хватання в пацюків ртр22, оброблених Міх7 у дозі 3.
На Фіг. 13 представлена істотна кореляція між латентністю в тесті на перекладині (після 9 тижнів обробки Міх?7 у дозі 3) і рівнем експресії РНК ртр22.
На Фіг. 14 представлена істотна кореляція між латентністю в тесті на перекладині після 9 тижнів обробки Міх?7 у дозі З і швидкістю проведення чутливого нерва (хвіст).
Аналогічні результати отримані для інших комбінацій (див. табл. 3).
Таблиця З пацюків РМР22
Ці дані показують, що іп мімо комбінації й схеми лікування запропонованого винаходом дозволяють ефективно лікувати СМТ.
О. Ефекти іп мімо на моделі токсичної невропатії
Препарати або композиції вводили перорально, починаючи за 1 день до першого внутрішньоочеревинного введення оксаліплатину З мг/кг (0-1) ії до 1 дня перед останнім випробуванням (016). Тварини, які належать до групи обробки оксаліплатином, одержували щодня дистильовану воду (10 мл/кг). Тварини одержували досліджувані препарати й дистильовану воду щодня в ранкові години, тоді як оксаліплатин уводили після обіду.
У дні тестування (тобто 01, 04, 010) препарат і дистильовану воду вводили після
Зо випробування. Що стосується дня тестування (04), включаючи введення сполук і носіїв і ін'єкції оксаліплатину, то препарат і дистильовану воду вводили перед ін'єкцією оксаліплатину після випробування. Тварини з контрольної групи одержували обробку тільки в дні тестування (тобто р1,04, 010 ї 017).
Холодову алодинію оцінювали шляхом вимірювання реакції на теплову неноцицептивну стимуляцію (ацетоновий тест) на день О1 (близько 24 год. після першої ін'єкції оксаліплатину З мг/кг (гострий ефект оксаліплатину), у дні 04, 010 (хронічний ефект оксаліплатину) і в 017 (залишковий ефект оксаліплатину через 1 тиждень після завершення лікування).
Тестування проводили за допомогою ацетонового тесту через 2 год. після введення контрольної речовини. Контрольна речовина - габапентин, 100 мг/кг, рег о5 (раз на день х 4 дня тестування).
Ацетоновий тест
Холодову алодинію оцінювали за допомогою ацетонового тесту. У цьому тесті визначається латентність відсмикування задньої лапи після нанесення краплини ацетону на поверхню підошов обох задніх лап (час реакції) і оцінюється інтенсивність реакції (холодовий показник).
Час реакції на охолодний ефект ацетону виміряється в межах 20 с (межа) після нанесення ацетону. Реакція на ацетон також класифікується за наступною 4-бальною шкалою: 0 (немає реакції); 1 (швидке відсмикування, змах лапою); 2 (тривале відсмикування або помітне струшування лапи); З (кількаразове струшування лапи з облизуванням або покусуванням).
Проводили шість випробувань на 1 пацюку. Для кожної експериментальної групи результати виражали у вигляді кумулятивного холодового показника, вираженого як загальна сума 6 оцінок для кожного пацюка їх ЗЕМ. Мінімальний показник дорівнює 0 (немає реакції при жодному з 6 випробувань), а максимально можливий показник дорівнює 18 (кількаразове струшування й облизування або покусування лап при кожному з 6 випробувань).
Джерело габапентину: 2Пеї|іапд Спіга! Медісіпе Спетісаї!5, Китай.
Джерело оксаліплатину: Зідта, Франція.
Результати представлені на Фіг. 8. Вони чітко показують захисний ефект запропонованих винаходом композицій на індуковану оксаліплатином невропатію.
Е. Дія іп мімо на моделі АЇ 5
Модель на тваринах
Для відтворення патології бічного аміотрофического склерозу вибрали модель на пацюках 5ОЮТО9ЗА (створена Ноулапа еї а). У цій моделі мутантний ген 5001 гіперекспресується в спинному мозку, багатьох ділянках головного мозку, а також у периферійних тканинах. Початок захворювання рухових нейронів у цій моделі виникає приблизно через 115 днів; воно проявляється у вигляді аномальної ходи задніх кінцівок. Через кілька днів виникає параліч задніх кінцівок.
Експериментальні процедури
Одержували колонії при схрещуванні пацюків-плідників 5О01593А із самками пацюків
Зргадиє Юаулеу. Гетерозиготних пацюків 5001293А ідентифікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ДНК із хвоста із праймерами, специфічними для Я5ОО1 (1). Тварин утримували в кімнаті з контрольованим освітленням (світло з 05:00 до 19:00) і температурою (23:41 "С) і з вільним доступом до їжі й води. Усі процедури на тваринах у даному дослідженні проводилися відповідно до стандартних рекомендацій з догляду за тваринами.
Щотижня проводили вимірювання ваги, а в б0о-денному віці починалися поведінкові тести й тривали до кінцевої точки. Препарати вводили щодня перорально або підшкірно, починаючи з
Б-тижневого віку.
Тест методом спостереження: характеристика загального аспекту
Кожного пацюка піддавали спостереженню в новій клітці для пацюків (розміром 55х33х18 см) без підстилки протягом 5 хвилин. Реєстрували п'ять різних параметрів.
Хода
Зо - О балів: нормальна хода (рівна) - 1 бал: аномальна хода (нерівна або ж пацюк трохи кульгає) - 2 бала: помірна нездатність (пацюк волочить лапу, але здатний поставити її правильно й ходити) - З бали: серйозна нездатність (пацюк волочить одну або обидві задні лапи й не здатний поставити її/їх правильно).
Шерстний покрив - О балів: чиста й шовковиста шерсть - 1 бал: скуйовджена або брудна шерсть
Тремор - О балів: немає тремору - 1 бал: є тремор
Положення тіла - О балів: нормальне - 1 бал: аномальне (прогнута або вигнута спина).
Положення задніх лап - О балів: нормальне - 1 бал: витягнуті задні лапи
Тест на рухові показники: характеристика рухового дефекту
У цьому тесті оцінюється здатність пацюків до відновлення положення тіла в межах 30 с після перекидання на будь-яку сторону (випрямний рефлекс (Заїйе еї а!.).
Використовували непараметричну систему бальної оцінки за наступними критеріями (Маїзитоїго єї аї., Гпопної еї аї.): - О балів: пацюк не може підвестися з обох боків протягом 30 с - 1 бал: пацюк не може підвестися тільки з одного боку протягом 30 с - 2 бала: пацюк здатний підвестися з обох боків протягом 30 с, але не може стояти в клітці; він постійно волочить якісь частини тіла - З бали: пацюк здатний підвестися з обох боків протягом 30 с, але не може стояти в клітці й не волочить деякі частини тіла - 4 бала: пацюк здатний підвестися з обох боків протягом 30 с, може стояти в клітці, але має бо видимі функціональні дефекти
- 5 балів: пацюк здатний підвестися з обох боків протягом 30 с, може стояти в клітці й не має видимих функціональних дефектів.
Кінцева точка хвороби фіксується при 0 балів; після цього пацюка забивали.
Тест на похилій площині: характеристика рухового дефекту
Обладнання для ковзання має пластину 30х50 см з оргскла, яка може нахилятися під кутом від 0" (горизонтально) до 60". Кожного пацюка спочатку поміщали на похилу пластину під кутом 257 у положенні вгору головою (орієнтація головою вгору); проводили два випробування з інтервалом в 1 хв. Через 30 хв. той же самий експеримент проводили на похилій пластині під кутом 35, а потім на похилій пластині під кутом 40". На цей час пацюка повертали в клітку.
Пластину чистили після кожного випробування.
Показники пацюків оцінювали за 4-бальною шкалою: - О балів: немає ковзання - 1 бал: невелике ковзання (одна або дві лапи) - 2 бала: помірне ковзання (4 лапи), але не до самого кінця пластини - З бала: пацюк сковзає до самого низу пластини.
Тест із дротяною сіткою: характеристика рухової здатності в складній ситуації
У контакті з ящиком нагорі (під кутом 707) і краєм стола внизу поміщали дротяну сітку.
Кожного пацюка ставили на нижню частину сітки й мотивували підніматися наверх, поміщаючи інших пацюків того ж приплоду у ящик нагорі. Кожний пацюк проходив навчання один раз на тиждень (З випробування).
Реєстрований параметр - латентний час до досягнення верхньої частини дротової сітки.
Тест у відкритому полі: характеристика рухової активності
Вимірювали рухову активність у ящику із плексигласу (45х45х30 см, Асії-Ттаск фірми
Віозеб, Гуоп, Франція) з 16 фотоелементами, спрямованими по двом осям, на 1 і 5 см над підлогою.
Оцінювали спонтанну й дослідницьку активності кожного пацюка протягом З годин.
Реєстрували 4 параметра (загальна пройдена відстань, кількість стійок на задніх лапах, відсоток пройденої відстані й час, проведений в центрі відкритого поля).
РЕ. Ефект іп мімо на моделі механічного пошкодження нерва шляхом передавлювання сідничного нерва
Передавлювання сідничного нерва одержало широке визнання як діюча модель для оцінки регенерації нервів. На цій моделі пошкодження нерва приводить до швидкого порушення функції нерва, про що свідчить вимірювання викликаних потенціалів дії в м'язах (СМАР5), що виникають при стимуляції пошкодженого сідничного нерва.
Пошкодження нерва характеризується зниженням проведення нервом сигналу, який приводить до підвищення латентності при генерації СМАР і до ослаблення сили потенціалу дії, що веде до зменшення амплітуди й тривалості. Це приводить до вираженої дисфункції ходи.
Передавлювання нерва
Мишей СО-1 (Спагіебх Кімег, тварини без захворювань) анестезували за допомогою ізофлурану (2,5-3 9о у повітрі). Вистригали праве стегно й оголювали сідничний нерв на рівні середини стегна (на 5 мм проксимальніше від біфуркації сідничного нерва), який передавлювали двічі протягом 10 с за допомогою мікропінцета (НоїКех, РЗ35311) з розворотом на 907 між кожним здавлюванням. У несправжньо-прооперованих тварин сідничні нерви оголювали, але не передавлювали. Нарешті, шкірний розріз стягували хірургічними дужками.
Перше введення Міх7 у дозі З проводили через 30 хв. після передавлювання. З 1-го по 42-й день уведення проводили раз на день. У дні тестування мишей обробляли (10 мл/кг) за 1,5 год. перед реєстрацією СМАР. Для експериментів по рознесенню ваги тваринам уводили тіх?7, баклофен 600 мкг/кг, налтрексон 70 мкг/кг, О-сорбітол 21 мг/кг, а тестування проводили на 13-й день.
Електрофізіологічні вимірювання
Електрофізіологічні вимірювання проводили через 30 днів після передавлювання нерва на електроміографі Кеуроїпі (ЕМО) (Медійгопіс, Франція) Мишей анестезували 2,5-3 95 ізофлураном, а для стимуляції й реєстрації використовували підшкірні монополярні голкові електроди. Для стимуляції сідничного нерва (із проксимальної сторони від пошкодження) подавали супрамаксимальні (12,8 мА) прямокутні імпульси в 0,2 мс. Правий сідничний нерв (іпсілатеральний) стимулювали одиночним імпульсом, який подавався на сідничну вирізку.
СМАР реєстрували через голкові електроди, вставлені в литковий м'яз. Визначали амплітуду (мкВ) потенціалу дії, яка відбиває рівень денервації й реінервації м'язів (Фіг. 15, панель А).
Морфометричний аналіз
Через 42 дні після пошкодження витягали великогомілкові нерви в б мишей на групу (описані вище) для проведення морфометричного аналізу в такий спосіб: одержували композитне зображення всього зрізу нерва з кожного зразка за допомогою оптичного мікроскопа (Мікоп Оріїрпої-2), оснащеного цифровою камерою (Мікоп Ю5-РЇ1). Проводили морфометричний аналіз цифрових зображень за допомогою програми Ітаде-Рго Різ (Медіа Субегпеїйсв Іпс.,
О5А), яка обчислює піксельні розміри аксонів і мієліну після індивідуалізації кожного мієлінового волокна за сірою шкалою пофарбованої толуідиновим синім мієлінової оболонки. Це дозволяє визначити калібр аксона (Фіг. 15, панель В) і О-співвідношення, тобто співвідношення між внутрішнім діаметром аксонів і зовнішнім діаметром нервового волокна (тобто товщину аксона т мієліну). Баланс між о-співвідношенням і діаметром аксона є показником мієлінізації нейронів (Фіг. 15, панель С).
Рознесення ваги на задніх кінцівках
Оцінювали розподіл ваги тварин (мишей СО1) на чотири кінцівки на 13-й день за допомогою тесту на динамічне рознесення ваги (Віобзер, Франція). Цей тест на покаліченість полягає в безперервному визначенні всіх точок тиску, який створюється твариною, яка вільно рухаються, що дозволяє проводити кількісну оцінку дисбалансу розподілу ваги, спричиненого пошкодженням нерва. Кожну мишу поміщали в клітку 11х11х22 см із гратами з 44х44 чутливих елементів на підлозі. Тиск на чутливі елементи, створюваний лапами тварини, реєстрували із частотою 10 Гц протягом 5 хв. Тиск і пороги детектування на поверхні визначалися автоматично для кожної тварини за допомогою програмного забезпечення ЮБупатіс угеідні Беагіпд 1.3.2 Н (Віозер, Франція). Після співвіднесення вручну кожної точки тиску до відповідної лапи розраховували середню вагу, яка припадає на кожну лапу, і співвідношення несучих поверхонь.
Нарешті, оцінювали однобічну дисфункцію ходи зі співвідношення ваги і несучих поверхонь в іпс/контралатеральних задніх лап (Фіг. 17, панель А).
Результати
Відзначалося значне поліпшення амплітуди СМАР (на 84 95, Фіг. 15, панель А) у порівнянні із тваринами з пошкодженням нерва без обробки, причому вже після З-тижневої обробки, що свідчить про прискорене функціональне відновлення нервів. Морфометрический аналіз також показує значне збільшення калібру аксонів (приблизно на 30 95 після б-тижневої обробки, Фіг.
Зо 15, панель В), що є показником посилення росту нервів. Таке поліпшення морфологічних і електрофізіологічних характеристик нервів свідчить про регенерацію нервів, яку запускає тіх7.
При обробці композицією запропонованою винаходом також спостерігається нормалізація мієлінізації аксонів. Нормальний стан мієлінізації характеризується майже рівномірною мієлінізацією аксонів, яка характеризується постійним С-співвідношенням, незалежно від діаметра аксонів (Фіг. 15, панель С, чорна горизонтальна лінія). Пошкодження нерва при здавлюванні, як зазначено вище, приводить до значного порушення мієлінізації аксонів. Через 42 дня після пошкодження відзначалася гіпермієлінізація дрібних аксонів (невеликого діаметра) поряд з гіпомієлінізацією великих аксонів у порівнянні з несправжньо-прооперованими тваринами; що дає позитивну кореляцію між б-співвідношенням і діаметром аксонів (Фіг. 15, панель С, чорна пунктирна лінія з позитивним нахилом).
При обробці Міх7 спостерігається нормалізація мієлінізації аксонів через 42 дня після пошкодження нерва (Фіг. 15, панель С, сіра лінія), про що свідчить розподіл б-співвідношення залежно від діаметра аксонів, що має проміжний нахил у порівнянні з несправжньо- прооперованими тваринами (чорна лінія) і із тваринами з пошкодженням нерва без обробки (пунктирна чорна лінія).
Ці результати підкреслюють великий потенціал композицій запропонованих винаходом щодо поліпшення й/або прискорення відновлення пошкоджених нервів, впливаючи на мієлінові оболонки (у мієлінізованих нейронів) або електрофізіологічні функції й/або цілісність аксонів.
Як видно з Фіг. 17 (панель В), Міх 7 також ефективна при відновленні функціональної поведінки мишей з пошкодженими нервами, тоді як окремо препарати не проявляють ніякого впливу на рухові порушення, викликані здавлюванням нерва (панелі С, О, Е), тим самим підкреслюючи особливу ефективність комбінованої терапії баклофен-сорбітол-налтрексон.
Таким чином, запропоновані винаходом композиції особливо ефективні для корекції пошкодження нервів шляхом посилення регенерації нервів. б. Ефекти запропоновані винаходом композиції іп мімо при оцінці в клінічному випробуванні
Позитивні ефекти композицій запропонованих винаходом на хворобу СМТ перевіряли в клінічних випробуваннях, зареєстрованих як Ецагаст 2010-023097-40 і як МСТ10401257 у базі даних СіїпісаІТгіаїє.дом. Це випробування тривало один рік у вигляді подвійного сліпого, рандомізованного, контрольованого за плацебо дослідження фази 2.
Головною метою дослідження була оцінка безпечності й переносимості Міх7 у пацієнтів, які страждають на хворобу СМТ. Другорядні цілі були спрямовані на попередній аналіз ефективності Міх7 для використання при організації подальших досліджень на пацієнтах.
Методи
Пацієнти, рандомізація й сліпий метод
Потенційно придатних піддослідних піддавали оцінці при відвідуваннях для скринінга для підтвердження діагнозу СМІТА, а саме: перевірка генотипування СМІТА, реєстрація показника невропатії Шарко-Марі-Тута (СМТМ5, ЗПу еї аї., 2005), оцінка за загальною шкалою обмежень при невропатії (ОМІ 5, сгапат еї аї., 2006).
Пацієнтів жіночої й чоловічої статі у віці 18-65 років, з діагнозом СМІТА згідно із клінічним обстеженням і перевіркою за генотипуванням, слабкістю принаймні при згинанні ноги й показником невропатії Шарко-Марі-Тута (СМТМ5) х 20 розподіляли випадковим чином у співвідношенні 1:1:1:1 на одержання щодня протягом одного року плацебо або суміші Міх7 (85)-баклофен: 6 мг/день, налтрексон: 0,7 мг/день, ЮО-сорбітол: 210 мг/день). Використовували блокову схему рандомізації з розшаруванням із центру дослідження. Усі дослідники й пацієнти нічого не знали про призначення лікування.
Безпечність, переносимість, дотримання приписів
Безпечність суміші в ході дослідження, включаючи перевірочне відвідування через 1 місяць після останнього дня введення Міх7, контролювали на основі повідомлень про негативні явища від пацієнтів і лабораторних випробувань. Дотримання приписів перевіряли при кожному відвідуванні (1, 3, 9 ї 12 місяців) шляхом підрахунку, повернутих порожніх флаконів і вимірювання об'єму. Середня (50) тривалість лікування в цілому становила 11,69 (1,53) місяців і була однакова між групами, а середній рівень дотримання призначень (50) препаратів становив 97,3 (9,41)965.
Електрофізіологічні аналізи
Проводили дослідження провідності нервів за стандартними методиками, за температури шкіри 32 "С. Аналізували й сенсорні, і рухові функції в серединних і ліктьових нервів недомінантної верхньої кінцівки.
Для рухових параметрів (амплітуди сумарного потенціалу дії в м'язах (СМАР, у мілівольтах)
Зо і дистальної моторної латентності (ОМІ, у мілісекундах) стимулювали серединний нерв на зап'ясті й у ліктьовій ямці, а відповіді реєстрували над араисіог роїїсі5 ргемі5. Ліктьовий нерв стимулювали на зап'ясті й нижче від ліктя, а відповіді реєстрували над ардисіог аідйні тіпіті.
Для сенсорних параметрів (амплітуди потенціалів дії сенсорних нервів (ЗМАР, у мілівольтах) і швидкості сенсорної провідності (ЗСУ, у метрах за секунду) використовували антидромний метод і стимулювали нерви кільцевими електродами, поміщеними на зап'ястя. Для серединного нерва активний електрод поміщали на основу другого пальця, а електрод порівняння - між четвертою й п'ятої п'ястковою кісткою другого пальця. Для ліктьового нерва активний електрод поміщали на основу п'ятого пальця, а електрод порівняння - між четвертою й п'ятою п'ястковою кісткою п'ятого пальця.
Показник невропатії Шарко-Марі-Тута (СМТМ5)
СМТМ5 був запропонований і підтверджений Зпу еї аЇ. (2005) як єдина й надійна міра ступеню важкості СМТ". На цей час він є єдиною специфічною мірою наслідків СМТ (хоча й не специфічною для СМІТА). СМТМ5 є 36-бальною шкалою на основі 9 пунктів, включаючи 5 за порушеннями (сенсорні симптоми, чутливість до болю, тремор, сила рук і ніг), 2 щодо обмеження активності (рухові симптоми рук і ніг) і 2 за електрофізіологією (амплітуда ліктьового
СМАР ії З5МАР). Більш високі оцінки означають погіршення функції, а показник класифікує інвалідність як легку (0-10), помірну (11-20) або важку (21-36).
Загальна шкала обмежень при невропатії (ОМІ 5)
ОМІ 5 була виведена з 0055 і поліпшена Бу Сгапат апа Ниднпез (2006) для вимірювання обмежень у повсякденній активності верхніх кінцівок (оцінка за 5-бальною шкалою) і нижніх кінцівок (оцінка за 7-бальною шкалою). Загальна оцінка коливається від 0 (- немає інвалідності) до 12 (- максимальна інвалідність). Хоча на працездатність пацієнтів з периферійною невропатією можуть вплинути й інші фактори, крім фізичних можливостей, за
ОМІ5 визначається здатність пересуватися й вести нормальне життя, як вона відчувається пацієнтом, тому вона повинна асоціюватися з якістю життя.
Статистичний аналіз
Статистичний аналіз проводили за допомогою програми К версії 3.0.1 або більш пізньої (пр //стап.г-рго|їесі.огд). Попередньо оцінювали розподіл даних і внутрішньогрупові коливання, щоб забезпечити методологічний вибір (Магкому»кі еї аї., 1990; Зау/Іому5кКі 4. Віаїг; Міскеге, 2005). 60 У припущенні, що відсутні дані мають випадковий розподіл (МАК, ГіШе 2 Кибіп, 2002),
проводили заповнення відсутніх даних розрахунковими згідно змішаної моделі, що вважається найбільш придатним методом для лонгітюдних досліджень за принципом іпепіїоп-гю-ігеаї (Спактаропу 5 Си, 2009). Для перевірки на чутливість проводили порівняння з результатами без заповнення відсутніх даних. Статистичні тести проводилися на рівні значимості 5 95.
Аналіз популяції
Усі аналізи проводилися на повній вибірці за принципом іпіепіоп-ю-їгеаї, що включає всіх рандомізованних пацієнтів, які приймали хоча б одну дозу Міх7 і здійснили хоча б одне вимірювання ефективності після вихідного моменту.
Аналіз на вихідному рівні
Характеристики пацієнтів на вихідному рівні піддавали описовому порівнянню між групами й аналізували за точним критерієм Фішера або методом дисперсійного аналізу (АМОМА).
Аналіз безпечності й переносимості
Аналіз безпечності й переносимості грунтувався на повідомленнях про негативні явища, які виникають при лікуванні та іншої інформації, яка стосується безпечності (дані лабораторних аналізів, основні показники організму й ЕКГ). Частоту негативних явищ (Теає5), які виникають при лікуванні, піддавали описовому порівнянню між групами й аналізували за точним критерієм
Фішера.
Аналіз ефективності
Відмінності між групами визначали методом коваріаційного аналізу (АМСОМА) за логарифмічно перетвореними значеннями з поправкою на вихідні значення. Оцінки були представлені у вигляді середнього відсотка змін від вихідного рівня. Цей аналіз проводився незалежно за різними результуючими ефективністі. Внаслідок множинності результуючих значимість ефекту лікування на два основні результати - СМТМ5 і ОМІ 5 визначали за тестом
ОІ/ 5 ОБрайена (О'Вгіеєп, 1984; Годап 5 Татпапе, 2006). Цей аналіз повторювали для інших результуючих ефективності (ОМ, 5СМ). Сприйнятливими до терапії визначалися ті пацієнти, стан яких не погіршився за 12 місяців лікування. Погіршення визначали за відсотками змін від вихідного рівня в середньому за СМТМ5 і ОМІ 5. Частки сприйнятливих у кожній групі порівнювали на моделі логістичної регресії. Відносні ризики виводили з оцінки співвідношення шансівзб6, Статистичні критерії при аналізі ефективності були однобічними. Однобічний підхід
Зо був виправданий за клінічними підставами (малоймовірність гіпотези шкідливого впливу за ефективністю або безпечністю внаслідок украй низької дози сполук, які комерційно використовуються у набагато більш високих дозах) і статистичної ефективності (І ем/і5 еї аї., 2013; Ранікн еї а!., 2011; Оє дадег еїаї., 2010).
Результати
Безпечність й переносимість
Результати щодо безпечності й переносимості Міх7/ були гарними, тому що прийом препарату не впливав на основні показники організму (кров'яний тиск, частота серцевих скорочень і вага), дані ЕКГ і лабораторні аналізи (біохімія й гематологія). Не відзначалося істотних відмінностей у частоті небажаних явищ, які виникають при лікуванні між групами плацебо та Міх7 (47 95 і 31 95, відповідно). Крім того, більша частина небажаних явищ, які виникають при лікуванні, були легкими й доброякісними.
Ефективність
Лікування за допомогою Міх7 приводить до поліпшення СМТМЗ5 (табл. 4, тенденція, р «0,20) у порівнянні із групою плацебо. Показник ОМІ 5 також поліпшувався в групі Міх7 у порівнянні із плацебо (табл. 4, поліпшення на 14,4 95, р «0,05). Дійсно, у той час, як показник ОМІ 5 знижувався після одного року (Фіг. 16, пунктирна лінія) у групі плацебо, він значно підвищувався в групі, яка одержувала Міх7 (Фіг. 16, суцільна лінія). Поліпшення показників загального стану пацієнтів підтверджується й з урахуванням поліпшення СМТМ5 ії ОМІ. 5 у групі Міх7 у порівнянні із плацебо, судячи з тесту ОЇ 5 О'Брайана (р « 0,05).
Цікаво, що функціонування мієліну також проявляло поліпшення в групі Міх7 у порівнянні із плацебо, судячи зі швидкості сенсорного проведення й рухової дистальної латентності.
Дистальна рухова латентність (ОМ) значно знижувалася в групі Міх7 у порівнянні із плацебо (табл. 4, 8 95, р «0,05), а швидкість сенсорного проведення (ЗСУ) значно зростала в групі Міх7 у порівнянні із плацебо (табл. 4, 26,6 95, р «0,001). Ці результати узгоджуються із впливом Міх7 на функції шванівських клітин і підтверджують ефективність композицій запропонованих винаходом при регенерації нервових волокон, як це спостерігалося в наведених вище дослідженнях іп міїго і доклінічних дослідженнях іп мімо.
Таблиця 4
Середній відсоток поліпшення в групі плацебо в порівнянні із групою лікування згідно чотирьох тестів (середнє ж 50)
Плацебо п-е19 Міх7 п-19 сМтМ5 2,8517,5 7. тк18,А
ОМ 5 -5,3-19,3 12,3228,4 0,043 0,428, 8,4ж21,7 0,038
ЗСМ (м/с) 3,4511,0 30,5:10,0 0,00037
Нарешті, частка сприйнятливих до терапії, визначених як пацієнти, стан яких не погіршився за 12 місяців лікування, була значно вищою в групі Міх7 (79 95, відносний ризик 1,66, р-:0,01).
Таблиця 5
Сприйнятливість до терапії в групі плацебо в порівнянні із групою Міх7. Після кількості пацієнтів у дужках наведений відповідний відсоток. Після відносного ризику наведені границі інтервалу
Плацебо Міх7 п-19 і Міх7 у порівнянні із плацебо п-19
Кількість о о , 105296). | 15(7995) 15(103:177) 0,047
Враховуючи вихідні характеристики (відзначені на початку дослідження) між сприйнятливими і такими, що не піддаються лікуванню, виявилося, що сприйнятливі взагалі були менше уражені захворюванням. Таким чином, запропоновані винаходом композиції не тільки можуть бути застосовані для уповільнення прогресування хвороби у хворих на пізній стадії захворювання, але можна очікувати, що вони будуть становити особливий інтерес для уповільнення захворювання в пацієнтів, слабко уражених або на ранній стадії захворювання, як то у дітей.
БІБЛІОГРАФІЯ
Атісі БА, ЮОипп УМА г, Мигрпу Ау, Адат5 МС, СаІе ММУ, МаІепгивєіїа ОМ, Мапсорошіов СО,
Мопнегрек Г. Репірпега! туеїїп ргоївіп 22 і5 іп сотріех мййп аіІрпабреїая4 іпіедпп, апа йб арзепсе анег5 Те Зспулапп сеї! база! Іатіпа. У Мешговсі. 2006, 26(4):1179-1189.
Атісі ЗА, Юипп УМА г, МоНегрек І. ОеємеІортепіа! арпоптаїйіев іп ШТе пегуез ої регірнегаї! туеіїп ргоївїіп 22-аеїїсіепі тісе. / Мешгозсі Нез. 2007, 85(2): 238-249.
Агапазовкі 5, Зспегег 55, Маме К-А, Зщег ). РгоїПегайоп ої 5спмапп сеїїв апа гедшайоп ої сусіїп 01 Ехргезвіоп іп ап апіта! тодеї ої СНагсої-Магівє-Тооїй аїізеазе їуре ТА. /) Мешгозсі Нев. 2002, 67(4):443-449.
Вазіа-Каїт А, Виагі52ему5Ка В, Чамжоїгїз5Ка-РеїїЇ І, Теїісп М, Геб5Кіем'іся М, Кибрега М, Газоп УМ.
СНіогрготаіпе іппірі5 їШйе діисосопісоїй гесеріог-теадіаїед депе іМапзспріоп іп а саїЇсійт- дерепаєпі таппег. МешгорНпаптасоїіоду 2002, 43(6):1035-1043.
Вацну ІН, Ріеєтіпд ІМ, Оомупе5 СР. Мизвсаїіпіс-гесеріог-теаіаїтей іппірйоп ої іпвиїїп-їКе дгомли
Тасіої-1 тесеріог-5ітціатєй рпозрпоіпозйіде З-Кіпазе в5ідпайпу іп 1321М1 авігосуюта сеї5.
Віоспет у. 2004, 379(РІ 3):641-651.
Водоуємісн! МА, Кейептап Ау, Буидаєп РН. СеїЇшаг вігеззев5 айегепійацу асіїмаїє с-|п М-
Іептіпа! ргоївіп Кіпазе5 апа ехігасеїІшміаг зідпаІ-гедшаїей ргоївіп Кіпазе5 іп сийштей мепійсшаг туосуїезв. У Віої Спет. 1995, 270(50):29710-29717.
Вгапсоїїпі С, Маггіпоно 5, Едоті Р, Адовіопі Е, Ріогепіїпі С, Миег НМУ, Зсппеїдег С. Кпо- дерепаепі гедшціайоп ої сеї! зргєадіпд Бу Ше івігазрап тетбргапе ргоїєїп Ссаз3/РМР22. Мої. Віо1.
Сеїї 1999, 10: 2441-2459.
Савієопе МО, Тегатою Н, сСшКкіпай 95. Сусіоохудепазе-2 ап соіогесіа! сапсег спеторгемепійоп: Те р-саїепіп соппесііоп. Сапсег Нез. 2006, 66(23):11085-11088.
СнаКгабопу Н. 5 Си Н. А тіхед тоадеї арргоасн ог іпіепі-ю-ігеаї апаїувів іп Іопуйиаіпаї сііпіса їіа!в м/Йп тів5іпу маІШевз. АВТІ Рге55 РибІ. МА-0009-09 (2009).
Спеп ХА, Вебззоп МС, РаїЇтієї В, Сагсіа М, Ріоїкіпе М, Магснапа-І егоих б. Меийгоіодісаї гесомегу-рготоїїпод, апіі-іпШаттаїйогу, апа апіі-охідайме еПесібв апйогадей Бу Тепоїїргаїє, а РРАН аІрна адопіві, іп Майтаїйс Бгаїп іп)игу. У Меигоїгашта 2007, 24 (7): 1119-1131.
СНієз В, Моббіо І, Едоті Р, 5спепопе А, ЗсНпеїдег С, Вгапсоїїпі С. АНегаїйопв5 іп Ше Анб-
Зо гедшаїтей ріазєта тетбгапе епдозотаї! гесусіїпд раїШулау іп сеї омегехрге55іпд Ше Івігазрап ргоївіп Сабз3/РМР22. У Сеї! Зсі. 2003, 116(РІ 6): 987-999.
Сопвіабіє АГ, Аптаїї РУ. ОМ5О іпаисійоп ої Те ІеиКоїієепе І. ТС4 бу І ем/із гаї Зспулапп сеїїв. У
Меигої Зсі. 1999, 162(2): 120-126.
Соз5дауа 9. М., Спап 9. А., Зпооїеї Е. М. Те пешйгоїорніп гесеріог р/5МТА аз а розійме тоашіаг ої туеїїпайоп. 5сієпсе 2002, 298: 1245-1248.
Ре дадег У, Кооу А, ІГепегпі Р, М/иШеє Мо, мап дег Коїк У, Веї5 О, Мегригуд У, ЮопКег АуУ, зЗіепоимег СО. І опд їегт і еаїйтепі м/йй тейогптіп іп раїепів мій їуре 2 аіабеїез апа гізК ої мтатіп
В-12 авеїісіепсу: гапдотізеа ріасеро сопігоїїєй паї. ВМУ 340, с2181 (2010).
Оемайх 9, Зспегег 55. АГегей іоп спаппеї!5 іп ап апіта! тоавеї ої Спагсої-Маге-Тооїй дізеавзе
Туре ІА. У Мешговзсі. 2005, 25 (6):1470-1480. бієр ОМ, ВепКігапе К, Атігі Е, Сойп 05, Епдетапп О, 5спінййп ЕГ. РРАВ аїрна асіїмайог
Тепоїїргаїе іппірії5 туосагаїа! іпїаттаїйоп апа їбговів іп апдіоїєепвіп Ії-іп?їивзей гаїв. У Мої! СеїЇ
Сагаїої. 2004, 36 (2):295-304.
Огаснема 5, Рамі5 КІ, Сніп В, МУсо БА, Зсптвеіаїег У, Нагошипіап У. Мувєїїп-аззосіаїед тта апа ргоїєїп ехргевзвіоп аеїйсіїв іп Ше апіегог сіпуцшайе сопйех апа Пірросатриє іп еїЇдепу 5спігорпгепіа раїепів. Мешгобіо! бів. 2006 Маг, 21 (3):531-540. бб'ягзо О, Епіпагаї Р, МоШег НУУ. Регірпега! туеїїп ргоївіп 22 апа ргоївіп 7его: а помеї аззосіайноп іп регірпега! пегуоив зузіет туеїїп. ) Мешговсі. 1999, 19 (9):3396-3403.
Еопип У, ЮОипп УА ук, доу 5, Її У, МоМегрек Г. Етегадіпу гоЇе ог ашорнаду іп те гетомаї ої аддгезотезв іп 5спулапп сеїїв5. У Мешйговсі. 2003, 23 (33): 10672-10680.
Еопип У, Гі У, Со У), Репвієеттакег А, Рієїснег В5, Мойегрек І. Ітраїгей ргоївазоте асіїміпу апа асситшайоп ої ибідийіпаїейд 5и!Ир5ігаїє5 іп а Пегедіагу пеигораїйу тодеї. У Мешгоспет. 2005, 92:1531-1541.
Еопип У, Со УС, Її У, Атісі БА, ЮОипп УА г, Монегрек Г.. АйМегаїйопз іп дедгадаїйме раїпжаув апа ргооївіп аддгедайоп іп а пешораїШйу тоде! разед оп РМР22 омегехргезвіоп. Меигобіо! бів. 2006, 22 (1):153-164.
Еопип У), Метієг УО, Со УС, МадогеКу І, Оипп УА, Мойегрек І. Те Топтаїйоп ої регірнегаї! туеїїп ргоївіп 22 адагедаїе5з і5 ПпПіпдегед Бу Ше еппапсетепі ої ашорпаду апа ехргезвіоп ої суїоріазтіс спарегопе5. Мешгобіо! бів. 2007, 25 (2): 252-265.
Саїе К, Кегавідів Н, М/гагНпаї! УВ. Зріпаї сога сопіивіоп іп їйе гаї: беНаміога! апаїувів ої Типсііопаї пешигоодіс ітраіптенпі. Ехр Мешгої. 1985 Арг, 88 (1):123-34.
Саме А5, ШІоа ЗА, Спіопа М, Стпіоїо А, Еїзпег У, Ваїтоз І Е, І амападего 5. АІдозе гедисіазе іпдисед Бу пурегозтоїс віге55 тедіаїе5 сагаітуосуїе ароріовів: дегтепіа! еМесів ої зогойо! апа таппійо). У Віої Спет. 2003, 278 (40): 38484-38494.
Стапат АС 4 Ниднев5, ВА. А тоаїїей регірнега! пеигораїну зсаІе: Ше Омегаї! Мешгторашту
Ітйайопв 5саївє. У. Мешгої. Мешйигозигу. Рзусніаїгу 77, 973-976 (2006).
Стоуєг С, Еуспеппе В, Сіігага С, Ваі)комубКкі К, Зспитаснег М, Садеропа Р. Ехргезвіоп апа
Типсїопаї віаїе ої Ше сопісовієгоїй гесеріої5 апа 11 реїа-пуагохувзієгоїд депудгодепазе їуре 2 іп
Зепулапп сеїЇ5. Епдостіпоіоду 2006, 147 (9):4339-4350.
Ноулапа 05, Пи У, пе У, Сова В, Магадакіз МУ, Кіт В, Егісквоп У, Киїїк У, Оемію І, Рзаїйв а,
Редеппаго ГУ, Сіємеїапа ОМУ, Воїнвзівїп 90. Еосаї Іо55 ої Ше дішатагїе ігапзропег ЕААТ?2г іпа іапздепіс гаї тоде! ої БООІТ тиїапі-тедіаїєд атуоїорніс Іаїега! 5сіегов5ів (АІ 5). Ргос Маї! Асай
Зсі ОБА 2002 Реб 5, 99 (3):1604-9. Ериб 2002 дап. 29.
Капіатпепі 5, Соїтва ЗА, НоадДдкКкіпзоп СК, Меуег б, Міпи ММ, Непіву ОМ, Мізпітипе А. СІ5Р: а помеї ргаіп-5ресіїіс ргоїєїп Ттаї рготоїе5 зипасе ехргеззіоп апа гпсіюп ої САВА(В) гесеріогв. У
Мешигоспет. 2007, 100 (4):1003-17.
Кієтепрішт 5С, Вигтп5 5Р, Вієгіпа-5огепзеп Е, Юопомап МУ, Стамез ОЕ, Упа А, допапзеп М,
УЧопез І, Кгтазвіоиком А, Миїсанпеу МУ, Зсптіді-Веай М, У/агіпд М/. Те уЧошттаї ої 5ріпа! Сога
Меадісіпе 2011, 34 (6):535-46.
Кнадамі М, 5Ппіда К, М/із2піемувКкі М, Не Е, Знам СА, Мап ), Мепзе! ТО, Зпіре5 СУ, Гирекі УВ.
Ога! ситситіп тіййдате5з Ше сіїпісаї апа пешгораїпоЇодіс рпепоїуре ої Ше Тгтетрбієг-) тоизе: а роїепійа! ІНегару ог іпнегіед пеигораїну. Ат ) Нит Сепеї. 2007, 81 (3): 438-453.
Коврзаг І, Назеприбвсп-Тпеї К, УмМеззід С, МоПег НУМ, Мапіпі К. Емідепсе їТог тасгорпаде- теаіаїейд туеїїп аїівгиріюп іп ап апіта! тоде! юг Спагсої-Маге-Тооїй пешйгораїШу іуре ЗА. ./.
Мешцгозсі Не. 2005, 81:857-864.
Іапде СА, Зпеп Т еї аЇ. Рипозрпогуїайоп ої питап ргодевієгопе гесеріог5 аї зепйпе-294 ру тпПодеп-асіїмаїєйд ргоївіп Кіпазе 5ідпа!5 ІНеїг Дедгадайоп Бу Ше 265 ргоївгазоте. РМА5 БА. 2000, 97: 1032-1037.
Коо) Ї е-Місшевзси Н, Киїйап ЗМ, Мепуамі М, Оіке С, Раївї 50, Едепбегу НУ, Твцапд МТ, Заїотоп
ОА, МитбБегдег У! г, Місшевзси АВ. Ідепійуіпуд бБріоой Біота/Кег5 їог тоой аівогаєг5 ивіпа сопмегдепі їшпсііопа! депотіс5. Мої! Рзуспіайнту 2008 Реб 26. (Ериб анеаай ої ріпу).
Ї емліз ВА, Мсдегтой МР, Неттапп ОМ, НокКе А, Сіамжвоп ІІ, бізКкіпа С, Реєїу БМ, МіПег ГУ,
Вагопп ВУ, Зтії Р, І себбе Е, Ми Х, 5пу МЕ; Мизсіє Бщшау Стоцир. Нідп-дозаде азсогбріс асій ї'єаітепі іп СНагсоЇї-Магіе-Тооїй адізеазе їуре ТА: Везийв ої а гапдотіед, дДоШибіе-тазкеа, сопігоїІєс іпаї. "АМА Мешгої!. 70, 981-7 (2013). ії МЛ, Ге боазсодпе С, Катацде М, Зспитаснег М, Ріегге М, Соипіп РЕ. Іпаисіоп ої їуре З іодоїпугопіпе аеіодіпазе Бу пегме іп)игу іп Пе гаї регірпега! пегиоив 5убвієт. Епаостіпоїоду 2001, 142 (12):5190-5197.
ГішШе ВОЮА 4. Вибіп ОВ. еіаїізіїса! Апаїувів м/йй Мів5іпу Оаїа. 408 (УММПеу-Іпіегзсієпсе, 2002).
Їодап ВА 4 Татпапе АС. Оп ОСтбіієп'є ОЇ 5 апа с 5 їевів Тог тийПіріє епароіпів. І есі. Моїев5-
Моподгарий 5етг. 47, 76-88 (2006).
Гирекі УА, М/ізе СА, Кимапо А, Репіао І, Раїке УТ, Сіаге ОС, І едбецег ОН, Стеепбега БЕ,
Раїєї! РІ. Сепе дозаде і а теспапізт ог Спагсої-Магіє- Тосїй адізеазе їуре 1А. Маї Сепеї. 1992, 1 (1):29-33.
МаїКком»гкі СА 4. МакомбкКі ЕР. Сопайіоп5 ог їе еПесіїмепезв5 ої а ргеїїтіпагу їеві ої мапапсе.
Ат. зіаї. 44, 322-326 (1990).
Маїзитоїо А, ОКада У, МаКатісні М, МаКкатига М, Тоуата М, 5обие Сї, Мадаї М, Аокі М,
Моуата МУ, ОКапо Н. Оівзєавзе ргодгевзвіоп ої питап 5001 (С93ЗА) Шмапз5депіс А 5 тові гаїв. /
Мешцговсі Не. 2006 Уап, 83 (1):119-33.
Машигег М, Кобрзаг І, Вегопой М, Зсптіа СО, Сагепіпі 5, Мапіпі К. Коїе ої іттипе сеїЇ5 іп апіта! тоаве!5 Тог іппепеа пешигораїйНіев: Тасів апа мівіоп5. у Апаї. 2002, 200 (4):405-414.
Меїсападі ВС, Самаїттецйа ІТ, Вайаріо М, І еопеїйї Е, Зспепопе А, Агсоїйна І, Мідиє! Сагсіа-Зедига
І, Мадпаодні МУ. Регірнега! пегуев: а їагдеї ог Те асіп ої пеигоасіїме 5іегоїд5. Вгаіїп Нез5 Немх. 2005, 48 (2):328-338.
Мегсієї С, Тигдие М, Зспитаснег М. Варій ейесів ої іпіодоїйугопіпе оп іттедіаїе-єапу депе ехргезвіоп іп Зспмапп сеїї5. Сіа 2001, 35 (2):81-89.
Меуег 2и Ногвів С., Маме К-А. Апіта! тодеї5 ої іппепіей пешйгораїнпіе5. Сит. Оріп. Мешгої. 2006, 19 (5):464-473.
Меуег 2и Ногвіє С, РгиКор Т, ГПереїап2 0, Мобіив МУ, Маме КА, Зегеда ММУ. Апіїргодевієегопе
Іегару ипсошрієз ахопаї! Іоз55 їот детуеїїпаїйоп іп а ігапздепіс гаї тодеї!ї ої СМІТА пешораїйну.
Апп Меишго!. 2007, 61 (1):61-72.
МіПег АГ, Сага А5, доппзоп ВН, Тотрзоп ЕВ. Раїпулау іпіегасіюп5 Беїмеєп Маркв, тіог,
РКА, апа їпе діисосопісоїа гесеріог іп ІЇмутрноїа сеї. Сапсег Сеї| Іпї. 2007, 28:73
Мціа М, ВіасКктап 5С, І е Вгеїоп С, Оемгієв СН. Ідепійїсайоп апа типсііопаї! спагасівгігайоп ої
Іготрохапе Аг гесеріогв іп Зспмапп сеїІв. ) Меигоспет. 2001, 78 (3):446-456.
МиПег ОГС, Опівєпмана ЕМ. Іп мімо тедшаїйоп ої ехігасеїІшміаг зідпаІ-тедшаїеа ргоївїп Кіпазе (ЕВНК) апа ргоївіп Кіпазе В (АК) рпозрпогуїайоп Бу асшіе апа спгопіс тогрпіпе. УРЕТ 2004, 310:774-782.
Матрби Н, Кибро Е, ТаКкатига У, Тзи2иКкі 5, Татига М, АКаді У. АнНепицаїйоп ої аідозе гедисіазе депе 5ирргеззев ПпПідп-дінсозе-іпдисей ароріозів апа охідаїме 5іге55 іп гаї Іеєп5 еріїпеїа! сеї5. ріареїтез Вез Сіїп Ргасі. 2008, 82 (1):18-24.
Маме КА, Бегеда МУМУ, ЕНгепгтеїсй Н. МесНнапізєтв5 ої аїібеабзе: іппепіед аетуеїпаїййпд пешигораїнівевз-тот бБавіс го сіїіпіса! гезеагсп. Маї Сіїп Ргасі Мешго!. 2007, З (8):453-464.
Міетапп 5., Зегеда ММУ., Вовзпег М., бівмай Н., 5щіег Ш., МеїпекК Н.М., Сптінйнз І.В., Маме К-
А. Тне "СМТ гаї": регірнега! пешгораїну апа адузтуєїіпайоп саийзеа Бу ігапздепіс омегехргезвіоп ої
РМР22. Апп. М.У. Асад. 5сі. 1999, 883:254-261.
Монегрек І, Зпооіег ЕМ, 5піре5 С). Оргедшіайоп ої Ше епдозотаї!-Іузозота! раїймау іп Ше їетрбіег!-| пештораїнпу. / Мешговсі. 1997, 17 (11):4190-4200.
Стріієп Р. Ргоседите5 юг сотрагіпд затрієз м/йй тийіріє епадроїіпів. Віотеїйнісв 40, 1079-1087 (1984).
ОбБіівєїап К, мап деп Рої АМ. САВАВ гесеріог-теадіаїва іппірйоп ої САВАА гесеріог саїЇсійт еіємайоп5 іп демеІоріпу пуроїнаіатіс пеигопв. У Меигорпузіої!. 1998, 79 (3):1360-1370.
Одаїа Т, Ціта 5, Новпікамжа 5, Міша Т, Мататоїйо 5, Ода Н, МаКатига К, ТапаКка 5 Оррозіпд ехігасеїІшаг 5зідпа!-гедшіаїєйд Кіпазе апа АКІ раїйулаув сопігої 5спмапп сеї! туєїїпайоп. ) Мешцговсі. 2004, 24 (30):6724-6732.
Опзажа У, МигаКкаті Т, Міуагакі М, Зпігарбе Т, Зипада У. Регірпега! туєїїп ргоївїп 22 ів ехргеззеай іп питап сепіга! пегуоив зузієт. У Мешгої! сі. 2006, 247 (1):11-15.
Ратіки РМ, Маїа А, Адмапі 5Н, Оідштапі В, Маднамап У, Мад 5, Варпа А, б5еКноп 95, Раїй 5,
Коо) Ієтаї! РМ, У/апд У, Магадпаснагу А, 2пи У, МаїїкК А. Напдотігеа, дошибіе-біїпа, ріасеро-сопігоїПейа рпазе ЇЇ вішау ої віпдіє-адепі огаї! їаіасіоїетіп іп райепібв м/йй ІосапПу адмапсейд ог теїавіаййс поп- зтаї-сеї! Ішпуд сапсег ІНаї ргодгеззейд апйег спетоїНегару. у. Сііп. Опсої. 29, 4129-36 (2011).
Раззаде Е, Моїтев! УС, Моаск-ЕНгаіззідпе5 Р, Запдиєдоїсе М, Рігапі У, Тпіпоп Х, Вобадіїа-
ЗсПішрр А, Реїїїввієг УЕ, Еопіез М. Авсогбріс асіа ігеаїтепі соїтесів Те рпепоїуре ої а тоизе тоавї ої СПагсої-Магіе-Тооїй адізеазе. Маїшге Мед. 2004, 10 (4): 396-401.
Регеа У, Вобегізоп А, ТоІтаснома Т, Миааїе у, Кіпд АН, Ропвіога 5, Тпотав РК, Нихієу С.
Іпдисейд туеїїпайоп апа детуеїїпайоп іп а сопайіопа! тоизе тоадеї! ої Спагсої-Маїе-Тооїй аізеазе їуре ТА. Нит Мої! Сепеї. 2001, 10 (10):1007-1018.
Вападага)и 5, МадогзкКу І, Рієдді да, Катаї А, Мобегрек Г.. Рпагтасоїодіса! іпаисійоп ої Те Неаї 5посК гезропзе Ітргоме5 туеїІїпайоп іп а пеигораїйіс тодеї. Мешигобріооду ої Оізєеєазе 2008, 32 (105-115).
Воа ВВ, Сагсіа СА, 5щшег І, Киїра СА, М/ізе СА, Миеїег У, МУєІснег АА, Зпіре5 СУ, ЗПоОїег
ЕМ, Раге! РІ, Гирзкі УА. Спагсої-Магів- Тосїй дізеазе їуре ТА. Авзосіайоп м/йй а зропіапеоив роїіпі тшиайоп іп Ше РМР22 депе. М Епаї У Меа. 1993, 329 (2):96-101.
Вобрадііїа-5спіирр А, Рігапі У, Моітеє! УС, Раззаде Е, Забегап-біопеїаі 0, Апзаїаі ДЇ., Міпау ГІ,
Рідагеїїа-Вгапдег 0, І ему М, Сіагас РЕ, Саи Р, РеїЇїввісг УР, Гопівєз М. РМР22 омегехргезвіоп саивев5 дузтуеііпаїйоп іп тісе. Вгаіп 2002, 125 (РІ 10):2213-2221.
Робегі Е, Сиеппоцп ЕР, Юезагпаца Е, Бо-Тпі А, Вептеззанвє! М, Вацієи ЕЕ, бспуитаснег М. зЗупіпевзів ої ргодезієгопе іп Зсепмапп сеїїв: гедшіайоп Бу зепзогу пепйгопв. Єшиг ) Мешговсі. 2001,13 0 (5):916-924.
Воих КУ), Атісі БА, МонНегрек І. Те їетрогозраїйа! ехргезвіоп ої регірпега! туеїїп ргоївіп 22 аї
Ше демеїІоріпуд Біосд-пегує апа ріоса-ргаїп батіегв. У Сотр Меигої. 2004, 474 (4):578-588. зЗапснпо 5, Моипд Р, Змщіег ). Ведшіайоп ої Зспмапп сеї! ргоїТегайоп апа ароріовзів іп РМР22- деїтісієпі тісе апа тоивзе тодеїв ої СПпагсої-Магіє-Тосїй адізеазе їуре ТА. Вгаіп 2001, 124 (РІ 011 )2177-2187. зЗаміїомувКу 55. є Віаїг ВС. А тоге геаїївіїс ІоокК аг Ше горивіпезз апа Туре ІЇ еітог ргорепієв ої
Ше її Теві о дерапигез тот роршіайоп погтаїйу. Рзуспоіодіса! ВиПейіп 1992, 111 (2):352-360.
Зспитаспег М, сСцеппоцп Е, Мегсіег С, ЮОезагпаца РЕ, І асог Р, Вепамідез .), Регла; В, Кобегі
Е, Вашієи ЕЕ. Ргодевієгопе 5упіпевзі5 апа туеіїп Топтпайоп іп регірпега! пегуе5. Вгаіп Нез5 Немх. 60 002001, 37 (1-3):343-359.
Зо
Зегеда ММУ, Меуег 2и Ногзіве С, Зщіег І, єї аІ. Тнегарешііс адтіпівігайоп ої ргодевіегопе апіадопіві іп а тодеї ої СНагсої-Маїе- Госій дізеазе (СМТ-1А). Маї Мед. 2003, 9:1533-1537.
Зегеда ММУ, Маме КА. Апіта! тодеї5 ої СНагсої-Магіє-Тооїй аізеазе їуре ТА (СМІТА).
Мешготої Меа. 2006, 8:205-215.
Зпу МЕ, Віаке У, Кгта|емувКкі К, Ецегві ОВ, І ага М, Нанп АК, Ії У, І ем/із ВА, Вейу М. Веїїаріїйу апа маїїану ої Те СМТ пешигораїну зсоге аз а тєавиге ої дізаріїну. МеигоІоду 64, 1209-1214 (2005).
Зіігпу/еіє5 У, МаїКома С, 7іезспе Е, Огире 5, Гіертапп С. Мизсагіпіс М2 гесеріог5 теаіаїе іапзасіїманоп ої ЕСЕ гесеріог Ійгоцдп Руп Кіпазе апа м/йпоші таїйгіх теїаІоргоїєазев. Сеї! Зідпаї. 2006, 18 (8):1338-1349. зЗшщіег О, Зспегег 55. Оіввазе тесНапівтв іп іппепіей пешигораїніев. Маї. Нему. Мешговсі. 2003, 4714-726. зЗшег У, М/єіснег АА, ОгсеїїкК Т, Зпіре5 Су, Козагаз В, ЕгапсКе М, ВіПіпдз-Садіїагаї 5, зідтап
ВІ, Зпооїег ЕМ. Ттетбрієї тоизе сатіез а роїпі тиїайоп іп а туєїїп депе. Маїште 1992, 356 (6366):241-244.
Тпопрой В, догдап РМ, Кагат УА, Ваззей ВІ, Уи Р. Ідепійісайоп ої вапу дізеазе ргодгеввіоп іп ап АЇ 5 гаї тоаеї. Мешйговзсі І ей. 2007 Маг 30, 415 (3):264-8. Ериб 2007 дап. 14.
Тнотах РК, Магднез МУ дуг, Юаміз МВ, Змеепеу Ма, Кіпду ВН, Вгадієу У, Мидаїе УВ, Тузоп У,
Маїсоїт 5, Нагаіпуд АЕ. Тне рпепоїуріс тапіїтевіайоп5 ої спготозоте 17р11.2 аиріїсайоп. Вгаїп 1997, 120 (РІ 3):465-478.
Торіег АВ, Гіми М, Миеїег Г, Зпооїег ЕМ. Оінегепіа! аддгедаїйоп ої Те Ттетбіег апа Ттетбіег У тиапів ої регірпега! туеїїйп ргоївїп 22. РМАБ ОА 2002, 99(1):483-488.
Ти Н, Ропаага Р, Хи С, Вепавзо Е, Сао Е, 2Напо Х, Ріп УР, Пи У. Оотіпапі гоїє ої САВАВ» апа
Среїадатта ог САВАВ гесеріог-теадіагеа-ЕК1/2/СВЕВ раїнугау іп сегереїІаг пешгопв. Сеїї Бідпа|. 2007, 19 (9):1996-2002.
Ой АМ, Апдегзоп СМ, МУерр Р, Кивипег Ру. Тгапзсгіріопа! асіїмйев ої евігодеп апа діисосопісоїа гесеріог5 аге Тшпсійопаїйу іптедгаїес аї Ше АР-1 гезропзе віетепі. ЕпдостіпоЇїоду 1997
Уиї, 138 (7):2900-2908.
Ш2Неїітег УС, Реїез Е, І еміпзоп 5В, Мапіпі В. АйГегей ехргеззіоп ої іоп спаппеї! івотоптзв аї Ше поде ої Вапмівг іп РО-деїїсіепі туєїїп тиїапів. Мої СеїЇ Мешговзсі. 2004, 25 (1):83-94.
Коо) Майаг УМ, Біпдом Р, Ргєих РМ, Табрагаца Р, Міїог АМ, Соигайєг Р, І едиєт Е, Віїсе А.
ОПгавігисіигта! РМР22 ехргезвіоп іп іппепіей детуеїїпаїпуд пешигораїпіез. Апп Мешйгої. 1996, 39 (6):813-817.
МісКегї5 АУ. Рагатейіс мег5и5 поп-рагатейнс віаїівіїс5 іп Ше апаїувіб5 ої гапдотігеа їпйаїв Умій поп-поптайу аізівшеа даїа. ВМС Мед. Вез. Мейо). 5, 35 (2005).
Ммацег ІВ. Мисієаг І ііодоїпугопіпе гесеріог ехргезвзіоп із гедшатей Бу ахоп-5спмапп сеї! сопіасі.
Мешгогеротп 1993, 5 (2):137-140.
ММацпег ІВ, Оєгиа? ОР, де Тибоієї М. ЮйШегепіца! ехргезвіоп ої Шіодоїйугопіпе гесерію!гв іп зспулаппота апа пешгоїїбгота: гоЇє ої Зспмапп сеїІ-ахоп іпіегасіюп. Асіа Мешигораїної (Ве). 1995, 90 (2):142-149.
М/еісн МУ, Вгомуп СВ. Іп'непсе ої тоІесціаг апа спетіса! спарегопевз оп ргоївіп оїдіпа. СеїЇ
Зіге55 Спарегопез 1996, 1 (2):109-115.
Муосанатз РІ, Масдопаїа ВЕ, СоїПпе 50, Спеззеї! ІР, Бау МО. І осаїїзайоп апа тоадшиіайоп ої розіапоїа гесеріої5 ЕР апа ЕРА іп Пе гаї спгопіс сопвікістоп іпішгу тодеї ої пешгорайіс раїп. Єиг
У Раїп 2007, 11 (6):605-613.

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Застосування композиції, яка включає баклофен, сорбітол, налтрексон або їх солі для посилення або покращення регенерації нерва у суб'єкта, який страждає від травматичної невропатії або механічного пошкодження нерва.
2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що при цьому композиція включає баклофен, О- сорбітол і налтрексон або їх солі.
З. Застосування за п. 1 або 2, яке відрізняється тим, що композиція додатково включає фармацевтично придатний наповнювач або носій.
4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, яке відрізняється тим, що вказані сполуки утворюють лікарську форму з полімером, який виділяє ліки, біомолекулою, ліпідами або емульсіями, які утворюють міцели або ліпосоми, типу олія-у-воді або пегильованими або твердими наночасточками або мікрочастинками для перорального або парентерального або інтратекального введення.
5. Застосування за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що вказані сполуки вводяться разом або окремо, одночасно або послідовно.
6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що поліпшення регенерації нерва передбачає поліпшення або прискорення одужання від даного механічного пошкодження нерва або травматичної невропатії.
7. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, яке відрізняється тим, що поліпшення регенерації, нерва передбачає поліпшення мієлінізації нерва або відновлення, принаймні часткове, морфології аксонів, ріст аксонів або електрофізіологічних функцій.
8. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що механічне пошкодження нервів є нейроапраксією, аксонотмезисом або нейротмезисом.
9. Застосування за будь-яким з пп. 1-7, яке відрізняється тим, що механічне пошкодження нервів полягає в черепно-мозковій травмі, травмі спинного мозку або механічному пошкодженні периферійних нервів.
10. Спосіб посилення або поліпшення регенерації нерва у суб'єкта, що страждає від травматичної невропатії або механічного ушкодження нерва, що включає введення йому композиції, що містить баклофен, сорбітол і налтрексон або їх солі.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що композиція містить баклофен, ЮО-сорбітол і налтрексон.
12. Спосіб за п. 10 або 11, який відрізняється тим, що в ньому композиція додатково містить фармацевтично прийнятний носій або наповнювач.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 10-12, який відрізняється тим, що в ньому вказані сполуки складають лікарську форму з виділяючим ліки полімером, біомолекулою, утворючими міцели або ліпосоми ліпідами, або емульсіями типу олія-у-воді, або пегильованими або твердими наночасточками, або мікрочастинками для перорального або парентерального, або інтратекального введення.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 10-13, який відрізняється тим, що в ньому вказані сполуки вводяться разом або окремо, одночасно або послідовно. Зо тк (Її шх Я А 5 в х Гея К ке те В ї Я ї ШИНИ осад она ННЯ що ВМО Вин КВ : Бе : Вин сті Ом : КЛІ УП: ТИПИ
М т. ШИК в ї З же 7 ів рес аов е еВ ЕМ жмені 3 В МИЛИ дитини хе : МЕШШЕШНТИ ЕТ КИ И де : ШЛДЛУ ЛИН МОТИВИ я, : МИ ШИ плити щу х мими Е Ин х т МИЛИ ШИК у Хо МИШЕЙ ОМ ТИНИ ЛИ роЯ ї МЕМ ШТ ШИ МИМО У Я МИ ММ ШЛХ б: п ПЛИТ ЛМІЛИТ МИЛИ МТ п ї ШИШКИ ШИЯ У р, ШИТИ ПИТИ Ми Я РИН сур хек Кантроль ВМчаУ Жак тео в х 4 С ЩЕ ооо Бо 5 жооуВй й БУ ГНН і - Б - яко дитинки НК : пе жу пошли ж й ВоттЕИ й дл они нти ІЗ ШИТИ Хе хаб ща ДИ ПИ, ХИТ ЕМ СМ Ж сем жк кг МАК са ки, о . : сзлжню АВ шо их яки нн жк ск КЕ КЕ мо й МЕТИ Що ЗМИТИ то : МЕНЕ З соя пі Щоовко Кошеня й НН му Е МІМЕМИ ВИН З Шити Не НН Мед внивя з. пори У з МПК Зх ДОП Клит « Ж Е ШЕЛВІНТУИИХ Я ШИТИ ІМ Моя ММ МЕ ММ х : ВДВ ях дитя їх Фр Зоо я щої й . й ШОК ШИШИИИЗ, ї х Й й "З Кан що ТЕ ЗВяо щюБ Нч вслам ЕВ Ж: : як Іва: Я М: ТРУ ї пе ЕХ ЩО пе ев вкккх Кок Ж ВАК ше Я ям МЕДИ ВІ как Її ШИПИ ТИ ПХ г Я ВОШЕИМ ЛЯ я ФМ А НО ВИШИТА У ШИПИ Є : ШИК ЛИ п. ІЕМ и ЕТИКИ. - т МУК жа
ФІГ. 1 їх Я ох
ОМ. ж Ж ско ч Жах БИТИ СПИ ТУТ ОМ
ІЖ. КМ ДЕШЕВО оо ПОПИ вн по ДВ, ЕК соя м Н ДИЕИт ПИТ Моя ШІ ж ЇВ ПЕПИЛІШИЕ ВИНИ ші и ши «Х, ше ШІШШТТИНИИИН що зе МО ШтТШШТНУ! ШТПИИИП ПИЛИ, КУ : МІШЕНІ ше СВ ЕЛ Мини нити о ММК х : Зими ши ит Я КУХННН ЖМШЛИМЛИ ил пит ПИЙ й й : ПИЛИ ПИ ЛИПИ отит КУ о: ДПТ ИуТИ «І й ння ї А о я й ЖомуУццих МІР вок - В З Я Е Є ї І ШОК, не КЗ Н ЖЕ ЖЕОЖЖМ СТ ке - ве : тЖх Я жом На подув Ж оащо к КУх ВИПИЛИ МИЦИК дит по -х ВІДК и ЖК оспош теж хх усміх тіл ОВУ Ж юю. УЖ БЛЕМИ МІ и Я Зп микиииу шт по Коли Мод й фр ЖОшО км й Я ХА КА КАМ КК я Ж Й ми ТИ ПИЛ Во й Клин ПЕ : Плити СУНІНЕЧННН ї ОПН шко ВИЛЯУЙИШН МОЗ Ох й Б. пиилиоу й КОТИ Бех : Ї опт Ин 2 МД ПТН ОО ; МИВИННИННКОВ о ШИШИ ПИВНИн СЯ : ї ВОШЕЙ. КЛІПИ Я 2 ОКА Ж... МИТІ, Ш КПНЗ ТИПИ т. ЕП ИЄПЛИНИ ПИТИ Хоче огих ЗК Зх ками шкіл КУ ЗЕ но а : Я о о о: Ди ня ВК Як ч пд іно ен А НИМИ. КІ Е шт дк Е ТИ, ПИШИ ОЇ Е ДИКІ МИХ Як Е ЕЕ ї Я з ПИПЛИ тих дк Її з КЕ Х ЗНТУ МІХ я сі ФГ,
се ; Сиджу, Й Й ня х ше ОВ Н Е 5 : ї пий ; : ШО доня, їУ : лю НН я І ВИПИЛИ ЙО СКЖМИМИт у УМ дпмииимитт о оеисейстст Дня : : БОНН рони ШИМИ ШІШЛТИМІВ реє» ПОКИ : : Борош ВН БУ ПТК нд Коток Дн тато - БОШ БоленЯ БК ІОШНИво Шо В Я З : ШЕ НИ КЕН З шиї І Ж Ух БОККЖеК: дк Я ОК ОН Кеш ЯКІ СИ МО хі СЯ СК їх : поршні В ЕН.
СКК ІАІ БЕН и: і ш : ІК ІК МАЛИК ФОНИ кн пиляння Ук І ІІ ПСМИИМИКИХ типи, ДИСК пеннннт яння - : ; ВО ож КДЖ я Ж КК КА Хди жа А ПЕ ет В до Бид я БО ШО ЕІШЕЕНОШ.
МИЛОМ МНК МЛтХ, Бони лИтеЕ ш ВЕ ШИ ДЕН ШТ ИТВ БТІ ЩЕОМОя с | опо КО ШЕУ ДИМ МО кер МЕНЕ Ко лний і: : Б ШО я пр Офлотииа БИ Ши финЧн Бо КИШЕНЮ ПЕН КК МИШМИиЮ Штори? Б и Ен - ШЕ ОБОЕЕКЕ КОХ Пе.
ЖНИВ ХО Мити і: ЛИШ : ШО М ПЕ ОЕИИЕИИ.
Фр ЕЕ ВК ПЕК Кт Ж ї ПИЕПИИ НИ М ПИСК, ПЮЄИЛ МИСВ ХЕ ОЗ пі Я СУ : ПЛИТИ ПИСК Со ПИ Пи ПИВА ПАВУКИ. як В І ЖДОППИХИЛНМ З ПЕЖТТІщНН ОПН Ж МТК щ я ш ї ВИПИЛА УХИЛИ КЕ и ван ої ж В Е ПОН ДИКИЙ | о х ї ПОЛКИ Пк ка по ча роя й похо х дно. р» я 7 Ди Дю де - Кокцимі: В Я ду В БЕЗ й : ї З : с ; : і Е : : х З с ї У Я : : ШИЯ : і і ; Кк КІ Я ї ! ня Я ї ШПУК ї . ПЕИИТТИТ Й ї З : шу ще о : ХЕ : ілЕшннЯ вошяори ї пи що : х : Блллшн ПИТИ Н Ж вен є І Ваши КИТ я і ! я М ШИ шо ТЕГ. пі ! ШЕ ко ї ПИТНЕ ШИ ОЛЯ РОТА рук щі Е с Шини Й ї Кох : І: поло ІШЛИ ОЇ ЩЕ : З : ЗТ Доти спт ие пд.
Бий і ї нях; В : ПА ши І ен М ТО фот рн ї ще І ЩІтллии Ж ЛЕО ВИН Ю Дилу ЩЕ От ЕОМ п . її : р МОЯ: ИЙИЕ Ким ЦЮ МІ С ОО ЖМ сла КУЗЯ І ВОЛШМИИИЮ БИ ШК СПИ ШИЮ ОМ ІМЯ тив Пи т : зн; риска да ТО ЕТО ТОЛЯ фу я п я ПЕН готи Б провини ри жи ОХ : Км ІЕМ ПН в ЩЕ о : дише МЕНЕ.
В ПЖООФЛМЛМИМЕ Ки ВИ ПЛІД - : ее ПЕН Те Шини.
КЛ Бош си : МЕ киа ЗО В ЛЮОБМІЕННЮ ОБЛИТИ ЖИ. фожоеи я . б в п Я Кинь фони фОЯ . : Мила МА Поеми о дж ВИТ ї : бота ее ПНО од Шо шин Бод МЕ мі ХЕ ї МЕП МИТИ ПТІТИТЕ ОТО ПИ МИ ДДИШТНОЙ МДЛтІ Мо Ши БК ОК и п. фея і МОНА БО Ме ПІ Б Й ЩЕ рим я : : ВИШІ ПЕК панк ОВ ШИК ТЕ ОШМОЇ ЩрОБУИМ ролю - : В о НМ БД ПИШЕ флишоия їх : р ПНЯ пе БО ШК вутнй, ВИНА - : Каіо вия БО п й Я Мо ППФ.
МИКИИИИИИ циля й де дело що ж Щек я ци що ще Х МУК.
ОКУ Фех З дюхот ї:Хех дк со дюЮюХ х Жамтцк 4 фр ІГ.
З
З І : ох 2оюже . ВО ІЗ Ко 1 щ : 1
ЖЕ. озуше 100 дже Й ВЖК ОЇ пе Б НИ : ПУХ Б : 1 : щ 1 Н ІЗ ТЩ 1 Н 5 ше 2004 : 3 З СН Я . 1 КЗ НАШЕ І маки ще х 1 Н дент, ке Н і ї Н де Не Н Й Н щЕ ше : Я : же ої Я хв Я Н 5 : 1 : КО Я Я ре і : : ! 1 БЕХ М НИ : Я фен дк Я : Я ІЗ Я | : Ф Я їх Ко КеКНШИ 1 : Ж ї Я У т Ж я тії Н Її ї : Н ї З НИ : я де ї Я ї ї ЩЕ |і НЯ Н ! Ї Я : : із і НЕ Н Н ме : х ЗУ М ї : і Н КИ Я І: ЩИТИ їх : Н : Н Н ШИНИ ї ІЗ ДИНИ Бах ру НН : : і ДШМ : І: ДИЛИ я і о 1 Н Н МИ : ї МЕ і НН В Н : ІК : ПИ М зала умі мх Н Н ПИ Н х ШИТИ Н ИН Н Н ІШЛИ, : У нд і ПЕ | ИЙ ї ПИ ОК Е СЕУ 1 Е ДЕННЯ І он по 5-й ос НААН, ооо НИ Днях КИ. шов рУрн ш керу. КН жк КК ХОТКЖКК ММК ОКУ КИМ Ка? Кен ик. мін ЇХ укомие : . Же зиції кіш 12 удцемі уд нн А ВН СЛДКНОКА Я пен» віх Но ТЕН» ТКеХКН Я тижні вик ТЗ пок ЩЕ І уми хх й 1: шт щук то Ж ощ о: г: що ст ОТ Ії то: ОЇ: г Бя 11 : У 1: її МОЩІ От ОЇ ОТ шк 11 1 МО т її КИ ще ме 1 хх Ії т рос 1 : го Ж лтОї їх В ше: От мо ЗМ ОТ: От м ШЕ ох с У хо ШЕ то Ж її: ПЕ : Ж шої її ЖИ І ме Її: ОД то: йо її пе ймо п МО: КИ то вЯ Ії ГИ о: ХХ її: КОД гої о Ії РОК І ХО: :ОЖЕХ г ХОЛ О Ох РОЖ по: КУ її ЖОДЕЩІ Ії ше 5 Оош Ой І о-е-х ж о: ОИ 1 ОКХ Ж змо ОЇ ЛЕ РОЛИ пООЖЕХ он З РОСИ Оу в ОТО ро УК ОБЖ ПООСИЖИК, її: ТОК ан ІОВ КОЇО СЛ ІОСОМИМ 1ОСЖИІИ вій 1: ТОЖ ІОВ ВОРОЖИХ РОЛІ по ЖЕ ОО Ол КОСИ тООЖЕІ щої о 1 ЛИлИ РОСИ по ОДИтЕ т КО ХО ОБЖ о НЯ 10 по, ї МНЕ. НН. ИН ОУН я 104 їООТИЦІ ПООШ пох с о зи МКК й ча с «ях г. зи БУ я. Мекка МНК, Жінка Мо мицее СК - пах се хр дек ОК капа Же Же БаездЕ Без х щ джкх кзіІху КЕЙ дар т Ше пахнлНМкІ о : 5 : Н ВХ осях ше ! ГУ й ї ВС з пили Ж : ! ї т Я ї них х а ме лод СЯ : ТО ПИ М її ПЕ : її ПІ ї її ПИШЕ у : її ПИ й х : п Її США Мк Тева ої ША Не ! Зв гої ПКИЕ «МА х : Н ПЕ зимлВк тм пої соуу з ї: : щ : СонооУ Зако ая НУ ПЕ Я БО : Не : КН пої ША Я ОК : жо Н ХенННу Ка о и З ИН я ОК сов ЗОН Й заава ЗОН а 4 х ще вимі нови Зх шЖ КЗ У М я Й Фіг: в їб» ди? НТ НН НН дю З ї х ПОЖВМЕО ОХ шт маги я Ве 1 фттт ож и дари : Н ЖИТО Я : Н щі Е дн КЕ кот я з ї ЦИХ : Шев Е ї ШИХ : Ї ОК : диня ш : ПВ ХО : ; ОК : ї ї мис : деки хол Е Н ЕК В НИ : Н У В ПЕ ст М ПИШИ ї ДИМ Мдьої Н УБОДАВН ї ПИ, срсиккек іх 1 : КЕ ї и ВОДНЕМ КУ : Ме ї Н о Е со В «АЙ Хе Н КИ, ї - КЕ ПИЩИК ення Куби Фк ЗАМ ин як пт кірх ХЕ Ні км
Зо єму пилм полити пий пи УМ ИМК, ШИМИ МИЛИ ТИ. ИН ПМ пи Ел КйИ Мт НН а нн в ЛОЖЕ а ОН жи їх пе ДИКЕ ПИ ДИЛИ ПТ ПІЦИ КИ ПЕТ Пе Три ли ОО ПКЕЕ КК ПИИЛИИНТ КЕ ШКІДНИК ТНИХ КЕ И МЕМ МИМ и КИТИ му ЕП ви и ПИ оп ШИК ПИШЕ Те за ІН у КЕШ Еш Еш пиши ВИ ШИ й ОО в М ОН и ВН п в НН Не Ж Ки В о и ЖІН уд ШК ОО БОМ ЛИШЕ ПОФОНЕ КО пове ТК ШИ ПИКА ТИ ти Кк ТИНИ т ШЕ т ТАМИ КНИШ Ж у НИ ЖИВ Болт ше и КЗ ДМ ДИ ЕД ИН ПЕ ПЕ ПИШНЕ І : їх не х МОСБИНЕ ше уи М Ат ПЕТ ВВ ЕК ННМІ КН НИКИ пи ї ПИШИ и НИ Е а ВО В ЕЕ ВИ Я Бо й Фе б. ЗЕД ПЕД ОТИТ ТІ ЗИ и ШИ ТТ х пп ет, - ї АККЕНе а о КНа не КЕдЕ КК ДТЕК КК х УК то У ВВ еквквнкь КН вн М и т ЕЙ ГНН ПИШШЮЮ ПИТ
ЩЕ. ТТ ПОН и нн Я оон нн се ЕП КИУ ТП М доня ЕН и В Кл ШО тот Вон он Зо в Кл ик и її ШИХ Корови во онов КВН со ВИПИТИ Кт х ШИШХ Ву ЩЕ ПЕКИ КЛОПИ ПИТИ ПМ ЛИЖ та Не ТТ ще ТТ по ШО ЕТЕШЮК нн ни ОК вн Ге а СУ ж кл І Б що не ОК ЕХ т пя . що о Бе Ії ПО . ТИХЕ Зк ШШЕПОК фІПИИПИ КНИШ ПИШЕТЕ ПИ ЗИМ ше ПХТ Ко ОА ШО. ПИЙИНИШИИИ пожИ ПИТ! ТИВ 0. пи шоЗ КВ пипп сш ШЕ о ВЕК . ТЕ . и ря ШИНОЮ Ер Ж ПОЕТ ПЕННІЕНИННВ ПЕТЯ ШО хх ШИ ФІЛЕ ИН КИЛИМ Ут ПИТИ тт и ХХ ЗаОНе є я шин ори о ЕЕ ! их . по 0 ООН ЕП ПЕН ПИТ ШИ ше 5 ШЕ о. ШЕ с п ТИВ : 0 о Кмин» ПИЛИОТОЙ . ШЛЕ род ї Ки ии тини А НИпИЛ и ППИЙИЛИ ЗИДЛИІ ОВ ная 1. Б ПВ ПК Що ДАК я ке ще КАК ЕК ХА Деві День Я День І
Фіг. 8 : 14 4 . шо ие : щої 7 пз Од : т Я ШИМИ : : її 1 десеттетет Мити, пахми Бе пак І КУ ї реніну І : Ех З ЗО бееооюввефротесссяї ви : Мо Ї : Щ КО раження : м й й - пе сн ломи : «Ж ої У ї ї пеня : Ку ї : Я -- У пф : КЕ пе ї й ї х : Я Я : В я : : КУ ої : Об вх : щ ї зорею ЗО КК - Ї шенні : Мепегегесесідносетнетноо ї ї ї со В : ї ї Ку 1 пе ві УВА и пас виацемо та енут-аащи я УК ж знаку Фіг З
Гожв за похезнинами У ТВ не пехиий пловее валок гени ГНюМміжннХ При Міирено Е сККННиК 1 МІКНМХ РІЖУЖИ інши СБУ лах ПЕЧАННЕ ВОК ИХ ЗЛНЦЕМКЄ опдапаАААААААЛАКАААААКАЛАААААЧАККААКАААКААЖАНААКАК КК ААААКАААААААКААААКААКАААКААААКАК КАК КК ААААЛААКААЛААНКА КАААААААЛККАК КАК АЖАЖКААКААКНКЯ. ШТ імен БІЙ г З СиЖК Коен лацю БЖ Кн мя . зт вда я Зк 5 ТЕ Беж ОХ ее Я МІК зе З ше Фі о ї З т Ес дети Бе ж зеянкннню ЗВУ КВН: о мах яке ТКУ є КЕ щи Я ї г. ТЖок ї Із явні ; » тегу ВИНИ ї Ж. хе :
: . т, не Ї ї л й в : и тка ї Бо ї " Б Н М і 7 ще ! ЩО я тя : х ї сс З с У вч Н Ту : м АХ. КУ ї в. Є 38 їх зо З: 5 5І Летентніють щеК
UAA201609808A 2014-02-24 2015-02-23 Композиції для лікування механічних пошкоджень нервів UA118785C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/187,841 US9393241B2 (en) 2009-06-02 2014-02-24 Compositions for treating CMT and related disorders
PCT/EP2015/053700 WO2015124763A1 (en) 2014-02-24 2015-02-23 New compositions for treating mechanical neuronal injuries

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118785C2 true UA118785C2 (uk) 2019-03-11

Family

ID=52669585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201609808A UA118785C2 (uk) 2014-02-24 2015-02-23 Композиції для лікування механічних пошкоджень нервів

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP3110411B1 (uk)
JP (1) JP6522641B2 (uk)
KR (1) KR20160126045A (uk)
CN (1) CN106456571B (uk)
AU (1) AU2015220717B2 (uk)
BR (1) BR112016019395A2 (uk)
CA (1) CA2940442C (uk)
EA (1) EA201691703A1 (uk)
ES (1) ES2774373T3 (uk)
IL (1) IL246919B (uk)
MX (1) MX2016010967A (uk)
SG (1) SG11201606485VA (uk)
UA (1) UA118785C2 (uk)
WO (1) WO2015124763A1 (uk)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017351638A1 (en) * 2016-10-26 2019-06-13 Genea Biocells USA (Holdings), Inc. Improved generation of muscle lineage cells and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070099947A1 (en) * 2005-11-03 2007-05-03 Alkermes, Inc. Methods and compositions for the treatment of brain reward system disorders by combination therapy
US20080255062A1 (en) * 2007-02-13 2008-10-16 University Of Manitoba Axon regeneration from adult sensory neurons
EP2065038A1 (en) * 2007-11-30 2009-06-03 Pharnext New therapeutic approaches for treating Charcot-Marie-Tooth disease
EP2135607A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Pharnext Combination of pilocarpin and methimazol for treating Charcot-MarieTooth disease and related disorders
EP2263665A1 (en) * 2009-06-02 2010-12-22 Pharnext New compositions for treating CMT and related disorders

Also Published As

Publication number Publication date
CA2940442A1 (en) 2015-08-27
CA2940442C (en) 2022-04-12
BR112016019395A2 (pt) 2017-10-24
ES2774373T3 (es) 2020-07-20
SG11201606485VA (en) 2016-09-29
CN106456571A (zh) 2017-02-22
AU2015220717A1 (en) 2016-08-25
WO2015124763A1 (en) 2015-08-27
JP2017507941A (ja) 2017-03-23
EA201691703A1 (ru) 2017-04-28
JP6522641B2 (ja) 2019-05-29
CN106456571B (zh) 2021-07-27
IL246919A0 (en) 2016-09-29
EP3110411B1 (en) 2019-11-06
AU2015220717B2 (en) 2020-03-26
IL246919B (en) 2020-04-30
MX2016010967A (es) 2016-11-29
EP3110411A1 (en) 2017-01-04
KR20160126045A (ko) 2016-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11672796B2 (en) Compositions for treating CMT and related disorders
US11576908B2 (en) Compositions for treating CMT and related disorders
EP2307000B1 (en) Combination of pilocarpin and methimazol for treating charcot-marietooth disease and related disorders
US20100310641A1 (en) Therapeutic approaches for treating cmt and related disorders
US20210317455A1 (en) Inhibitor of tdp-43 aggregation
UA118785C2 (uk) Композиції для лікування механічних пошкоджень нервів
US20220119819A1 (en) Formulation
AU2014256372A1 (en) New compositions for treating CMT and related disorders