UA118470C2

UA118470C2 - Варіант гфпд та спосіб його застосування

Info

Publication number: UA118470C2
Application number: UAA201610140A
Authority: UA
Inventors: Фабієн Поре; Фабиен Поре; Бернд Лабер; Бэрнд Лабер; Гудрун Ланге; Мануель Дубальд; Роксенн Армстронг; Роксэнн Армстронг
Original assignee: Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт; Байер Кропсайенс Акциенгезелльшафт; Байєр Кропсайєнс Лп; Байер Кропсайенс Лп
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2019-01-25
Also published as: MX2018014301A

Abstract

Винахід стосується ферментів ГФПД і рослин, що містять їх, і які демонструють повну стійкість до декількох класів інгібіторів ГФПД. Розроблений комплект ферментів ГФПД, що не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, і в той же час швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту, підвищену настільки, що інгібітори ГФПД більш не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але як повністю оборотні інгібітори, а саме надані ізольовані полінуклеотиди, які кодують поліпептиди стійкості до інгібіторів ГФПД. Додатково охоплені амінокислотні послідовності, що відповідають полінуклеотидам.

Description

Галузь техніки

Винахід стосується галузі молекулярної біології рослин, особливо, нових поліпептидів ГФПД, що надають підвищену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД.

Рівень техніки 4-гідроксифенілпіруватдіоксигенази (ГФІПД) - це ферменти, які каталізують реакцію перетворення пара-гідроксифенілпірувату (тут і далі скорочено ГФП), продукту деградації тирозину, у гомогентизат (тут і далі скорочено ГГ), попередник токоферолу й пластохінону в рослин (Стоисі М.Р. і ін. (1997), Теїігапеагоп, 53, 20, 6993-7010, Еге і ін. (2004), Ріапі Рпузіоїоду 134:1388-1400). Токоферол відіграє роль мембранно-асоційованого антиоксиданту.

Пластохінон, по-перше, діє як переносник електронів між РБЗІЇ і комплексом цитохром Бб/, їі по- друге, є редоксо-кофактором фітоєндесатурази, що бере участь у біосинтезі каротиноїдів.

На сьогоднішній день більше 1000 послідовностей нуклеїнових кислот у базі даних МСВІ анотовані як такі, що кодують передбачуваний білок з доменом ГФПД. Але для більшості цих білків не доведено ні того, що вони мають ферментативну активність ГФПД при аналізі іп міго або при підході іп ріапіа, ні того, що подібні білюи ГФПД можуть надати стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД при експресуванні їх у рослині. Деякі білки ГФПД і їх первинні послідовності були описані раніше в даній галузі техніки, зокрема білки ГФПД бактерій, таких як Рхеендотопах (Киеївспі і ін., Еиг. У. Віоспет., 205, 459-466, 1992, МО096/38567), Когаіа (МО2011/076889) зЗупеспососсив5 (М/О2011/076877) і Кподососсив (ММО2011/076892), протист, таких як Віерпагізта (МО2011/076882), евріархеотів, таких як Рісгорпйи5 (УМО02011/076885), рослин, таких як

Агарідорзіз (М/О96/38567, СЕМВАМКФ АРО47834), морква (МО 96/38567, СЕМВАМКФ 87257),

Ауепа займа (УО2002/046387, УМО2011/068567), пшениця (УМО2002/046387), Вгаспіагіа ріатурпуїйа /(М/02002/046387), Сепсиги5 еспіпайв (М/О2002/046387), І оїйшт гідідит (М О2002/046387), ЕРевіиса агипаіпасєа (М/О2002/046387), бЗеїапа їабей (МО 2002/046387),

ЕІеивзіпе іпаійса (М/02002/046387), сорго (М/О02002/046387, УО2012/021785), кукурудза (М/О2012/021785), Соссісоїдез (ЗЕМВАМКФ СОЇТКР), Соріїв |аропіса (МО2006/132279),

Спатудотопазх геіппагайії (Е5 2275365; ММО2011/145015), або ссавців, таких як миша або свиня.

Інгіібування ГФІПД приводить до роз'єднання фотосинтезу, недостатності допоміжних світлозбиральних пігментів і, що найважливіше, деструкції хлорофілу Уф-випромінюванням і

Зо активними формами кисню (знебарвлення) через недостатність фотозахисту, у нормі забезпечуваного каротиноїдами (Моггі5 і ін. (1995), Ріапі СеїЇ 7: 2139-2149). Знебарвлення фотосинтетично активних тканин приводить до інгібування росту й загибелі рослини.

Деякі молекули-інгібітори ГФПД, які інгібують перетворення ГФП у гомогентизат і які зв'язуються специфічно з ферментом, довели свою ефективність як гербіциди.

У цей час більшість комерційно доступних ГФПД-інгібіторів належать до одного з наступних хімічних сімейств: 1) трикетони, напр., сулькотріон (тобто 2-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)бензоїл|-1,3- циклогександіоні, мезотріон (тобто 2-(4-(метилсульфоніл)-2-нітробензоїл|-1,3-циклогександіоні|; темботріон Ігобто 2-(2-хлор-4-(метилсульфоніл)-3-((2,2,2,-трифторетокси)метилі| бензоїл|-1,3- циклогександіоні; тефурилтріон Їгобто 2-(2-хлор-4--«метилсульфоніл)-3-| (тетрагідро-2- фураніл)метокси|метилібензоїл|-1,3-циклогександіоні|; біциклопірон Ігобто 4-гідрокси-3-(2-(2- метоксіетокси)метил|-6-(трифторметил)-3-піридинілІкарбоніл|біцикло|3.2. Покт-3-ен-2-оні; бензобіциклон (гобто 3-(2-хлор-4-мезилбензоїл)-2-фенілтіобіцикло|3.2. Цокт-2-ен-4-оні; 2) дикетонітрили, напр. 2-ціано-3-циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл-4-трифторметилфеніл)- пропан-1,3-діон і 2-ціано-1-(4--(«метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3-(1- метилциклопропіл)пропан-1,3-діон; 3) ізоксазоли, напр. ізоксафлютол |гобто (5-циклопропіл-4-ізоксазоліл)(2-(метилсульфоніл)- 4-(трифторметил)феніл|Іметаноні. У рослинах ізоксафлютол швидко перетворюється в ДКН, дикетонітрильну сполуку, що виявляє властивості ГФПД-інгібітора; 4) піразолінати, напр., топрамезон тобто І3-(4,5-дигідро-3-ізоксазоліл)-2-метил-4- (метилсульфоніл) фенілі)(5-гідрокси-1-метил-1 Н-піразол-4-іл)метаноні і пірасульфотол |гобто (5- гідрокси-1,3-диметилпіразол-4-іл(2-мезил-4-трифторметилфеніл)метаноні; піразофен |гобто 2-

І4-(2,4-дихлорбензоїл)-1,3-диметилпіразол-5-ілоксиїацетофеноні; 5) М (1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензаміди (М/О2011/035874) ії М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)убензаміди (МО2012/126932), напр., 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 17"); б) М-(тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксаміди (М/О2012/028579), напр., 2-хлор-

З-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 273; 4-(дифторметил)-2-метокси-3-с«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- бо тетразол-5-іл)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 3"); 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-

метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 4"); 2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (тут і далі також називається "Спол. 5"); 7) Похідні піридазинону, як описано в УМО2013/050421 і М/О2013/083774; 8) Заміщені 1,2,5-оксадіазоли, як описано в УМО2013/072300 і ММО2013/072402; і 9) Похідні оксопразину, як описано в УМО2013/054495.

Ці інгібітори ГФПД можуть застосовуватися проти трави та/або широколистих бур'янів на полях з культурними рослинами, що демонструють метаболічну стійкість, такими як кукурудза (7еа таух), рис (Огу/а Заїїма) і пшениця (Тгйісит аевзіїмит), у яких вони швидко розкладають (Зеспиі? і ін. (1993), РЕЕВЗ ІеНегв5, 318, 162-166; Міїспеї! і ін. (2001), Резі Мападетепі Зсіепсе, Мої 57, 120-128; Сагсіа і ін. (2000), Віоспет., 39, 7501-7507; Раїей і ін. (2001), Резї Мападетепі

Зсіепсе, Мої 57, 133-142). З метою розширити спектр застосування цих гербіцидів-інгібіторів

ГФПД, були початі деякі зусилля для надання рослинам, особливо рослинам без метаболічної стійкості або з недостатнім її рівнем, достатнього в польових агрономічних умовах рівня стійкості.

Крім спроби обходу опосередкованого ГФПД вироблення гомогентизату (05 6,812,010), виконувалася також понадекпресія чутливого ферменту з метою зробити в рослині достатню кількість цільового ферменту по відношенню до гербіциду (М/096/38567). Понадекпресія ГФПД приводила до переважної досходової стійкості дикетонітрильного похідного (ДКН) ізоксафлютолу (ІФТ), але рівень стійкості був недостатнім для виникнення стійкості при післясходової обробки (Маїгіпде і ін. (2005), Ребзі Мападетепі бсієпсе 61: 269-276).

Третя стратегія полягала в тому, щоб мутувати ГФПД таким чином, щоб одержати цільовий фермент, який при збереженні здатності каталізувати перетворення ГФП у гомогентизат є менш чутливим до інгібіторів ГФПД, ніж природна ГФПД до мутації.

Ця стратегія успішно застосовувалася у виробництві рослин, стійких до 2-ціано-3- циклопропіл-1-(2-метилсульфоніл-4-трифторметилфеніл)-пропан-1,3-діону й до 2-ціано-1-|4- (метилсульфоніл)-2-трифторметилфеніл|-3-(1-метилциклопропіл)упропан-1,3-діону (ЕР496630), двох гербіцидів-інгібіторів ГФПД, що належать до родини дикетонітрилів (М/099/24585).

Рго215І ей, СіуЗзЗбОоїм, СІуЗ36б Пе, і більш конкретно СІуЗ36бТгр (положення мутуючих амінокислот

Зо позначені відносно ГФІПД Реепйдотопах Пиогезсеп5) були ідентифіковані як мутації, відповідальні за підвищену стійкість до обробки цими дикетонітрильними гербіцидами.

Не дуже давно введення гена ГФПД Рзейдотопазх Пиогезсеп5 у пластидний геном тютюну й сої показало більшу ефективність у порівнянні з ядерною трансформацією, надаючи стійкість при післясходовій обробці ізоксафлютолом (Ошоигтапгеї і ін. (2007), Ріапі Віоїесппої У).5(1):118- 33).

В МО2004/024928 винахідники задавалися метою підсилити біосинтез пренілхінонів (напр., синтез пластохінонів, токоферолів) у клітинах рослин за допомогою підвищення припливу попередника ГФП у клітини рослин. Це досягалося шляхом приєднання синтезу згаданого попередника до "шикиматного" шляху через понадекпресію ферменту префенатдегідрогенази (ПДГ). Вони також відзначали, що трансформування рослин геном, що кодують фермент ПДІ і геном, що кодують фермент ГФПД, уможливлює підвищення стійкості згаданих рослин до інгібіторів ГФПД.

В М/О2009/144079 розкриті послідовності нуклеснових кислот, що кодують гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (ГФПД) з конкретними мутаціями в положенні 336 білка ГФПД

Рзейидотопах Пиогезсеп5 і їх використання для одержання рослин, стійких до гербіцидів- інгібіторів ГФПД.

В ММО2002/046387 були ідентифіковані декілька доменів білків ГФПД, що мають походження з рослин, які можуть бути значимими для надання стійкості до різних гербіцидів-інгібіторів

ГФПД, але не показані ні дані іп ріапіа, ні біохімічні дані, що підтверджують вплив описаних функцій доменів.

В М/О2008/150473 була показана комбінація двох різних механізмів стійкості - модифікований ген Амепа займа мутантний фермент, що кодує ГФПД і СУР450 монооксигеназ кукурудзи (ген пвії) - з метою одержати поліпшену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, але не були розкриті дані, що демонструють синергетичні ефекти комбінації обох білків.

Далі, в О052011/0173718 описаний спосіб створення рослин, стійких до інгібіторів ГФПД, шляхом понадекпресії не тільки гена, що кодує стійкий ГФПД, наприклад, від Амепа заїїма, але й комбінації З декількома генами рослин, що кодують білок гот (гомогентизатсоланезилтрансферазу). Однак рівень стійкості до деяких вибраних гербіцидів - інгібіторів ГФПД був украй обмежений. 60 В УМО2011/094199 ії О52011/0185444 була оцінена стійкість декількох сотень ліній сої дикого типу до інгібітора ГФПД ізоксафлютолу. Дуже мало ліній показували прийнятний рівень стійкості до гербіцидів. Був ідентифікований передбачуваний ЛКП (локус кількісних ознак), відповідальний за стійкість. На цій ділянці генома як основної ознаки, яка відповідає за спостережувану поліпшену стійкість до інгібіторів ГФПД, був розпізнаний ген, що кодує транспортер АВС. Однак трансгенні рослини, які експресують ідентифіковані гени, не показували ніякого поліпшення стійкості до перевірених гербіцидів-інгібіторів ГФПД.

В УМО2010/085705 були описані декілька мутантних ГФПД Амепа заїїма. Було показано, що деякі варіанти демонстрували поліпшену стійкість іп міго до трикетону "мезотріону", однак у рослинах тютюну експресувалось дуже мало мутантів. До того ж, жодна з рослин тютюну, які експресують ці мутанти, не показала підвищеної стійкості до мезотріону або ізоксафлютолу в порівнянні з рослинами тютюну, що експресують ген ГФПД Амепа заїїма дикого типу.

ОБ 2012/0042413 описує поліпептиди, що проявляють активність ГФПД, але також демонструють певну нечутливість до принаймні одного інгібітора ГФПД, і також пропонує певний набір мутацій у різних положеннях ферментів ГФПД, і зрештою розкриває біохімічні дані й рівні стійкості рослин, що містять деякі подібні мутовані ГФПД. В ЕР 2453012 описані декілька мутантних ГФІПД; однак не показана підвищена стійкість описаних мутантів іп ріапіа до декількох гербіцидів-інгібіторів ГФПД.

Описані в цей час і частково комерціалізовані інгібітори ГФПД діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори (див. Могтізоп (1982) Тгтепаз Віоспет. сі. 7, 102-105).

Ці інгібітори зв'язуються повільно (тобто, з невеликою швидкістю асоціації, Коп), але не ковалентно з ферментом ГФІПД (тобто, вони дають залежне від часу зв'язування) і дуже повільне звільняються (тобто, з винятково малою швидкістю дисоціації, Кой) завдяки надзвичайно сильній взаємодії з ферментом.

Ці інгібітори зв'язуються настільки сильно, що стають можливими стехіометричні титрування з ферментом.

Усе ясніше стає те, що повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори є не тільки винятково сильними інгібіторами ГФПД, але також мають риси, що роблять їх привабливими агрохімікатами для боротьби з бур'янами. Мала швидкість дисоціації підсилює ефективність інгібітора настільки, що в ідеальному випадку достатньо усього однієї молекули

Зо інгібітора на активний сайт ферменту для повного інгібування його активності й збереження цього ж ступеню інгібування на тривалий період часу навіть під час відсутності вільних молекул інгібітора в рослинній клітині. Це обумовлює малу величину дози інгібіторів, що вимагається для боротьби з небажаними бур'янами в районах вирощування сільськогосподарських культур.

Властивості повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів мають перевагу в тому випадку, коли метою є досягнення інгібування ГФПД і гербіцидна активність.

Однак ці ж властивості є великим недоліком у випадку, коли необхідно проектувати стійкі до цих інгібіторів ферменти ГФПД. Мутації у ферменті ГФПД, які тільки знижують афінність інгібітора до ферменту (рібо), не можуть повністю подолати інгібування ГФПД, оскільки зв'язування інгібітора й інгібування ферменту ГФПД усе ще можуть мати місце й, відповідно, досягнутий рівень інгібування буде утримуватися довгий час навіть під час відсутності вільного інгібітора в рослинній клітині.

Завдяки вищеописаним кінетичним властивостям усіх описаних у цей час і частково комерціалізованих гербіцидів-інгібіторів ГФПД, до сьогоднішнього дня не було створено рослин, повністю стійких до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, незважаючи на численні зусилля в їх створенні.

Короткий опис винаходу

У даному винаході описані ферменти ГФПД і рослини, які їх містять, що демонструють повну стійкість до декількох класів інгібіторів ГФПД. З'ясувалося, що для створення таких ферментів

ГФПД із максимальною або повною стійкістю до інгібіторів ГФПД більш важливо підвищити швидкість дисоціації (Кої) повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів, ніж понизити їх афінність до ферменту (рібо), якщо необхідно досягти стійкості до інгібітора. В ідеалі необхідно одночасно досягти зниження афінності інгібітора до ферменту ГФПД (рі5БО) і підвищити швидкість дисоціації інгібітора з ферменту ГФПД (КоОй) у мутантному ферменті, щоб одержати високий рівень стійкості до інгібітора.

У запропонованому винаході ця мета була досягнута розробкою комплекту ферментів

ГФПД, що не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, і в той же час швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту підвищену настільки, що інгібітори ГФПД більш не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але як повністю оборотні інгібітори.

У запропонованому винаході надані композиції й способи для одержання ферментів ГФПД, бо що мають вищезгадані властивості (тобто, що не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, підвищену швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту; інгібітори ГФПД більше не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але як повністю оборотні інгібітори). Композиції включають ГФПД і ізольовані, рекомбінантні або химерні молекули нуклеїнової кислоти, що кодують такі поліпептиди, а також вектори й клітини-хазяїни, що містять ці молекули нуклеїнової кислоти. Композиції також включають антитіла до цих поліпептидів. Нуклеотидні послідовності можуть бути використані в конструкціях ДНК або касетах експресії для трансформації й експресії в організмах, включаючи мікроорганізми й рослини. Нуклеотидні послідовності можуть бути синтетичними послідовностями, розробленими для експресії в організмі, включаючи, але не обмежуючись ними, мікроорганізм або рослину.

Композиції включають молекули нуклеїнової кислоти, що кодують стійкі до гербіцидів поліпептиди, включаючи молекули нуклеїнової кислоти, що кодують ГФПД-білок Рзендотопав

Пиогезсеп5, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕО ІЮ МО-1 і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений у будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33, також як і його фрагменти.

Композиції також включають трансформовані рослини, рослинні клітини, тканини й насіння, стійкі до гербіцидів-інгібіторів ГФПД завдяки введенню послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом у геном рослин, рослинних клітин, тканин і насіння. Введення послідовності дозволяє застосовувати гербіциди-інгібітори ГФПД до рослин для селективного знищення чутливих до інгібітора ГФІПД бур'янів або інших нетрансформованих рослин, але не трансформованого організму. Послідовності можуть також бути використані як маркер для селекції рослинних клітин, вирощуваних у присутності одного або більше гербіцидів-інгібіторів

ГФПД.

Додатково викладаються способи ідентифікування ферменту ГФПД із активністю стійкості до інгібіторів ГФПД.

Композиції й способи згідно з винаходом корисні в створенні організмів з посиленою стійкістю до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Ці організми й композиції, що містять організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Рослини або насіння, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом, можуть бути вирощені в полі й зібрані для одержання рослинного продукту. Композиції згідно з винаходом також корисні у виявленні присутності стійких до інгібіторів ГФІПД білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах.

Короткий опис креслень

На Фігурі 1 показане вирівнювання амінокислотних послідовностей ГФПД видів мікробів і рослин, включаючи Рзейдотопах Пиогезсепз (РІ, 5ЕО ІЮ МО:1), Амепа займа (5ЕБО ІЮ МО:38), варіант ГФПД Амепа заїїма (ЗЕО ІО МО:39), 7еа тауз5 (5ЕО ІЮО МО:40), бБігеріотусе5 амегтійіів (ЗЕО ІЮ МО:44), Агарідорзів ІНаійапа (5ЕО ІО МО:41), Ногаєит муціІдаге (ЗЕО ІЮ МО:42), Байсив сагоїа (ЗЕО ІЮ МО:43), МусозрпаеєгеїІа дгатіпісоїа (ЗЕО ІЮ МО:45) і Соссісоїде5 іттіїй5 (ЗЕО ІЮ

МО:46).

На Фігурі 2А показаний приклад залежного від часу інгібування мутантного залежного від часу ферменту ГФПД у присутності 1 мкМ інгібітора ГФПД. На фігурі 28 показаний приклад оборотного інгібування оборотного мутантного ферменту ГФПД у присутності 10 мкМ інгібітора.

Детальний опис винаходу

Нижче даний винахід буде описаний більш повно з посиланнями на додані креслення, на яких показані деякі, але не всі варіанти здійснення винаходу. Насправді, дані винаходи можуть бути здійснені в багатьох різних формах і не повинні бути витлумачені як обмежені наведеними варіантами; скоріше, ці варіанти наведені для задоволення даного розкриття застосовним вимогам закону. Ті самі номерні позначення всюди позначають ті самі елементи.

Фахівцеві в галузі техніки, до якої належать ці винаходи, при наявності переваг інформації, надаваної даним документом у вищезгаданих описах і зв'язаних з ними кресленнях, можуть згадатися багато модифікацій і інших варіантів здійснення винаходів. Тому слід розуміти, що винаходи не обмежуються конкретними описаними варіантами здійснення й що модифікації й інші варіанти здійснення передбачається охопити в обсязі доданої формули. Хоча тут і далі використовуються специфічні терміни, вони використані в узагальненому й описовому розумінні й не з метою обмеження.

Огляд

Було почато декілька спроб для надання рослинам агрономічно прийнятного рівня стійкості 60 до широкого спектра гербіцидів-інгібіторів ГФОД, включаючи обхід опосередкованого ГФПД вироблення гомогентизату (05 6,812,010), понадекпресію чутливого ферменту з метою виробити в рослині достатню кількість цільового ферменту стосовно гербіциду (М/О96/38567), і мутацію ГФПД таким чином, щоб одержати цільовий фермент, який при збереженні здатності каталізувати перетворення ГФП у гомогентизат є менш чутливим до інгібіторів ГФПД, ніж природна ГФПД до мутації.

Незважаючи на ці успіхи в розробці рослин, що демонструють стійкість декількох гербіцидів- інгібіторів ГФПД, усе ще необхідно розробити та/або поліпшити стійкість рослин до більш нових або декількох різних інгібіторів ГФПД, зокрема інгібіторів ГФПД, що належать до класів трикетонів (напр., сулькотріону, мезотріону, темботріону, бензобіциклону й біциклопірону), піразолінатів (напр., топрамезону й пірасульфотолу), М-(1,2,5-оксадіазол-З3-іл)бензамідів (М/О2011/035874), М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-іллуарилкарбоксамідів (М/О2012/028579), похідних піридазинону (М/02013/050421 і УУО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О2013/072300 ії УМО2013/072402); і похідних оксопразину (ММО2013/054495).

Таким чином, даний винахід надає поліпшені композиції й способи для регулювання стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Гербіциди-інгібітори ГФІПД, такі як клас М-(1,2,5- оксадіазол-З3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-іляуарилкарбоксамідів, таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл/бензамідів, таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3--сметилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4- (дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3--(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідні піридазинону (МИО2013/050421 і ММО2013/083774); заміщені 1,2,5-оксадіазоли (МИО2013/072300 і УМО2013/072402); і похідні оксопразину (М/О02013/054495); трикетони, такі темботріон, сулькотріон і мезотріон; клас ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або клас піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон, мають видатну гербіцидну активність проти широкого спектра економічно важливих однодольних і дводольних однолітніх шкідливих рослин.

Зо Активні речовини також ефективно діють на багаторічні шкідливі рослини, що пускають відростки від ризом, деревної маси або інших багаторічних органів і з якими складно боротися.

У рамках даного винаходу "гербіцид" слід розуміти як гербіцидно активну субстанцію саму по собі або таку субстанцію, яка скомбінована з добавкою, що змінює її ефективність, таку як, наприклад агент, що підвищує активність (синергетичний агент), або обмежуючий активність агент (запобіжник). Гербіцид також може містити тверді або рідкі ад'юванти або носії, звичайно використовувані в технології приготування (напр., природні або регенеровані мінеральні субстанції, розчинники, диспергатори, змочувані агенти, агенти для надання клейкості, емульгатори, агенти посилення росту й т.п.), також як і один або більше пестицидів (напр., інсектицидів, вірицидів, мікробицидів, амебоцидів, пестицидів, фунгіцидів, бактерицидів, нематицидів, молюскоцидів і т.п.)

Способи включають трансформування організмів нуклеотидними послідовностями, що кодують ген стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом або іншим способом гени, що вносять такі, стійкості до інгібітора ГФПД в організми, що їх не містили (напр., спарюванням, злиттям клітин, або схрещуванням організмів, що містять введений ген інгібітора ГФПД згідно з винаходом з організмами, що його не містили, й одержанням потомства, що містить такий ген).

Нуклеотидні послідовності згідно з винаходом корисні для створення рослин, що демонструють підвищену стійкість до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищену стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-

Б-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-5-іл)- або

М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4--дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-

М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3--«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметилуібензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 її УО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О02013/072300 і

УМО2013/072402); і похідних оксопразину (ММО2013/054495); трикетонів, таких темботріон, бо сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон. Ген стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом може також демонструвати стійкість до "гербіцидів-похідних кумарону" (описані в УМО2009/090401,

УМОо2009/090402, УМО2008/071918, УМО2008/009908). Щодо цього будь-який з генів стійкості до інгібітора ГФПД згідно з винаходом може також експресуватися в рослині, що експресує також химерний ген гомогентизатсоланезилтрансферази (ГСТ) або мутантний ген ГСТ, як описано в

УМО2011/145015, УМО2013/064987, УМО2013/064964 або ММО2010/029311, для одержання рослин, стійких до гербіцидів-інгібіторів ГОСТ. Тут і далі терміни "гербіцид-похідне кумарону" або "гербіцид-інгібітор ГОСТ" охоплюють сполуки, що підпадають під номенклатури ІШРАС 5Нн- тіопірано(4,3-бБ|Іпіридин-8-ол, / 5Н-тіопіраноЇ3,4-б|Іпіразин-8-ол, оксатіїно|5,6-б|Іпіридин-4-ол.КЧ/ і оксатіїно|5, 6-б|піразин-4-ол.

Таким чином, під геном "стійкості до інгібітора ГФПД" згідно з винаходом слід розуміти ген, що кодує білок, який надає клітині або організму здатність переносити більш високі концентрації інгібітора ГФПД, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити деяку концентрацію інгібітора ГФПД протягом більш тривалого часу, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж який надає клітині або організму здатність виконувати фотосинтез, рости та/або розмножуватися з меншими ушкодженнями або інгібуванням росту, ніж спостережувані в такої ж клітини або організму, які не експресують подібний білок. "Білок стійкості до інгібітора ГФПД" включає білок, який надає клітині або організму здатність переносити більш високі концентрації інгібітора ГФПД, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж переносити деяку концентрацію інгібітора ГФПД протягом більш тривалого часу, ніж така ж клітина або організм, які не експресують білок, або ж який надає клітині або організму здатність виконувати фотосинтез, рости та/або розмножуватися з меншими ушкодженнями або інгібуванням росту, ніж спостережувані в такої ж клітини або організму, які не експресують подібний білок. Під "стійким" або "стійкістю" слід розуміти або здатність пережити застосування конкретного гербіциду-інгібітора ГФПД, або здатність виконувати найважливіші клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка, дихання або розмноження таким чином, який не відрізняється явно від присутнього в необроблених клітин або організмів, або ж здатність рослин, оброблених гербіцидом-інгібітором ГФПД, не мати значної різниці у врожайності або навіть мати поліпшену врожайність у порівнянні з такими ж

Зо рослинами, необробленими таким же гербіцидом (але для яких бур'яни забирали або запобігали їх появі за допомогою іншого механізму, ніж застосування гербіциду-інгібітора ГФПД, таким як способи, описані в М/О2011/100302, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання).

Крім надання клітині стійкості до інгібіторів ГФПД, послідовності нуклеїнових кислот ГФПД згідно з винаходом також кодують поліпептиди, що мають ГФПДдД-активність, тобто, які каталізують реакцію, у якій пара-гідроксифенілпіруват (ГФП) перетворюється в гомогентизат.

Каталітична активність ферменту ГФПД може бути визначена різними відомими в даній галузі методами. М/О2009/144079 описує різні підходящі методи скринінгу.

Ферментативна активність білків ГФІПД може бути виміряна будь-яким методом, що дозволяють визначити або зниження кількості ГФП або О»2 субстратів, або накопичення будь- яких продуктів ферментативної реакції, тобто гомогентизату або СО». Зокрема, активність ГФПД може бути виміряна за допомогою методу, описаного в М/О2009/144079; Сагсіа і ін. (1997),

Віоспет. 4). 325, 761-769; Сагсіа і ін. (1999), РіІапі Рнузіої. 119, 1507-1516; або в УУМО2012/021785, які включені в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.

Для цілей даного винаходу "еталонний" білок ГФПД (або ген ГФПД) - будь-який білок ГФПД або нуклеїнова кислота, з якої порівнюється білок ГФПД або нуклеїнова кислота ГФПД згідно з винаходом. Для цілей опису білків ГФПД згідно із запропонованим винаходом терміни "білок" і "поліпептид" використовуються взаємозамінно. Еталонним ГФПД може бути природна рослинна, бактеріальна або тваринна ГФПД, або ж мутантна ГФПД, відома з рівня техніки, така як мутанти РІР215І і РІСЗ3З36Е, описані в Публікації міжнародної заявки М/О2009/144079 і викладені тут як відповідно ЗЕО ІЮ МО:20 і 2, або ж може бути будь-яким з білків РІНРРОЄмо33,

РІНРРОЕмо3б, РІНРРОЄмоз37, РІНРРОЄмо40 або РІНРРОЕмо41, викладених тут як відповідно

ЗБЕО ІЮ МО:6 і 34-37, які також описані в Міжнародній патентній заявці РСТ/О52013/59598, поданій З вересня 2013 року й включеної в даний опис шляхом посилання. Подібна еталонна

ГФПД може бути використана для визначення того, чи має білок або нуклеїнова кислота ГФПД згідно з винаходом особливу властивість, що представляє інтерес (напр., поліпшену, порівнянну або знижену стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД або активність ферменту ГФПД; поліпшену, порівнянну або знижену експресію в клітині-хазяїні; поліпшену, порівнянну або знижену стабільність білка й т.п.) 60 У різних варіантах здійснення винаходу стійкий до гербіциду-інгібітора ГФПД білок, який кодується нуклеїнової кислотою (включаючи його ізольовані, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяїни, рослини, частини рослини й насіння, що містять нуклеїнові кислоти, поліпептиди ГФПД і їх композиції, які кодуються нуклеїнової кислотою, також як і способи використання білка, який кодується нуклеїнової кислотою, для підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу

М-(1,2,5-оксадіазол-3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)у- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4- оксадіазол-2-іл)/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (М/О2013/072300 і УМО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон) містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕБО ІОЮО МО і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений у будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33.

Під "відповідним" слід розуміти положення нуклеотиду або амінокислоти відносно такого положення в 5ЕО ІЮО МО:1, коли дві (або більше) послідовності вирівняні з використанням стандартних алгоритмів вирівнювання, описаних тут в інших розділах. Характерне вирівнювання

ЗЕО ІЮ МО:1 з амінокислотними послідовностями ГФПД різних видів мікробів і рослин показано на Фігурі 1. Наприклад, положення амінокислот 188, 215, 335, 336, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО 1 відповідають положенням амінокислот 241, 271, 412, 413, 416 їі 417, відповідно, ГФПД Амепа займа (ЗЕО ІО МО:38); положенням амінокислот 235, 265, 406, 407, 410 ї 411, відповідно, ГПД

Ногдешт миЇдаге (ЗЕО ІЮ МО:42) і положенням амінокислот 242, 272, 413, 414, 417 їі 418, відповідно, ГФПД еа таухє (ЗЕБЕО ОО МО:40). Вирівнювання безлічі амінокислотних послідовностей ГФПД різних видів також можна знайти в Таблицях 2а й 265 Європейської патентної публікації Мо ЕР2453012, яка включена в даний опис шляхом посилання. Відповідно, залежно від довжини розглянутої амінокислотної послідовності ГФОПД, що має більше або менше залишків, ніж послідовність зЕО ІЮ МО:1 відповідне положення може розташовуватися в положенні, що відрізняється від положень 188, 189, 200, 215, 226, 335, 336, 339 і 340 у такому розглянутому білку ГФПД.

В одному варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 ЗЕО ІЮ МО:1, ії фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1.

В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕБЕО ІЮ МО, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО :1 і іі. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і іі. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200

ЗЕО ІЮ МО:1; і 60 м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти

215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІЮ

МО:1; і міі. гістидин, ізолейцин, лейцин, метіонін, глутамін, аргінін, аланін, лізин, серин, треонін або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і мії. аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮО МОЛ, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО :1 і і. аланін, гліцин, гістидин, серин або триптофан у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮ МО-:1; і ії. аргінін, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, гістидин, фенілаланін або серин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200

ЗЕО ІЮ МО:1; і м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІЮ

МО:1; і мі. серин, аланін, треонін, глутамін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і мії. аланін, аргінін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин або лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО 10 МО 1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕБО ІЮ МО/1, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЕС 10 МО: і іі. аланін, або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і іі. аргінін, цистеїн, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮ МО:1; і їм. ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200

ЗЕО ІЮ МО:1; і м. аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 ЗЕ ІЮ МО:1; і мі. гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮ

МО:1; і міі. аланін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 ЗЕО ІО МО:1; і мії. аланін, глутамінову кислоту, глутамін або гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО І МО:1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5БЕО ІО МО:1.

В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- 60 хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 ЗЕО ІО МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5БЕО ІО МО:1; і глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮ МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО І МО1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІЮО МО:1; і ім. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і м. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮО МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

В іншому варіанті здійснення ГФПД згідно із запропонованим винаходом (включаючи, нуклеотидну послідовність, що її кодує, і її рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини- хазяїни, рослини, частини рослин і насіння, що містять нуклеотидну послідовність, що кодує 60 ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. аланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 ЗЕО ІЮ МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. ізолейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО-:1; і ії. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5БЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. ізолейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО-:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО І МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1; і ії. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і і. лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІО МО-:1; і ії. гістидин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІО МО-1; і ім. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІО МО-1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5БЕО ІО МО:1; і іі. гліцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮО МО:1; і ії. цистеїн у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ім. аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5БЕО ІО МО-:1; і м. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ

МО-1.

ГФПД згідно з винаходом) складається з амінокислотної послідовності, що містить і. пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮ МО:1; і а. фенілаланін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІО МО:1; або р. тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1; і іі. гістидин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 ЗЕО ІО МО:1; і ії. глутамінову кислоту в положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 ЗЕО ІЮ

Зо МО-1.

Відповідні положення амінокислот еталонних білків ГФПД і білків ГФПД згідно з винаходом, що містять одну або більше заміщень амінокислот, підсумовані в Таблиці 1.

Таблиця 1

Заміщення амінокислот еталонних білків ГФПД і білків ГФПД згідно з винаходом, відносно 5ЕО

ІО МО/:1, також містить колонку 1 з ідентифікаційним номером клону й відповідним ЗЕО ІЮ МО згідно з переліком послідовностей і посилань в описі. У випадку порожньої комірки в цьому положенні знаходиться амінокислотна послідовність дикого типу (РІНРРО).

РІНРРО | (1 А |в | Р (0 в | (ік А рРОЗЗВЕ |! 7772 11117171 ТТ

РОЗВ! 77 з 7117 Г17111111ГМ

РОЗМ |! 4 11717171 мМм1 6959... | ..5 |! ГГ її Р

РЕМЗ3З3 | 6 | / / ГГ РМ 1

РЕМАЗ | 7 2 Щ | Її 1 її Р в її

РЕМА. | (ФВ ЇЇ 11711711 РМ 1 її

РІО! 779 ЦЮ 1 1 1 Р |в А ОО вРІЗО ЇЇ 77ло 17 Г171717717171111711Р (є | 1

РІЗ Її 11711171 Р є Її

РО | 7712 | 17 ГГ Р (є | ЕЕ

Кізі Г777711377 ГГ Г1117171771717171111711Р ДМ ФА 0 кІз2 7 Г7771714 17171171 Р1М

КкІ37 7 Г77711115 1717 Г171711111ГР М ЄС 1

Кгоз 7777716 11711711 Р ЇМ | г го | 717 (а |сС | 1-4 Її Р (є | с

Таблиця 1

Кг55 | 777718 17117117 лА ЇЇ Р (є | ЕЕ

Кг58 ЇЇ 77777197 17111711 ГР (є | ЕЕ

Кг3я/ Ї777712го 11711111 ко Г777717211 11711171 Р є Її с кзо3 7 Г77771122 | 11711111 ГР (є | 0 кзо4 7 Ї77777723 117111 1мМ 1 Її Р (є | ЕЕ кзоб6 7 Ї 77777724 17 Ї171171717711111- 13. Р (є | ЕЕ ках | 725 (а |С | м Її Р | | ГЕ кз57 | 26 (а |С | 171 Р | | ГЕ ко Ї777711127 17111711 1Р (є | 1 кв 77771728 117117 1мМ 17717 ЇЇ Р (є | ЕЕ кзв3 7 Ї777771729 117 Ї111717177171717171111113. Р (є | 0 као5 | 30 2 2 (а |С | А | Р | | (ГЕ каб | 777731 (а (6 | м ЇЇ Р | | ГЕ као7 | 732 (а (ЕЕ | м ЇЇ Р | | ГЕ ка | 33 2 (а (0 |! м Її Р |(є | ГЕ

В іншому варіанті здійснення послідовність білків ГФПД згідно з винаходом принаймні на 53 95, принаймні на 60 95, принаймні на 65 95, принаймні на 70 95, принаймні на 75 95, принаймні на 80 95, принаймні на 85 95, принаймні на 90 95, принаймні на 91 95, принаймні на 92 95, по меншій мері на 93 95, принаймні на 94 95, принаймні на 95 95, принаймні на 96 95, принаймні на 97 95, принаймні на 98 95 або принаймні на 99 95 ідентична до амінокислотної послідовності, викладеної тут як БЕО ІЮ МО:1.

Типові послідовності ГФПД, які можуть бути модифіковані згідно із запропонованим винаходом, включають такі бактерій, наприклад, типу Рхейпдотопавх 5р., або ж ціанобактерій, наприклад, роду Зупеспосубії5. Послідовність також може мати рослинне походження, зокрема походити від однодольних або дводольних рослин. Як корисні приклади можна процитувати такі рослини, як тютюн, Агарідорвзі5 Іпаіййапа (М/096/38567), ЮБайсив сагоїа (М/096/38567), 7є6єа тауз (кукурудза, УМО2012/021785), пшениця (Тиййсит аевзімит, УМО2002/046387), ячмінь (ЕР2453012), Амепа бваїйма (МмО2002/046387ЛМО2011/068567), Вгаспіага ріадзурпуйа (МО2002/046387),

Сепснгив еспіпайи5 (МО2002/046387), І от гідідит (М/02002/046387), Ревіиса аппаіпасеа (ММО2002/046387), беїагіа Ттабегі (М/О2002/046387), ЕІвизіпе іпаіса (М/О2002/046387), або сорго (МИО2002/046387, УМО2012/021785). У конкретному варіанті здійснення винаходу ГФПД, яка може бути модифікована згідно із запропонованим винаходом, має бактеріальне або протистне походження, зокрема від Рзепдотопа5 5р., більш конкретно від Рхеидотопа5 Пиогезсепв,

Реєпдотопаз риїйда, Рвепдотопаз аегидіпозва, Рвбецйдотопавз іевіовівгопі (Сотатопав

Іевіовіегопі), НПодососсив в5р. (УММО2011/076892), Віернагвта |аропісит (МО2011/076882), зЗупеспососси5 5р. (ММО2011/076877), Когаїа аїдісіда (М/02011/076889), від евриархеота

Рісгорпйив5 їоггідиб5 (ММО2011/076885), або ж рослинне походження, включаючи від Агабрідорвів

Таїїапа, Зогопйит бБісоїог, Огула 5аїїма, Тгйісит аевіїмит, Ногдешт мцідаге, Гоїїшт гідійшт або

Ауепа заїїма.

Для цілей даного винаходу ГФПД згідно з винаходом може також включати подальші модифікації, наприклад, у яких деякі амінокислоти (напр., від 1 до 10 амінокислот) замінені, додані або вилучені для цілей клонування, злиття транзитних пептидів і т.п., зберігаючи при

Зо цьому активність ГФПД, тобто здатність каталізувати перетворення пара-гідроксифенілпірувату в гомогентизат, або ж може бути будь-який інший ГФПД, що може бути далі вдосконалена.

Наприклад, ГФПД, яка може бути далі вдосконалена описаними тут модифікаціями, може бути варіантом ГФПД, отриманою від Рзхендотопах ПЙпиогезсеп5, викладеною тут як будь-яка з ЗЕО ІЮ

МО:34-37, варіантом ГФПД, отриманою отАмепа заїїма, викладеною тут як 5ЗЕО ІЮ МО:38, варіантом послідовностей ГФПД, викладених тут як будь-яка з БЕО ІЮ МО:3-326, 383-389, 393, 395 і 397-459 в УМО2012/021785, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; послідовностями ГФПД, викладеними як будь-яка з ЗЕО ІЮ МО:2-14 і 20-50 в

ММО2011/068567, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; послідовностями ГФПД, викладеними як будь-яка з 5ЕО ІЮ МО:15-26 в УМО2010/08570, яка включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних в УМО2009/144079 або Патенті США 6,245,968, кожний з яких включений у даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання; ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних у Таблицях 1, 2, 5 або 6 УМО2010/085705; та/"або ГФПД, що має одне або більше заміщень, описаних у Таблиці 1 М/О2011/068567.

У деяких варіантах здійснення нуклеотидна послідовність згідно з винаходом (включаючи її ізольовані, рекомбінантні й химерні гени, вектори, клітини-хазяїни, рослини, частини рослини й насіння, що містять послідовності нуклеїнових кислот, амінокислотні послідовності і їх композиції, які кодуються послідовністю нуклеїнової кислоти, також як і способи використання послідовності нуклеїнової кислоти для підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, особливо підвищення стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-3- іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл"арилкарбоксамідів, переважно таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-5-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

МО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон) кодує амінокислотну послідовність, викладену в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО:7-33, а також її фрагменти й варіанти, що кодують поліпептид стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД.

А. Методи вимірювання стійкості до інгібітора ГФПД

Для оцінки послідовностей ГФПД згідно з винаходом може бути застосований будь-який підходящий метод вимірювання стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД. Стійкість може бути виміряна шляхом відстеження здатності клітини або організму пережити застосування конкретного гербіциду-інгібітора ГФПД, або здатності виконувати найважливіші клітинні функції, такі як фотосинтез, синтез білка, дихання або розмноження таким чином, який не відрізняється явно від присутнього в необроблених клітин або організмів, або ж здатність рослин, оброблених гербіцидом-інгібітором ГФПД, не мати значної різниці у врожайності або навіть мати поліпшену врожайність у порівнянні з такими ж рослинами, необробленими таким же гербіцидом (але для яких бур'яни забирали або запобігали їх появі за допомогою іншого механізму, ніж застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). У деяких варіантах здійснення стійкість може бути виміряна за видимим індикаторним фенотипом клітини або організму, трансформованого нуклеїнової кислотою, що містить ген, що кодує відповідний білок ГФПД, або в аналізі іп міго білка ГФПД, у присутності різних концентрацій різних інгібіторів ГФПД. Реакції на дози й відносні зсуви в реакціях на дози, пов'язані з такими індикаторними фенотипами (утворення коричневого кольору, інгібування росту, знебарвлення, гербіцидний ефект і т.д.), для зручності виражені, наприклад, значеннями СК50 (концентрація, що викликає 50 95-е інгібування росту) або МІК (мінімальна інгібуюча концентрація), де підвищення значень відповідає підвищенню стійкості, властивої експресованому ГФПД, звичайним способом, грунтуючись на ушкодженні рослин, симптомах знебарвлення меристеми і т.д. у діапазоні різних концентрацій гербіцидів. Ці дані можуть бути виражені, наприклад, значеннями СК50, отриманими із кривих доза/реакція, де на осі х нанесена "доза" і на осі в нанесені "відсоток загибелі", "гербіцидний ефект", "кількість зелених рослин, що зійшли " і т.д., де підвищені значення ЗК50 відповідають підвищенню рівня стійкості, властивої експресованому ГФПД. Гербіциди можуть бути застосовані підходящим чином до сходів або після сходів.

У різних варіантах здійснення рівень стійкості нуклеїнової кислоти або гена, що кодує білок

ГФПД згідно з винаходом, або білка ГФПД згідно з винаходом, може бути перевірений переносом генів, регенерацією, розмноженням і розпилювальними тестами тестової рослини, такої як тютюн, або сільськогосподарської рослини, такої як соя, кукурудза або бавовник. Згідно з результатами такої перевірки, подібні рослини більш стійкі бажано переносять дозу принаймні в 2 рази більше нормальної дози, рекомендованої для застосування в полі, ще більш переважно переносять дозу до 4-х раз більше нормальної дози, рекомендованої для застосування в полі, гербіцидів-інгібіторів ГФПД (напр., гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М- (1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-З3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і бо 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-

оксадіазол-2-іл)/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«(трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, таких темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, таких як пірасульфотол і топрамезон), ніж подібні рослини, що не містять ніякого екзогенного гена, що кодує білок ГФПД, або чим рослини, що містять ген, що включає еталонну ГФПД-кодуючу ДНК, наприклад, ГФПД- кодуючу ДНК Рзейдотопав5 Пиогезсеп5, під контролем того ж промотору, що й у нуклеїнової кислоти, що кодує білок ГФПД згідно з винаходом. Відповідно, термін "здатний підвищувати стійкість рослини до принаймні одному гербіциду, що діє на ГФПД" означає стійкість рослини, що експресує ГФПД згідно з винаходом, до дози принаймні в 1, в 2, або в 3, або в 4 або більше разів більше нормальної польової дози гербіциду-інгібітора ГФПД у порівнянні з рослиною, що експресує тільки власний ендогенний ГФПД або рослиною, що експресує еталонний фермент

ГФПД. Щодо цього термін "гербіцид, що діє на ГФПД" не обмежується субстанціями, відомими та/або використовуваними як гербіциди, але стосується також будь-яких субстанціям, які інгібують каталітичну активність білків ГФПД.

Альтернативно, на кількісному рівні дані, подібні ріго (значення ріго означає логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 95 ферментативної активності, у молярній концентрації), можуть бути отримані для білка ГФПД згідно з винаходом і зрівняні з егалонною послідовністю ГФПД у присутності або відсутності будь-яких відповідних гербіцидів-інгібіторів

ГФПД.

Спеціальним, хоча й не обмежуючим, типом аналізу, який може бути використаний для оцінки послідовностей ГФПД згідно з винаходом, є колориметричний аналіз. У цьому аналізі культуральне середовище типу триптон-дріжджового бульйону (У1-ЮОгоїй) з 1 95 агарози, 5 мМ /1-

Зо тирозину й 42 мМ сукцинату, що містить селективний агент для вектора ро5Е420 (Іпмігодеп,

Карлерує, Німеччина) або модифіковану версію роЕ420 (р5Е429(ЕІ)МХ), заливають у планшети із глибокими лунками. У кожну лунку вносять культуру Е. соїї в експонентній фазі росту, що містить вектор р5Е420-НРРОХ (НРРОХ означає будь-який ген, що кодує передбачуваний фермент/білок ГФІД). Після 16 годин при 37 "С лунки, що не містять культурального середовища, ті, які були засіяні культурою Е. соїї, що містить порожній вектор рЗЕ420, є прозорими, або ж ті, які були засіяні культурою Е. соїї, що містить вектор РЗЕ420-НРРОХ, що включає ген, який кодує неактивну ГФПД, є прозорими, у той час як лунки, засіяні культурою Е. соїї, що містить вектор РЗЕ420-НРРОХ, що кодує активну ГФПД, є коричневими. Попередньо було показано, що цей тест відображає активність ГФПД, яким би не було джерело цієї активності, і дозволяє ідентифікувати активності ГФПД (05 6,768,044), тобто на якісному рівні.

Б. Методи внесення мутацій у послідовності ГФПД

У мутантному білюу ГФПД, що кодується нуклетсовою кислотою згідно з винаходом, принаймні одна амінокислота була замінена як визначено вище.

Заміна може бути здійснена в послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує еталонний ГФПД, як визначено вище, будь-якими засобами, що підходять для заміни у вказаній послідовності кодону, що кодує замінну амінокислоту, кодоном, що відповідає замінюючій амінокислоті; вказані кодони широко описані в літературі й добре відомі фахівцеві.

Для досягнення заміни можуть бути використано декілька методів молекулярної біології.

Практичний метод підготовки мутантної послідовності нуклеїнової кислоти згідно з винаходом і відповідного білка включає виконання сайт-направленого мутагенезу кодонів, що кодують одну або більше заздалегідь вибраних амінокислот. Способи одержання таких сайт-направлених мутацій добре відомі фахівцеві й широко описані в літературі (зокрема: Оігесівєй Миїадепевів: А

Ргасіїса! Арргоасі, 1991, Едйей Бу М.О). Мерпегзоп, ІК РКЕ55), або є методами, для яких можливо використовувати комерційні набори (наприклад, набір для мутагенезу ОШІКСНАМОЕ М

Ідичепіпд від Оіадеп або Зігаїадепе). Після сайт-направленого мутагенезу не зайво також відібрати клітини, що містять мутантний ГФПД, що є менш чутливим до інгібітора ГФПД, використовуючи відповідний механізм відбору. Відповідні методи відбору для досягнення цієї мети були описані вище.

Альтернативно, послідовність ДНК, що кодує еталонний ГФПД, може бути модифікована іп 60 зійсо так, щоб кодувати білок ГФПД, що містить одну або більше перерахованих тут заміщень, і потім синтезована де помо. Нуклеотидна послідовність, що кодує мутантний білок ГФПД, може бути введена в клітину-хазяїн так, як описано тут в інших розділах.

В. Ізольовані полінуклеотиди, їх варіанти й фрагменти

У деяких варіантах здійснення даний винахід включає ізольовані або рекомбінантні полінуклеотиди. "Рекомбінантний" полінуклеотид або поліпептид/білок, або його біологічно активна частина, тут визначений як не присутній більше у своєму оригінальному, природному організмі, такий як міститься в гетерологічній клітині-хазяїні або в трансгенній рослинній клітині, насінню або рослині. В одному варіанті здійснення рекомбінантний полінуклеотид є вільним від послідовностей (наприклад, що кодують білок, або регуляторних послідовностей), які природно обрамляють нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розташованих на 5" і 3" кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого взятий полінуклеотид. Термін "рекомбінантний" означає полінуклеотиди або поліпептиди, з якими проводилися маніпуляції стосовно природного полінуклеотиду або поліпептиду, так що полінуклеотид або поліпептид відрізняється (напр., за хімічним складом або структурою) від такого, що зустрічається в природі. В іншому варіанті здійснення "рекомбінантний" полінуклеотид вільний від внутрішніх послідовностей (тобто інтронів), які зустрічаються в природі в геномній ДНК організму, з якого отриманий полінуклеотид. Типовим прикладом такого полінуклеотиду є так звана комплементарна ДНК (кднк). Наприклад, у різних варіантах здійснення ізольований полінуклеотид, що кодує стійкість гербіциду-інгібітора ГФПД, може містити менше, ніж 5 кб, 4 кб,

З кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб або 0,1 кб нуклеотидної послідовності, яка природно обрамляє полінуклеотид у геномній ДНК клітини, з якої отриманий полінуклеотид. Молекули нуклеїнових кислот згідно з винаходом включають ті, які кодують ГФПД згідно з винаходом. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом функціонально зв'язана із промотором, здатним направляти експресію молекули нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні (напр., рослинній клітині-хазяїні або бактеріальній клітині-хазяїні).

Даний винахід також передбачає варіанти й фрагменти будь-якої послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує амінокислотні послідовності, викладені в будь-якій з 5ЕО ІЮ МО:7-33. "Фрагмент" полінуклеотиду може кодувати біологічно активну частину поліпептиду, або ж це може бути фрагмент, який може бути використаний як гібридизаційний зонд або ПЛР-праймер,

Зо використовуючи методи, описані тут в інших розділах. Полінуклеотиди, що є фрагментами полінуклеотиду, включають принаймні близько 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 суміжних нуклеотидів, або ж до кількості нуклеотидів, присутнього в описаному тут повнорозмірному полінуклеотиді, залежно від передбачуваного призначення (напр., описана тут нуклеїнова кислота ГФПД). Під "суміжними" нуклеотидами слід розуміти залишки нуклеотидів, розташовані безпосередньо поруч один з одним.

Фрагменти полінуклеотидів згідно із запропонованим винаходом у загальному кодують фрагменти поліпептиду, що зберігають біологічну активність повнорозмірного білка стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД; тобто, активність стійкості до гербіциду. Під "збереженням активності стійкості до гербіциду" слід розуміти, що фрагмент має принаймні близько 30 95, принаймні близько 50 95, принаймні близько 70 95, принаймні близько 80 95, 8595, 90 95, 95 95, 100 95, 110965, 125965, 15095, 17595, 200 95, 250 95, принаймні близько 300 95 або більш активності стійкості до гербіциду повнорозмірного білка стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД, викладеного тут як ЗЕО ІЮ МО:7-33. Методи вимірювання активності стійкості до гербіциду добре відомі в даній галузі техніки, а ілюстративні методи описані тут. У необмежуючому прикладі фрагмент згідно з винаходом буде стійким до тієї ж дози гербіциду-інгібітора ГФПД, або буде стійким до дози в 1, в 2, в 3, в 4 раз вище або ще більш високій дозі гербіциду-інгібітора ГФПД, або ж фрагменти будуть такими ж або більш стійкими на основі рібо або Кі між фрагментом і ЗЕО ІЮ

МО:7-33.

Фрагмент полінуклеотиду, що кодує біологічно активну частину поліпептиду згідно з винаходом, кодують принаймні близько 150, 175, 200, 250, 300, 350 суміжних амінокислот, або ж до загальної кількості амінокислот, що присутні в повнорозмірному поліпептиді згідно з винаходом. У необмежуючому прикладі фрагмент полінуклеотиду, що кодує біологічно активну частину білка ГФПД, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню 335 5ЕО ІЮ МО:1 і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню 336 5ЕО ІЮ МО: і, необов'язково, одне або більше заміщень амінокислот у положеннях, що відповідають положенням 188, 189, 200, 215, 226, 339 і 340 5ЕО ІЮ МО:1, включаючи білок ГФПД, викладений в будь-якій з БЕО ІЮ МО:7-33.

Винахід також охоплює варіанти полінуклеотидів, як описано 5ирга. "Варіанти" 60 полінуклеотиду також включають послідовності, що кодують ГФПД згідно з винаходом, однак консервативно відмінні через дегенерацію генетичного коду, а також ті, які є достатньо ідентичними. Варіанти даного винаходу зберігають активність ферменту ГФПД і стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД. Термін "достатньо ідентичні" означає, що послідовність поліпептиду або полінуклеотиду є принаймні на приблизно 53 95, принаймні на приблизно 60 95 або 65 95 ідентичною, на приблизно 70 95 або 75 95 ідентичною, на приблизно 80 95 або 85 95 ідентичною, на приблизно 90 95, 91 95, 92 95, 93 о, 94 95, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95 або 99 95 ідентичною в порівнянні з еталонною послідовністю, при використанні однієї із програм вирівнювання зі стандартними параметрами. Фахівцеві буде зрозуміло, що ці значення можуть бути підходящим чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, кодованих двома полінуклеотидами, беручи до уваги дегенерацію кодонів, подібність амінокислот, положення рамки зчитування й т.п.

Бактеріальні гени дуже часто мають численні ініціаторні кодони метіоніну близько від початку відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції на одному або більше із цих стартових кодонів приводить до утворення функціонального білка. Такі стартові кодони можуть включати кодони АТО. Однак бактерії, такі як Васійи5 5р., також розпізнають як стартовий кодон

СТО, і білки, що ініціюють трансляцію на кодонах СТО, містять як першу амінокислоту метіонін.

Більше того, часто не можна а ргіогі визначити, який із цих кодонів використовується бактеріями в природі. Тому слід розуміти, що використання одного з альтернативних кодонів метіоніну може привести до утворення варіантів, що надають стійкість до гербіцидів. Ці білки стійкості до гербіцидів охоплюються даним винаходом і можуть бути використані в способах згідно із даним винаходом. Що зустрічаються в природі алельні варіанти можуть бути визначені за допомогою добре відомих технік молекулярної біології, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) і гібридизація, так, як вказано нижче. Варіантні полінуклеотиди також включають полінуклеотиди синтетичного походження, утворені, приміром, з використанням сайт-направлених або інших стратегій мутагенезу, але які усе ще кодують поліпептид, що має бажану біологічну активність.

Фахівцеві також зрозуміло, що подальшою мутацією полінуклеотидів згідно з винаходом можуть бути внесені зміни, у такий спосіб приводячи до подальших змін в амінокислотній послідовності кодованих поліпептидів, без зміни біологічної активності поліпептидів. Таким чином, варіанти ізольованих полінуклеотидів можуть бути створені введенням одного або більше додаткових нуклеотидних заміщень, додавань або делецій у відповідний полінуклеотид, що кодує ГФПД згідно з винаходом, так що в кодований поліпептид вводять 1-5, 1-10 або 1-15 заміщень, додавань або делецій амінокислот, або ж 1,2, 3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 заміщень, додавань або делецій амінокислот. Подальші мутації можуть бути введені стандартними техніками, такими як сайт-направлений мутагенез і ПЛР-опосередкований мутагенез, або техніками генної перестановки. Подібні варіанти полінуклеотидів також охоплюються винаходом.

Варіанти полінуклеотидів можуть бути створені введенням мутацій у випадковому порядку по всій кодуючій послідовності або її частині, таким насичувальний мутагенез або перестановочний мутагенез, і отримані в результаті мутанти можуть бути піддані скринінгу на здатність надавати активність стійкості до гербіцидів для виявлення мутантів, що зберігають активність.

Додаткові способи утворення варіантів включають піддавання клітини, яка експресує описаний тут білок (або їх бібліотеку) спеціальним умовам, що створюють навантаження на активність білка. Спеціальні умови можуть включати (але не обмежуються цим) зміни в температурі, зміни в рН і зміни в концентраціях субстратів або інгібіторів. Бібліотека білків може бути піддана цим умовам протягом часу експресії білка (напр., в Е. соїї або іншому хазяїні) або ж після створення білкового екстракту, або після очищення білка.

Функціональна або ферментативна активність бібліотеки білків, підданої стресовим умовам, потім може бути порівняна з еталонним білком для виявлення білків з поліпшеними властивостями. Це порівняння активностей може виконуватися як частина скринінгу росту або альтернативно як частина ферментативного аналізу, що кількісно визначає активність білка.

Властивості, які можуть бути визначені як поліпшені, можуть включати стійкість до гербіцидів- інгібіторів ГФПД, зміни в кінетичних константах (включаючи Кт, Кі, Кс), стабільність білка, термостабільність білка або оптимум температури й рН для білка.

Г. Ізольовані білки, їх варіанти й фрагменти

Поліпептиди стійкості до гербіцидів також охоплюються даним винаходом. Поліпептид стійкості до гербіцидів включає препарати поліпептидів, що містять менше, ніж приблизно 30 95, 20 96, 10 95 або 5 95 (за сухою вагою) поліпептиду не-стійкості до гербіцидів (тут і далі також позначається "забруднюючий білок"). У рамках даного винаходу "білок стійкості до гербіцидів" 60 означає описаний тут поліпептид ГФПД. Також надаються його фрагменти, біологічно активні частини й варіанти, які можуть бути використані в практичному втіленні способів згідно із даним винаходом. "Фрагменти" або "біологічно активні частини" включають фрагменти поліпептиду, що містять частину амінокислотної послідовності, що кодує білок стійкості до гербіцидів і що зберігає активність стійкості до гербіцидів. Біологічно активна частина білка стійкості до гербіцидів може бути поліпептидом довжиною, наприклад, в 10, 25, 50, 100 або більш амінокислот. Подібні біологічно активні частини можуть бути приготовлені техніками рекомбінації й оцінені на активність стійкості до гербіцидів.

Під "варіантами" слід розуміти білки або поліпептиди, амінокислотна послідовність яких принаймні на приблизно 53 95, 60 95, 65 95, приблизно 70 95, 75 95, приблизно 80 95, 85 Ов, 90 9, 91 Фо, 92 95, 93 о, 94 Фо, 95 Фо, 96 95, 97 У, 98 95 або 99 95 ідентична до будь-якої з ЗЕО ІЮ МО:7- 33, при цьому вказаний варіант має ферментативну активність ГФПД і стійкість гербіцидів- інгібіторів ГФПД. Фахівцеві буде зрозуміло, що ці значення можуть бути підходящим чином відрегульовані для визначення відповідної ідентичності поліпептидів, кодованих двома полінуклеотидами, беручи до уваги дегенерацію кодонів, подібність амінокислот, положення рамки зчитування й т.п.

Наприклад, консервативні заміщення амінокислот можуть бути зроблені в одному або більше несуттєвих амінокислотних залишків. "Несуттєвий" амінокислотний залишок - це залишок, який може бути змінений в еталонній послідовності поліпептиду без зміни біологічної активності, у той час як "істотний" амінокислотний залишок необхідний для біологічної активності. "Консервативне заміщення амінокислоти" - це заміщення, при якому амінокислотний залишок заміщають залишком, що мають подібний бічний ланцюг. Сімейства амінокислот з подібними бічними ланцюгами визначені в галузі техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (напр., лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (напр., аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (напр., гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (напр., аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (напр., треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (напр., тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин).

Зо Заміщення амінокислот можуть бути зроблені на неконсервативних ділянках, що зберігають свою функцію. У цілому, подібні заміщення не роблять для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків усередині консервативного мотиву, коли такі залишки істотні для активності поліпептиду. Однак фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що функціональні варіанти можуть мати незначні консервативні або неконсервативні зміни в консервативних залишках.

Також охоплюються антитіла до ГФПД згідно із даним винаходом, або до її варіантів або фрагментів. Методи одержання антитіл добре відомі в даній галузі техніки (див., напр., Нагіом/ апа Гапе (1988) Апіїродієв: А Іарогаюту Мапиаї, Со брііпуд Нагбог Іарогаїогу, Со 5ріїпд

Нагбог, МУ; Патент США Мо 4,196,265).

Таким чином, один з аспектів винаходу стосується антитіл, одноланцюгових антигензв'язувальних молекул або інших білків, що специфічно зв'язуються з однією або більше молекулою білка або пептиду згідно з винаходом і їх гомологами, химерами або фрагментами.

В особливо переважному варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з білком, амінокислотна послідовність якого викладена в 5ЕБЕО ІЮ МО:7-33, або його фрагментом. В іншому варіанті здійснення антитіло специфічно зв'язується з химерним білком, що містять амінокислотну послідовність, вибрану з послідовностей, викладених в ЗЕО ІЮ МО:7-33, або її фрагмент. У деяких варіантах здійснення антитіло специфічно зв'язується з ділянкою білка, що відповідає положенням амінокислот 188 і 189 5ЕО ІО МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІЮ МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положенню

БО амінокислоти 215 ЗЕО ІЮ МО:1, або ділянкою білка, що відповідає положенням амінокислот 335- 340 5ЕО І МО.

Антитіла згідно з винаходом можуть бути використані для кількісного або якісного визначення молекул пептиду або білка згідно з винаходом, або ж для виявлення посттрансляційних модифікацій білків. Тут і далі антитіло або пептид вважається ", що специфічно зв'язуються" з молекулою білка або пептиду згідно з винаходом, якщо таке зв'язування не інгібується конкурентно присутністю неспоріднених молекул.

Д. Накопичення генів

У комерційному виробництві сільськогосподарських культур бажано знищити небажані рослини (тобто "бур'яни" на полі зернових рослин шляхом надійного пестицидного 60 регулювання. Ідеальною обробкою стала б така, яку можна було б застосувати до цілого поля,

але яка знищувала б тільки небажані рослини, не виявляючи впливу на культурні рослини.

Одна з подібних систем обробки включає використання стійких до гербіцидів сільськогосподарських рослин, так що при розпиленні гербіциду над полем гербіцидостійких культур вони продовжують розростатися, у той час як нестійкі до гербіциду бур'яни гинуть або серйозно ушкоджуються. В ідеалі подібні системи обробки повинні користуватися перевагою варіювання властивостей гербіцидів, так що боротьба з бур'янами була б найкращою з можливих комбінацій гнучкості й економії. Наприклад, окремі гербіциди мають різну довговічність у польових умовах, і деякі гербіциди зберігаються і є ефективними протягом відносно довгого часу після застосування на полі, у той час як інші гербіциди швидко розпадаються на інші та/або неактивні сполуки. Ідеальна система обробки дозволила б застосовувати різних гербіцидів, так що виробники могли б підганяти вибір гербіцидів під конкретну ситуацію.

У той час як на сьогоднішній день комерційно доступно деяка кількість гербіцидостійких сільськогосподарських культур, проблемою в застосуванні багатьох комерційних гербіцидів і комбінацій гербіцид/культура є те, що окремі гербіциди звичайно мають неповний спектр активності по відношенню до поширених видів бур'янів. Для більшості окремих гербіцидів, використовуваних уже якийсь час, сталі переважати популяції гербіцидостійких видів і біотипів бур'янів (див., напр., Тгапе!Ї апа Уугідні (2002) М/еєйд 5сіепсе 50: 700-712; Омеп апа 7еїІауа (2005)

Резі Мапад. 5сі. 61: 301-311). Описані трансгенні рослини, стійкі до більше ніж одного гербіциду (див., напр., М/02005/012515). Проте, постійно необхідні вдосконалення в кожному аспекті виробництва сільськогосподарських культур, можливостях боротьби з бур'янами, продовження залишкового контролю бур'янів і поліпшення врожайності зернових.

Білок ГФПД або нуклеотидна послідовність згідно з винаходом переважно скомбінована в рослинах з іншими генами, що кодують білки або РНК, що надають таким рослинам корисні агрономічні властивості. Серед генів, що кодують білки або РНК, що надають трансформованим рослинам корисні агрономічні властивості, можна згадати послідовності ДНК, що кодують білки, які надають стійкість до одному або більше гербіцидів, які за своєю хімічною структурою відрізняються від гербіцидів-інгібіторів ГФПД, і інш, що надають стійкість до деяких комах, що надають стійкість до деяких хвороб, ДНК, що кодують РНК, що забезпечують боротьбу з

Зо нематодами або комахами, і т.п.

Подібні гени, зокрема, описані в опублікованих заявках РСТ УМО91/02071 ії М/О95/06128, а також у Патенті США 7,923,602 і Публікації патентної заявки США Мо 20100166723, кожна з яких включена в даний опис у всій своїй повноті шляхом посилання.

Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, що надають трансформованим рослинним клітинам і рослинам стійкість до певних гербіцидів, можна згадати гени Баг або РАТ, або ген зігеріотусев соеїїсоЇог, описаний в У/О2009/152359, що надає стійкість до глюфозинатних гербіцидів, ген, що кодує підходящу ЕРБР5, що надає стійкість до гербіцидів, метою яких є

ЕРБ5БРЗ, таким як гліфозат і його солі (05 4,535,060, 05 4,769,061, 05 5,094,945, 05 4,940,835, 5 5,188,642, 05 4,971,908, 005 5,145,783, Ш5 5,310,667, 05 5,312,910, 005 5,627,061, 5 5,33,435), ген, що кодує гліфозат-н-ацетилтрансферазу (наприклад, 05 8,222,489, 05 8,088,972, 005 8,044,261, 005 8,021,857, 05 8,008,547, 005 7,999,152, 05 7,998,703, 05 7,863,503,

ОБ 7,714,188, 005 7,709,702, 5 7,666,644, ОБ 7,666,643, 05 7,531,339, ОБ 7,527,955, і 05 7,405,074), ген, що кодує гліфозатоксидоредуктазу (наприклад, О5 5,463,175).

Серед послідовностей ДНК, що кодують підходящу ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРБР5, можна більш конкретно згадати ген, що кодує рослинну

ЕРБР5, зокрема ЕРБРБЗ кукурудзи, зокрема ЕРБР5 кукурудзи, що містить дві мутації, зокрема мутацію в положенні амінокислоти 102 і мутацію в положенні амінокислоти 106 (М/О2004/074443), і яка описана в Патентній заявці 05 6566587, тут і далі позначається подвійною мутантною ЕРЗР5 кукурудзи або 2пЕРБ5БР5Б, або ж ген, що кодує ЕРБОР5, ізольовану з Адгорасіегішт і описувану послідовностями ІЮ Мо. 2 і ІЮ Мо. З Патенту США 5,633,435, також позначувану СРА.

Серед послідовностей ДНК, що кодують підходящу ЕРБР5, що надають стійкість до гербіцидів, метою яких є ЕРЗР5, можна більш конкретно згадати ген, що кодує ЕРБРЗ СКО23 з

Агіпгорасіег діобітогітіх5, але також і мутантні ОКО23 АСЕ1, СКО23 АСЕ2, або СКС23 АСЕЗ, особливо мутанти або варіанти СКОС23 як описано в УУО2008/100353, такі як оКОо23(асе3)К17ЗК 5ЕО ІЮ Мо. 29 в ММО2008/100353.

У випадку послідовностей ДНК, що кодують ЕРБР5Б, і які зокрема кодують перераховані вище гени, послідовності, яка кодує ці ферменти, переважно передує послідовність, що кодує транзитний пептид, зокрема "оптимізований транзитний пептид", описаний у Патенті США 60 5,510,471 або 5,633,448.

Типові риси стійкості до гербіцидів, які можуть бути скомбіновані з послідовністю нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, також включають принаймні один інгібітор АЛС (ацетолактатсинтази). (М/О02007/024782); мутантний ген Агарідорзіз АЛС/АГКС (Патент США 6б,855,533); гени, які кодують 2,4-д-монооксигенази, що надають стійкість до 2,4-Ю0 (2,4- дихлорфеноксіоцтової кислоти) шляхом метаболізування (Патент США 6,153,401); і гени, які кодують монооксигенази Юісатра, що надають стійкість до дикамби (3,6б-дихлор-2- метоксибензойної кислоти) шляхом метаболізування (5 2008/0119361 ії 05 2008/0120739).

У різних варіантах здійснення ГФПД згідно з винаходом зібрана з одним або більше генів стійкості до гербіцидів, включаючи один або більше додаткових генів стійкості до гербіцидів- інгібіторів ГФПД, та/або один або більше генів, стійких до гліфозату та/"або глюфозинату. В одному варіанті здійснення ГФПД згідно з винаходом скомбінована з 2птЕРЗРЗ і Баг.

Серед послідовностей ДНК, що кодують білки, що стосуються властивостей стійкості до комах, варто згадати білки Ві, широко описані в літературі й добре відомі фахівцям у даній галузі. Також варто згадати білки, виділені з бактерій, таких як Рпоїотптараив (М/097/17432 8

МО98/08932).

Серед таких послідовностей ДНК, що кодують цільові білки, що надають нові властивості стійкості до комах, варто більш конкретно згадати білки Ві Сту або МІР, широко описані в літературі й добре відомі фахівцям у даній галузі. Вони включають білок Стуї1Е або отримані з нього гібриди (напр., гібридні білки Сту1тА-сгу1!Е, описані в 05 6,326,169; 05 6,281,016; 5 6,218,188, або їх токсичні фрагменти), білки типу СтутА або їх токсичні фрагменти, переважно білок Сту1Ас або отримані з нього гібриди (напр., гібридний білок СтутАб-сгуТАс, описаний в О5 5,880,275), або білок СтгутАБ або ВІ2 або їх інсектицидні фрагменти, як описано в ЕР451878, білки Сту2Ає, Сту2Аї або Стгу2Ад як описано в УМО2002/057664 або їх токсичні фрагменти, білок

СтутА.105, описаний в УУО 2007/140256 (5ЕО ІО Мо. 7) або його токсичний фрагмент, білок

МІРЗАа19 під номером у каталозі МСВІ АВО20428, білок МІРЗАаг0 під номером у каталозі МСВІ

АВОС20429 (5ЕО ІЮ Мо. 2 в УМО 2007/142840), білки МІРЗА, які виробляються в подіях бавовни

СОТ202 або СОТ203 (МО2005/054479 і ММО2005/054480, відповідно), білюи Сгу як описано в

УО2001/47952, білок МІРЗАа або його токсичний фрагмент як описано в Евбігисі і ін. (1996), Ргос

Маї! Асай 5сі 0 5 А. 28:93(11):5389-94 і 05 6,291,156, інсектицидні білки зі штамів Хепопарадив

Зо (як описано в М/О98/50427), Зеїтайна (особливо з 5. епіоторпійа) илиРНоіїогнараив, такі як То- білки з Ріпоїогпарди5 як описано в УУО98/08932 (напр., Умаїегієїй і ін., 2001, Аррі Епмігоп

Містобріо!. 67(11):5017-24; Ептепсп-сопвіапі апа Воуеп, 2000, Сеїї Мої Ме з5сі.; 57(5):828-33).

Також тут включені будь-які варіанти й мутанти будь-якого із цих білків, що відрізняються декількома (1-40, переважно 1-5) амінокислотами від будь-якої з наведених вище послідовностей, особливо послідовності їх токсичного фрагмента, або які злиті із транзитним пептидом, таким як пластидний транзитний пептид або будь-який інший білок або пептид.

У різних варіантах здійснення послідовність ГФІД згідно з винаходом може бути скомбінована в рослинах з одним або більше геном, що надають бажану властивість, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до посух, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, поліпшена живильна цінність, стійкість до хвороб, поліпшений фотосинтез, поліпшена якість волокон, стійкість до стресів, поліпшене розмноження й т.п.

Особливо корисні трансгенні події, які можуть бути скомбіновані з генами згідно із запропонованим винаходом у рослинах того ж виду (напр., схрещуванням або ретрансформацією рослини, що містить іншу трансгенну подію, з химерним геном згідно з винаходом), включають подію 531/ РУ-СНВКО4 (бавовник, боротьба з комахами, описану в

УМО2002/040677), подію 1143-14А (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в

МО2006/128569); подію 1143-5188 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в

УМО2006/128570); подію 1445 (бавовник, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в Ш5-А 2002-120964 або УМО2002/034946; подія 17053 (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА- 9843, описану в УМО2010/117737); подію 17314 (рис, стійкість до гербіцидам, депоновану як

РТА-9844, описану в УМО2010/117735); подію 281-24-236 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-6233, описану в УМО2005/103266 або И5-А 2005- 216969); подію 3006-210-23 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-6233, описану в Ш5-А 2007-143876 або УМО2005/103266); подію 3272 (кукурудза, якісна властивість, депонована як РТА-9972, описану в МУМО2006/098952 або О5-А 2006-230473); подію 33391 (пшениця, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-2347, описану в МО2002/027004), подію 40416 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-11508, описану в УМО 11/075593); подію 43А47 (кукурудза, боротьба з 60 комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-11509, описану в МЛО2011/075595);

подію 5307 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-9561, описану в

ММО2010/077816); подію А5К-368 (тонконіг, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА- 4816, описану в ШШ5-А 2006-162007 або М/О2004/053062); подію В16 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в О5-А 2003-126634); подію ВРУЗ-СМ127-9 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ Мо. 41603, описану в М/О2010/080829); подію ВІ К1 (олійний рапс, відновлення стерильності чоловічих особин, депоновану як МСІМВ 41193, описану в

УММО2005/074671), подію СЕ43-67В (бавовник, боротьба з комахами, депоновану як Ю5М

АСС2724, описану в Ш5-А 2009-217423 або УМО2006/128573); подію СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в И5-А 2010-0024077); подію СЕ44-690 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2006/128571); подію СЕ46-0О2А (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2006/128572); подію СОТ102 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в ИШ5-А 2006-130175 або

УО2004/039986); подію СОТ202 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5-

А 2007-067868 або УМО2005/054479); подію СОТ203 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в УМО2005/054480);); подію ОА521606-3 / 1606 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11028, описану в УМО2012/033794), подію ОА540278 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-10244, описану в М/О2011/022469); подію ОА5З-44406-6 / рорАВ8264.44.06.1 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11336, описану в

ММО2012/075426), подію ЮМАБ5Б-14536-7 /ррАВ8291.45.36.2 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11335, описану в ММО2012/075429), подію ОА5-59122-7 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА 11384, описану в О5-А 2006- 070139); подію ЮАБ-59132 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2009/100188); подію РБАБЗБб8416 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-10442, описану в ММО2011/066384 або ММО2011/066360); подію ОР- 098140-6 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8296, описану в О5-А 2009-137395 або УМО 08/112019); подію ОР-305423-1 (соя, якісна властивість, не депоновану, описану в Ш5З-А 2008-312082 або У/О2008/054747); подію ЮР-32138-1 (кукурудза, система гібридизації депоновану як АТСС РТА-9158, описану в И5Б-А 2009-0210970 або

УМО2009/103049); подію ЮОР-356043-5 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-

Ко) 8287, описану в Ш5-А 2010-0184079 або УМО2008/002872); подію ЕЕ-1 (баклажан, боротьба з комахами, не депоновану, описану в МО 07/091277); подію РІ117 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209031, описану в О5-А 2006-059581 або МО 98/044140); подію

ЕС72 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11041, описану в ММО2011/063413), подію

СА21 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС 209033, описану в ШЗ-А 2005- 086719 або УМО 98/044140); подію 5525 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209032, описану в О5-А 2005-188434 або УМО 98/044140); подію СНВ119 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8398, описану в ММО2008/151780); подію ЗНВО614 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-6878, описану в 05-

А 2010-050282 або ММО2007/017186); подію 511 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 209030, описану в Ш5-А 2005-188434 або М/098/044140); подію СМ К213 (цукровий буряк, стійкість до вірусів, депоновану як МСІМВ-41601, описану в УМО2010/076212); подію Н7-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ 41158 або МСІМВ 41159, описану в О5-А 2004-172669 або УМО 2004/074492); подію ЗОРІ ІМ1 (пшениця, стійкість до хвороб, не депоновану, описану в О5-А 2008-064032); подію ГІ 27 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ41658, описану в М/О2006/108674 або Ш5-А 2008-320616); подію ГІ 55 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як МСІМВ 41660, описану в УМО 2006/108675 або О5-А 2008-196127); подію ГІсойоп25 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-3343, описану в

УМО2003/013224 або И5-А 2003-097687); подію ГІ КІСЕОб (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 203353, описану в 5 6,468,747 або М/О2000/026345); подію І Ігісеб2 (мал, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС 203352, описану в УМО2000/026345), подію

ГЕКІСЕбОТ1 (рис, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-2600, описану в Ш5-А 2008- 2289060 або УМО2000/026356); подію І 038 (кукурудза, якісна властивість, депонована як АТСС

РТА-5623, описану в И5-А 2007-028322 або УМО2005/061720); подію МІК162 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як РТА-816б6, описану в И5-А 2009-300784 або

УМО2007/142840); подію МІКбО4 (кукурудза, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5-

А 2008-167456 або УМО2005/103301); подію МОМ15985 (бавовник, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-2516, описану в ШВ-А 2004-250317 або УМО2002/100163); подію

МОМ810 (кукурудза, боротьба з комахами, не депоновану, описану в О5З-А 2002-102582); подію

МОМ863 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-2605, описану в бо УМО2004/011601 або О5-А 2006-095986); подію МОМ87427 (кукурудза, боротьба із запиленням,

депоновану як АТС РТА-7899, описану в УМО2011/062904); подію МОМ87460 (кукурудза, стресостійкість, депоновану як АТСС РТА-8910, описану в МУМО2009/111263 або 0О5-А 2011- 0138504); подію МОМ87701 (соя, боротьба з комахами, депоновану як АТСС РТА-8194, описану в О5-А 2009-130071 або М/О2009/064652); подію МОМ87705 (соя, якісна властивість - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-9241, описану в И5-А 2010-0080887 або

МО2010/037016); подію МОМ87708 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-9670, описану в УМО2011/034704); подію МОМ87712 (соя, урожайність, депоновану як РТА-10296, описану в УМО2012/051199), подію МОМ87754 (соя, якісна властивість, депонована як АТОС

РТА-9385, описану в УМО2010/024976); подію МОМ87 769 (соя, якісна властивість, депонована як

АТОСС РТА-8911, описану в И5-А 2011-0067141 або М/02009/102873); подію МОМ88017 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-5582, описану в ШВ-А 2008-028482 або М/О2005/059103); подію МОМ88913 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-4854, описану в УМО2004/072235 або О5-А 2006-059590); подію МОМ88302 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-10955, описану в

МО2011/153186), подію МОМ88701 (бавовник, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11754, описану в М/О2012/134808), подію МОМ89034 (кукурудза, боротьба з комахами, депоновану як

АТОСС РТА-7455, описану в УМО 07/140256 або 05-А 2008-260932); подію МОМ89788 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-6708, описану в О5-А 2006-282915 або

МО2006/130436); подію М511 (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-850 або РТА-2485, описану в М/О2001/031042); подію М58 (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-730, описану в

УМО2001/041558 або 05-А 2003-188347); подію МКбОЗ (кукурудза, стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-2478, описану в О5-А 2007-292854); подію РЕ-7 (рис, боротьба з комахами, не депоновану, описану в М/О2008/114282); подію КЕЗ (олійний рапс, боротьба із запиленням - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТС РТА-730, описану в М/О2001/041558 або 0О5-А 2003-188347); подію КТ7З3 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2002/036831 або И5-А 2008-070260); подію ЗУНТОН2 / 5ММ-000Н2-5 (соя, стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11226, описану в М/О2012/082548), подію Т227-1 (цукровий буряк, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в УМО2002/44407 або Ш5-А

Зо 2009-265817); подію Т25 (кукурудза, стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в О5-А 2001-029014 або УМО2001/051654); подію 7304-40 (бавовник, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-8171, описану в ШВ-А 2010-077501 або ММО2008/122406); подію Т342-142 (бавовник, боротьба з комахами, не депоновану, описану в М/О2006/1285658); подію ТС1507 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, не депоновану, описану в 0О5-А 2005-039226 або УМО2004/099447); подію МІР1034 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як АТСС РТА-3925., описану в М/О2003/052073), подію 32316 (кукурудза, боротьба з насекомими-стійкость до гербіцидів, депоновану як РТА-11507, описану в УМО2011/084632), подію 4114 (кукурудза, боротьба з комахами - стійкість до гербіцидів, депоновану як РТА-11506, описану в ММО2011/084621), подію ЕЕ-СМ3З / ЕС72 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11041) необов'язково зібрана с: подія ЕЕ-

СМ1/Л1 27 або подія ЕЕ-СМ2/Л/І.55 (М/О2011/063413А2), подію ЮА5З-68416-4 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-10442, УМО2011/066360А1), подію ЮА5З-68416-4 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-10442, УМО2011/066384А1), подію ОрР- 040416-8 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТСС РТА-11508,

УМО2011/075593А1), подію ЮР-043А47-3 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер

АТОСС РТА-11509, ММО2011/075595А1), подію ЮР-004114-3 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТСС РТА-11506, УМО2011/084621А1), подію ОР-032316-8 (кукурудза, боротьба з комахами, обліковий номер АТС РТА-11507, УМО2011/084632А1), подію. МОМ- 88302-9 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-10955,

МО2011/153186А1), подію ЮА5-21606-3 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС

РТА-11028, УМО2012/033794А2), подію МОМ-87712-4 (соя, якісна властивість, обліковий номер

АТОСС РТА-10296, М/О2012/051199А2), подію ОБАБ5З-44406-6 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11336, УМО2012/075426А1), подію ЮА5-14536-7 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-11335, МО2012/075429А1), подію ЗУМ-000Н2-5 (соя, стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТСС РТА-11226,

УММО2012/082548А2), подію ЮР-061061-7 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, УМО2012071039А1), подію ОР-073496-4 (олійний рапс, стійкість до гербіцидів, номер депонування недоступний, И52012131692), подію 8264.44.06.1 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер РТА-11336, УМО2012075426А2), подію 60 8291.45.36.2 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер РТА-11335,

УМО2012075429А2), подію 5МУНТОН2 (соя, обліковий номер АТСС /РТА-11226,

УМО2012/082548А2), подію МОМ88701 (бавовник, обліковий номер АТСС РТА-11754,

УМО2012/134808А1), подію КК179-2 (люцерна, обліковий номер АТСС РТА-11833,

МО2013/003558А1), подію ррАВ8264.42.32.1 (соя, накопичена стійкість до гербіцидів, обліковий номер АТС РТА-11993, МУО2013/010094А1), подію М2ОТО9У (кукурудза, обліковий номер

АТСС РТА-13025, ММО2013/012775А1).

Е. Полінуклеотидні конструкції

Полінуклеотиди поліпептиди, що кодують, ГФПД згідно із запропонованим винаходом, можуть бути модифіковані для одержання або посилення експресії в рослинних клітинах.

Полінуклеотиди, що кодують ідентифіковані тут поліпептиди, можуть бути забезпечені в касетах експресії для експресії в рослині, що представляє інтерес. "Рослинна касета експресії" включає конструкцію ДНК, включаючи рекомбінантну конструкцію ДНК, здатну приводити до експресії полінуклеотиду в рослинній клітині. Касета може включати в напрямку транскрипції 5'-3' ділянку ініціації транскрипції (тобто, промотор, зокрема гетерологічний промотор), функціонально з'єднаний з одним або більше потрібних полінуклеотидів, та/або ділянку переривання трансляції й транскрипції (тобто, ділянку переривання), які функціонують у рослинах. Касета також може додатково містити принаймні один додатковий полінуклеотид, що вводиться в організм, такий як ген селективного маркера. Альтернативно, додатковий полінуклеотид (-и) може бути забезпечений у касеті множинної експресії. Подібна касета експресії забезпечена безліччю сайтів рестрикції для вставки полінуклеотиду (-ів) так, щоб він підпадав під регуляцію транскрипції в регуляторних ділянках.

В подальшому варіанті здійснення даний винахід стосується химерного гену, що містить кодуючу послідовність, яка включає гетерологічну нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, функціонально зв'язану з експресованим у рослинах промотором і необов'язково ділянкою переривання транскрипції й поліаденілування. "Гетерологічний" у загальному стосується полінуклеотиду або поліпептиду, що не є ендогенним для клітини або, що не є ендогенним для розташування в природному геномі, у якому він є в наявності, і доданому в клітку шляхом інфекції, трансфекції, микроіїн'єкції, електропорації, мікропроекції або т.п. Під " функціональним зв'язком" мається на увазі функціональний зв'язок між двома полінуклеотидами. Наприклад,

Зо коли промотор функціонально зв'язаний з послідовністю ДНК, то послідовність промотору ініціює й виступає проміжною ланкою в транскрипції послідовності ДНК. Слід усвідомлювати, що функціонально з'єднані полінуклеотиди можуть бути суміжними, а можуть і не бути, і там, де цей термін використовується для позначення з'єднання двох ділянок, що кодують поліпептид, поліпептиди експресуються в одній і тій же рамці зчитування.

Промотором може бути будь-яка полінуклеотидна послідовність, що демонструє транскрипційну активність в вибраних рослинних клітинах, частинах рослин або рослинах.

Промотор може бути природним або аналогічним, або ж чужорідним і гетерологічним, по відношенню до рослини-хазяїна та/або послідовності ДНК згідно з винаходом. Якщо промотор є "природним" або "аналогічним" по відношенню до рослини-хазяїна, то мається на увазі, що промотор присутній у природній рослині, у яку його вводять. Якщо промотор є "чужорідним" або "гетерологічним" по відношенню до послідовності ДНК згідно з винаходом, то мається на увазі, що промотор не є природнім або промотором, що зустрічається в природі, для функціонально зв'язаної з ним послідовності ДНК згідно з винаходом. Промотор може бути індукованим або конститутивним. Він може зустрічатися в природі, бути складеним із частин різних промоторів, що зустрічаються в природі, або ж може бути частково або повністю синтетичним. Посібник із проектування промоторів надає дослідження структури промоторів, такі як в Нагіеу апа Кеупоїд5 (1987) Мисієїс Асійб5 Нев5. 15:2343-2361. Крім того, розташування промотору щодо старту транскрипції може бути оптимізоване. Див., напр., Кобегіз і ін. (1979) Ргос. Май). Асай. сі. ОБ5А, 76:760-764. Для використання в рослинах у цій галузі техніки добре відомі багато підходящих промоторів.

Наприклад, підходящі конститутивні промотори для використання в рослинах включають: промотори вірусів рослин, таких як промотор каулімовірусу хлоротичної смугастості арахісу (Рсібєм) (Патент США Мо 5,850,019); промотор 355 вірусу мозаїки кольорової капусти (Сату) (оОаеї ї ін. (1985) Маїшге 313:810-812); промотори метилтрансферазних генів вірусу СпПіогейПа (Патент США Мо 5,563,328) і повнорозмірний промотор транскрипції вірусу мозаїки ранника (ЕМУ) (Патент США Ме 5,378,619); промотори таких генів, як рисовий актин (Мсеїгоу і ін. (1990)

Ріапі СеїІ 2:163-171 і Патент США Мо 5,641,876); убіквітин (Спгістепзеп і ін. (1989) Ріапі Мої. Віої. 12:619-632 і Спгізтепзеп і ін. (1992) Ріапі Мої. Віої. 18:675-689); рети (Гаві і ін. (1991) Тпеог. Аррі.

Сепеї. 81:581-588); МАЗ (Мекеп і ін. (1984) ЕМВО 3. 3:2723-2730 і Патент США Мо 5,510,474); бо гістон НЗ кукурудзи (І ереїй і ін. (1992) Мої. Сеп. Сепеї. 231:276-285 і Агапаззома і ін. (1992) Ріапі

У. 2(3):291-300); Вгаззіса пари АІ 53 (РСТ-заявка МУО97/41228); ген малої субодиниці рослинної рибулозо-біскарбоксилази/оксигенази (Кибібхс; цирковірус (А 689 311) або вірус мозаїки прожилок маніоки (Свмітпм, 05 7,053,205); а також промотори різних генів Адгобасіегішт (див.

Патенти США Мо 4,771,002; 5,102,796; 5,182,200; і 5,428,147).

Підходящі індуковані промотори для використання в рослинах включають: промотор із системи АСЕТ, що відповідає на мідь (Мей і ін. (1993) РМАБ 90:4567-4571); промотор гена кукурудзи Іп2, що відповідає на бензенсульфонамідні запобіжники від гербіцидів (НегеПеу і ін. (1991) Мої. Сеп. Сепеїйсв 227:229-237 і Саї» і ін. (1994) Мої. Сеп. Сепеїїс5 243:32-38); а також промотор репрессора Теї з Тп10 (Саї; і ін. (1991) Мої. Сбеп. Сепеї. 227:229-237). Іншим індукованим промотором для використання в рослинах є той, який реагує на індукуючий агент, на який рослини в нормі не реагують. Прикладом індукованого промотору такого типу є індукований промотор гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого індукується гормоном-глюкокортикостероїдом (5спепа і ін. (1991) Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 88:10421), або недавнє застосування химерного активатора транскрипції, ХМЕ, для використання в заснованій на рецепторі естрогену індукованої системи експресії в рослинах, що активується естрадіолом (2цо ії ін. (2000) Ріапі 9., 24:265-273). Інші індуковані промотори для використання в рослинах описані в ЕР 332104, РСТ УМО 93/21334 і РСТ УМО 97/06269, які включені в даний опис у повному обсязі шляхом посилання. Можуть бути також використані промотори, складені із частин інших промоторів, і частково або повністю синтетичні промотори. Див., напр., Мі і ін. (1995) Ріапі 9. 7:661-676 і РСТ УМО 95/14098, що описують такі промотори для використання в рослинах.

В одному варіанті здійснення даного винаходу для експресії білків ГФПД згідно з винаходом може бути використана послідовність промотору, специфічна для конкретних ділянок або тканин рослин, така як промотори, специфічні для насіння (Оайа, К. і ін., 1997, Вібїесппоіоду

Апп. Вем. 3, 269-296), особливо промотор напіну (ЕР 255 378 А1), промотор фазеоліну, промотор глютеніну, промотор геліантиніну (М/092/17580), промотор альбуміну (МУО98/45460), промотор олеозину (ММО98/45461), промотор 5АТІ1 або промотор ЗАТЗ (РСТ/О598/06978).

Також можна використовувати індукований промотор, переважно вибраний з фенілаланінамоніаліази (ФАЛ), НМО-КоА редуктази (НМ), хітинази, глюканази, інгібітора

Зо протеїнази (ІП), гена сімейства РК1, нопалінсинтази (по5) і промоторів мерВ (005 5 670 349,

Таблиця 3), промотору НМО2 (05 5 670 349), промотору яблучної бета-галактозидази (ЯБГ1) і промотору яблучної аміноциклопропанкарбоксилатсинтази (Ацк-синтази) (М/098/45445).. У конструкціях згідно з винаходом можуть бути використані численні промотори, у тому числі наступні один за одним.

Промотор може включати, або бути модифікованим так, щоб включати один або більше елементів-енхансерів. У деяких варіантах здійснення промотор може включати безліч елементів-енхансерів. Промотори, що містять елементи-енхансери, забезпечують більш високі рівні транскрипції в порівнянні з промоторами, що їх не містять. Підходящі для використання в рослинах елементи-енхансери включають елемент-енхансер Ресізм (Патент США Мо 5,850,019), елемент-енхансер Сатм 355 (Патент США Мо 5,106,739 і 5,164,316) і елемент-енхансер ЕММ (Майї і ін. (1997) Тгапздепіс Ке5. 6:143-156); активатор трансляції вірусу тютюнової мозаїки (ТММ), описаний у заявці УУО87/07644, або вірусу тютюнового гравірування (ТЕМ), описаних

Сатіпдіоп 4. Егевей 1990, 9. Мігої. 64: 1590-1597, наприклад, або інтронів, таких як інтрон аднп1 кукурудзи або інтрон 1 рисового актину. Див. також РСТ УУО96/23898, МО2012/021794,

УМО2012/021797, ММО2011/084370 і УМО2011/028914.

Часто подібні конструкції можуть містити 5' і 3' нетрансльовані ділянки. Подібні конструкції можуть містити "сигнальну послідовність" або "лідерну послідовність" для полегшення ко- трансляційного або посттрансляційого транспорту розглянутого пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких як хлоропласти (або інші пластиди), ендоплазматичного ретикулуму або апарата Гольджи, або ж на секрецію. Наприклад, конструкція може бути спроектована таким чином, щоб містити сигнальний пептид для полегшення переходу пептиду в ендоплазматичний ретикулум. Під " сигнальною послідовністю" слід розуміти послідовність, про яку відомо або передбачається, що результатом її дії є ко-трансляційний або посттрансляційний транспорт пептиду через клітинну мембрану. В еукаріотів це звичайно включає секрецію в апарат Гольджи, з деяким результуючим глікозилуванням. Під "лідерною послідовністю" слід розуміти будь-яку послідовність, яка при трансляції дає амінокислотну послідовність, достатню для запуску ко-трансляційного транспорту пептидного ланцюгу в субклітинну органелу. Таким чином, це охоплює лідерні послідовності, націлені на транспорт та/або глікозиловані через перехід в ендоплазматичний ретикулум, перехід у вакуолі, пластиди, включаючи хлоропласти, бо мітохондрії й т.п. Може також виявитися переважним сконструювати рослинну касету експресії,

що містить інтрон, так що для експресії необхідний процесинг цього інтрона в мрнк.

Під "3" нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований нижче кодуючої послідовності. Сигнальні послідовності поліаденілування й інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на додавання ділянок поліаденілової кислоти до 3'-кінця прекурсору мрнк, є З'-нетрансльованими ділянками. Під "5" нетрансльованою ділянкою" слід розуміти полінуклеотид, розташований вище кодуючої послідовності.

Інші нетрансльовані елементи вище або нижче включають енхансери. Енхансери - це полінуклеотиди, дія яких підсилює експресію ділянки-промотора. Енхансери добре відомі в даній галузі техніки й включають, але не обмежуються ними, ділянку-енхансер 5М40 і ділянку- енхансер 355.

Ділянка переривання може бути властива ділянці ініціації транскрипції, властива послідовності згідно із даним винаходом, або може бути отримана з іншого джерела. Підходящі ділянки переривання є в наявності в Ті-плазміди А. їштегїасієп5, такі як ділянки переривання октопінсинтази й нопалінсинтази. Див. також Сиегіпеаи і ін. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 262:141-144;

Ргоцагоої (1991) Сеї! 64:671-674; Запіасоп і ін. (1991) Сепе5 Оем. 5:141-149; Модеп і ін. (1990)

Ріапі СеїІ 2:1261-1272; Мипгое і ін. (1990) Сепе 91:151-158; Ваїазх і ін. (1989) Мисіевїс Асід5 Кезв. 17:7891-7903; дов5пПі і ін. (1987) Мисієїс Асіа Кез. 15:9627-9639; і Європейську патентну заявку ЕР 0 633 317 АТ.

В одному з аспектів винаходу синтетичні послідовності ДНК проектують для заданого поліпептиду, такого як поліпептиди згідно з винаходом. Експресія відкритої рамки зчитування синтетичної послідовності ДНК у клітині приводить до вироблення поліпептиду згідно з винаходом. Синтетичні послідовності ДНК можуть бути корисні для простого усунення небажаних сайтів рестрикції ендонуклеаз, для сприяння стратегіям клонування ДНК, для зміни або усунення будь-якого потенційного зсуву кодонів, для зміни або поліпшення вмісту ГЦ, для усунення або зміни альтернативних рамок зчитування, та/або для усунення або зміни сайтів розпізнавання сплайсингу інтронів/екзонів, сайтів поліаденілування, послідовностей Шайна-

Дальгарно, небажаних елементів-промоторів і т.п., які можуть бути присутні у нативній послідовності ДНК. Можливо також використання синтетичних послідовностей ДНК для введення інших поліпшень у послідовність ДНК, таких як введення інтронної послідовності,

Зо створення послідовності ДНК, яка експресується як злитий білок до націлених на органели послідовностям, таким як транзитні пептиди хлоропластів, націлені на апопласти/вакуолі пептиди, або пептидні послідовності, що приводять до утримання результуючого пептиду в ендоплазматичному ретикулумі. Синтетичні гени можуть також бути синтезовані з використанням переважних для клітини-хазяїна кодонів для поліпшеної експресії, або можуть бути синтезовані з використанням кодонів із частотою, переважною для хазяїна. Див., наприклад, СатрбеїЇ апа Сзом/угі (1990) Ріапі РпузхіоЇ. 92:1-141; Патенти США Мо 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831; і 5,436,391, опубліковані патентні заявки США Мо 20040005600 і 20010003849, і Мигау і ін. (1989) Мисівїс Асійд5 Кев5. 17:477-498, включені в даний опис за допомогою посилання.

В одному з варіантів здійснення цільові полінуклеотиди для експресії націлені на хлоропласт. У цьому способі, якщо цільовий полінуклеотид не вводиться прямо в хлоропласт, то касета експресії додатково містить полінуклеотид, що кодує транзитний пептид, для напрямку цільового нуклеотиду в хлоропласти. Подібні транзитні пептиди відомі в даній галузі техніки. Див., наприклад, Моп Неїі/|пе і ін. (1991) Ріапі Мої. Віої!. Нер. 9:104-126; СіагкК і ін. (1989) 9.

ВіоІ. Снет. 264:17544-17550; РеїІа-сіорра і ін. (1987) Ріапі Рпузіо!. 84:965-968; Коптег і ін. (1993)

Віоспет. Віорпуз. Ве5. Соттип. 196:1414-1421; ії Пан і ін. (1986) Зсіепсе 233:478-481.

Цільові полінуклеотиди, що направляються в хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропласті з урахуванням різниці у використанні кодонів у рослинному ядрі й цієї органелі. Таким способом цільові полінуклеотиди можуть бути синтезовані з використанням переважних для хлоропластів кодонів. Див., наприклад, Патент США Мо 5,380,831, включений у даний опис за допомогою посилання.

Така рослинна касета експресії може бути введена у вектор трансформації рослини. Під "вектором трансформації" слід розуміти молекулу ДНК, що робить можливою трансформацію клітини. Подібна молекула може складатися з однієї або більше касет експресії й може бути організована в більше ніж одну векторну молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори - це вектори трансформації рослин, що використовують два несуміжні вектори ДНК для кодування всіх необхідних цис- і транс-діючих функцій для трансформації рослинних клітин (НеїЇеп5 апа

МийПпеаих (2000) Ттепав іп Ріапі Осіепсе 5:446-451). "Вектор" означає полінуклеотидну конструкцію, розроблену для переносу між різними клітинами-хазяїнами. "Вектор експресії" бо означає вектор, що має здатність включати, інтегрувати й експресувати гетерологічну послідовність ДНК або її фрагменти в чужорідній клітині.

Вектор трансформації рослини містить один або більше вектор ДНК для досягнення трансформації рослини. Наприклад, загальноприйнятою практикою в даній галузі техніки є використання векторів трансформації рослини, що містять більш ніж один суміжний сегмент

ДНК. Ці вектори часто позначаються як бінарні вектори. Бінарні вектори, як і вектори з хелперними плазмідами, найбільш часто використовуються для опосередкованої Адгобасієгійт трансформації, де розмір і складність сегментів ДНК, що потрібні для досягнення ефективної трансформації, дуже великі, і вигідно розділяти функції на окремі молекули ДНК. Бінарні вектори звичайно містять плазмідний вектор, що містить цис-діючі послідовності, необхідні для переносу Т-ДНК (такі як лівий прикордонний район і правий прикордонний район), селективний маркер, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, і "цільовий полінуклеотид" (полінуклеотид, спроектований з можливістю експресії в рослинній клітині, для якої бажано створення трансгенних рослин). Також у цьому плазмідному векторі присутні послідовності, необхідні для бактеріальної реплікації. Цис-діючі послідовності розташовані так, щоб дозволити ефективний трансфер у рослинні клітини й експресію в них. Наприклад, послідовність селективного маркера й цільова послідовність розташовані між лівим і правим прикордонними районами. Часто другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, що виконують роль проміжної ланки в переносі Т-ДНК із Адгорасіегішт у рослинні клітини. Ця плазміда часто містить функції вірулентності (гени Міг), що роблять можливим інфікування рослинних клітин

Адгорасіегішт, і перенос ДНК шляхом розщеплення на прикордонних послідовностях і міг- опосередкований перенос ДНК, як це розуміють у даній галузі техніки (НеїПеп5 апа МийПпеаих (2000) Тгєпавз іп Ріапі бсієпсе, 5:446-451). Для трансформації рослин можуть бути використано декілька типів штамів Адгобасіегішт (напр., І ВА4404, 5МУЗ3101, ЕНА1ТО1, ЕНАТО5, ії т.д.) Другий плазмідний вектор не є необхідним для введення полінуклеотидів у рослини іншими методами, такими як мікропроекція, мікроін'єкція, електропорація, полієтиленгліколь і т.д.

Є. Трансформація рослин

Способи згідно з винаходом включають введення нуклеотидної конструкції в рослину. Під "введенням" слід розуміти презентацію нуклеотидної конструкції рослині таким способом, що згадана конструкція одержує доступ усередину клітини рослини. Способи згідно з винаходом не

Зо вимагають використання особливого методу для введення нуклеотидної конструкції в рослину, тільки того, щоб нуклеотидна конструкція одержала доступ усередину принаймні однієї клітини рослини. Способи введення нуклеотидних конструкцій у рослини відомі в даній галузі, включаючи, але не обмежуючись або, методи стабільної трансформації, тимчасової трансформації й опосередковані вірусами методи. Див., наприклад, способи трансформації рослинних клітин і регенерації рослин, описані в: 05 4,459,355, 5 4,536,475, 5 5,464,763, 05 5,177,010, 005 5,187,073, ЕР 267,159 АТ, ЕР 604 662 АТ, ЕР 672 752 АТ, 5 4,945,050, 05 5,036,006, 005 5,100,792, 05 5,371,014, 005 5,478,744, 005 5,179,022, 05 5,565,346, 05 5,484,956, 05 5,508,468, 05 5,538,877, 05 5,554,798, 05 5,489,520, 05 5,510,318, 05 5,204,253, 05 5,405,765, ЕР 442 174 АТ, ЕР 486 233 АТ, ЕР 486 234 АТ, ЕР 539 563 АТ, ЕР 674 725 А1,

МО91/02071, М/О95/06128 і М/О2011/095460, кожний з який включений у даний опис шляхом посилання, особливо відносно описаних методів трансформації.

У цілому методи трансформації рослин включають перенос гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (напр., незрілі або зрілі ембріони, суспензійні культури, недиференційваний калус, протопласти і т.д.), за яким іде застосування максимального граничного рівня підходящого селектора (залежно від гена селективного маркера) для виділення трансформованих клітин рослин з нетрансформованої клітинної маси. Експлантати звичайно переносять у таке ж свіже середовище й культивують у плановому порядку. Після цього трансформовані клітини диференціюють у паростки після поміщення в регенераційне середовище з додаванням максимального граничного рівня селективного агента. Паростки потім переносять на селективне середовище для вкорінення з метою одержання вкоріненого паростка або саджанця. Трансгенні саджанці потім вирощують до зрілих рослин і збирають схожі насіння (напр., Нієї і ін. (1994) Те Ріапі доигпа! 6:271-282; Ібпіда їі ін. (1996) Маїшге

Віотесппоїоду 14:745-750). Експлантати звичайно переносять у таке ж свіже середовище й культивують у плановому порядку. Загальний опис технік і методів створення трансгенних рослин можна знайти в Ауге5 апа Рагк (1994) Стйіса! Кеміему5 іп Ріапі Зсіепсе 13:219-239 апа

Воттіпепі апа дашнаг (1997) Маудіса 42:107-120. Оскільки трансформований матеріал містить багато клітин, то в будь-якій частині, що цільового калусу, що піддається обробці, або тканині або групі клітин присутні як трансформовані, так і нетрансформовані клітини. Здатність убивати нетрансформовані клітини й дозволяти трансформованим клітинам розростатися приводить до бо трансформованих культур рослин. Часто здатність забирати нетрансформовані клітини є обмеженням швидкого виділення трансформованих клітин і успішного створення трансгенних рослин. Для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного цільового гена в геномі трансгенного рослини можуть бути використані молекулярні й біохімічні методи.

Створення трансгенних рослин може бути виконано одним або декількома методами, включаючи, але не обмежуючись, введення гетерологічної ДНК у клітини рослин за допомогою

Адгорасієгішт (Аагорасієгійт-опосередкована трансформація), бомбардування рослинних клітин гетерологічною чужорідною ДНК, прикріпленої до частинок, і різні інші прямі або опосередковані методи переносу ДНК без участі частинок (напр., Ніеєї і ін. (1994) Тпе Ріапі ота! 6:271-282; ІзПпіда і ін. (1996) Маїшге Віоїесппоїоду 14:745-750; Ауге5 апа Раїк (1994)

Стіса! Вемівемув іп Ріапі 5сіепсе 13:219-239; Воттіпепі апа дашйНаг (1997) Маудіса 42:107-120)

Методи трансформації хлоропластів відомі в даній галузі техніки. Див., напр., змаб і ін. (1990) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 87:8526-8530; 5маб апа Маїїда (1993) Ргос. Маї). Асад. бсі. ОБА 90:913-917; мав апа Маїїда (1993) ЕМВО 4). 12:601-606. Метод заснований на доставці ДНК, що містить селективний маркер, за допомогою генної гармати, і націлюванні ДНК на пластидний геном через гомологічну рекомбінацію. Крім того, трансформація пластид може бути виконана трансактивацією мовчазного стійкого пластидою трансгену шляхом переважної тканинної експресії ядернокодованої пластидонаправленої РНК-полімерази. Про таку систему повідомлялося в Мебгіае і ін. (1994) Ргос. Май. Асай. 5сі. ОБА 91:7301-7305.

Трансформовані рослинні клітини можуть бути вирощені до рослин згідно зі стандартними методиками. Див., напр., МеосоптіскК і ін. (1986) Ріапі Сеї! Керогів 5:81-84. Ці рослини можуть бути вирощені й обпилені таким же трансформованим штамом або іншими штамами, з одержанням гібриду, що має конститутивну експресію бажаної фенотипічної характеристики.

Можуть бути вирощено два або більш поколінь, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипічної характеристики стабільно підтримується й успадковується, а потім можуть бути зібрані насіння для того, щоб переконатися, що експресія бажаної фенотипічної характеристики досягнута. Таким способом даний винахід надає трансформоване насіння (також позначається "трансгенне насіння"), що містить нуклеотидну конструкцію згідно з винаходом, наприклад, касету експресії згідно з винаходом, стабільно включену в геном. У різних варіантах здійснення насіння може бути покрите принаймні одним фунгіцидом та/або принаймні одним інсектицидом,

Ко) принаймні одним гербіцидом, та/або принаймні одним запобіжником, або будь-якою їх комбінацією.

Ж. Оцінка трансформації рослин

Після введення гетерологічної чужорідної ДНК у клітини рослин трансформацію або інтегрування гетерологічного гена в геном рослини підтверджують різними методами, такими як аналіз нуклеїнових кислот, білків і метаболітів, пов'язаних з інтегрованим геном.

Швидким способом скринінгу трансформованих клітин, тканин або паростків на присутність включеного гена на ранній стадії перед пересадженням у грунт є ПЛР-аналіз (Затбгоок апа

Виззеї! (2001) МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї (Соїд 5ргіпд Натог І арогаїогу Ргев5, Соїа зргіпд Нагброг, МУ)). ПЛР виконують, використовуючи олігонуклеотидні праймери, специфічні для цільового гена, або векторний фон Адгобрасіегіцт і т.п.

Трансформація рослин може бути підтверджена саузерн-блот-аналізом геномної ДНК (ЗатргооК апа Киззеї! (2001) зирга). У цілому, загальну ДНК екстрагують із трансформанту, розщеплюють за допомогою підходящих ферментів-рестриктаз, фракціонують в агарозному гелі й переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрана або "блот" потім може бути зондована, наприклад, міченим радіоактивним ЗР фрагментом цільової ДНК для підтвердження включення введеного гена в геном рослини відповідно до стандартних методик (ЗатбгоокК апа Риззеї, 2001, зирга).

У нозерн-аналізі ізолюють РНК із конкретних тканин трансформанту, фракціонують у формальдегід-агарозному гелі й наносять на нейлоновий фільтр відповідно до стандартних процедур, звичайно використовуваних в даній галузі (затргоокК апа КиззеїЇ, 2001 зирга).

Експресію РНК, кодованої нуклеотидними послідовностями згідно з винаходом, потім перевіряють гібридизацією фільтра з радіоактивним зондом, отриманим з БОС відомими методами (ЗатргооК апа Кивхзеїї (2001) вирга)» РНК також може бути виявлена та/або визначена кількісно з використанням ПЛР зі зворотною транскриптазою, як відомо в галузі техніки (напр., сгееп апа ЗБатьгоок (2012) МоїІесшаг СіІопіпд: А Гарогаїогу Мапиаї, 4 Еайоп,

Соа 5ргіпд Натог І арогаїогу Ргез55, ММоодригу, МУ).

Трансгенні рослини можуть бути проаналізовані методами вестерн-блотингу, ЕГІЗА, тестами із краплею рідини, що розтікається, й біохімічними аналізами, для визначення присутності білка, який кодується геном стійкості до гербіциду, шляхом стандартних процедур 60 (бБатргооК апа Виззеї! (2001) зирга), використовуючи антитіла, що зв'язуються з одним або більше епітопом, присутнім на білку стійкості до гербіциду.

В одному з аспектів винаходу описані тут гени ГФПД корисні як маркери оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. 3. Використання як маркер трансформації

Винахід також стосується використання в способі трансформації рослин нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом, як маркерного гена або кодуючої послідовності, що робить можливим надання рослині стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, і використання одного або більше інгібітора (-ів) ГФПД на рослинах, що містять послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ГФПД згідно з винаходом. Див., напр., Патент США 6,791,014, включений у даний опис у повному обсязі шляхом посилання.

У цьому варіанті здійснення інгібітор ГФПД може бути введений у культуральне середовище компетентних рослинних клітин, щоб знебарвити згадані клітини перед трансформацією.

Знебарвлені компетентні клітини потім трансформують геном стійкості до інгібіторів ГФПД як селективним маркером, і трансформовані клітини, що включили вказаний маркер у свій геном, стають зеленими, роблячи можливим їх виділення. Подібний процес може зменшити час, необхідний на відбір трансформованих клітин.

Таким чином, один з варіантів здійснення даного винаходу полягає в способі трансформування рослинних клітин введенням гетерологічного гена в вказані рослинні клітини з геном стійкості до інгібіторів ГФОД як селективного маркера, при цьому спосіб включає підготовку й культивування компетентних рослинних клітин, здатних прийняти гетерологічний ген, на підходящому середовищі, і введення достатньої кількості інгібітора ГФПД у підходяще культуральне середовище з компетентними рослинними клітинами. Потім компетентні клітини трансформують гетерологічним геном і селективним маркером, і трансформовані клітини, що містять гетерологічний ген, вирощують на підходящому середовищі й відбирають трансформанти. Трансформовані клітини потім можуть бути регенеровані до плодоносної трансформованої рослини.

И. Рослини й частини рослин

Під "рослиною" слід розуміти цілу рослину, органі рослин (напр., листя, стебла, коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони і їх нащадки. Рослинні клітини можуть бути

Зо диференційованими або недиференційованими (напр., калус, клітини в суспензійній культурі, протопласти, клітини листя, клітини коренів, клітини флоеми, пилок). Даний винахід може бути використаний для введення полінуклеотидів у будь-які види рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, однодольні й дводольні. Приклади цільових рослин включають, але не обмежуються ними, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс, види Вгаззіса, люцерну, жито, просо, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніоку, кава, кокос, ананас, цитрусові дерева, какас, чай, банани, авокадо, фігу, гуаву, манго, оливу, папайю, кеш'ю, макадамію, мигдаль, овес, овочі, декоративні рослини й хвойні дерева.

Овочі включають, але не обмежуються ними, томати, латук, зелений горошок, лімську квасолю, горох і види роду Сигситів, такі як огірок, канталупа й диня. Декоративні рослини включають, але не обмежуються ними, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, нарциси, петунії, гвоздики, пуансетію й хризантеми. Також можуть становити інтерес сільськогосподарські культури, включаючи, приміром, кукурудзу, сорго, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картопля, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукровий очерет, тютюн, ячмінь, олійний рапс і ін.

Цей винахід пасує будь-якому члену родини однодольних рослин, включаючи, але не обмежуючись ними, кукурудзу, рис, ячмінь, овес, пшеницю, сорго, жито, цукровий очерет, ананас, ямс, цибуля, банани, кокос і фініки.

І. Способи підвищення врожайності рослин

Забезпечуються способи підвищення врожайності рослин. Способи включають забезпечення рослини, що містить полінуклеотид, або введення в рослину або рослинну клітку полінуклеотиду, що включає нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД згідно з винаходом, вирощування рослини або її насіння в польових умовах і збору врожаю із цих рослин або насіння. Тут і далі "урожайність" рослини позначає якість та/або кількість біомаси, що продукується рослиною. Під "біомасою" слід розуміти будь-який вимірюваний рослинний продукт. Підвищення вироблення біомаси - це будь-яке поліпшення врожайності вимірюваного рослинного продукту. Підвищення врожайності рослин має декілька комерційних застосувань.

Приміром, підвищення біомаси рослинних листків може підвищити врожайність листових овочів для вживання людиною й тваринами. Крім того, підвищення біомаси листя може бути використане для збільшення виробництва фармацевтичних або промислових продуктів з бо рослин. Підвищення врожайності може включати будь-яке статистично значиме підвищення,

включаючи, але не обмежуючись цим, підвищення принаймні на 1 95, підвищення принаймні на

З 96, підвищення принаймні на 5 95, підвищення принаймні на 10 95, підвищення принаймні на 2095, принаймні на 30 95, принаймні на 50 95, принаймні на 70 95, принаймні на 100 95 або більше підвищення.

У конкретних способах рослину, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, обробляють ефективною концентрацією гербіциду-інгібітора ГФПД, такого як один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів- інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4--(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-

МО2013/072402); і похідних оксопразину (М/02013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, де застосування гербіциду приводить до підвищення врожайності рослини.

Також забезпечуються способи надання стійкості до гербіцидів рослині або частині рослини.

У подібних способах у рослину вводять нуклеотидну послідовність, що кодує ГФПД згідно з винаходом, де експресія полінуклеотиду приводить до стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД.

Рослини, створені таким способом, можуть бути оброблені ефективною концентрацією гербіциду-інгібітора ГФПД (такого як один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М- (тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-

Зо (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл/бензамід (Спол. З), 2-хлор-3-«(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і УМО2013/072402); і похідних оксопразину (УММО2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон), і демонструвати підвищену стійкість до гербіциду. "Ефективна концентрація" гербіциду в рамках даної заявки означає кількість, достатню для вповільнення або зупинки росту рослин або частин рослин, які не мають вроджену або набуту стійкість до гербіциду.

Ї. Способи боротьби з бур'янами в польових умовах

Даний винахід також стосується способу боротьби з небажаними рослинами або регулювання росту рослин у посівах рослин, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, де один або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, наприклад, один або більше

БО гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається із класу М-(1,2,5-оксадіазол-3- іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл"арилкарбоксамідів, переважно таких як 2- хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3- (метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол- 2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-«-трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б-іл)у- або М-(триазол-3- ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4--«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл/бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 3), 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- бо тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

УМО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (ММО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, застосовують до рослин (наприклад, рослин- шкідників, таких як однодольні або дводольні бур'яни або небажані культурні рослини), до насіння (наприклад, зерну, насіння або вегетативних пагонів, таких як бульби або паросткові частини із бруньками) або до зони вирощування рослин (наприклад, зони культивування). У цьому контексті ефективна концентрація одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, наприклад, одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД, вибраних із групи, яка складається з гербіцидів-інгібіторів ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)/бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М- (триазол-3-іл)яуарилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)/бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл/бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5- метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4-(трифторметилубензамід (Спол. 1); М- (тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4--(дифторметил)-2-метокси-

З-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. З), 2-хлор-3- (метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 4), -2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О02013/050421 і УМО2013/083774); заміщених 1,2,5- оксадіазолів (МУМО2013/072300 і МО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких, як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон), може бути застосована, приміром, до посадки (якщо потрібно, то й включенням у грунт), до сходів або після сходів, і може бути застосована в комбінації з іншими гербіцидами, до яких культура має вроджену стійкість або стійка через експресію одного або більше трансгенів стійкості до гербіцидів. Див., напр., Опубл. пат. заявку США Мо 2004/0058427 і Опубл. пат. заявку РСТ Мо М/О98/20144. Під " ефективною концентрацією" слід розуміти концентрацію, що контролює ріст або поширення бур'янів або інших нетрансформованих рослин без значного

Зо впливу на стійку до інгібітора ГФПД рослину або насіння. Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що застосування гербіцидів може мати багато різних форм і може здійснюватися в різний час до та/або під час посіву насіння і процесу росту. "Досходове" застосування - застосування гербіциду в бажаній зоні (напр., полі або зоні культивування) до видимих сходів рослини із грунту. "Післясходове" застосування - застосування гербіциду в бажаній зоні після видимих сходів рослини із грунту. У деяких випадках терміни "досходовий" і "післясходовий" застосовують по відношенню до бур'янів у бажаній зоні, а в деяких випадках ці терміни застосовують по відношенню до культурної рослини в бажаній зоні. При вживанні по відношенню до бур'яну ці терміни можуть стосуватися конкретного типу або виду бур'яну, що присутні або передбачуваному в цільовій зоні. "Допосадкове включення" гербіциду включає примішування сполук до грунту до висадження.

Таким чином, даний винахід включає спосіб боротьби з бур'янами в полі, що включає висадження в полі рослини або її насіння, що містить ГФПД згідно з винаходом, і застосування до вказаної рослини або зони, що її оточує, ефективної концентрації одного або більше гербіцидів-інгібіторів ГФПД.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу поле, яке повинне бути засіяне рослинами (такими як соя, бавовник, кукурудза або пшениця й т.п.), що містять нуклеотидну послідовність

ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблене гербіцидом-інгібітором ГФПД, таким як ізоксафлютол (ІФТ), до посадки рослин або посіву насіння, що очищає поле від бур'янів, знищуваних інгібітором ГФПД і дозволяє використовувати практики нульової обробки грунту, з наступною посадкою або посівом рослин на цьому ж попередньо обробленім полі (контактне застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). Залишкова активність ІФТ також буде захищати сходи й зростаючі рослини від конкуренції з бур'янами на ранніх стадіях росту. Коли рослини виростають до певного розміру, і бур'яни схильні з'являтися заново, поверх рослин може бути застосований глюфозинат або гліфозат, або ж інгібітор ГФПД або суміш інгібітора ГФПД із іншим гербіцидом, таким як гліфозат, якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.

В іншому варіанті здійснення винаходу поле, засіяне насіннями, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, може бути оброблене гербіцидом-інгібітором ГФПД, таким як ізоксафлютол (ІФТ), до сходів рослин, але після посіву насіння (поле може бути попередньо очищене від бур'янів іншими засобами, звичайно стандартними практиками 60 обробки грунту, такими як орання, глибоке орання або підготовка посівних місць), при цьому залишкова активність буде підтримувати поле вільним від бур'янів, знищених гербіцидом, так що рослини, що сходять і ростуть, не мають конкуренції з бур'янами (досходове застосування гербіциду-інгібітора ГФПД). Коли рослини виростають до певного розміру, і бур'яни схильні з'являтися заново, поверх рослин може бути застосований глюфозинат або гліфозат, або ж інгібітор ГФПД або суміш інгібітора ГФПД із іншим гербіцидом, таким як гліфозат, якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.

В іншому варіанті здійснення винаходу рослини, що містять нуклеотидну послідовність

ГФПД згідно з винаходом, можуть бути оброблені гербіцидом-інгібітором ГФПД поверх рослин, що зійшли з посіяних насіння, що очищає поле від бур'янів, знищених інгібітором ГФПД, якась обробка може проводитися разом з (напр., у баковій суміші розпилювального приладу), з наступною або попередньою обробкою гліфозатом або глюфозинатом як післясходовим гербіцидом поверх рослин (післясходове застосування гербіциду-інгібітора ГФПД (з або без гліфозату)), якщо такі рослини стійкі до вказаних гербіцидів.

Приклади окремих представників однодольних і дводольних бур'янів, з якими можна боротися гербіцидами-інгібіторами ГФПД, включають:

Однодольні рослини-шкідники родів: Аедіїор5, Адгоругоп, Адговії5, АІоресиги5, Арега, Амепа,

Вгасніапа, Вготив, Сепспгиб5, Соттеїїпа, Суподоп, Сурегиз5, Оасіуіосієпішт, Оіднапа,

ЕсПіпоспіІоа, ЕїІеосНагі5, ЕІвивіпе, Егадгобії5, Епоспіоа, Ревіиса, Рітбіізіуї5, Неїегапіпега,

Ітрегаїа, Ізспаеєтит, І ерюоспіса, І от, Мопоспогіа, Рапісит, Разра!шт, РНаїагі5, Рпієит, Роа,

Войбоеіа, Ззадіната, осігрив, Зеїагіа, 5огапит.

Дводольні рослини-шкідники родів: Аршіоп, Атагапійи5, Атрбгозіа, Апода, Апіпетів,

Арпапез, Апетівіа, Айріех, Веїїї5, Відеп5, СарзеїПа, Сагдци5, Саввзіа, Сепіаштєа, Спепородійт,

Сіквішт, Сопмоїмиіив, Оаїшта, ЮОевтодійт, Етех, Егузітит, Еирпогбіа, СаїІеорзів5, Саїїпзода,

Саїїшт, Нірізсив, Іротоєа, Коспіа, Іатіит, І еріаіїшт, І іпдетіа, Майсагіа, Мепійа, Мегситпіаїв5,

Миїїшдо, Муозоїї5, Рарамег, РНагбії5, Ріапіадо, Роуудопит, Ройшіаса, Напипсши5, Нарпапив,

Вогірра, Роїаїа, Витех, зЗаївоїа, Зепесіо, Зезбрапіа, зіда, б5іпарі5, Зоїапит, 5опспив5, Зрпепосіва, зіеїЇагіа, Тагахасит, ТНІазрі, Титоїйшт, Опіса, Мегопіса, Міоіїа, Хапіпіт.

Гербіциди-інгібітори ГФІПД, що підходять для даного винаходу, включаючи, але не обмежуючись ними, гербіциди-інгібітори ГФПД класу М-(1,2,5-оксадіазол-З-іл)бензамідів; М-

Зо (тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілл'арилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід і 2-хлор-3-(метоксиметил)-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід; М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, переважно таких як 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 1); М-(тетразол-б5-ілу- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, переважно таких як 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід (Спол. 2), 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл/бензамід (Спол. З), 2-хлор-3-«(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензамід (Спол. 4), 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід (Спол. 5); похідних піридазинону (М/О2013/050421 і

УММО2013/083774); заміщених 1,2,5-оксадіазолів (МИО2013/072300 і ММО2013/072402); і похідних оксопразину (М/О2013/054495); трикетонів, переважно таких як темботріон, сулькотріон і мезотріон; класу ізоксазолів, переважно таких як ізоксафлютол; або класу піразолінатів, переважно таких як пірасульфотол і топрамезон, можуть бути зроблені в вигляді різних рецептур, залежно від переважних біологічних та/або фізико-хімічних параметрів. Прикладами можливих рецептур є: змочувані порошки (СП), водорозчинні порошки (ВП), водорозчинні концентрати, емульгувальні концентрати (ЕК), емульсії (ЕВ), такі як емульсії типу "масло-в-воді" або "вода-в-маслі", розпилювані розчини, концентрати суспензій (КС), дисперсії на основі масла- або води, розчини, що змішуються з маслом, суспензії капсул (СК), пудри (ПП), продукти для обробки насіння, гранули для застосування врозкид і на грунті, гранули (ГР) у вигляді мікрогранул, що розпорошуються гранул, гранул з покриттям і адсорбційних гранул, вододисперговані гранули (ВГ), водорозчинні гранули (РГ), рецептури наднизького об'єму (ОЇ М), мікрокапсули й воски.

Ці індивідуальні форми рецептур у принципі відомі й описані, наприклад, в: Уміппаскег- каспіег, "Спетізспе Тесппоїодіє" |Спетіса! Тесппоіоду|, моїште 7, С. Напзег Мепйад Мипісн, Ат

Еа. 1986; У/аде мап МаІКепригу, "Ревіїсіде Еоптиїайопв", Магсе! ОеккКег, М.У., 1973; К. Мапепв, "Бргау Огуіпа" Напароок, Зга Еа. 1979, Сх. Сюоодм/іп Ца. І опдоп.

Додаткові речовини, необхідні в рецептурах, такі як інертні речовини, поверхнево-активні речовини, розчинники й інші добавки, також відомі й описані, наприклад, в: Умаїкіп5, "Напабоок ої Іпзесіїсіде Биві Оіїшепів апа Сапієгв", 2па Еа., бапапа ВоокК5, Саідмжеї! М.9)., Н.м. Оірнеп, 60 0 "Ппштодисіоп о Сіау СоПоід Спетівігу"; 2па Еа., 9). М/Пеу б 5оп5, М.У.; б. Магзаєп, "Зоїмепів

Зо

Спціде"; 2па Еа., Іпіегесіепсе, М.М. 1963; МеСшспеоп'є "Оєвівєгдепів апа Етиївіїєгтв Аппиа!", МО

Рибі. Согр., Віддежмоса М..).; 5ізвієу апа М/оса, "Епсусіореєдіа ої Зипасе Асіїме Адепів", Спет. Рибі.

Со. Іпс., М.М. 1964; бспбпгеїді, "Сгеплпаспепакіїме Атуіепохідаадикіе" ГІпіегасе-асіїме еіпуїеєпе охіде аддисів|, Мі. Мепадзаезеї!., еїиндапй 1976; МіппасКег-каспег, "Спетібзспе Тесппоїодіе"

ІСпетіса! Тесппоіоду), моїште 7, С. Напзег Мепйад Мипісн, 4 Еа. 1986.

На основі цих рецептур також можливо приготувати комбінації з іншими пестицидно активними субстанціями, такими як, наприклад, інсектициди, акарициди, гербіциди, фунгіциди, і із запобіжниками, добривами та/або регуляторами росту, наприклад, у вигляді готової суміші або бакової суміші.

Й. Способи введення гена згідно з винаходом в інша рослину

Також тут забезпечені способи введення нуклеотидної послідовності ГФПД згідно з винаходом в іншу рослину. Нуклеотидна послідовність ГФІПД згідно з винаходом або її фрагмент може бути введена в інша рослину шляхом повторюваного відбору, зворотного схрещування, сортового розведення, лінійної селекції, масової селекції, мутаційного розведення та/або селекції, посиленої генетичним маркером.

Таким чином, в одному з варіантів здійснення способи згідно з винаходом включають схрещування першої рослини, що містить нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, із другою рослиною для одержання рослин-нащадків ЕТ, і відбір рослин-нащадків Е1, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом.

Способи можуть також включати схрещування відібраних рослин-потомства з першою рослиною, що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, для одержання рослин-нащадків зворотного схрещування, і відбір рослин-нащадків зворотного схрещування, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом. Способи оцінки стійкості до гербіциду-інгібітора ГФПД описані тут в інших розділах.

Способи можуть також включати повторення цих етапів один або більше раз послідовно для одержання відібраних рослин-нащадків зворотного схрещування другого покоління або вище, стійких до гербіциду-інгібітора ГФПД або що містять нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом.

У способі згідно із даним винаходом може бути використаний будь-який метод розведення,

Зо що включає селекцію рослин за бажаним фенотипом. У деяких варіантах здійснення рослини

Е1 можуть самозапилюватися для одержання виділеного покоління 2. Потім у кожному поколінні (ЕЗ, Е4, Е5, і т.д.) можуть бути відібрані окремі рослини, що представляють бажаний фенотип (напр., стійкість до гербіциду-інгібітора ГФПД), поки ознаки не стануть гомозиготними або закріпленими в популяції, яку розводять.

Другою рослиною може бути рослина, що має бажану властивість, таку як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, стійкість до посух, боротьба з нематодами, ефективність використання води, ефективність використання азоту, поліпшена живильна цінність, стійкість до хвороб, поліпшений фотосинтез, поліпшена якість волокон, стійкість до стресів, поліпшене розмноження й т.п. Друга рослина може бути елітною подією, як описано тут в інших розділах.

У різних варіантах здійснення частини рослин-результатів схрещувань (цілі рослини, органі рослин (напр., листи, стебла, коріння і т.д.), насіння, рослинні клітини, пагони, ембріони й т.п.) можуть бути зібрані для подальшого розмноження або обробки (таке як виробництво їжі, корму, біопалива, масла, борошна, вживання в їжу й т.п.)

К. Способи одержання рослинного продукту

Даний винахід також стосується процесу одержання товарного продукту, що включає збір та/або помел зерна культури, що включає нуклеотидну послідовність ГФПД згідно з винаходом, для одержання товарного продукту. Агрономічно й комерційно доступні продукти та/або композиції, що включають, але не обмежувані ними, корми для тварин, товари, а також рослинні продукти й побічні продукти, які призначені для використання як продуктів харчування для споживання людиною або для використання в композиціях і товарах, призначених для споживання людиною, особливо позбавлених життєздатності насіння / зернових продуктів, у тому числі (напів-) оброблених продуктів, отриманих з таких зерен / насіння, де вказаний продукт або містить цільні або оброблені насіння або зерно, корми для тваринних, кукурудзяне або соєве борошно грубого помелу, кукурудзяне або соєве борошно, кукурудзу, кукурудзяний крохмаль, соєвий шрот, соєве борошно, пластівці, концентрат соєвого білка, ізоляти соєвого білка, текстурований концентрат соєвого білка, косметику, засоби з догляду за волоссями, масло соєвих горішків, натто, темпі, гідролізований соєвий білок, збиті вершки, шортенінги, лецитин, цільні харчові соєві боби (сирі, смажені, або як едамаме), соєвий йогурт, соєвий сир, тофу, фучжу, а також приготовлене, поліроване, ошпарене, запечене або пропарене зерно й бо т.п., слід розуміти як охоплювані суттю даного винаходу, якщо ці продукти й композиції містять,

кількості нуклеотидної та/або амінокислотної послідовності, що виявляються, викладеної тут і далі як діагностична для будь-якої рослини, що містить такі нуклеотидні послідовності.

Нижченаведені приклади наведені в ілюстративних цілях і не для обмеження.

Експериментальна частина

Приклад 1. Бібліотека точкових мутантів першого покоління.

Мутантну ГФПД РІЄмМо33 (описана в Міжнародній патентній заявці Ме РСТ/О52013/59598 (подано 13 вересня 2013 року) і викладена тут як 5БЕО ІЮ МО:5) мутували в положеннях 334 і 336. Насичений мутагенез цих положень здійснювали за допомогою набору ОШІКСНАМОСЕФ

Ідйіліпу. Мутанти накопичували й трансформували в клітини ОНзЗаїрна Е. соїї. Шістсот окремих клонів перевіряли на стійкість до інгібітора ГФПД темботріону (ТБТ). Клони вирощували на середовищі І.В плюс канаміцин при 37 градусах С у шейкері до досягнення ОГбООнм 0,3. Потім культури переводили на 30 градусів С і інкубували протягом додаткових 17 годин. Культури центрифугували й клітинні гранули ресуспендували в 10 мМ Нерез/КОН рі 7,6, 4 мМ Моаосі», 1

ММ ОТТ. Клітини піддавали лізису шляхом розбивання кульками, і після центрифугування одержували розчинні клітинні екстракти.

Мутанти аналізували методом коричневого кольору. Більш конкретно, екстракти ГФПД аналізували в 9б-лунковому форматі на стійкість до інгібітора ГФПД шляхом нанесення на тверде середовище, що містить І Бр-агар, канаміцин, 5 мм тирозин, 42 мм сукцинат і інгібітор

ГФПД. В основному скринінгу 20 мкл екстракту наносили в трьох повтореннях на планшети, що містять 250, 500, 1000 або 2000 мкМ темботріону. Планшети покривали повітропроникною стрічкою й інкубували при 37 градусах С. Після закінчення 24 годин утворення бурого пігменту візуально порівнювали зі зразками, що містять РІНРРО і РІЄмо33. Варіанти, що демонструють у присутності ТБТ утворення більш темного коричневого кольору, ніж РІЕмо33, аналізували заново на 0, 500, 1000, 2000 мкм ТБТ і 500, 1000, 2000 мкМ дикетонітрилу (ДКН, активної сполуки ізоксафлютолу (ІФТ)), і 500, 1000, 2000 мкМ мезотріону. Варіанти, які знову демонстрували більш темний коричневий колір, знову експресували, і екстракт титрували на всіх протестованих інгібіторах ГФПД, щоб визначити ступінь поліпшення.

Найтемніший колір демонстрували подвійні мутанти Ріез35Р-336Е і РіеЗз35Р-336У (які тут і далі позначені як РІЄмо43 (5ЕО ІЮО МО:7) і РІЄмо44 (ЗЕО ІЮ МО:8), відповідно). Ці білки

Зо виробляли в Е. сої), очищали й перевіряли їх активність за допомогою нижчеописаних аналізів

ГФПД.

Приклад 2: Виготовлення й очищення білків ГФПД і визначення активності ГФПД у присутності гербіцидів-інгібіторів ГФПД

Білки ГФПД виготовляли й очищали як описано в М/О2011/076882. Активність білків ГФПД під час відсутності або в присутності інгібіторів ГФПД визначали, використовуючи або так званий ОЮО-аналіз, або НОЮО-аналіз. а) Об-аналіз: Активність ГФПД визначали колориметрично шляхом вимірювання кількостей

ГФП, що залишається в аналітичній суміші наприкінці інкубаційного періоду після дериватизації

ГФП 2,4-динітрофенілгідразином (ДНФ) для утворення в лужних умовах янтарно-коричневого 2,4-динітрофенілгідразону. Аналіз виконували при кімнатній температурі в 96б-лункових планшетах Сгеїіпег з Е-подібним профілем дна. Аналітична суміш містила 50 мМ Ттгі5-НОЇ рн 7,8, 0,5 мМ ГФП, 10 мм аскорбату, 650 одиниць каталази й належні кількості очищеного ферменту

ГФПД загальним об'ємом аналізу 100 мкл. Реакцію починали додатком ферменту. Після інкубаційного періоду 24 хвилини реакцію зупиняли додаванням 50 мкл розчину 0,04 95 ДНФ в 3,8 Н НОЇ. Після подальшого інкубаційного періоду 15 хвилин до реакційної суміші додавали 100 мкл 5 Н розчину КОН, і кількість непрореагованого ГФП вимірювали фотометрично при 405 нм.

Активність ферменту розраховували як різницю в Е405 між аналізом без ферменту (негативний контроль) і аналізом, що містять фермент (ДЕ405-Е405(негативний контроль) - Е405).

Активність ферменту (нмоль переробленого субстрату за хвилину) розраховували за калібрувальною кривою, зробленою на ГФП. Значення рі5о (негативний логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 96 ферментативної активності, у молярному вираженні) визначали за графіком доза-реакція активності ГФПД проти тестованої концентрації інгібітора (5,0 х 10-6,1,0 х 10-5,2,5 х 10-5, 4,0 х 10-5, 7,0 х 10-5, 1,0 х 10-4,2,0 х 10-4 ії 5,0 х 10-4М), використовуючи Логістичну регресію з 4-ма змінними або Сигмоїдну модель дози-реакції з пакету програмного забезпечення ХНИ ІЮ Вивзіпе55 ЗоіІшіоп5 ЦЯ. Результат "»5,6" означає, що інгібування при найменшій тестованій концентрації було більше 85 95, і тому значення рі5о не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. Результат "«2,5" означає, що інгібування при найбільший тестованій концентрації було менше 25 95, і тому значення рібо не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. "не бо визн." означає "не визначене".

р) НнаО-аналіз: При Ноб-аналізі активність ГФПД вимірювали при кімнатній температурі додаванням належних кількостей ГФПД до розчину 200 мМ Ттгі5-НСЇІ рн 7,6, 10 мм аскорбату, 20

МКМ РезО4, 650 одиниць каталази, 8 мкг ГГА-діоксигенази (ГГА: гомогентизат) і 600 мкм ГФпП загальним об'ємом 1 мл. Початкові швидкості реакції під час відсутності або в присутності інгібіторів визначали по збільшенню поглинання при 318 нм завдяки утворення малеїлацетоацетату (є318-11,900 М-1 см-1). Значення рібо (негативний логарифм концентрації інгібітора, необхідної для інгібування 50 95 ферментативної активності, у молярнім вираженні) визначали за графіком доза-реакцчя активності ГФПД проти тестованої концентрації інгібітора, використовуючи Логістичну регресію з 4-ма змінними або Сигмоїдну модель дози-реакції з пакета програмного забезпечення ХИйЙ ІЮ Вивзіпе55 Боішіоп5 4. Через Уф-поглинання тестованих інгібіторів ГФПД концентрації інгібіторів понад 100 мкМ не могли бути протестовані.

Результат "«4" означає, що інгібування при концентрації інгібітора 100 мкМ було менше 25 95, і тому значення рі5бБо не могло бути точно визначене за всім діапазоном тестованих концентрацій. "не визн." означає "не визначене".

Нар-аналіз дозволяє безперервно відслідковувати каталізоване ГФПД утворення ГГА протягом деякого періоду часу й тому використовувався для визначення типу інгібуваннятестованих інгібіторів ГФПД. Коли в присутності інгібітора активність ГФПД зменшувалася залежним від часу чином, характерним для повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів (для визначення див. Моїтізоп (1982) Тгепаз Віоспет. Зсбі. 7, 102- 105), інгібітор називали залежним від часу (скорочено "зв"). Коли в присутності інгібітора активність ГФПД інгібувалася, але інгібування не зменшувалося залежним від часу образом, інгібітор називали оборотним (скорочено "обор").

Скорочення "по-іп" означає, що тип інгібування неможливо було визначити через те, що при концентрації інгібітора 100 мкМ не спостерігалося інгібування відповідного варіанта ГФПД.

Коли стійкість білків ГФПД РіІЄмо43 і РІіЄмо44 до дикетонітрилу (ДКН) і мезотріону (МЗТ) визначили з використанням ОЮ-аналізу, стало очевидно, що їх стійкість поліпшилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІСЗ3З3бУ, РІЗЗЗбУМ, С959 і РІємоЗ3З3 (див. Таблицю 2).

Таблиця 2

Оцінка стійкості (ріІ5О) білків ГФПД першого покоління до дикетонітрилу (ДКН) і мезотріону (МЗТ) з використанням ОО-аналізу

ФЕОЮ Положення

Клон МО амінокислоти Активність в РІНРРО

Рекаг/24хв МКГ 711» |в реве зно 0

РІЗУ 2 |Е | | 066 | 53 | 56

РІЗУ! З |Е ЇМ | 066 9 Щ | 52 | 55 себя | 5 |Р |6 (| 009 2 | 55 | »56

РЕМОЗЗ|Ї 6 |Р | | 025 | 43 | 5

РЕМАЗ| 7 |Р | | 039 | 4 | 46

РЕМЯ4|, 8 |. ЇМ | 01 9 Щ | 40 | 46

Коо)

Коли стійкість білків ГФПД Р'іЄЕмо43 і РіЄмо44 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) визначали з використанням НОоЮ-аналізу, було виявлено, що їх стійкість значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД (деталі в Таблиці 7 нижче). Що ще більш важливо, аналіз часової динаміки інгібування дикетонітрилом (ДКТ), темботріоном (ТБТ) і мезотріоном (МЗТ) показав, що механізм інгібування білків ГФПД РіЄмо43 і РІіЄмо44 значно відрізнявся від механізму інгібування еталонних білків ГФПД у тому розумінні, що він змінився із залежного від часу інгібування, характерного для повільнозв'язувальних або повільно, міцнозв'язувальних інгібіторів, до повністю оборотного інгібування (деталі в Таблиці 11 нижче).

Приклад 3: Бібліотека точкових мутантів другого покоління

РІЄмо43 і РІЄмо44, отримані як описано в Прикладі 1, використовували для створення білків

ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 339 і 340 за допомогою набору

ОШІКСНАМСЕФ Іднпіпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено в

Таблиці 3.

Таблиця З

Оцінка стійкості (ріІ5О) білків ГФПД другого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл)бензамід) з використанням ОЮО-аналізу. яю ее Де ою анбеее р Тег ет (ее. мкг Білок 2

РЕМАЗ | 7 | Р | Е | Кк | А | 039 | 41 |556| 46 | 556 щРІгО /ї 9 | Р | Е | А | 0 | 036 33 | 48 | 37 | 54

ЕСРІЗО | ло | Р | в | Кк | Е | 039 / зе | 48 | 37 | 55 тент ик яю рвві зв визн. «11151815 15581 визн. се ||| кт сю 11 визн.

Стійкість білків ГФПД РІГ/РІ29, РІГР1ІЗ30, К131 і К132 до дикетонітрилу (ДКТ) та/або темботріону (ТБТ) та/або мезотріону (МЗТ) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІЗЗ33б6У, РІЗЗбУУ, С959, і РІЕЄмо33. Коли стійкість білків

ГФПД БГРІ129 і РІ РІ130 до дикетонітрилу (ДКТ) та/або темботріону (ТБТ) та/або мезотріону (МЗ3Т) визначали з використанням НОоО-аналізу, було виявлено, що їх стійкість також значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД РІНРРО, РІСЗЗбЕ, РІСЗЗбУ, РІСЗЗбМУ,

С959, і РІЄємо33 (деталі в Таблиці 7 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування показав, що дикетонітрил (ДКТ), темботріон (ТБТ) і мезотріон (МЗТ) були повністю оборотними інгібіторами білків ГФПД РІГ Р129 і РІ Р130 (деталі в Таблиці 11 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування

Спол. 2 білків ГФПД К131 і К1І32 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків

ГФПД КІ131 і К132 (деталі в Таблиці 12 нижче).

Приклад 4: Бібліотека точкових мутантів третього покоління

Варіанти ГФПД, отримані як описано в Прикладі 3, використовували для створення білків

ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 215 за допомогою набору

ОШІКСНАМСЕФ Іідніпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено в

Таблиці 4. Як другий еталон додатково до РІНРРО використовували К299, що несе тільки мутацію Р2151І.

Таблиця 4

Оцінка стійкості (рІ5О) білків ГФПД третього покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (М3ЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-

Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу. яю рев | хеТвю вітки Тег т |. в мкг Білок 2

РІНРРО у 1 / Р | Е | а | Кк | А | 0,76 | 556 | 55,6 | 55,6 | 55,6

РЕМЯЗ | 7 | Р | Р | Е | Кк | А | 039, | 41 |556.| 46 | 556

ЕШР2О2 | 12 1 | Р | є | Кк | Е | 0,09. | «25 36 | «25 45

ЕСРІЗ6 | 11 1 2 ЇЇ Р | є | к | А / 009 / 26 | 47 | 33 | 48

ЕРІг3 | 9 | Р | Р | Е | А | 0 | 0,936 / 33 | 48 | 37 | 54

ЕСРІЗО | ло | Р | Р | є | к | Е | 039 | зе | 48 | 37 | 55

Таблиця 4

Фе |в: |и кв |25 |з визн.

СЕЗНИ НЕ НН СНИ ЕТАПУ НУ НСХУ НЯ ПЕУЧИСсІ визн.

СЕН НЕСТИ НС С НО НЕ ОСТ НОСА ВЕ НЕ НЕСЛО визн. че ||| і1кТк сю |і визн.

Стійкість білків ГФПД с мутацією Р215Ї до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗ3Т) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Коли стійкість білків ГФПД РІ Р136 і РІГ Р202 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗ3Т) визначали з використанням НОоЮ-аналізу, було виявлено, що їх стійкість значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД (деталі в Таблиці 7 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування показав, що дикетонітрил (ДКТ), темботріон (ТБТ) і мезотріон (МЗТ) були повністю оборотними інгібіторами білків ГФПД РІ /РІ136 і РІ Р202 (деталі в Таблиці 11 нижче). Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К137 і К2О3 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К137 і К20О3 (деталі в Таблиці 12 нижче).

Приклад 5: Бібліотека точкових мутантів четвертого покоління

Варіант ГФПД ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 215 за допомогою набору

ОШІКСНАМСЕЄФ Іопіпіпод. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОЮр-аналізом, наведено в

Таблиці 5.

Таблиця 5

Оцінка стійкості (рІ5О) білків ГФПД четвертого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-

Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу.

Ми ННЯ НЕСЛИ в мкг Білок 2

РсРІЗО | 10 | Р | Р | Р | Е | 039 | 32 | 48 3/7 | 55

РР2О2 | 12 | і | Р | в | Е | 009 |-«25)| 36 «25| 45

Каб | 18 | А | Р | Е | Е | 009 | 30 45 | 37 | 50

Кка;в | 19 | м | Р | ЕР | Е | 05 |-25) 44 | 34 | 54

Стійкість білків ГФПД К255 і К258 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (М3ЗТ) значно покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К255 і К258 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К255 і К258 (деталі в Таблиці 12 нижче).

Приклад 6: Бібліотека точкових мутантів п'ятого покоління

Варіанти ГФПД РГГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, і ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 226 і 340 за допомогою набору ОШІКСНАМСЕФ Ідніпіпд. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена Ор-аналізом, наведено в Таблиці 6.

Таблиця 6

Оцінка стійкості (рІ50О) ферментів ГФПД четвертого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензамід) з використанням ОО-аналізу.

Репаєг/24х Спол.

Пере реєроє р р рнесввя Ге ет ек.

Р2О2 | 12 | | ОРЕ | КЕ 009 / «25 36 | «25 45 кзоо її 21 | ОРІ ЕК || 001 / «25| ЗЛ | «25 38 кзоб 1 24 | | 3. РЕ | КЕ 001 / «251 48 | 37 | 5 кз63 | 29 | Р | 3. | Р | є | К | Е | 020 | 38 | 55 | 43 | 54

Стійкість білків ГФПД КЗО0 і К306 до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) покращилася в порівнянні з еталонними білками ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД КЗО0, КЗ306 і КЗ63 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД КЗО0, КЗ306 і КЗ363 (деталі в Таблиці 12 нижче).

Приклад 7: Стійкість варіантів ГФПД, створених, як описано в Прикладах 1-6, до інгібіторів

ГФПД, визначена НОоО-аналізом

Стійкість варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ), визначена НОб-аналізом, наведено в Таблиці 7.

Таблиця 7

Оцінка стійкості (рі5О) варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до дикетонітрилу (ДКТ), темботріону (ТБТ) і мезотріону (МЗТ) з використанням НоО-аналізу 7711... |2151|3935| 336 | 339 | з40 ДдКн. тБТ //- |м3т

РІНРРО у 1 | Р | Е | а | Кк | А | 58 | 64 | 58 рРІЗЗ3бМІ 4 | Р | Е | М'| Кк | А | 53 | 6 | 55 /

РІЗУ! 2 | Р | Е | є | Кк | А | 51 | 59 | 51 рРІЗЗвМІ З | Р | Е | М | Кк | А | 49 | 55 | 50

РЕМОЗЗ | 6 | Р | Р | М | Кк | А | 46 | 62 | 55

РЕМАЗ | 7 | Р | Р | є | Кк | А Ї 40 | 60 | 51

РЕМЯА4 | 8 | Р | Р | М | Кк | А Ї 41 | 59 | 52

РІгО ї 9 | Р | Р | Е | А. | 2 | 46 | 62 | 50

ЕСРІЗО | 10 | Р | Р | є | Кк | ЕЕ Її 43 | 62 | 53

РІЗ | 11 | 4 | Р | Е | Кк | А ЇЇ 40 | 53 | 45

Р2О2г | 12 | Її | Р | є | Кк |! ЕЇ «4 | 42 | «4

Стійкість варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, до Спол. 1 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4- оксадіазол-2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. З (4--(дифторметил)-2-метокси-

З-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. 4 (2-хлор-3- (метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) і Спол. 5 (2- (метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід), визначена НОоО-аналізом, наведено в Таблиці 8.

Таблиця 8

Оцінка стійкості (рі5О) варіантів ГФПД, створених у Прикладах 1-6, з використанням НОор-аналізу

ЗЕО І не . год

Клон МО Положення мутацій в РІНРРО Гербіциди-інгібітори ГФПД 71 ..ю.юЮ |215|226 | 335 | 336 | 339 | 340 | Спол. 2| Спол. 1| Спол. З|Спол. 4| Спол. 5

РІНРРО | 1 |Р ОО |Е |с0 |кК А | 67 | 63 | 66 | 70 | б ріазз3бу| 4 |Р |О |Е |М |К А | 68 | бе | 64 | 67 | б

Р.РІ2гУ | 9 |Р ОО |Р |Е ТА (0 | 58 | би | 59 66 | б

РсРІЗО | ло |Р 0 |Р |Е |К є | 62 | бе | 64 | 66 | 60 се Гете ке ее тн (тн (Мн Гн визн. |визн. |визн. |визн.

СЕЗНН НЕСЛО СТИ С СТВО СУНОСУНО ВЕСТ ПСИ НСБ визн. визн.

Р.РІЗБ | 11 |- ТО |Р |Е |К А | 59 | 56 | 56 | 60 | 56

Приклад 8: Бібліотека точкових мутантів шостого покоління

Варіанти ГФПД РГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, і К255 і К258, отримані як описано в Прикладі 5, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положеннях 188 і 189 за допомогою набору ОШІКСНАМОЕФ ІІпіпіпу. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ООр-аналізом, наведено в Таблиці 9.

Таблиця 9

Оцінка стійкості (рі5О) білків ГФПД шостого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (МЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5- іл)бензамід) з використанням ОЮО-аналізу

ЗЕО І . . пд:

Клон МО: Положення амінокислоти в РІНРРО | Активність Інгібітори ГФПД 1 ре реа оо вю ревсова мкг Білок 2

РР2О2 | 12 | А | в | СГ | Р | Е | Е | 009 |-25)/36 25 45

Ка58 | 19 | А | В | М | Р | Е | Е | 05 |-25)| 44 | 34 | 54 каб7 | 26 | а | с | Р | РЕ |Е | 047 |35|53| А | 5А4

КкагБбо | 17 | а/с | РІ |Е | 007 |-25)| 38 30 | 46 кзагх; | 25 | а | с | м /|РІЕ|Е | 041 |-25)|46| 36 | 56 ко5 | 30 | а | С | А | Р | ЕЕ | Е | 06 | 33 | 48 | 37 | 49 коб | 31 | а са | м | РІ | Е | 052 /|-25)|45| 35| 56 ко7 | 32 | й Е | М | Р | Е | ЕЕ | 041 |«25)| 46 | 36 | 57 ков | з3 | с | 0 | мМ Р | ЕР | Е | 056 |«25) 46) 365

Комбінація мутацій у положеннях 188 і 189 з мутаціями в положеннях 215, 335, 336 і 340 позитивно впливає на рівень активності ферментів, які усе ще показують високий рівень стійкості до інгібіторів. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД К250, КЗ25 і

КЗ357 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД К250, КЗ325 і К357.

Значення рібо Спол. 2 проти білків ГФПД К250, КЗ325 і КЗ3З57 минулого визначені як «4, 5,51 5,1, відповідно.

Приклад 9: Бібліотека точкових мутантів сьомого покоління

Варіанти ГФПД РГГР130, отриманий як описано в Прикладі 3, і ЕГР202, отриманий як описано в Прикладі 4, використовували для створення білків ГФПД, що містять подальші заміни амінокислот у положенні 200 за допомогою набору ОШІКСНАМСЕФ Іідпіпіпд. Їх стійкість до інгібіторів ГФПД, визначена ОО-аналізом, наведено в Таблиці 10.

Таблиця 10

Оцінка стійкості (рІ50) ферментів ГФПД сьомого покоління до дикетонітрилу (ДКН), темботріону (ТБТ), мезотріону (М3ЗТ) і Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-"«метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-

Б-іл)бензамід) з використанням Об-аналізу.

ЗЕО І . . ск яв ре в рвевю Іевое ле Тег рег ети мкг Білок 2

ШР2О2 | 12 | 4 | 1 7 Р | є | Е | 009 /|25)136 25|45 кзо3 1 22 | І! | 4 1 Р | є | ЕЕ | 0008 |25142 32 | 46 кзо4 1 23 | М | її Р | є | Е | 001 /|25142 32| 46 кЗзбо 1 27 | І | Р | Р | Е | ЕЕ | 028 /|36153 43|53 збі | 28 | М | Р | Р | Є | Е | 021 |з34/| 51140 | 52

Комбінація мутацій у положенні 200 з мутаціями в положеннях 215, 335, 336 і 340 приводить до варіантів ГФПД, які усе ще показують високий рівень стійкості до інгібіторів ГФПД. Аналіз часової динаміки інгібування Спол. 2 білків ГФПД КЗ303, К304, КЗ360 і КЗ61 показав, що Спол. 2 була повністю оборотним інгібітором білків ГФПД КЗ303, К304, КЗ60 і КЗ61 (деталі в Таблиці 12 нижче). Значення рі5Бо Спол. 2 проти білків ГФПД КЗО03, К304, КЗ360 і КЗ61 минулого визначені як 5,0, 4,7, 5,5 і 5,3, відповідно.

Приклад 10: Аналіз типу інгібування варіантів ГФПД інгібіторами ГФОД

Тип інгібування варіантів ГФПД, отриманих як описано в Прикладах 1-9, різними інгібіторами

ГФПД, визначений з використанням вищеописаного НОО-аналізу, наведено в Таблицях 11 і 12.

Таблиця 11

Тип інгібування варіантів ГФПД ДКН (дикетонітрилом), ТБТ (темботріоном) і МЗТ (мезотріоном), визначений з використанням НОоЮ-аналізу.

ЗЕО І г. . од 777 ..ю.юЮю | 215| 335 | 336 | 339 | з40 |ДКН |тБТ (мзт

РІНРРО | 1 | Р | Е | б | Кк | А (зв (зв (зв рРІЗЗ3БМ | 4 | Р | Е | М | Кк | А зв (зв (зв рРЗЗВЕ | 2 | Р | Е | ЕЕ | Кк | А зв (зв (зв рРІЗЗ3БМ | З | Р | Е | М | Кк | А зв (зв (зв

РЕМОЗЗ | 6 | Р | Р | М | Кк | А зв (зв (зв

РЕМАЗ | 7 | Р | Р | Е | Кк | А (обор (|обор |обор,//

РЕМА. | 8 | Р | Р / У | Кк | А (обор (|обор |обор,//

ЕщРІгО | 9 | Р | Р | Е | А | ОО (обор (|обор |обор,//

ЕШРІЗО | ло | Р | Р / Е | КК | Є Цобор (|обор, |обор,/7/

ЕШРІЗ6 | 711 | Є Ї Р в 1 КО А (обор, |обор |обор,//

ЕШР2О2 | 712 | | Р | в | Кк | є Цпо-п // |обор,(|по-п/З

Таблиця 12

Тип інгібування варіантів ГФПД Спол. 1 (2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3- (метилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензамід), Спол. 2 (2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. З (4--дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М- (1-метил-1Н-тетразол-5-іл)бензамід), Спол. 4 (2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід) і Спол. 5 (2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензамід), певний НОр-аналізом.

ЗЕО

Клон ІО Положення мутацій в РІНРРО Гербіциди-інгібітори ГФПД

МО

. Тго0|215|226|335|336| 3391340 | Спол. 2 | Спол. 1 | Спол. З | Спол. 4 | Спол. 5

РІНРРО | 1 | (Р ТО |Е (с |кК ТА (зв. зв. (зв, |зв (зв рРІШЗЗ6МУ| 4 | (Р ТО (ЕЕ |М/ |К ТА (зв. зв, (зв (зв (зв

Кго5 |18 | ТА ТО |Р |Е |К ЦЕ Ообор |/|не визн.|не визн.| не визн.| не визн.

Усі варіанти ГФПД, отримані як описано в Прикладах 1-9, не мають або ж мають значно зменшену афінність до інгібіторів ГФПД, і в той же час швидкість дисоціації інгібіторів ГФПД із ферменту підвищену настільки, що інгібітори ГФПД більш не діють як повільнозв'язувальні або повільно, міцнозв'язувальні інгібітори, але стають повністю оборотними інгібіторами.

Приклад 11. Трансформація сої

Трансформація сої досягається використанням добре відомих методів, таких як описаний для трансформації напівнасінних експлантатів сої, опосередкованої Адгобасієгішт ішптегасіепв, використовуючи в основному метод, описаний Ра; і ін. (2006), Ріапі се Вер. 25:206.

Трансформанти ідентифікували, використовуючи як селективний маркер темботріон або ізоксафлютол. Спостерігалася поява зелених паростків, задокументована як індикатор стійкості до гербіцидів ізоксафлютолу або темботріону. Стійкі трансгенні паростки демонстрували нормальне позеленіння в порівнянні з паростками сої дикого типу, не обробленими ізоксафлютолом або темботріоном, у той час як паростки сої дикого типу, оброблені тими ж кількостями ізоксафлютолу або темботріону, повністю знебарвилися. Це вказує, що присутність білка ГФПД створює можливість стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, на зразок ізоксафлютолу або темботріону.

Стійкі зелені паростки переносили в середовище для вкорінення або прищеплювали.

Укорінені саджанці поміщали в грунт і переносили в теплицю після періоду акліматизації. Потім рослини, що містять трансген, обприскували гербіцидами-інгібіторами ГФПД, для прикладу - темботріоном у кількості 100 г Ага або мезотріоном у кількості 300 г АІ/га з додаванням сульфату амонію й метилового ефіру рапсової олії. Через десять днів після застосування гербіциду симптоми, що з'явилися, оцінювали й порівнювали із симптомами, що спостерігалися в рослин дикого типу в тих же умовах.

Приклад 12. Стійкість рослин сої до мезотріону

Рослини сої ТО, які експресують стійкий до інгібіторів ГФПД фермент згідно із даним винаходом, разом з геном, що надає стійкість до гліфозату й геном, що надає стійкість до глюфозинату або що мають " рослинну касету експресії"? що включає тільки стійкий до інгібіторів ГФПД фермент, перевіряли на стійкість до мезотріону. До тепличних випробувань трансгенних рослин трансформанти сої регулярно перевіряли на експресію й присутність трансгенів за допомогою методу виявлення білка ЕГ І5А (детальний опис див. у розділах Г і Е).

Для аналізу стійкості до гербіцидів використовували тільки рослини, виділені на селективному середовищі і які мають експресією трансгенного білка ГФПД, що виявляється. Розпилювач

Оемгіеє ТгасКкег Зргауег калібрували перед кожним обприскуванням. Хімічною рецептурою, використаною в перевірці на мезотріон (МЗТ), була рецептура СаїйсіоФ 4 КС із додаванням сульфату амонію й метилованої рапсової олії (Асійгор). Тести з обприскуванням проводили, використовуючи ЗХ польової кількості (еквівалентно 9 рідких унцій на акр тієї ж рецептури гербіциду, що містить 40 95 активного інгредієнта (АЇ) мезотріону), що дорівнює 316 грам АЇ на гектар. Стійкість оцінювали через тиждень після обприскування. Рослини сої дикого типу, обприскані тією ж рецептурою гербіциду, повністю знебарвилися й показували 100 95 ушкодженого листя. Рейтинг стійкості "О" присвоювали рослинам, у яких повністю знебарвилися верхівки паростків, нововипущені трилисники й деякі пазушні бруньки. Рейтинг "1" присвоювали рослинам з низькою стійкістю, тобто наймолодші тканини паростка мали деяке зелене листя й не були повністю знебарвлені. Рейтинг "2" присвоювали рослинам із середньою стійкістю, тобто більш 50 95 площі листя трьох верхніх трилисників не показували хлорозу або знебарвлюючих ушкоджень. Рейтинг "3" присвоювали рослинам з майже зробленою стійкістю, тобто менше 10 95 площі листя показували хлороз або знебарвлення. Результати показано в Таблиці 13.

Таблиця 13

Оцінка ушкоджень площі листя подій трансгенної сої ТО, які експресують різні варіанти ГФПД, через сім днів обробки мезотріоном у кількості ЗХ від польового, еквівалентно 316 грам АїЇ на гектар. Рейтинг "1" присвоювали рослинам з низькою стійкістю, тобто наймолодші тканини паростка мали деяке зелене листя й не були повністю знебарвлені. Рейтинг "2" присвоювали рослинам із середньою стійкістю, тобто більш 50 95 площі листя трьох верхніх трилисників не показували хлорозу або знебарвлюючих ушкоджень. Рейтинг "3" присвоювали рослинам з майже зробленою стійкістю, тобто менше 10 95 площі листя показували хлороз або знебарвлення. Різні рослинні касети експресії конструювали або з ферментом (-ами), що надають стійкість тільки до гербіцидів-інгібіторів ГФПД (Нт-одинарний), або, що надають стійкість за трьома різними за механізмами дії гербіцидами (Нт-потрійний), тобто, інгібіторам

ГФПД, гліфозату й глюфозинату. гФПД МО: експресїї 0 | 1 | 2 | 3 | рослин

РІЕМО43 | 7 |НТпотрйнийї// | 6 | 718 | 26 | 20 | 7

РІЕМОД4Д | 8 |НТпотрйнийї// | 4 | 22 | 19 | 26 | л

РІЕМО44 | 8 |НТодинарлий.їу/ | 7 | 714 | 43 | 21 | 85

ЕШРІ2 | 19 |НТпотрійнийї// | 13 | 718 35 | 12 | 78

ШР2О2 | 12 |НТпотрйнийї// | 7 | 8 | ло | 14 | 39

З 713 регенерованих і відібраних трансгенних трансформантів більше 25 95 показало високий рівень стійкості з менше ніж 10 95 ушкоджень від загальної площі листя. У загальному -70 95 перевірених трансгенних рослин візуально були оцінені як такі, що мають рейтинг стійкості від середнього до високого.

Крім того, експресія трьох різних ферментів, що надають стійкість до трьох різних класів механізмів дії (сполуки-інгібітори ГФПД, гліфозат і глюфозинат), не заважала прояву стійкості до інгібітора ГФПД. Трансгенні рослини, трансформовані тільки стійким до інгібітора ГФПД

Зо ферментом - варіантом згідно із даним винаходом, показали розподіл рейтингів, схожу з таким у накопичених подій.

Приклад 13: Створення й селекція ТО рослин бавовнику.

Трансформації бавовнику досягали використанням добре відомих методів, віддаючи особливу перевагу методу, описаному в патентній публікації МУО 00/71733. Регенеровані рослини переносили в теплицю. Після періоду акліматизації достатньо підрослі рослини обприскували гербіцидами-інгібіторами ГФПД, наприклад, еквівалентом темботріону від 100 до 200 г АІ/га з додаванням сульфату амонію й метилового ефіру рапсової олії. Через сім днів після застосування обприскування симптоми, що з'явилися, оцінювали й порівнювали із симптомами, що спостерігалися в рослин бавовнику дикого типу, що зазнали такої ж обробки в тих же умовах.

Приклад 14. Трансформація рослинних клітин кукурудзи Адгобасіегіит-опосередкованою трансформацією

Конструювання рослинної касети експресії для стабільної експресії в рослині кукурудзи й трансформація кукурудзи добре відомі в даній галузі техніки, і в даному конкретному прикладі описані й використані методи з патентних публікацій УУ02014/043435 і УМ/О2008/100353.

Полінуклеотидні послідовності, що кодують варіанти ГФПД у даній заявці, були об'єднані з послідовністю ДНК, що кодує варіант більа ЕРБР5 для надання стійкості до гербіцидів, що націлюються на ЕРБР5. Ген ЕРБР5 був ізольований і мутований з Агіпгобасіег діорітогтів (МУО2008/100353) і приєднаний усередині рамки до послідовності транзитного пептиду для напрямку транслокації трансльованого білка на хлоропласт. Стабільної експресії досягали за допомогою загальнопоширеного промотору (убіквітин-4-промотор із цукрового очерету, Патент

США Мо 6,638,766) і послідовністю переривання 355 з вірусу мозаїки кольорової капусти, які відповідно клонували вище й нижче гена ЕРБР5.

Відповідні варіанти ГФПД клонували з таким же промотором, хлоропластним транзитним пептидом і послідовністю переривання, які описані для касети експресії гена ЕРБР5. Кодуючі послідовності обох генів кодон-оптимізували для експресії в кукурудзі. Для трансформації кукурудзи качани найкраще збирати через 8-12 днів після запилення. З качанів ізолювали ембріони, і для трансформації переважно використовували ембріони розміром 0,8-1,5 мм.

Ембріони накладали щитком догори на підходяще інкубаційне середовище й інкубували на ніч при 25 "С у темряві.

Однак, інкубувати ембріони саме на ніч не було обов'язковим рег зе. Ембріони приводили в контакт зі штамом Адгобасіегішт, що містять потрібні вектори, що включають нуклеотидну послідовність згідно із даним винаходом для опосередкованого Ті-плазмідою переносу,

Зо протягом близько 5-10 хв, і потім накладали на середовище для спільного культивування приблизно на З дні (при 25"С у темряві). Після спільного культивування експлантати переносили на середовище періоду відновлення приблизно на 5 днів (при 25 "С у темряві).

Експлантати інкубували на селективному середовищі із гліфозатом протягом до 8 тижнів, залежно від природи й характеристик конкретного використаного селективного середовища.

Після періоду селекції отриманий калус переносили в середовище дозрівання ембріонів, поки не спостерігалося утворення зрілих соматичних ембріонів. Отримані зрілі соматичні ембріони потім поміщали під слабке освітлення й ініціювали процес регенерації, як відомо в даній галузі.

Отриманим паросткам дозволяли вкоренитися в середовищі для вкорінення, і отримані рослини переносили в горщики для розсади й розмножували як трансгенні. Рослини регулярно аналізували на експресію й присутність трансгенів, використовуючи метод виявлення білків

ЕГІБА. Для аналізу стійкості до гербіцидів використовували тільки рослини, виділені на селективному середовищі, і які мають експресію трансгенного білка ГФПД, що виявляється.

Приклад 15. Стійкість ТО-рослин кукурудзи до гербіцидів ГФПД у тепличних дослідженнях

Регенеровані події ТО із клітинної культури пересаджували у квадратні горщики площею 2 дюйми із синтетичним грунтом (РаїагафФ Міх) і добривом з контрольованим вивільненням (Наїйїа

Мийісоїейт; покрите полімером добриво з контрольованим вивільненням, МРК Рго 18-6-12 мікронутрієнти) і вирощували в теплиці (ТП) під додатковими натрієвими лампами високого тиску впродовж 12 днів при максимальній температурі 30 "С днем і мінімальній 22 "С уночі.

Повністю відновлені рослини переносили у квадратні горщики площею 5 дюймів із синтетичним грунтом і добривом з контрольованим вивільненням за тих самих умов навколишнього середовища. Після закінчення семи днів ТО-рослини обприскували 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-

М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4-(трифторметил)бензамідом (Спол. 4); в агрономічно значимій концентрації 100 г АйЇ/га (при цьому "г Ага" означає "грам активного інгредієнта на гектар", приготовленому з рецептури СП20 (змочуваний порошок 2095), з додаванням суміші етерифікованих рослинних олій (Назіепіт ад'юванти для спреїв, 0,578 95 об./06.) і сульфатом амонію (АМС, 0,97 95 мас/ об). Обробку гербіцидом проводили в системі ЮОемгіє5 ТгасКег 5ргауег за стандартними протоколами застосування, добре відомими у даній галузі. Як контроль події

ТО обприскували сумішшю ад'ювантів без гербіциду. Усі події ТО, обприскані цією сумішшю, не мали знебарвлених листів. бо Якщо не вказано інше, через шість днів після обробки (ДПО) 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-

(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)/бензамідом оцінювали ушкодження трансгенних подій ТО.

Події ТО, які експресують ген селективного маркера ЕРБР5, і які не мають варіанту типу

ГФПД, використовувалися як контрольні рослини кукурудзи й показували 100 Уо-е ушкодження листя уже при 25 г Аїга 2-хлор-3-«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду.

Нетрансформовані рослини кукурудзи також показували 100 У5-е ушкодження листя уже при 25 г АІ/га 2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4--трифторметил)бензаміду.

Таблиця 14 підводить підсумки трансгенних рослин кукурудзи, які експресують мутанти

ЕГР2О2 їі БГ/Р136 білка ГФПД Рзейидотопах Пшиогезсеп5, отриманих як описано в Прикладі 14.

Рослини із присвоєним рейтингом "0" показували серйозне знебарвлення листя в діапазоні від 41 95 до 100 95 ушкодження від загальної площі листя. Рейтинг "1" присвоювався рослинам, що мають середню стійкість з 16-40 95 ушкоджень від загальної площі листя. Рейтинг "2" присвоювався рослинам, що мають гарну стійкість з 6-15 906 ушкоджень від загальної площі листя. Рослини із привласненим рейтингом "3" майже не показували знебарвлення, з 5 95 або менше площі листя, ушкоджених обробкою гербіцидом.

Результати в Таблиці 14 демонструють, що значна частина незалежних подій ТО кукурудзи стійкі до гербіциду ГФПД /2-хлор-3-(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду в агрономічно значимих дозах 100 г АІ-га в порівнянні з контрольними рослинами.

Приблизно 40 95 тестованих подій, які експресують РІ Р136 (п-84), показували гарну або високу стійкість із 15 95 або менше знебарвленої площі листя після обробки 100 г АІ/га Спол. 4.

Із усіх перевірених рослин кукурудзи, які експресують ЕГР136, «15 95 показують менше, ніж 5 Фо або взагалі не показують видимого ушкодження листя.

Та ж картина слушна й для ТО рослин кукурудзи, які експресують РІ Р202. Більше 30 95 від загального числа тестованих подій (п-89), показували також гарну або високу стійкість із 15 95 або менше знебарвленої площі листя після обробки 100 г АЇ/га гербіциду, а «13 95 показували менше, ніж 5 95 або взагалі не показували видимого ушкодження листя.

Таблиця 14

Оцінка ушкодженої площі листя у трансгенних подій ТО кукурудзи через шість днів після застосування 2-хлор-3--(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду (Спол. 4) у кількості 100 г АІ/га. Трансгенні рослини кукурудзи, які експресують варіанти РІ Р202 або РІ Р136 білка ГФПД Рзейдотопавх Пиогезсепо, одержували як описано в Прикладі 4. Були визначені наступні класи стійкості до гербіцидів: "0": незначна стійкість; 41 95 - 100 95 площі листя ушкоджене; "17: середня стійкість; 16 95 - 41 95 площі листя ушкоджене; "2": гарна стійкість; 6 95 - 15 95 площі листя ушкоджене; "3"- висока стійкість; 0 9 - 5 95 площі листя ушкоджене.

ЕШР2О2 77777771 171712 | 49 | 16, 1712 | 7777778984ДЮюЮ:

Коо)

Усі публікації й патентні заявки, згадані в описі, вказують на рівень навичок фахівців в галузі техніки, до якої належить цей винахід. Усі публікації й патентні заявки включені в даний опис шляхом посилання в такому ж ступені, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була конкретно й окремо позначена як включена шляхом посилання.

Хоча викладений винахід описаний з деяким ступенем деталізації шляхом ілюстрації й прикладу з метою ясності розуміння, очевидно, що в рамках доданої формули можуть практикуватися певні зміни й модифікації.

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40

1. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти, що кодує білок 4- гідроксифенілпіруватдіоксигеназу (ГФПД), який складається з амінокислотної послідовності, що містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮО МО", і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО, 45 при цьому вказаний білок ГФПД стійкий до гербіциду-інгібітора ГФПД.

2. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний кодований білок ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що також містить: ї) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІЮ МО:1; і і) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ії) ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО:1; і їм) аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО1; і м) гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮО МО:1; і мі) гістидин, ізолейцин, лейцин, метіонін, глутамін, аргінін, аланін, лізин, серин, треонін або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІО МО:1; і мії) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.

3. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний кодований білок ГФПД складається з амінокислотної послідовності, що також містить: ї) аланін, гліцин, гістидин, серин або триптофан у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і ії) аргінін, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, гістидин, фенілаланін або серин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ії) ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО:1; і їм) аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮ МО1; і м) гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮО МО:1; і мі) серин, аланін, треонін, глутамін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІО МО:1; і мії) аланін, аргінін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин або лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО 10 МО 1.

4. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за пп. 1, 2 або 3, яка відрізняється тим, що вказаний білок ГФПД включає амінокислотну послідовність, принаймні на 53 95 ідентичну до амінокислотної послідовності, викладеної тут як ХЕО ІЮ МО:1.

5. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що її нуклеотидна послідовність є синтетичною послідовністю, призначеною для експресії в рослині.

6. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-4, яка відрізняється тим, що її нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана із промотором, здатним направляти експресію нуклеотидної послідовності в рослинній клітині.

7. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 1, яка відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з М-(1,2,5-оксадіазол-З3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, М- (тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілялуарилкарбоксамідів, похідних піридазинону, заміщених 1,2,5- оксадіазолів, похідних оксопразину, трикетонів, ізоксазолів і піразолінатів.

8. Рекомбінантна молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, яка відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з 2-хлор-3-етокси-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензаміду Й 2-хлор-3-(метоксиметил)-4- (метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н-тетразол-5-іл)бензаміду, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол- 2-іл)-3-сметилсульфоніл)-4-(трифторметил)бензаміду, 2-хлор-3-етокси-4--(метилсульфоніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5-іл)бензаміду, 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил- 1Н-тетразол-5-іл)бензаміду, 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н- тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду, 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)- 4-(трифторметил)бензаміду, темботріону, сулькотріону, мезотріону, ізоксафлютолу, пірасульфотолу й топрамезону.

9. Клітина-хазяїн, що містить рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за пп. 1, 2 або 3.

10. Клітина-хазяїн за п. 9, яка є бактеріальною клітиною-хазяїном. 60

11. Клітина-хазяїн за п. 9, яка є рослинною клітиною-хазяїном.

12. Трансгенна рослина, яка включає рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за пп. 1,2 або 3.

13. Рослина за п. 12, яка відрізняється тим, що вказана рослина вибрана із групи, яка складається з кукурудзи, сорго, пшениці, соняшника, томатів, хрестоцвітих, перців, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряку, цукрового очерету, тютюну, ячменю й олійного рапсу.

14. Трансгенне насіння, що включає рекомбінантну молекулу нуклеїнової кислоти за пп. 1, 2 або

3.

15. Рекомбінантний поліпептид, що включає білок ГФПД, при цьому вказаний білок ГФПД стійкий до гербіциду-інгібітора ГФПД, і при цьому вказаний білок ГФПД містить пролін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 335 5ЕО ІЮ МО:1, і фенілаланін або тирозин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 336 5ЕО ІЮ МО:1,

16. Рекомбінантний поліпептид за п. 15, який відрізняється тим, що вказаний білок ГФПД також містить: ї) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО І1О МО:1; і і) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ії) ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО:1; ї їм) аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮО МО:1; і м) гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮО МО:1; і мі) гістидин, ізолейцин, лейцин, метіонін, глутамін, аргінін, аланін, лізин, серин, треонін або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІО МО:1; і мії) аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, серин, треонін, триптофан, тирозин або валін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО ІЮ МО:1.

17. Рекомбінантний поліпептид за п. 15, який відрізняється тим, що вказаний білок ГФПД також містить: ї) аланін, гліцин, гістидин, серин або триптофан у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 188 5ЕО ІО МО:1; і ії) аргінін, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, гістидин, фенілаланін або серин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 189 5ЕО ІО МО:1; і ії) ізолейцин, лейцин або метіонін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 200 5ЕО ІО МО:1; і їм). аланін, лейцин, пролін або аспарагін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 215 5ЕО ІЮО МО:1; і м) гістидин або глутамін у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 226 5ЕО ІЮ МО; і мі) серин, аланін, треонін, глутамін або лізин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 339 5ЕО ІО МО:1; і мії) аланін, аргінін, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, глутамін, гліцин або лейцин у положенні, що відповідає положенню амінокислоти 340 5ЕО 10 МО 1.

18. Рекомбінантний поліпептид за пп. 15, 16 або 17, який відрізняється тим, що вказаний білок ГФПД включає амінокислотну послідовність, принаймні на 53 95 ідентичну до амінокислотної послідовності, викладеної тут як ЗЕО ІЮ МО-1.

19. Рекомбінантний поліпептид за пп. 15, 16 або 17, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з М-(1,2,5-оксадіазол-З3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол-3-ілларилкарбоксамідів, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, М- (тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3-ілялуарилкарбоксамідів, похідних піридазинону, заміщених 1,2,5- оксадіазолів, похідних оксопразину, трикетонів, ізоксазолів і піразолінатів.

20. Рекомбінантний поліпептид за п. 19, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з 2-хлор- 3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)/бензаміду Й 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)бензаміду, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензаміду, 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5- іл)бензаміду, 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1- метил-1Н-тетразол-5- іл/бензаміду, 2-хлор-3-«(«метилсульфаніл)-М-(1-метил-1 Н- тетразол-5-іл)-4- бо (трифторметил)бензаміду, 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-

4-(трифторметил)бензаміду, темботріону, сулькотріону, мезотріону, ізоксафлютолу, пірасульфотолу й топрамезону.

21. Спосіб виготовлення поліпептиду з активністю стійкості до гербіцидів-інгібіторів ГФПД, який включає культивування клітини-хазяїна за п. 9 в умовах, у яких експресується молекула нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид.

22. Рослина, що має стабільно включену в геном конструкцію ДНК, де конструкція включає промотор, функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою за будь-яким з пп. 1, 2 або 3.

23. Рослина за п. 22, яка відрізняється тим, що вказана рослина вибрана із групи, яка складається з рослинної клітини, рослинної тканини й рослинного насіння.

24. Рослина за п. 22, яка відрізняється тим, що вказана рослина вибрана із групи, яка складається з кукурудзи, сорго, пшениці, соняшнику, томатів, хрестоцвітих, перців, картоплі, бавовнику, рису, сої, цукрового буряку, цукрового очерету, тютюну, ячменю й олійного рапсу.

25. Трансгенне насіння рослини за п. 22.

26. Спосіб боротьби з бур'янами в полі, який включає посадку рослини за п. 22 або посів її насіння в полі й застосування до вказаного поля ефективної концентрації гербіциду-інгібітору ГФПД.

27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з М-(1,2,5-оксадіазол-З3-іл)бензамідів; М-(тетразол-4-іл)- або М-(триазол- З-іллуарилкарбоксамідів, М-(1,3,4-оксадіазол-2-іл)бензамідів, М-(тетразол-5-іл)- або М-(триазол-3- іл)арилкарбоксамідів, похідних піридазинону, заміщених 1,2,5-оксадіазолів, похідних оксопразину, трикетонів, ізоксазолів і піразолінатів.

28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що вказаний гербіцид-інгібітор ГФПД вибраний із групи, яка складається з 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5- іл/бензаміду Й 2-хлор-3-(метоксиметил)-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5- іл/бензаміду, 2-метил-М-(5-метил-1,3,4-оксадіазол-2-іл)-3-(метилсульфоніл)-4- (трифторметил)бензаміду, 2-хлор-3-етокси-4-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5- іл)бензаміду, 4-(дифторметил)-2-метокси-3-(метилсульфоніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5- іл/бензаміду, 2-хлор-3-«(метилсульфаніл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)-4- (трифторметил)бензаміду, 2-(метоксиметил)-3-(метилсульфініл)-М-(1-метил-1Н-тетразол-5-іл)- Зо 4-(трифторметил)бензаміду, темботріону, сулькотріону, мезотріону, ізоксафлютолу, пірасульфотолу й топрамезону.

29. Застосування нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3 для надання рослині стійкості до одного або більше гербіциду(ів)-інгібітора(ів) ГФПД.

30. Товарний продукт, що включає молекулу нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-3 або білок за будь-яким з пп. 15-17, яка відрізняється тим, що вказаний продукт вибраний із групи, яка містить цільні або оброблені насіння або зерно, корми для тварин, кукурудзяне або соєве борошно грубого помелу, кукурудзяне або соєве борошно, кукурудзу, кукурудзяний крохмаль, соєвий шрот, соєве борошно, пластівці, концентрат соєвого білка, ізоляти соєвого білка, текстурований концентрат соєвого білка, косметику, засоби з догляду за волоссями, масло соєвих горішків, натто, темпі, гідролізований соєвий білок, збиті вершки, шортенінги, лецитин, цільні харчові соєві боби, соєвий йогурт, соєвий сир, тофу, фучжу, а також приготовлене, поліроване, ошпарене, запечене або пропарене зерно.

РІНРЕр МАПЬУЕМРМОЇМО-------- я ЕЕ 16 Ауепа вабіхта МРЕТРАТ-АТОАААААУТРЕНААКО----КРЕУУВУМРЕКООВЕРУТЕЕНН 45 Абепа вабіча де1 МЕРТРАТ-АТОАААААУТРЕНААКО----КРЕУУВУМРЕКООВЕРУТЕЕНН 45 зеа маув МОРТРТААААБААУАААКААКОААКНГУЧЗНРМЕУВЕМРЕВОВЕНТСАЕННО ЗО АхавіЗор:ів патїіапа МОНОМААУБЕМВОООААВЕРОСЕКРУС-КЗККУВККМРеКООКЕКУККЕНН.О 45 Ннокавию упідатга МЕРТРТТРААТСААААУТРЕНАВР-- - «НЕ МУКЕМНРЕЕВОВКЕНТЬСЕНН о 44 айлив сакоба МОКК-ОБЕАЕТРОВМОБМТВРАТЕКІУО-КНМХКУКАНЕКВОВЕАУККЕНН 4 пЕгерсоштшусеї ауеюсвіс1і1ї5 МТОТТЕНТРІИТАКОАБРрЕР-----------------------УКОМОА 25 Мусоврпаезгеїй1а чраштіпісоїа МАРОАТІУТЗОМОЕТОРОУПООСУУРАР------ААГУУсСЕУМУВОтТНН 44 бСассісоїдЗвбе іп сів МАРААБОРТІОРАОРЕПІМ-------тттття нн 5 ю ОУБОХОН ОС Є х . РІНЕВБ ТІЕКАЗРТІРОТІЕРІЕБІМОВЕТКУАТНВОкМ-------УБІУРОСКІМЕЬІТ. 58 Аепа заїіуав УКІМСАРААЗААОВКЕЗКАГСАРВРНААНОПЬОТОМОАНАВГБПВЕСАГАВТЕ 55 Атепа заціуа че1. УКІМСАБААЗААОБЕЗКАТЗАРЬААКОПЬСТОМБАНАБІТТВСОАТАВТЕ 55 дев щшаув УКІМСАБААЗААОБЕЗЕКОТЗАРЬААКОПЬОТОМБАНАЗТЬТБЕОВІБЗЕТЕ 100 АкаріЗорвія спвітапа ТЕВКМСОБАТМУАВБЕВМСТЗМЕЕВАКОСЬВТОММУНАВУТТТБОВЕТЕ 59 Нотовит спідЧате УККМСАПААБААСКЕАКАГЛАРЬААВВОЬБТОМОАНАСОТЬЬВЕОБТАВБЕ 54 Пасив савроба ІТЕВМСОБАТМТЕЕКЕБМСЬЧМРЕУАКОрЬТМОУНАБУБУВКАМНІОВУК 5 Збуертоптусев аусттівії18 УУКАУЗМАКОАА-НУВТАВІМО1 МАХ ВІРЕМОЗВЕТАВУУТЕМОБАВЕУТ 7А Мусоврпаеггеїїа цтатіпіссіа АЕМУУЗМАКОУАОКТІТАМОКЕРУАНКОБЕТООЗВЕКАЗНУУСММИОСУВЕУВ 54 Соссісоїдев інтісів УБМУУЗМАКОААТУУУТРЕМОВЕКУАХУРВЬЕТООКАУЗАЗНУУВМОМІТЕІІ, 76 РЕНЕРр ММЕБЕМЕ---------------------1АБУКААБрЕРБУССМАЕКУКІОВЇ 88 Ачтепа ватіча ТАРТАРРРОБА-АТАААТАБІРБЕБАРААВТЕВААБСЬАУВБУСУКУАрА 144 Ачепа затіуа деї ТАРТАЕРРОЕА-АТ-ААТАВІРОЕБАРААВТЕАААБСТАУВБУСУКУАРА 143 йеа маух ТАРТАН-- - 5 А А ЗА РА АТААБРЕКБААААВНЕААПОЕСЬАУВАМАБКУАГА 144 Ахтарідсрзів Ена1іапа ТАРТВРЗІВАСЗЕРТКРЕТТТАВІРЕЕСНОгСВЕКЕВосНсЬОУВАМАІВУЮІА 149 Ногавиют учічаге ТАБТАМ------СПСПААТАЗЬРОБЕБАБААВКЕБВАЛЕСОТАУВБУАТЕУАПА 138 ансив сагога ТАБУБРЕтТТТ----ВБОБААТРОЕБАВОЕНВКЕААКЕСЬАУВАТАТЕУАПУ тай ЗЕгерсотусев ауектісіїї158 ТЕБУІКРАТРЯСОС---БЕГА------------ПНУАЕБСОСУУ.АТЕУРрА 105 Мусовопаєкеї1їа згатіпісоїа ТЕРУКОВАКОТ---БКААРГАЛОАКОРЛЕМУрНІ ОК ОСУКОУАЕБУТОУ 141 Собслооїйез івлітіх тТЕРІКЗУКОАЗ---БЕРЕ---ПЕАТІКЕІНАНІЕВБСТУКОУАКЕМІОМ 19 . . ярих РЕНРРЕ ОКАХМКАБЕТСсАОР----ІНІПТСРМЕБМІБАТКОТІСОАВЬУТІСОВЕСВО 134 Ахепв ваціхча АБАКЕКУБУАЧОАНКРАКАРАГІЄ---НОСКСГАБУКТТСПУЧУОКЕУЄУРОВТ 191 Ахепв ваціха бв1 АБАКЕКУБУАЧНОАНРАКАРАПІЄЇ---НОСКСГАВБУКТІУСПУУЦКЕУВУРрОВтТ 190 -еа таув еПАЕКАБУААСАВКРАКОРУрІО---БОСКБГАБУКТУСОГУЧЬКУУВУРОСА 151 Ахарійсоювів їпаїіїапа ЕБЕАЕБІВУАМОАТРОВРРІЗІМ---КАМТІАВУКЬХСГУУЬКУУВІКАВГ 195 Ногавот уцпічЧате АБАЕКАБВЕКСАКРАКАРУПІС---БСКАКАБУКБЬУСПУУЧІКЕУВЕРОСТ 185 вас сатоїа КААББАБУАКСАКРАВАРУВІО- --РОАУМТАБУВБЬТСОУУТКЕУВЕСНЕВ 11 кігерсотусевз зуертіціїї5 ВКААНАТАТЕНСАКОУАЕРУВІКРЕБНОТУУБААТАТУОКТЕНТІУПеТОоХВ 153 Мусоврпаетеїіїа сгашіпісоїа ТАУТЕМАУАМОАЕВУВОРНТОБСПЕОПУТКААТКЕТУООТТЕТЕтОВТТУТ 191 Соссісоійев іптітів КВУКВААУКМСАКБУУВОУКТУЮВКОООІКМАТІВТУСЕРТТНТІІЕБсСУК 170 601 ЖЖ «1 х. І. РІНРвр д--ВІіТпІрКУХГЕСЇ---УВВМРУВАСЬКУТОНІТНМУХВІКМУХМАНЕУ 179 Ауемта вабіхча П--БРЕБеЕсКВБУуВ-----5РОАМУПЖСЬТККОНУ МОМ -УВЕМАРУТОУМ 232 Асепа вагіча деі 2--БВБЕБЕСЕБЕУВ-----ЗРОАУБЖУЬТКЕОНУЧОМ--УРЕМАВЗІГУМ 831 еа маув АСБ-ЕРЕБЕсСКВОУА-----ЗРОААВУСЬВКЕОНІУОМ--УРЕТАРАААХУЕ 233 Акарійоовів Спаїіїапа ТЕКБЕЕБРОЖКЕВЕУЕПВА--ВБЕР-БОУСІВКЬОСНАУОМ--УРЕТЗРАТТУМ 241 НногЯецю Уупідатге Г2--УРЕБраквОЗУТ-----МРОАМОУСЬТКЕОНУУОМ--УРЕГАРАААХУІ бо асп савротга --ЗБЕБРОКБАУЕСТ--АВЕРЛЬОУСІВВБОНАУОМ-- УТВІР УУВХІ 834 пегерсотусех азектіє1115 п---ВУБРСУМАААРРІУКРЕРАНВ---ТКЕОАТОНСУСІУВІЗВММЕМУСКХУ 503 Мусоврпавтетія дкамівпісоіїа сп---ВЕБРЕСУВБСТТУВКАМКЕСРРУМЬЕАТОНСУСМОПЯСЕМИІПАСОКУ ЗВ босстісоідев іштіб18 б5---СЕМРОУРМЕВМАПАТОКЕГСРКУУСЕКТІОНСУСМОПУЯРЕМЕВУСЬУХУ 817 го нини 1 : ФІЛ1А

РЕНЕРБ ВКІЕМЕВЕАВУК---РІКОСВБУТОІТЕКАМБАРОЕМІКІРІМЕ--ЕНОКОА Да Ахепа ваціха КОКІСЕНЕБАБЕТАВОУустТтТВО С МОУУТАММОЕАУТЬРІМЕРУНОТККЕ 282 Ачепа ваціув деї КОКРСЕНЕКАКБЕТАВБОУустТтТВО МОУ УТАММОЕАЛРІМЕРУБОСТККВ 9581 пев пауг АсСЕТСЕНЕКАБЕТТЕОУСТАВОНЬМОМУБАММОЕМУТЬРОМЕРУНОСТЕКВВ 283 АкавріЗсрхів Спв1ітарпа АСЕТСЕНОКАБЕТАТОЮМОТАВОНЬМЗАУБАЕМРЕМЛОЬРІМЕРУБИТИВИ 991 Нотовит усічЧата АСЕТСЕНЕКАБЕТАВОУОТТВО НМУ УБАММОБЕСЛОЬРОМЕРУБИТИКЕ ТЕ апсав сакота КаЕТОСЕНЕКАКЕТАВОУСТІВООЬМОУУБАММЕЕМУТЬРМЕрУ У ТКВК ва ЗЕтерсотусев аузктісі115 МКУМСЕТКМКЕВБЕЧЛ ТІ ЮТАТЕУБАБМОКУУАПОСТЬКУКЕРІМЕРАБАКК-К 257 Мустовшопаєгеі1а дтатіпісоїа ВЕСТСЕНВЕВЕМВОКОТСТЕЕОАБКОЗІУМБАЕМОУУКМРІМЕРАНСКК-К 287 СопсісоіЯее інптісі ВКІБСЕНВЕМВЕУВІИКОТСТЕЕБАБКОЗІУМАПЕМОТУКМРІМЕРАКОКК-О 266 ах. . хі ткож 1: НЕШНИаН их РЕНЕРЕ СОТЕВБКІМОВМСОСЕЗІОНУАКТ ПО УКТИВАЬККІСО----МЕЕМТАВРІТ ит Ахепа вакіча ЗОтОотТуБЕХНОБРІУЗНІАГАСМОУБВТБВЕМВАКТЕКОЧЕВБЕМАРРОАК ОЗ Ачзепа вагіча Зеї1 ЗОХОТУБЕХНООРУЛОНІАГСАЄМЕУТВТІВЕМЕАВТРМОКЗЕВЕМАРРОАК О 331 леза тауУуз ЗОХОТЕБОННОСРААЛОНМАГАБОЕУТВТЬВЕМОАВНАМОУЗЕВЕМАРРІЗЕ 333 Ахаврійсюрзівя сва1іівпа ЗОТОТУБЕНМЕОСАЬОНЬАГМОЕПІКВТЬРЕМРКАВНТОЕОКЕМРОЕвЕт ЗА Нотовиш спідЧате ЗОатОТЕБЕННОСБРІУОНІАМАВЕПУБВТЬВКМВАНКВАМОСЕОКЗ,РЕРЬЕК Зо Гансав сакога ЗОХОТУБЕНМЕСАТЛОІНСЬАТОУБЕБІКЕВТІВЕМЕКВОСТОКЗЕВЕМЕОЗРЕРТ 334 ЗЕгергсотусев атеїхтісіїї:5 ЗОТРЕЖІКБЕХООАЗУОНІАТМТОРІУЕТУВІМВАА----УОКІОТР-НВ 297 Кусовопаєкеііїа згашіпіссоїа ЗОТЕБУУПЕУМОРУЛОНІАГЕТЕМНІТЕАУВМЬВОВ----ОУЕКІБУР- ПТ 33 Соссісої9ЦЧез зінщшісів ЗОТЕБУУПЕУМОАЛОНІАГЕТМИІТІПАТТМІЬКАВК--- -ОТЕКІКУР-ЕТ 311 «хжі 1: ж жрикук, її 11, 1 її: жЖрох РБІНЕРЕ ХУЕМПЕСКЬРОВО----БРУПОТОСАВСТРІОСВБЕУКОрККІТЛОтКВЕТІ. 316 Ачепа вагіча ХУБОСУВЕТАСОМІ- ВОК КСОКБІСУГУ----ВІДКХАЛІСТЕТКРУ 376 Ачепа пвагіта Зеї ХЖВОУВЕТАСОМІ В-ВО КЕСОКБІСУТЛ А ---ВІЛЮСЛІІОТЕТКРУ 375 йеа мах ХУПОУВЕКАСІМІТ--БАОТКЕСОКБІСУТ А ---ВІЛЮСЛІМТОТЕТКРУ 377 Ахаріайсрвів Спатіапа хуОоМмиККвИОМІ--ПрОТКЕСЕКІСТІЛА----ВІДЮСТІТОТЕТКРІ. 385 Ногавит Уучідчатге ХЖВОУВЕБАСОМІВЇ-- ВАСКО А ---ВІЛЮОСЛІІОТЕТКРУ 370 Папсав сакога УК ОМІ- ПОТ КЕСЕПТСТІЛА----ВІЛЮСТІТОТЕТКРУ 375 ЗЕгерсотусев аувртісіїї1ї8 УХОТіБЕМУЄОТ----ВУРУПТІВЕЕБКІБАП-- ОБО ОО ІЛОТЕТКРУ 335 Кусовопаєкаї!1а здчратіплосіая УХЕММЕТАГБКААСМКБЕБЕБЕЛІТОКЬМІГІ0----ЕБЕСОТІТОБЕТКРІ 378 Соссісоїйез їівилітіх УЖЕБМКІНЬКНОСІУБОБПЕЕТЬКЕБОТЬІ0----ЕБЕМОХІТОТЕТКНІ. 357 хх. 1 пи хх «І хжкІТІ: : РЕНРРР Мо--РУКЕЕЕТОВК---------------срОСЕСЕСЦЕКАБЕЕЕТЕНОО 345 Ахепа закіха ОПЕРЕТЕКБЕМІОВІСОСМЕКОВУО ВУС КОС ОопЕОоКОМЕОЕСЕКСІВОУЕ 4796 Ахепа пакіха дбеї ОЗПВЕТЕКГЕМІОКІССМЕКрЕУОвУСКОоСОСЕОКОМЕБЕБЕКСТЕПУЄ 455 ва тауд ОЗПВЕТОЕБЕІТОКІССМЕКОЕКоОвУСКОоСОсЕОоКОМЕООБЕКСІВОЕ 477 Атхарісюювія Єпа1їіїапа ОЗПВРЕТІКТБІТОКУуУССММКМЕЕСКАОСБОССОСЕОКОМЕБЕБЕКСІВЕХУЕ 435 Ногасиют УчічЧатге ОПЕРТОЕБЕМТОВІССМЕКОВНОКЕУОКОССОСЗЕОКОМЕЗЕБЕКИІТЕПЕ 49 Оапсав сакога ОБРТІОЕТБІТОКУСЄСМІКОПАСОМ КОСОВО ОЕБЕКІБВУЕ 425 ЗЕгерсотусев аузртіціїї8 ОПЕРЕТУКЕВІТЕКН-О- Я - «З «З 5 5 5 5 « ОМ КОКОМПЕКАБЕЕАТЕНВО 375 Мусовопаєкеіїа згашіпіссоїа МОБРТУКІВІТОВМ---З------------МЕГЗЕСАСЗМНЕКБІТВЕЕАТЕНВО 415 Соссісої дез п0щісів МОБРТУКІБІТОВМ---------------МЕЗЗЕСАСМПЕКАБЕЕАТЕНЕО 357 . ча хіжЖІЙІХ . с ШЕ ее жжтжк : ВЕНЕР УАВЕУБТАБ-- З 55 5 -- 358 Ахепа ваціча КЕІЕУКОВУУвОКО--- 44 Ахепа шваціча беі1і кОТЕУКОБУУАОКО--- 439 йеа таув КЕТКАКОВААВААдАОсГІЗЇ 444 Агхарійсорювів Спатїіапа ЕКРТІКЕАКОТ Ул ------ 445 нокіаевит УчіЧате КЕТКАКОБААУСИІІ--- 234 Озисав сакога КТІКЕАКОТРТОБААА--- 449 вігерсотусев зузртісії15 ВКВОМІ.----------- 380 Мусовопаєкеіїз зрашівісоїа ПЬБЯМІ.----------- 815 Соссісої4Яев ппщісів АБРстіІ---------- 8355

ФІГ. ІВ