UA114652U - METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 - Google Patents
METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 Download PDFInfo
- Publication number
- UA114652U UA114652U UAU201610423U UAU201610423U UA114652U UA 114652 U UA114652 U UA 114652U UA U201610423 U UAU201610423 U UA U201610423U UA U201610423 U UAU201610423 U UA U201610423U UA 114652 U UA114652 U UA 114652U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- inclusion bodies
- centrifugation
- protein
- synthesized
- sedimentation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 12
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 6
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 4
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 3
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 10
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 abstract 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 6
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101100412856 Mus musculus Rhod gene Proteins 0.000 description 1
- HPKJGHVHQWJOOT-ZJOUEHCJSA-N N-[(2S)-3-cyclohexyl-1-oxo-1-({(2S)-1-oxo-3-[(3S)-2-oxopyrrolidin-3-yl]propan-2-yl}amino)propan-2-yl]-1H-indole-2-carboxamide Chemical compound C1C(CCCC1)C[C@H](NC(=O)C=1NC2=CC=CC=C2C=1)C(=O)N[C@@H](C[C@H]1C(=O)NCC1)C=O HPKJGHVHQWJOOT-ZJOUEHCJSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000000286 epitheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Abstract
Спосіб одержання очищеного і розчинного рекомбінантного інтерлейкіну-10 людини, синтезованого штамом-продуцентом E. coli BL21/hIL10, включає осадження бактеріальних клітин після завершення біосинтезу центрифугуванням та руйнування бактеріальних клітин та хромосомної ДНК ферментативним методом в присутності лізоциму та ДНК-ази з наступною сонікацією. Виконують осадження фракції тілець включення центрифугуванням та послідовно промивають тільця включення розчинами, що містять неіонні детергенти, та розчинами, які містять сечовину, шляхом суспендування осаду з наступним осадженням центрифугуванням, солюбілізацію тілець включення у присутності гуанідин гідрохлориду та ДТТ. Здійснюють ренатурацію hIL-10 шляхом заміни буфера за допомогою гель-фільтраційної хроматографії на колонці в присутності L-аргінін гідрохлориду та неіонного детергенту, з наступним хроматографічним очищенням білка в нативних умовах за допомогою аніообмінної та афінної хроматографії.A method of obtaining purified and soluble recombinant human interleukin-10 synthesized by E. coli BL21 / hIL10 producing strain includes bacterial cell deposition upon completion of biosynthesis by centrifugation and destruction of bacterial cells and chromosomal DNA by enzymatic attack in the presence of lysozyme. The inclusion bodies of the inclusion bodies were centrifuged and sequentially washed the inclusion bodies with solutions containing non-ionic detergents and urea-containing solutions by suspending the sediment with subsequent precipitation by centrifugation, solubilizing the inclusion bodies in the presence of guinea. The hIL-10 is renatured by replacing the buffer by column gel gel filtration chromatography in the presence of L-arginine hydrochloride and non-ionic detergent, followed by purification of the protein under native conditions by anion exchange and affinity chromatography.
Description
Пропонована корисна модель належить до молекулярної біології, генної інженерії, а саме - до способу одержання очищеного і розчинного рекомбінантного інтерлейкіну-10 людини (НІЇ - 10), синтезованого штамом-продуцентом Е.соїї ВІ 21/пІ/ 10, який може бути використаний в біотехнології для подальшого одержання фармацевтичної субстанції і науково-дослідницької роботи.The proposed useful model belongs to molecular biology, genetic engineering, namely to the method of obtaining purified and soluble recombinant human interleukin-10 (NII - 10), synthesized by the producer strain of E. soya VI 21/pI/ 10, which can be used in biotechnology for the further production of pharmaceutical substance and research work.
Аналогами рекомбінантного ПІЇ-10 є інтерлейкін-10, що експресується переважно моноцитами периферичної крові людини, а також Т-хелперами другого типу, дендритними клітинами і епітеліоцитами (|11.Analogues of recombinant PII-10 are interleukin-10, which is expressed mainly by monocytes of human peripheral blood, as well as T-helpers of the second type, dendritic cells and epitheliocytes (|11.
Відомий рекомбінантний ПІЇ-10, який напрацьовують та очищають з трансгенних рослин тютюну (21, рису ІЗ| та моркви |І4). Також, рекомбінантні аналоги ПІЇ-10 людини одержують синтезом в бактеріях, таких як Е.соїї (51-71.Recombinant PII-10 is known, which is developed and purified from transgenic plants of tobacco (21, rice IZ| and carrots |I4). Also, recombinant analogues of human PII-10 are obtained by synthesis in bacteria, such as E. soii (51-71.
Оскільки, ПІЇ-10 є ключовим протизапальним цитокіном, він має як велике терапевтичне так і діагностичне значення, адже може бути використаний як для лікування гострих і хронічних запальних захворювань людини (81-10, так і для діагностики, оскільки рівень його експресії змінюється при різних патологіях (11121121.Since PII-10 is a key anti-inflammatory cytokine, it has both great therapeutic and diagnostic value, because it can be used both for the treatment of acute and chronic human inflammatory diseases (81-10) and for diagnosis, since its expression level changes in different pathologies (11121121.
Відомо декілька методик одержання рекомбінантного ПІЇ-10.Several methods of obtaining recombinant PII-10 are known.
Відомий ПІІ/-10 генно-інженерного походження, продукований в трансгенних рослинах, модифікованих його геном |З|, який одержували шляхом екстракції з насіння рису. Зазначений спосіб одержання ПІЇ-10 має суттєві недоліки, серед яких відносно тривалий вегетаційний період рису, а також те, що до вихідної послідовності НІЇ -10 була внесена послідовність бх Нів- їад, яка може афінно зв'язуватись з металафінним сорбентом |З). Застосування даного підходу здатне забезпечити швидке очищення цільового протеїну, проте має певні обмеження при застосуванні для очищення терапевтичних рекомбінантних білків, оскільки подібна модифікація може призвести до підвищення його імуногенності.Known FDI/-10 of genetic engineering origin, produced in transgenic plants modified by its |Z| gene, which was obtained by extraction from rice seeds. The indicated method of obtaining PII-10 has significant drawbacks, including a relatively long growing season of rice, as well as the fact that the original sequence of NII-10 was supplemented with the sequence of Nivyad, which can bind affinity to the metal affinity sorbent |Z). The use of this approach is able to provide rapid purification of the target protein, but it has certain limitations when used for the purification of therapeutic recombinant proteins, since such a modification can lead to an increase in its immunogenicity.
Відомий метод одержання рекомбінантного НІІ-10 (2), який одержували шляхом екстракції рослин трансгенного тютюну. Зазначений спосіб одержання Пі -10 має суттєві недоліки, серед яких відносно тривалий вегетаційний період тютюну, а також те, що до вихідної послідовностіThere is a known method of obtaining recombinant NII-10 (2), which was obtained by extracting transgenic tobacco plants. The specified method of obtaining Pi-10 has significant disadvantages, including the relatively long growing season of tobacco, as well as the fact that the original sequence
МПІ-10 була внесена послідовність еластино-подібного поліпептидного тагу (ЕІ! Р), а також зеленого флуоресцентного білка, що значно збільшило накопичення цільового продукту вThe sequence of elastin-like polypeptide tag (EI!P) and green fluorescent protein was introduced into MPI-10, which significantly increased the accumulation of the target product in
Зо рослинних клітинах та полегшило спостереження за його експресією, проте подібна модифікація може призвести до підвищення його імуногенності.From plant cells and facilitated observation of its expression, however, such a modification may lead to an increase in its immunogenicity.
Відомий спосіб отримання трансгених рослин моркви, що продукує інтерлейкін-10 людиниThere is a known method of obtaining transgenic carrot plants that produce human interleukin-10
ЇЇ, що описує лише поліпшений спосіб одержання трансгених рослин моркви, які продукуютьHER, which describes only an improved method of obtaining transgenic carrot plants that produce
МНІС-10. Подальшому виділенню та очистці не приділялась значна увага. Проте слід зазначити, що у будь-якому випадку одержані рослини мають тривалий період вегетації, складну процедуру екстракції (яка часто проводиться з використанням органічних розчинників), що призводить до денатурації цільового білка та виникає потреба в його ренатурації, а також складність процедури його очищення.MNIS-10. Further isolation and purification were not given much attention. However, it should be noted that in any case the obtained plants have a long vegetation period, a complex extraction procedure (which is often carried out using organic solvents), which leads to the denaturation of the target protein and the need for its renaturation, as well as the complexity of the purification procedure.
Також, відомий ПІЇ/-10 генно-інженерного походження, продукований в клітинах ЕзвспПегіпіа соїї (5І-Г/Ї. Однак, при експресії гетерологічних білків у системі Е.соїї у значній кількості випадків спостерігається агрегація синтезованих білків, що призводить до накопичення цільового білка у вигляді нерозчинних неактивних цитоплазматичних агрегатів - тілець включення. А отже, при використанні такого продуценту виникає необхідність окрім етапу хроматографічного очищення вводити етап його виділення у функціонально активній формі (ренатурацію).Also, the known PII/-10 of genetic engineering origin, produced in EzvspPegipia soybean cells (5I-G/Y. However, when heterologous proteins are expressed in the E. soybean system, in a significant number of cases, aggregation of synthesized proteins is observed, which leads to the accumulation of the target protein in the form of insoluble inactive cytoplasmic aggregates - an inclusion body. Therefore, when using such a producer, it is necessary, in addition to the stage of chromatographic purification, to introduce the stage of its isolation in a functionally active form (renaturation).
У вищезазначених роботах І|51-(/7| основним методом, який використовується для ренатураціїIn the above-mentioned works, I|51-(/7| is the main method used for renaturation
МНІ-10, є розведення. Використання такого методу має суттєві недоліки, основним з яких є необхідність концентрації цільового продукту після етапу розведення, за рахунок чого значно збільшуються втрати цільового білка. Також застосування даного методу підвищує собівартість одержаного терапевтичного білка за рахунок збільшення витрат таких сполук, як, наприклад, глутатіон окиснений та оглутатіон відновлений, які використовуються для коректного формування дисульфідних містків у ренатурованому продукті та ін.MNI-10, there is breeding. The use of this method has significant disadvantages, the main of which is the need to concentrate the target product after the dilution stage, due to which the loss of the target protein increases significantly. Also, the use of this method increases the cost of the obtained therapeutic protein due to an increase in the cost of such compounds as, for example, oxidized glutathione and reduced glutathione, which are used for the correct formation of disulfide bridges in the renatured product, etc.
В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити більш технологічний та ефективний спосіб одержання очищеного і розчинного рекомбінантного інтерлейкіну-10 людини, синтезованого штамом-продуцентом БЕ.соїї ВІ 21/п11 10.The basis of the proposed useful model is the task of developing a more technological and effective method of obtaining purified and soluble recombinant human interleukin-10, synthesized by the BE.soy producer strain VI 21/p11 10.
Поставлена задача вирішується пропонованим способом одержання очищеного і розчинного рекомбінантного інтерлейкіну-10 людини, синтезованого штамом-продуцентом Е.соїїThe task is solved by the proposed method of obtaining purified and soluble human recombinant interleukin-10, synthesized by the producer strain of E. soya
ВІ 21/пІІ-10, який, відповідно до корисної моделі, включає осадження бактеріальних клітин після завершення біосинтезу центрифугуванням, руйнування бактеріальних клітин та хромосомноїVI 21/pII-10, which, according to a useful model, includes sedimentation of bacterial cells after completion of biosynthesis by centrifugation, destruction of bacterial cells and chromosomal
ДНК ферментативним методом в присутності лізоциму та ДНК-ази з наступною сонікацією, бо осадження фракції тілець включення центрифугуванням, послідовне промивання тілець включення розчинами, що містять неіонні детергенти, та розчинами, які містять сечовину, шляхом суспендування осаду з наступним осадженням центрифугуванням, солюбілізацію тілець включення у присутності гуанідин гідрохлориду та ДТТ, ренатурацію МІ-10 шляхом заміни буфера за допомогою гель-фільтраційної хроматографії на колонці в присутності |І- аргінін гідрохлориду та неіонного детергенту, з наступним хроматографічним очищенням білка в нативних умовах за допомогою аніообмінної та афінної хроматографії.DNA by an enzymatic method in the presence of lysozyme and DNAse followed by sonication, because sedimentation of the fraction of inclusion bodies by centrifugation, successive washing of inclusion bodies with solutions containing nonionic detergents and solutions containing urea, by suspending the sediment followed by sedimentation by centrifugation, solubilization of inclusion bodies in the presence of guanidine hydrochloride and DTT, renaturation of MI-10 by replacing the buffer using gel filtration chromatography on a column in the presence of I-arginine hydrochloride and a nonionic detergent, followed by chromatographic purification of the protein in native conditions using anion exchange and affinity chromatography.
Авторами було показано, що при суперсинтезі в клітинах штаму-продуценту рекобмінантнийThe authors showed that supersynthesis in the cells of the producer strain is recombinant
МІС-10 накопичується у фракції тілець включення.MIS-10 accumulates in the fraction of inclusion bodies.
В даному аспекті пропонована корисна модель забезпечує спосіб одержання очищеного і розчинного рекомбінантного НІЇ-10 з клітин штаму-продуценту Е.соїї ВІ 21/11 10, за допомогою якого ПІЇ-10 може бути одержаний в три стадії із збереженням властивих нативному білку антигенних детермінант та біологічної активності, з високим ступенем чистоти і у розчинній формі.In this aspect, the proposed useful model provides a method of obtaining purified and soluble recombinant NII-10 from the cells of the producer strain E. soya VI 21/11 10, by means of which PII-10 can be obtained in three stages while preserving the antigenic determinants characteristic of the native protein and biological activity, with a high degree of purity and in soluble form.
Спосіб виділення рекомбінантного білка НІЇ-10 з бактеріальних клітин буде легко оцінений спеціалістами даної галузі на основі опису і прикладів. Процес ренатурації і очищення легко автоматизується у разі використання хроматографічної системи, що програмується. Відповідно до корисної моделі вихід розчинного білка ПІІ -10, виділеного ренатурацією із тілець включенняThe method of isolation of recombinant protein NII-10 from bacterial cells will be easily appreciated by specialists in this field based on the description and examples. The process of renaturation and purification is easily automated when using a programmable chromatographic system. According to a useful model, the yield of soluble protein FDI -10 isolated by renaturation from inclusion bodies
Е.соїї, складав більше 85 95 вихідного цільового білка. Відсоток димерної форми, отриманої після очищення від олігомерних форм за допомогою аніонобмінної хроматографії, визначений розділенням очищеного ренатурованого білка за допомогою гель-фільтрації на колонці зЗирегаєх 75 10/300 СІ, становив 90-95 95. При внесенні 1 мкг та наступному розділенні в 13 95- му поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію очищений і ренатурований білок виявлявся як дискретна смуга з молекулярною масою близько 19 кДа (Фіг. 3). Чистота розчинного продукту, одержаного після циклу хроматографічного розділення на колонці аніонобмінним сорбентом, розрахована методом денситометрії електрофореграм, складала більше 90 95, концентрація у пробі після ренатурації та аніонобмінної хроматографії - 0,1-0,05 мг/мл. Очищений білок ПІЇ-10, виділений з бактеріальних тілець включення, зберігав активні антигенні детермінанти нативного інтерлейкіну-10 людини, що підтверджувалося у здатності його зв'язування з моноклональними та поліклональними антитілами до інтерлейкіну-10 людиниE. soy comprised more than 85 95 of the original target protein. The percentage of the dimeric form obtained after purification from oligomeric forms using anion exchange chromatography, determined by the separation of the purified renatured protein using gel filtration on a Zyregayeh 75 10/300 SI column, was 90-95 95. When applying 1 μg and subsequent separation in 13 95 - on a polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate, the purified and renatured protein was detected as a discrete band with a molecular weight of about 19 kDa (Fig. 3). The purity of the soluble product obtained after a cycle of chromatographic separation on a column with an anion exchange sorbent, calculated by the densitometry method of electrophoregrams, was more than 90 95, the concentration in the sample after renaturation and anion exchange chromatography was 0.1-0.05 mg/ml. Purified PII-10 protein isolated from bacterial inclusion bodies retained the active antigenic determinants of native human interleukin-10, which was confirmed by its ability to bind to monoclonal and polyclonal antibodies to human interleukin-10
Зо у "сандвіч"-варіанті твердофазного імуноферментного аналізу. Також, було продемонстровано збереження специфічної біологічної активності, яка виявлялась у пригніченні виділення оксиду нітрогену клітинами лінії 2774, стимульованими додаванням ліпополісахариду Е.соїї, під дією ренатурованого ПІЇ-10.Zo in the "sandwich" variant of the solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay. Also, it was demonstrated the preservation of specific biological activity, which was manifested in the inhibition of the release of nitric oxide by cells of line 2774, stimulated by the addition of E. soy lipopolysaccharide, under the action of renatured PII-10.
Суть корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де:The essence of a useful model is explained by graphic materials, where:
На фіг. 1 - хроматограма ренатурації білка МІ-10 із тілець включення заміною буфера на гель-фільтрафійному сорбенті Зерпадеха-25: 1 - фракція, що містила НІ/-10; 2 - фракція, яка містила гуанідин гідрохлорид та дитіотрієтол.In fig. 1 - chromatogram of MI-10 protein renaturation from inclusion bodies by buffer replacement on Zerpadekha-25 gel filtration sorbent: 1 - fraction containing NI/-10; 2 - fraction that contained guanidine hydrochloride and dithiotrietol.
На фіг. 2 - хроматограма очищення білка НІ/-10 за допомогою аніонобмінної хроматографії на ОЕАЕ-бЗеНагозе: 1 - фракція білка, яка не зв'язалася з сорбентом; 2 - фракція білка, що неспецифічно зв'язалася з сорбентом; З - фракція білка, елюйована з сорбенту буферним розчином з 1М Мас; 4 - Зміна іонної сили буферного розчину шляхом додавання 1,5 М Масі.In fig. 2 - chromatogram of NI/-10 protein purification using anion exchange chromatography on OEAE-bZeNagose: 1 - protein fraction that did not bind to the sorbent; 2 - the protein fraction that non-specifically bound to the sorbent; C - the protein fraction eluted from the sorbent with a buffer solution with 1M Mass; 4 - Changing the ionic strength of the buffer solution by adding 1.5 M Mass.
На фіг. З - електрофоретичний аналіз фракцій білків: 1-3: Електрофореграма лізатів клітин штаму-продуценту Е.соїї ВІ 21/пІ-10: 1-8І21 (ОЕЗУпІ ТО через 18 годин після додавання ізопропіл-В-тіогалактозиду- 30 мкл клітинної суспензії; 2-3-ВІ 21 (ОЕЗУПІ 10 після лізису із додаванням лізоциму - осад (2) і надосад (3) клітинної фракції після лізису; 4-8 - Електрофореграма білкових фракцій, одержаних після ренатурації НІ -10: 4-5 - маркер молекулярної ваги - рекомбінантний ІЕМ-с256 людини; 6-8 - надосад білкової фракції після ренатурації (5, 10, 25 мкл відповідно); 9-13 - Електрофореграма елюатів, одержаних після очищення на ОЕАЕ-Зернагозе таIn fig. C - electrophoretic analysis of protein fractions: 1-3: Electrophoresis of cell lysates of the producer strain E. soy VI 21/pI-10: 1-8I21 (OEZUPI TO) 18 hours after the addition of isopropyl-B-thiogalactoside - 30 μl of cell suspension; 2 -3-VI 21 (OESUPI 10 after lysis with the addition of lysozyme - sediment (2) and supernatant (3) of the cell fraction after lysis; 4-8 - Electrophorogram of protein fractions obtained after renaturation NI -10: 4-5 - molecular weight marker - human recombinant IEM-c256; 6-8 - supernatant of the protein fraction after renaturation (5, 10, 25 μl, respectively); 9-13 - Electrophorogram of eluates obtained after purification on OEAE-Zernagose and
Нераїгіп-5ернагове: 9-11 - фракція, яка містить ПІІ -10; 12-13 - маркер молекулярної ваги - рекомбінантний ІЕМ-с425 людини.Neraihip-5ernagove: 9-11 - fraction containing FDI -10; 12-13 - molecular weight marker - human recombinant IEM-c425.
Приклад виділення рекомбінантного білка ПІ/-10 в очищеному та розчиненому стані. Для часткового очищення тілець включення використовували промивання буферним розчином наступного складу: 7/М сечовина, 20мМ Тріс-НСЇІ рН 8.0, їмММ ЕОТА. Промивання здійснювали шляхом повного суспендування нерозчинного білка на ультразвуковому дезінтеграторі з наступним відділенням осаду центрифугуванням 15 хв. при 120009. Ізольовані тільця бо включення ресуспендували в буферному розчині наступного складу: 7М гуанідин гідрохлорид,An example of isolation of recombinant PI/-10 protein in a purified and dissolved state. For partial purification of inclusion bodies, washing with a buffer solution of the following composition was used: 7/M urea, 20 mM Tris-HCII pH 8.0, 1 mM EOTA. Washing was carried out by completely suspending the insoluble protein on an ultrasonic disintegrator, followed by separation of the sediment by centrifugation for 15 min. at 120009. The isolated inclusion bodies were resuspended in a buffer solution of the following composition: 7M guanidine hydrochloride,
0,1 М бікарбонатний буфер рн 8,5, 0,1 М І! -аргініну, 0,1 95 Пуееп-20, 0,1 М ОТТ, та інкубували з перемішуванням при ж-22"С протягом 1 години. Солюбілізований білок відділяли від нерозчинної фракції центрифугуванням 15 хв. при 12000 д та наносили на хроматографічну колонку з Зерпадех С-25 об'ємом 20 мл - 100 мл, урівноваженою розчином наступного складу: 0,1 М бікарбонатний буфер рН 8,5, 0,1 М І -аргініну, 0,1 956 Гуееп-20. Цільовий білок елюювався 1 фракцією (фіг. 1) у тому ж буфері, яким була врівноважена колонка. Після елюції білок фільтрували через 0,2 мкм мембранний фільтр чи центрифугували 15 хв. при 12000 49 і наносили на хроматографічну колонку з ЮЕАЕ-Зерпагозе об'ємом 5-10 мл, еквілібровану буфером, в якому елюювався білок з зерпадех С-25. Еквілібрація сорбенту, проводилася згідно з рекомендаціями фірми-виробника. Сорбент промивали урівноважуючим буфером (5 об'ємів колонки) та зв'язаний білок елюювали буфером наступного складу: 0,1 М бікарбонатний буфер рН 8,5, 0,1 М І аргініну, 0,1 95 Гуееп-20, 1,5 М Масі. Димерна фракція інтерлейкіну-10 людини була присутня у фракції, яка не зв'язувалась із сорбентом, у той час як олігомерні форми білка елюювалися буферним розчином, який містив 1,5 М Масі (фіг. 2). Для проведення етапу хроматографічного очищення на афінному сорбенті (Нерагіп Зернагозє) рН розчину, у якому знаходилася димерна фракція доводили до 7,2 додаванням 0,1 М розчину НзРоОх. Після цього білок наносили на хроматографічну колонку з Нерагіп берпагозе 5-10 мл, еквілібровану фосфатним сольовим буфером (ФСБ) рН 7,0-7,6, який містив 0,1 95 Тмееп-20 та 01 М 1- аргініну. Сорбент промивали урівноважуючим буфером (5 об'ємів колонки) та зв'язаний білок елюювали буфером наступного складу: ФОБ рН 7,0-7,6, 0,1 М І -аргініну, 0,1 956 Тмєеп-20, 1,5 М0.1 M bicarbonate buffer pH 8.5, 0.1 M I! -arginine, 0.1 95 Pueep-20, 0.1 M OTT, and incubated with stirring at 22°C for 1 hour. The solubilized protein was separated from the insoluble fraction by centrifugation for 15 minutes at 12,000 rpm and applied to a chromatographic column with Zerpadeh C-25 with a volume of 20 ml - 100 ml, balanced with a solution of the following composition: 0.1 M bicarbonate buffer pH 8.5, 0.1 M I -arginine, 0.1 956 Gueep-20. The target protein was eluted with 1 fraction (Fig. 1) in the same buffer with which the column was equilibrated. After elution, the protein was filtered through a 0.2 μm membrane filter or centrifuged for 15 min at 12,000 49 and applied to a chromatographic column with a volume of 5-10 ml of UEAE-Zerpagose , equilibrated with the buffer in which the protein was eluted from Zerpadek C-25. The equilibration of the sorbent was carried out according to the recommendations of the manufacturer. The sorbent was washed with equilibration buffer (5 column volumes) and the bound protein was eluted with the buffer of the following composition: 0.1 M bicarbonate buffer pH 8.5, 0.1 M I arginine, 0.1 95 Gueep-20, 1.5 M Mass. Dimer frac human interleukin-10 was present in the fraction that did not bind to the sorbent, while the oligomeric forms of the protein were eluted with a buffer solution containing 1.5 M Massey (Fig. 2). To carry out the step of chromatographic purification on an affinity sorbent (Neragip Zernagoze), the pH of the solution containing the dimer fraction was adjusted to 7.2 by adding a 0.1 M solution of NzRoOx. After that, the protein was applied to a 5-10 ml Neragip berpagose chromatographic column equilibrated with phosphate salt buffer (PSB) pH 7.0-7.6, which contained 0.1 95 Tmeep-20 and 01 M 1-arginine. The sorbent was washed with an equilibration buffer (5 column volumes) and the bound protein was eluted with a buffer of the following composition: FOB pH 7.0-7.6, 0.1 M I-arginine, 0.1 956 Tmeep-20, 1.5 M
Масі. Моніторинг фракцій, що містять білок, проводили спектрофотометрично при 280 нм за допомогою ШМ-монітора. Одержані елюцією фракції білків аналізували електрофорезом.Massey Monitoring of protein-containing fractions was carried out spectrophotometrically at 280 nm using a CM monitor. The protein fractions obtained by elution were analyzed by electrophoresis.
Електрофорез білків проводили за методом Ш.ІЇаєттії (13), використовуючи для їхнього розділення 13-15 95-й поліакриламідний гель з 0,1 У-м додецилсульфату натрію. Кількість сумарного білка у різних фракціях визначалась спектрофотометрично за поглинанням розчину при довжині хвилі 280 н.м. Коефіцієнт поглинання при 280 н.м. цільового білка становив - 0,38 для концентрації 1 мг/мл рекомбінантного ПІІ -10, розведеного у ФСБ.Electrophoresis of proteins was carried out according to the method of Sh.Iyaetti (13), using 13-15 95% polyacrylamide gel with 0.1 U-m sodium dodecyl sulfate for their separation. The amount of total protein in different fractions was determined spectrophotometrically by the absorption of the solution at a wavelength of 280 nm. Absorption coefficient at 280 n.m. of the target protein was - 0.38 for a concentration of 1 mg/ml of recombinant PII -10, diluted in FSB.
Для аналізу молекулярних форм одержаного після ренатурації НПІ/10 використовували фракціонування на колонці 5ирегаєх 75 10/300 СІ (СЕ Неайнсаге, США). Еквілібрацію сорбентуTo analyze the molecular forms of NPI/10 obtained after renaturation, fractionation was used on a 5iregayeh 75 10/300 SI column (SE Neainsage, USA). Equilibration of the sorbent
Зо здійснювали буфером наступного складу: 0,1 М бікарбонатний буфер рН 8,5, 0,1 М І -аргініну, 0,196 Туеєп-20, швидкість потоку елюенту становила 0.5 мл/хв. Калібрування колонки здійснювали сумішшю білків-маркерів з відомою молекулярною вагою, а саме: БСА, овальбуміну, НІЕМ-а2р. Аналіз продемонстрував, що одержаний ПІЇ -10 (37,2 кДа) має приблизно той же час утримання, що і овальбумін (44 кДа). Слід зазначити, що фракціонуюча здатність використаної колонки не забезпечує розділення білків з настільки близькою молекулярною вагою.Zo was carried out with a buffer of the following composition: 0.1 M bicarbonate buffer pH 8.5, 0.1 M I-arginine, 0.196 Tueep-20, the eluent flow rate was 0.5 ml/min. The column was calibrated with a mixture of marker proteins with a known molecular weight, namely: BSA, ovalbumin, NIEM-a2r. Analysis demonstrated that the resulting PII -10 (37.2 kDa) has approximately the same retention time as ovalbumin (44 kDa). It should be noted that the fractionation capacity of the used column does not ensure the separation of proteins with such a close molecular weight.
Очищений білок НІ!/-10, виділений з бактеріальних тілець включення, зберігав активні антигенні детермінанти нативного інтерлейкіну-10 людини, що підтверджувалося у здатності його зв'язування з моноклональними та поліклональними антитілами до інтерлейкіну-10 людини у "сандвіч"-варіанті твердофазного імуноферментного аналізу. Також, було продемонстровано збереження специфічної біологічної активності, яка виявлялась у пригніченні виділення оксиду нітрогену клітинами лінії 2774, стимульованими додаванням ліпополісахариду Е.соїї, під дією ренатурованого ПІЇ-10.The purified NO!/-10 protein, isolated from bacterial inclusion bodies, preserved the active antigenic determinants of native human interleukin-10, which was confirmed by its ability to bind to monoclonal and polyclonal antibodies to human interleukin-10 in the "sandwich" variant of the solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay analysis Also, it was demonstrated the preservation of specific biological activity, which was manifested in the inhibition of the release of nitric oxide by cells of line 2774, stimulated by the addition of E. soy lipopolysaccharide, under the action of renatured PII-10.
Запропонований спосіб дозволив зменшити кількість технологічних етапів при виділенні та очищенні цільового продукту та збільшити його вихід приблизно у 4 рази (до 26-30 мг/1 ! вихідної культури) порівняно з описаним в літературних джерелах (приблизно 6 мг/1 І вихідної культури І51).The proposed method made it possible to reduce the number of technological stages in the isolation and purification of the target product and increase its yield by approximately 4 times (up to 26-30 mg/1 ! of the initial culture) compared to that described in the literature (approximately 6 mg/1 I of the initial culture I51) .
Джерела інформації: 1. Кк. Забаї, б. Сг, К. МУагеламеКа, 5. Кітзси, Е. МУЩе, К. УМоїК, апа 9. Седіпаї, "Віоіоду ої іптепецйкКкіп-10," СуюкКіпе Стоули Расіог Вем., Осі. 2010. - Мої. 21, Мо 5. - Р. 331-344. 2. А. Каїді5, А. Аптадє, А. Веїд, В. МеСагуєу, у. Вгапаїйе, 5. Ма, А. демпікаг, 5. Е. Копа!Іті, апаSources of information: 1. Kk. Zabai, b. Sg, K. MUagelameKa, 5. Kitzsy, E. Musche, K. UMoiK, apa 9. Sedipai, "Vioiodu oi iptepecykKkip-10," SuyukKipe Stowly Raciog Vem., Osi. 2010. - Mine. 21, Mo. 5. - R. 331-344. 2. A. Kaidi5, A. Aptade, A. Veid, V. MeSagueu, u. Vgapaiye, 5. Ma, A. dempikag, 5. E. Kopa!Iti, apa
А. Мепазза, "Нідн-Іеме! ргодисіоп ої питап іпіепеикКіп-10О Тибіоп5 іп їобассо сеї! 5зиврепвіоп сипигев, " Ріапі Віотесппо). У., дип. 2013. - Мої. 11, Мо 5. - Р. 535-545. 3. М. Ецімага, У. АїКі, І. Мапа, Р. ТаКаїма, А. КозаКа, М.М. Твції, К. ЗНігакі, апа К. ЗеКкікаула, "Ехіасіоп апа рипгіїісайоп ої питап іпіепеийкіп-10 їтот апздепіс гісе 5евав5, " Ргоївіп Ехрг. Ритії, и. 2010. - Мої. 72, Мо 1. - Р. 125-130. 4. "Патент Мо 2374321 - Способ получения трансгенньїх растений моркови, продуцирующих интерлейкин-10 человека." (Опіїпе). Амаїїабіє: пир://аПраїепів.ги/рагепу2374321.ПІті. (Ассевзейд: 04-Мау-20161,.A. Mepazza, "Nidn-Ieme! rgodisiop oi pitap ipiepeikKip-10O Tibiop5 ip iobasso sei! 5zyvrepviop sypygev, " Riapi Viotesppo). U., dip. 2013. - Mine. 11, Mo. 5. - R. 535-545. 3. M. Etsimaga, U. AiKi, I. Mapa, R. TaKaima, A. KozaKa, M.M. Tvtsi, K. ZNigaki, apa K. ZeKkikaula, "Ehiasiop apa ripgiiisayop oi pitap ipiepeiykip-10 ytot apzdepis gise 5evav5," Rgoivip Ehrg. Rytii, i. 2010. - Mine. 72, Mo. 1. - R. 125-130. 4. "Patent Mo 2374321 - Method for obtaining transgenic carrot plants producing human interleukin-10." (Opiipe). Amaiiabie: pyr://aPraiepiv.gy/ragepu2374321.PIti. (Assevzeid: 04-Mau-20161,.
5. 5. Кіотрив, С. бБоіотоп, апа А. Сепієї, "А 5ітріе помє! теШтой ог їШїе ргерагаїйоп ої попсомаІепі потоаіїтетгіс, Біоіодісайу асіїме питап іпіепеиКіп 10 іп Е5сНегтісніа соїї-епнапсіпд ргоїєїп ехргеззіоп Бу дедепегаїє РСВ ої 5 ОМА іп їШїе ореп геадіпа Мате, " Ргоївіп Ехрг. Ригії,5. 5. Kiotryv, S. bBoiotop, apa A. Sepiei, "A 5itrie pomie! teShtoi og iShie rgeragaiiop oi popsomaIepi dinemiitetgis, Bioiodisaiyu asiime pitap ipiepeiKip 10 ip E5sNegtisnia soii-epnapsipd rgoieip ehrgeziop Bue dedepegaie orpa RSV Oepgeyi 5 Mate, "Rgoivip Ehrg. Riga,
Оес. 2008. - Мої. 62, Мо 2. - Р. 199-205. 6. І. В. Рійвуп, І. В. Ахтап, апа М. М. Сигом, "(Ехргезвіоп ої зупіпеїйс питап іпіепешикКіп-10 депе апа йб5 тшиїапі магліапів іп ЕвсПетгісніа соїї сеїІ5)|" Віоогу. Кпіт., дап. 1998. - Мої. 24, Мо. 1. - Р. 48-57. 7. ЇХ В. Рійвуп, І. В. АІїтап, М. М. Схитом, апа А. М. Кикіп, "(Ехргезвіоп ої питап іпіепеикКіп-10 іп ЕвсПегісніа сої сеїІв|," Вішеїтеп ЕКзр. Віої. Медіївіпу, Маг. 1995. - Мої. 119, Мо 3. - Р. 324-327. 8. М. а. А. Вгоєгеп, М. ає Мгієз, М. В. Веппіпк, 0. .. Агпіг, А. В. Віот, М. І. Коєпавеєг», Р.Г. Е.Oes. 2008. - Mine. 62, Mo. 2. - R. 199-205. 6. I. V. Riivup, I. V. Akhtap, apa M. M. Sygom, "(Ehrgezviop oi zupipeiis pitap ipiepeshikKip-10 depe apa yb5 tshiiapi magliapiv ip EvsPetgisnia soii seiI5)| Vioogu Capt., add. 1998. - Mine. 24, Mo. 1. - R. 48-57. 7. IH V. Riivup, I. V. Aiitap, M. M. Shytom, apa A. M. Kykip, "(Ehrgezviop oi pitap ipiepeikKip-10 ip EvsPegisnia soi seiIv|," Visheitep EKzr. Vioi. Mediivipipu, Mag. 1995. - Moii. 119, Mo. 3. - R. 324-327. 8. M. a. M. I. Koepaveeg", R. G. E.
М. мап Г епі, Р. М. мап дег Кгаап, МУ. В. мап деп Вега, апа Р. А. у). мап де оо, "бізеазе-НедшаїваM. map G epi, R. M. map deg Kgaap, MU. V. map dep Vega, apa R. A. u). map de oo, "bizease-Nedshaiva
Сепе Тнегару м/ййп Апіїі-Іпїаттайогу ІпіепецйКкіп-10 Опаєг Ше Сопігої ої Ше СХСІ 10 Рготоїег огSepe Tnegaru m/yp Apiii-Ipiattayogu IpiepetsyKkip-10 Opayeg She Sopigoi oi She SHSI 10 Rgotoieg og
Те Тгєаїтепі ої Внештаїйоіа АпнНтийів, " Нит. Сепе ТНег., Маг. 2016. Мої. 27, Мо 3. - Р. 244-254. 9. О. Новз, Р. Виснег, В. Недепіив5, М.-Ї. ЮОгеівому, ЕР. ВоскК, І. М. Неїпаї, 5. А. Етіпо, апа б.Te Tgeaitepi oi Vneshtaiyoia ApnNtiyiv, " Nit. Sepe TNeg., Mag. 2016. Moi. 27, Mo 3. - R. 244-254. 9. O. Novz, R. Vysneg, V. Nedepiiv5, M.-Yi. YuOgeiv, ER. VoskK, I. M. Neipai, 5. A. Etipo, apa b.
Сигвівстеп, "1-10 Іпаїгеспу Недшагїез Сопвеаї І утрпапдіодепевзів апа Незоїшіоп ої Іпїаттаїйіоп міаSigvivstep, "1-10 Ipaigespu Nedshagiez Sopveai I utrpapdiodepevziv apa Nezoishiop oi Ipiattaiiop mia
Масгорнадев, " Ат. У. Раїйої, дап. 2016. - Мої. 186, Ме 1. - Р. 159-171. 10. 0. Е. бБогаппо, С. В. Ноабеї, С. Айтапп, у. Оиріапіїв, А. Апаге5з-Негтапоо, у. А. ВигаїсК, апа 5. Еацбеї, "ОвєїЇїмегу ої іпіепешцкКіп-10 міа іпіестабіє пудгоде!5 ітргомев5 гепа! оцісотев апа гедисев5 взузієтіс іпїаттаїйоп юїПом/іпд ізспетіс асшіе Кідпеу іп|игу іп тісе " Ат. У. Рнузіої. Непаї! Рпузіої, р. аіїргепа!.00579.2015, Маг. 2016. 11. У. Снепіті, Х. Ма, 5. Спопцаїр, А. 7уай, Т. Мадазпиптидат, ЇЇ. Му/оісік, 5. Спепйіті, Ї.Masgornadev, " At. U. Raiyoi, supplement. 2016. - Moi. 186, Me 1. - R. 159-171. 10. 0. E. bBogappo, S. V. Noabei, S. Aitapp, U. Oiriapiiv, A. Apage5z-Negtapoo, u. A. VygaisK, apa 5. Eatsbei, "OvieiYimegu oi ipiepestskKip-10 mia ipiestabie pudgode!5 itrgomev5 hepa! otsisotev apa gedysev5 vzuzietis ipiattaiiop yuiPom/ipd izspetis asshie Kidpeu ip|igu ip tise " At. U. Rnuzioi. Nepai! Rpuzioi, r. aiirgepa!.00579.2015, Mag. 2016. 11. U. Snepiti, H. Ma, 5. Spoptsair, A. 7uai, T. Madazpiptidat, Y. Mu/oisik, 5. Spepyiti, Y.
Міввіт, апа І. Егапк, "Оїйегепіа! ргодисіюп ої іпіелПецйкКіп 10 дийпа питап іттипоаеїїсівепсу міги5 іптесійоп, " АІЮО5 Вев. Нит. Неїомігизев5, Аца. 1996. - Мої 12, Мо 12. - Р. 1141-1149. 12. Н.О. Тотапсе, К. Вгопі, А. М. Реагзе, С.А. Меїп, Е. Могпіак, 9.8. Ргом/іє, С.9. Ніпав, апаMivvit, apa I. Egapk, "Oiyegepia! rgodisiyup oi ipielPetsykKip 10 dyypa pitap ittypoaeiissivepsu migy5 iptesiyop, " AIЮО5 Vev. Thread Neiomigizev5, Atsa. 1996. - Moi 12, Mo 12. - R. 1141-1149. 12. N.O. Totapse, K. Vgopi, A.M. Reagze, S.A. Meip, E. Mogpiak, 9.8. Rhom/ie, P.9. Napav, apa
М.У. О'Оугуєг, "Авзосіайоп ремуєеп депе ехргезвіоп БіотаїКегв ої іттипозирргезвзіоп апа Біоса тмапвтивіоп іп земегеїу іпішгейд роїуїгашта раїйепів, " Апп. 5ийга., Арг. 2015. - Мої. 261, Мо 4. - Р. 751- 759. 13. ШО. К. Гаеттії, "Сієамхаде ої бЗігисішта! Ргоїєїп5 дигіпд Ше Авзетріу ої Ше Неєай оїM.U. O'Ouguyeg, "Avzosiayop remuyeep depe ehrgezviop BiotaiKegv oi ittypozyrrgezvziop apa Biosa tmapvtiviop ip zemegeiu ipishgeid roiuigashta raiyepiv, " App. 5iiga., Arg. 2015. - Mine. 261, Mo. 4. - R. 751-759. 13. SHO. K. Gaettii, "Sieamhade oi bZigisishta! Rgoieip5 digipd She Avzetriu oi She Neeai oi
Васіепорнаде Т4," Маїиге, Аца. 1970. - Мої. 227, Мо 5259. - Р. 680-685.Vasiepornade T4," Maiige, Atsa. 1970. - Moi. 227, Mo 5259. - R. 680-685.
ЗоZo
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201610423U UA114652U (en) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201610423U UA114652U (en) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA114652U true UA114652U (en) | 2017-03-10 |
Family
ID=58504349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201610423U UA114652U (en) | 2016-10-13 | 2016-10-13 | METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA114652U (en) |
-
2016
- 2016-10-13 UA UAU201610423U patent/UA114652U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101883610B1 (en) | Methods of purifying recombinant adamts13 and other proteins and compositions thereof | |
| Burke | The purification of interferon | |
| CN102851339A (en) | Production method of Sublancin antibacterial peptide | |
| Salvi et al. | Purification and proteomic analysis of chloroplasts and their sub-organellar compartments | |
| Coelho et al. | Protein purification by affinity chromatography | |
| US10781250B2 (en) | Refolding process for antibody's fragments | |
| EP1531160B1 (en) | Recovery of a heat shock protein | |
| Boaglio et al. | Features of the milk whey protein partitioning in polyethyleneglycol-sodium citrate aqueous two-phase systems with the goal of isolating human alpha-1 antitrypsin expressed in bovine milk | |
| Rane et al. | On-column refolding of bone morphogenetic protein-2 using cation exchange resin | |
| CN101104635B (en) | Method for purifying recombination human alpha-whey albumin from transgene cow milk | |
| CN104046646B (en) | A kind of method utilizing SUMO system expression HMGB1 A-box albumen | |
| CN107001407A (en) | The formation of disulfide bond in protein solution is controlled by adding reducing agent | |
| CN100432230C (en) | Fusion expression method for metallothionein and use thereof | |
| UA114652U (en) | METHOD OF OBTAINING PURE AND SOLUTION RECOMBINANT INTERLAYKIN-10 HUMANS SYNTHESIZED BY E. COLI BL21 / hIL10 | |
| CN112028976A (en) | 2019 novel coronavirus spike protein receptor binding domain protein and application | |
| CN108752455B (en) | Recombinant preparation method and application of fungal defensin | |
| CN106715459B (en) | Conotoxin polypeptide kappa-CPTx-bt 104, preparation method and application thereof | |
| Santos-Ballardo et al. | Expression of the acidic-subunit of amarantin, carrying the antihypertensive biopeptides VY, in cell suspension cultures of Nicotiana tabacum NT1 | |
| Mishkind et al. | [28] Cell-free reconstitution of protein transport into chloroplasts | |
| Gu | Recovery of recombinant proteins from plants using aqueous two-phase partitioning systems: an outline | |
| US7439337B2 (en) | Three-phase partitioning method for purifying a protein | |
| CN104854239A (en) | Protein purification | |
| US11261472B2 (en) | Peptide sequence of a guide protein for the production of a peptide of interest, an expression vector, a host cell, and a method for the production of a peptide of interest | |
| Kudo et al. | Heterogeneous expression and emulsifying activity of class I hydrophobin from Pholiota nameko | |
| JP6583766B2 (en) | Protein separation method, protein analysis method, and protein separation kit |