UA114190C2 - Способи лікування фіброзу - Google Patents

Abstract

Даний винахід стосується лікування фіброзу печінки або фіброзу кишечнику, що включає введення терапевтично ефективної кількості 2-метоксі-3-(4'-амінофеніл)пропіонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера.

Description

Дана заявка запитує пріоритет заявки ЕР1Т2425027.5, поданої 9 лютого 2012, і заявки

О.5.5.М. 61/644 544, поданої 9 травня 2012, кожна з який включена в дану заявку за допомогою посилання в повному обсязі.

СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

Дана заявка включає список послідовностей, що був поданий в електронному вигляді в текстовому форматі і включений у дану заявку в повному обсязі за допомогою посилання.

Вказана текстова копія, створена 21 травня 2013, названа Р5О6Б6БРСТ 5І І і має розмір 3284 байти.

ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Фіброз полягає у формуванні надлишкової фіброзної сполучної тканини в органі або тканині у відновному або реактивному процесі, наприклад, при загоєнні, звичайно внаслідок травми або тривалого запалення. Фіброз викликає затвердіння і/або набрякання уражених тканин і зменшує потік рідин через ці тканини. У результаті тканини, уражені фіброзом, можуть втратити здатність функціонувати належним чином.

Наприклад, фіброз печінки можна описати, як реакцію загоєння у відповідь на хронічне ураження печінки, у результаті, наприклад, алкогольної або наркотичної залежності, вірусної або паразитарної інфекції (наприклад, гепатиту, такого, як гепатит В або С), неалкогольного стеатогепатиту (НАСГ),, надлишку заліза або міді, а також аутоїмунних захворювань. Усі хронічні захворювання печінки можуть приводити до фіброзу печінки, причому його основними причинами є хронічний вірусний гепатит В і захворювання печінки, викликані алкоголем.

Ендоканабіоїдна система печінки опосередковує як про-, так і анти-фіброгенний ефекти за рахунок активації різних сигнальних шляхів, які по-різному впливають на проліферацію і смерть фіброгенних типів клітин. З часом ці процеси можуть приводити до цирозу печінки, при якому структурна організація функціональних одиниць печінки розбудовується до такого ступеня, що кров протікає через печінку і діяльність печінки порушується.

Фіброз печінки являє собою поширену і непросту проблему світового значення. В даний час єдиним радикальним шляхом лікування цирозу на кінцевій стадії є трансплантація, але навіть у розвинутих країнах кількість донорських органів, доступних у клінічних умовах для потенційних реципієнтів, обмежує застосовність даної методики. Прогресування фіброзу і, зокрема, цирозу,

Зо є причиною значної захворюваності і смертності. Таким чином, існує нагальна потреба в розробці стратегій боротьби з фіброзом, які застосовні при фіброзі печінки.

Фіброз нирок приводить до значної захворюваності і смертності як первинна набута патологія, приводячи до необхідності діалізу або трансплантації нирок. Фіброз може виникати або у фільтруючому, або в реабсорбуючому компоненті нефрону, тобто функціональної одиниці нирки. Крім того, фіброз може виникати в серці, наприклад, фіброз серця може виявлятися у вигляді стовщення серцевого клапана.

Фіброз кишечнику є поширеним ускладненням запального захворювання кишечнику (ЗЗК), що може виявлятися у вигляді симптомів і може потребувати хірургічного втручання, якщо в результаті фіброзу формується звуження просвіту кишечнику. Більшість традиційних і нових механізмів, які лежать в основі фіброзу кишечнику, пов'язані з хронічним запаленням.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Даний винахід стосується, наприклад, способів лікування фіброзу, що включає введення пацієнту сполук, розкритих у тексті даної заявки. Крім того, у винаході розроблені сполуки для застосування у вказаних способах. Наприклад, у винаході розроблений спосіб профілактики або лікування фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику в суб'єкта або пацієнта, що має потребу в цьому або страждає на вказані захворювання, що включає введення терапевтично і/або фармацевтично прийнятної кількості сполуки формули: ноос ех

Же в/о 11 де замісник К:о вибраний із групи, яка складається з Н і С1-Св алкілу;

замісник К:: вибраний із групи, яка складається з Н, С1-Св алкілу і -0(0)-С1-Св алкілу; замісник Е5 являє собою С1-Св алкіл; а також її фармацевтично прийнятні солі.

У деяких варіантах здійснення, придатний замісник К5 може являти собою Н.

Придатні варіанти Сі-Сє алкільних груп для фрагментів Ко, Ні: і/або К5 можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу.

Алкільні групи можуть бути лінійними або розгалуженими. Особливо переважними є метильні і етильні алкільні групи, причому метил є найбільш переважною алкільною групою.

Придатними точками приєднання атома азоту до циклу можуть бути положення 2", 3, 4" або 5. Переважно, азот приєднаний за положеннями 3' або 4". Найбільш переважним є положення 4.

Типові сполуки за даним винаходом можуть мати формули А і А", де замісники Ко, Вч: і К5 відповідають даним вище визначенням і де нос,

ОК ноОс щ во во

Р А"; Р А".

У деяких варіантах здійснення, придатний замісник К5 може являти собою Н.

Придатні варіанти Сі-Сє алкільних груп для фрагментів Ко, Ні: і/або К5 можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу.

Алкільні групи можуть бути лінійними або розгалуженими. Особливо переважними є метильні і етильні алкільні групи, причому метил є найбільш переважною алкільною групою. У деяких варіантах здійснення, К5 означає метил, етил, пропіл або, наприклад, метил. У деяких варіантах здійснення, К5 означає метил, етил, пропіл або, наприклад, метил.

Крім того, даний винахід стосується способу профілактики або лікування фіброзу печінки або кишечнику, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, фармацевтичного препарату, який включає РРАКУ агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці. Винахід охоплює способи профілактики або лікування фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу і/або нефрогенного системного фіброзу, що включають уведення пацієнту, якому це необхідно, фармацевтичного препарату, що включає РРАКу агент, наприклад, сполуку,

Зо розкриту в даному винаході. Способи, розкриті в даній заявці, можуть, наприклад, включати способи, у яких пацієнт є людиною. Відповідно, сполуки, описані в даній заявці, можуть застосовуватися для лікування і/або профілактики вказаних захворювань/станів.

Ці й інші аспекти і переваги даного винаходу стануть зрозумілі з наведеного нижче ілюстративного матеріалу, докладного опису і формули винаходу.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

На фіг. 1 зображена зміна маси тіла мишей при введенні СсСіх, УМ/ Н-133 і сполуки 34.

На фіг. 2 (А) наведене розшифрування балів шкали МЕТАМІК і (В) відображений вплив уведення СсСі, УМ/Н-133--ССІ 4 і сполуки 344-ССі4 на печінку, і наведені результати за шкалою

МЕТАМІК для кожної групи.

На фіг. З (А) відображені результати за шкалою МЕТАМІК і (В) результати за адаптованою шкалою МЕТАМІК для печінки мишей, що піддавалися дії ССіх, УМ/Н-1334-4-0С14 і сполуки 344.

На фіг. 4 відображена дія ССі4, УМ/Н-133--С СІ 4 і сполуки 34-ССі» на рівні а-ЗМА і колагену-1.

На фіг. 5 наведений розклад дослідження кишкового фіброзу.

На фіг. 6 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.

На фіг. 7 наведена протизапальна дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.

На фіг. 8 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику.

На фіг. 9 відображена дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику, визначена за результатами імуногістохімічного аналізу основних маркерів фіброзу (колагену І1-

І, СТОР, МАО 2/3, РОСЕ, а-5МА і ТОБЕ-В1).

На фіг. 10 показана дія сполуки 34 на ободову кишку мишей з фіброзом кишечнику, визначена за допомогою вестерн-блотингу.

На фіг. 11 показана крива маси тіла мишей, яким вводили О55 і О555-0Е0.

На фіг. 12 показаний рівень розвитку фіброзу в ободовій кишці мишей, що одержували О55 і

О05550Е0 порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду.

На фіг. 13 показані результати мікроскопічного дослідження ободової кишки мишей із хронічним колітом, які одержували 055 і 0555-5ЕО. Тканини ободової кишки фіксували в 4 90РЕА і поперечні зрізи (4 мкм) забарвлювали барвником Мея-Грюнвальда-Гімза (НеЕЕ) і трихромом за Масоном. Миші 055 демонстрували сильний ступінь запалення і фіброзу, як у підслизуватому шарі, так і в серозній оболонці порівняно з контрольними тваринами, у той час як уведення ЗЕЮО забезпечувало відновлення нормальної структури кишкової стінки. Дані наведені у вигляді середнє значення Ж55ЕМ (стандартна помилка середнього значення); "жр«0,05 и -р«001 і ихр«0,005 відносно НгО.

На фіг. 14 показані результати імуногістохімії і імуноблотингу основних маркерів фіброзу.

Мікрофотографії демонструють значне зменшення рівнів колагену І-Ш (а), 4-ЗМА (Б) у 055 мишей, яким вводили СЕО, порівняно з мишами з О55-індукованим хронічним колітом. Рівні цих маркерів вимірювали також за допомогою Вестерн-блотингу, підтверджуючи профіль експресії, індукований СЕЮО. Показано характерні результати блотингу. "-р«0,05; -р«0,01. М-6 мишей у контрольній групі, 8 мишей у групі 055, 8 мишей у групі О55505Е0.

На фіг. 15 наведені мікрофотографії, які демонструють значне зменшення рівнів ТОЕ-В1 (а),

ЗМАЮ 2/3 (р), СТОК (с) у 055 мишей, яким вводили СЕО, порівняно з мишами з хронічним колітом, викликаним Ю55.

На фіг. 16 показаний вплив уведення СЕО на рівні білка І/-13 у мишей, що постійно одержували 055, а також похідних медіаторів, а саме - ТаБ-В1 і СТОР. Рівні І--13, ТОБ-ДІ1 і

СТОБ визначали за допомогою вестерн-блотингу. Дані виражені у відсотках від середніх значень для контрольних тварин. Показані репрезентативні результати блотингу. "-р«0,01. М-6

Зо мишей у контрольній групі, 8 мишей у групі О55, 8 мишей у групі О55-СЕ0.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Даний винахід частково оснований на даних про те, що деякі сполуки, розкриті в даній заявці, мають здатність запобігати або лікувати фіброз, наприклад, печінки або ободової кишки.

В одному з аспектів, винахід спрямований на способи профілактики або лікування фіброзу, наприклад фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику, у пацієнтів, яким це необхідно. Способи за даним винаходом включають уведення сполук, розкритих у даній заявці.

Перед подальшим описом винаходу нижче по тексту зібрані визначення деяких термінів, використовуваних в описі, прикладах і прикладеній формулі винаходу. Ці визначення варто сприймати у світлі частини опису, який залишився, і розуміти так само, як їх розуміють фахівці в даній галузі техніки. Якщо не вказане інше, усі технічні і наукові терміни, використані в описі, мають ті ж значення, що традиційно розуміються під ними рядовими фахівцями в даній галузі техніки. "Пацієнт", "суб'єкт" або "хазяїн", якого передбачається лікувати способом за даним винаходом може означати як людину, так і тварину, що не є людиною, наприклад, дрібного ссавця, такого, як щур або миша, а також кінь, корова, собака, кішка і т. д.

Термін "терапевтичний агент" відомий у техніці і стосується будь-якої хімічної частинки, що є біологічно, або фізіологічно фармакологічно активною речовиною, яка місцево і/або системно діє в організмі суб'єкта. Приклади терапевтичних агентів, які називаються також "лікарськими засобами", описані в добре відомих літературних джерелах, таких, як Мегск Іпдех, Ше РНузісіапе ревзК Кеїегепсе і Те РІагтасоїіодіса! Вазіє ої Тпегарешіс5, і такі засоби включають, не обмежуючи вказаними, медикаменти; вітаміни; мінеральні добавки; речовини, застосовувані для лікування, профілактики, діагностики, усунення або ослаблення хвороби або захворювання; речовини, що впливають на будову або функції організму; або проліки, які набувають біологічної активності або стають активнішими після того, як їх вміщують у фізіологічне середовище.

Термін "терапевтичний ефект" відомий у техніці і стосується місцевої і/або системної дії у тварин, зокрема ссавців, і конкретніше - людей, викликаної фармакологічно активною речовиною. Таким чином, вказаний термін стосується будь-якої речовини, яка призначена для застосування в діагностиці, лікуванні, ослабленні, усуненні або попередженні захворювання, або в поліпшенні бажаного фізичного або розумового розвитку і/або стану в тварини або бо людини. Фраза "терапевтично ефективна кількість" означає таку кількість даної речовини, що викликає бажану місцеву або системну дію при розумному співвідношенні користь/ризик, застосовна до будь-якого лікування. Терапевтично ефективна кількість даної речовини буде змінюватися залежно від суб'єкта і хворобливого стану, що піддається лікуванню, маси і віку суб'єкта, важкості хворобливого стану, шляху введення і подібних факторів, що може легко визначити рядовий фахівець у даній галузі техніки. Наприклад, деякі композиції за даним винаходом можна вводити в кількості, достатній для одержання ефекту при розумному співвідношенні користь/ризик, застосовному до такого лікування.

Термін "лікування" відомий у техніці і стосується усунення захворювання, а також ослаблення принаймні одного із симптомів будь-якого стану або захворювання.

Термін "алкіл" відомий у техніці й охоплює насичені аліфатичні групи, зокрема алкільні групи з лінійним ланцюгом, алкільні групи з розгалуженим ланцюгом, циклоалкільні (аліциклічні) групи, циклоалкільні групи з алкільними замісниками й алкільні групи з циклоалкільними замісниками.

У деяких варіантах здійснення кістяк алкільних груп з лінійним або розгалуженим ланцюгом включає приблизно 30 або менше атомів вуглецю (наприклад, С1-Сзо для лінійного ланцюга, Сз-

Сзо для розгалуженого ланцюга) і, як альтернатива, приблизно 20 або менше, наприклад, від 1 до 6 атомів вуглецю. Аналогічно, циклічна структура циклоалкілів включає від приблизно З до приблизно 10 атомів вуглецю і, як альтернативу, приблизно 5, 6 або 7 атомів вуглецю. Крім того, термін "алкіл" визначається таким чином, що він охоплює галогензаміщені алкіли.

Крім того, термін "алкіл" (або "нижчий алкіл") включає "заміщені алкіли", що являють собою алкільні фрагменти, які включають замісники, які заміщують атоми водню в одного або декількох атомів вуглецю вуглеводного кістяка. Згадані замісники можуть включати, наприклад, гідроксил, карбоніл (наприклад, карбоксил, алкоксикарбоніл, форміл або ацил), тіокарбоніл (наприклад, тіоефір, тіосацетат або тіоформіат), алкоксил, фосфорил, фосфонат, фосфінат, аміно, амідо, амідин, імін, ціано, нітро, азидо, сульфгідрил, алкілтіо, сульфат, сульфонат, сульфамоїл, сульфонамідо, сульфоніл, гетероцикліл, аралкіл, або ароматичний або гетероароматичний фрагмент. Фахівець у даній галузі зрозуміє, що фрагменти, які є замісниками вуглеводневого ланцюга, самі по собі можуть бути заміщеними, якщо є відповідна можливість. Наприклад, замісники заміщеного алкілу можуть включати заміщені і незаміщені форми аміно, азидо, іміно, амідо, фосфорилу (зокрема фосфонатів і фосфінатів), сульфонілу

Зо (зокрема сульфату, сульфонамідо, сульфамоїлу і сульфонату) і силільної групи, а також простих ефірів, алкілтіо, карбонільних сполук (зокрема кетонів, альдегідів, карбоксилатів і складних ефірів), -СМ і т. п. Типові заміщені алкіли описані нижче. Циклоалкіли можуть бути додатково заміщені алкілами, алкенілами, алкокси, алкілтіо, аміноалкілами, карбонілзаміщеними алкілами, -СМ і т. п.

Терміни "орто-", "мета-" і "пара-" відомі в техніці і стосуються 1,2-, 1,3- і 1,4-дизаміщених бензолів відповідно. Наприклад, назви 1,2-диметилбензол і орто-диметилбензол є синонімічними.

Мається на увазі, що визначення для кожного фрагмента або змінної величини, наприклад, алкілу, т, п і т. п., якщо в якій-небудь структурі вони зустрічаються більше одного разу, є незалежними від будь-яких інших визначень цієї перемінної в тій же самій структурі.

Деякі сполуки, що входять у композиції за даним винаходом, можуть існувати в конкретних геометричних або стереоіїзомерних формах. Крім того, сполуки за даним винаходом можуть також бути оптично активними. Даний винахід охоплює всі такі сполуки, зокрема цис- і транси- ізомери, К- і 5-енантіомери, діастереомери, (0)-ізомери. (І)-ізомери, їх рацемічні суміші й інші суміші, які потрапляють в обсяг даного винаходу. Додаткові асиметричні атоми вуглецю можуть бути присутніми у заміснику, наприклад, алкільній групі. Мається на увазі, що всі такі ізомери, а також їх суміші включені в даний винахід.

Мається на увазі, що терміни "заміщення" або "заміщений чим-небудь" включають потенційно можливі молекули, за умови, що такі заміщення відповідають можливим валентностям заміщеного атома і замісника, і що заміщення приводить до стійкої сполуки, яка, наприклад, не піддається мимовільному перетворенню, наприклад, у результаті перегрупування, циклізації, елімінування або інших реакцій.

Передбачається також, що термін "заміщений" включає всі припустимі замісники органічних сполук. У широкому аспекті, припустимі замісники включають ациклічні і циклічні, розгалужені і нерозгалужені, карбоциклічні і гетероциклічні, ароматичні і неароматичні замісники органічних сполук. Ілюстративні приклади замісників включають, наприклад, замісники, перераховані вище по тексту. Придатні органічні сполуки можуть включати один або трохи замісників, і ці замісники можуть бути однаковими або різними. Для цілей даного винаходу, гетероатоми, наприклад, азот, можуть бути заміщені воднем і/або будь-якими допустимими замісниками органічних бо сполук, описаними в тексті заявки, що насичують валентність вказаних гетероатомів. Мається на увазі що даний винахід не обмежений яким-небудь чином допустимими замісниками органічних сполук.

Для цілей даного винаходу хімічні елементи ідентифікуються відповідно до Періодичної таблиці елементів, версія СА5, Напароок ої Спетізігу апа РПузіс5, 67" Еа., 1986-87, на розвороті обкладинки. Також для цілей даного винаходу вважається, що термін "вуглеводень" включає всі можливі сполуки, які містять принаймні один атом водню й один атом вуглецю. У широкому аспекті, можливі вуглеводні включають ациклічні і циклічні, розгалужені і нерозгалужені, карбоциклічні і гетероциклічні, ароматичні і неароматичні органічні сполуки, які можуть бути заміщеними або незаміщеними.

Термін "фармацевтично прийнятні солі" відомий у техніці і стосується відносно нетоксичних неорганічних і органічних кислотно-адитивних солей сполук, зокрема, наприклад, таких, які входять у композиції за даним винаходом.

Термін "фармацевтично прийнятний носій" відомий у техніці і стосується фармацевтично прийнятних матеріалів, композицій або носіїв, наприклад, рідких або твердих наповнювачів, розріджувачів, ексципієнтів, розчинників або інкапсулюючих матеріалів, які беруть участь у перенесенні або транспортуванні будь-якої композиції за даним винаходом або її компонента з одного органа або частини організму в інший орган або частину організму. Кожний з носіїв повинний бути "прийнятним" у змісті сумісності з композицією за даним винаходом і її компонентами, і відсутності шкідливості для пацієнта. Деякі приклади матеріалів, які можуть служити фармацевтично прийнятними носіями, включають: (1) цукри, наприклад, лактозу, глюкозу і сахарозу; (2) крохмалі, наприклад, кукурудзяний крохмаль і картопляний крохмаль; (3) целюлозу і її похідні, наприклад, натрій карбоксиметил целюлозу, етилцелюлозу й ацетат целюлози; (4) порошкоподібний трагакант; (5) солод; (б) желатин; (7) тальк; (8) такі ексципієнти, як олія какао і воски для супозиторіїв; (9) олії, наприклад, арахісову олія, олію насіння бавовни, сафлорову олія, кунжутну олію, оливкову олія, кукурудзяну олія і соєву олія; (10) гліколі, наприклад, пропіленгліколь; (11) поліоли, наприклад, гліцерин, сорбіт, маніт і поліетиленгліколь; (12) складні ефіри, наприклад, етилолеат і етилаурат; (13) агар; (14) буферні агенти, наприклад, гідроксид магнію і гідроксид алюмінію; (15) альгінову кислоту; (16) апірогенну воду; (17) ізотонічний сольовий розчин; (18) розчин Рингера; (19) етиловий спирт; (20) фосфатний

Зо буферний сольовий розчин; й (21) інші нетоксичні сумісні речовини, застосовувані у фармацевтичних сполуках.

Сполуки

Сполуки, призначені для застосування в одному або декількох способах за даним винаходом, включають сполуки формули (І) або їх фармацевтично прийнятні солі, енантіомери або стереоізомери: ау хх р

МА'В" (у де: кожний із замісників ВЕ' і К? незалежно вибраний із групи, яка складається з Н і С..є алкілу; або В" ії В? разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, можуть утворювати ароматичний або аліфатичний цикл, що складається з 5 або 6 атомів; замісники М ії 7 незалежно вибрані з групи, яка складається з Н, ОН, СООН, -ОНЗ, -

СН(ОВз)СООН , і замісник КЗ вибраний із групи, яка складається з Н, фенілу, бензилу, вінілу, алілу, С:-є або алкілу Сів алкілу, заміщеного одним або декількома атомами галогену; або його фармацевтично прийнятну сіль.

Придатні С.і-є алкільні фрагменти можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу. Алкільний фрагмент може бути лінійним або розгалуженим. Особливо переважними алкільними групами є метил і етил, і найбільш переважною алкільною групою є метил.

В одному з варіантів здійснення У може означати Н або СООН. Наприклад, У може означати

Н, ї 7 може означати СН(ІОКУСООН, або У може означати СООН, і 7 може означати -ОНЗ. У деяких варіантах здійснення, ЕКЗ може представляти метил, етил, н-пропіл або ізопропіл.

В інших варіантах здійснення фрагмент МА'В2 формули (І) може знаходитися в положенні 4" або в положенні 3". У деяких варіантах здійснення К! і К2 являють собою атоми Н.

У деяких варіантах здійснення придатним замісником Кз може бути Н.

Типові приклади сполук включають також сполуки формул (Па) або (ПІБ) або їх фармацевтично прийнятні солі, енантіомери або стереоізомери: ее Еге ві в

ЕЕ ЕЕ або А зр са: М в вв'м (Па) (ПЬ) де: замісники К' ії К2 незалежно вибрані з групи, яка складається з Н і С:.6 алкілу; або Кі Кк: разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, можуть утворювати ароматичний або аліфатичний цикл, який складається з 5 або 6 атомів; замісник КУ вибраний із групи, яка складається з -МАРОН, ОН і -ОН8;

В? означає Сі.-в алкіл; замісник КЕ" вибраний із групи, яка складається з Н, галогену, фенілу, бензилу, вінілу, алілу,

С..-в алкілу і Сів алкілу, заміщеного одним або декількома атомами галогену; замісники Е і КЕ" незалежно вибрані з групи, яка складається з водню або галогену, або

В Її 2», або В: і КУ спільно утворюють конденсований гетероцикл, який складається з 5 або 6 атомів, необов'язково заміщений галогеном С-в або алкілом; і

А являє собою конденсований гетероцикл; або його фармацевтично прийнятну сіль.

Придатні С.і-є алкільні фрагменти можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу. Алкільний фрагмент може бути лінійним або розгалуженим. Особливо переважними алкільними групами є метил і етил, і найбільш переважною алкільною групою є метил.

У деяких варіантах здійснення фрагмент МК'В: сполуки (Па) може знаходитися в положенні 4 або в положенні 3'. У деяких варіантах здійснення, замісники К' і К2 являють собою атоми Н.

У деяких варіантах здійснення, ЕК? може являти собою метил, етил, н-пропіл або ізопропіл.

У деяких варіантах здійснення, сполука за даним винаходом може бути представлена формулами:

Зо

Ов

НьМ о

С або о ро

НМ р де р означає 1 або 2; замісник Р вибраний із групи, яка складається з ОН або -ОН", де Е? відповідає даному вище визначенню; і замісник К"О у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з Н, галогену або С.і.є алкілу, наприклад, метилу або етилу.

Крім того, даний винахід надає, щонайменше частково, сполуки наведених нижче формул, для застосування в розкритих способах.

Наприклад, винахід стосується застосування в розкритих способах сполук формули (ПП):

ІФ)

Ва, о. о К5

Хх 1

ВЗ Ї

Се 6)

Кг

Кк. шШ де Х означає Сі-Сз алкілен, необов'язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, вибраними з галогену або гідроксилу; замісник БЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Свє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; замісник Кг вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Ка вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Свє алкілу; замісник Е5 являє собою Сі-Св алкіл; або з їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів.

У деяких варіантах здійснення придатний замісник К5 може являти собою атом Н.

Придатні С.і-є алкільні фрагменти можуть бути незалежно вибрані з групи, яка складається з: метилу, етилу, пропілу, пентилу і гексилу. Алкільний фрагмент може бути лінійним або розгалуженим. Особливо переважними алкільними групами є метил і етил, і найбільш переважною алкільною групою є метил.

В одному з варіантів здійснення, замісник К: у формулі (ІП) може являти собою Сі-в алкіл, наприклад, метил. В одному з варіантів здійснення К2 може бути воднем. В іншому варіанті здійснення замісник Кз може бути вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Свє алкілу, галогену і гідроксилу. В іншому варіанті здійснення Кз може бути воднем. В одному з варіантів здійснення кожний із замісників К. і К5 може являти собою Сі-Свє алкіл. В іншому варіанті здійснення К. може бути воднем, і К5 може бути метилом. В одному з варіантів здійснення фрагмент Х може являти собою групу (СНг)н, де п означає 1 або 2, наприклад 1.

В іншому варіанті здійснення фрагмент -МА2-СОВ.: формули (Ії) може знаходитися в мета- або пара-положенні відносно групи Х, що представлено формулами (Ша) і (ПІБ). (в) 6)

Ва о. т) о Ре

Ше й: 5 х

Х оз з І

Х й

М Ви ра Р й в. 2 Ша о шь

Зо Крім того, даний винахід надає сполуки наведеної нижче формули (ІМ), які можуть застосовуватися в розкритих у заявці способах, наприклад:

но (в) (о); - й Ке п - (в)

Є

Ро в

ІУ де замісник КЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Сє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і С2-Св алкінілу; замісник Кг вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Е5 являє собою водень або Сі-Св алкіл; а також їх фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.

Крім того, даний винахід стосується сполук наведеної нижче формули (М): (о! Ва ох х 224

Кз (в)

Кк.

У з де замісник КЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Сє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; замісник Кз у кожному випадку незалежно вибраний із групи, яка складається з водню, С1-Св алкокси, Сі1-Св алкілу, ціано, Сз-Св6 циклоалкілу, галогену, гідроксилу і нітро; замісник Ка вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; замісник Е5 являє собою водень або Сі-Св алкіл; і фрагмент А являє собою конденсований п'яти- або шестичленний гетероцикл; а також їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів вказаних сполук.

В одному з варіантів здійснення Кі: може являти собою Сі-Св алкіл, наприклад, метил. В іншому варіанті здійснення кожний із замісників Кі і Кз може являти собою Сі-Св алкіл, наприклад, метил. В одному з варіантів здійснення ЕК» може бути воднем.

У деяких варіантах здійснення, сполука за даним винаходом може бути представлена формулами

Те (Ф (в)

Вих. ЯК (Ф) А- і Д о Рв 1 М Р або Кв

Зо де р означає 1 або 2;

замісник БЕ: вибраний із групи, яка складається з Сі-Свє алкілу, Сз-Св циклоалкілу, С2-Св алкенілу і Со-Св алкінілу; кожний із замісників Ка і Кз незалежно вибраний із групи, яка складається з водню і С1-Св алкілу; або сполука за даним винаходом являє собою фармацевтично прийнятну сіль або М-оксид вказаної сполуки.

Наприклад, в одному з варіантів здійснення, сполуки за даним винаходом, придатні для застосування в розкритих способах, включають сполуки формули А: нос,

ОК хх зе в/о

Щі , де замісник К:о вибраний із групи, яка складається з Н і Сі-Сє алкілу (наприклад, метилу); замісник Ки: вибраний із групи, яка складається з Н, С1-Св алкілу і групи -С(0)-С:1-Св алкіл (наприклад, К:ї може являти собою Н, метил, -С(О)-метил або -С(О)-етил). замісник К5 являє собою Сі-Св алкіл (наприклад, К5 може бути метилом, етилом або пропілом); або їх фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.

Наприклад, передбачене застосування в способах за даним винаходом сполук формул А і

А": нос,

ОК ноОс щ во во

Р А: Р І

Типові приклади сполук, передбачених у даному винаході для застосування в розкритих способах, включають:

Ме

Н Е но ме д но о ЕЕ хо но он он і, г он -

МН». МН МН». МН. 00 МНо , МН», ме он

МН

Й або їх фармацевтично прийнятні солі.

У деяких варіантах здійснення, сполуки за даним винаходом включають: 4-аміно-М-гідрокси- 2-метоксибензамід (сполука 13); б-метокси хінолін-5-карбонову кислоту (сполука 36); б-метокси- 1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5-карбонову кислоту (сполука 37); і 5-діізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 38).

Інші типові приклади сполук включають наступні речовини: он я он

МН

Ме

Ме (сполука 13). МНо (сполука 14); НОМ ; он

МН (о) Фін! (сполука 26). НОМ : (сполука 17). НоМ , он

МН о

О;-Рг шо (сполука 91); Нам ; (сполука 28): і) | .

Сполуки за даним винаходом включають рацемічні суміші і енантіомери сполук, наприклад: ()-2-гідроксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 29); (5)-2-метоксі-2-(4- амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 23); (ж)-2-етоксі-2-(3'-амінофеніл)уоцтову кислоту (сполука 32); (з)-2-етоксі-2-(4-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 33); ()-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 34); сполуку 34 (рацемічна форма); (ж)-2-етоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 39); (ж)-2-етоксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонову кислоту (сполука 40).

Наприклад, сполуки, застосовувані в способах за даним винаходом, можуть являти собою енантіомери наступних рацемічних сумішей: (К, 5)-2-гідроксі-2-(3-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 10); (К, 5)-2-гідроксі-2-(4-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 11); (ЕЕ, 5)-2-гідроксі-3- (4'-амінофеніл)упропіонової кислоти (сполука 21); (Б, 5)-2-метоксі-2-(3'-амінофеніл)оцтової кислоти (сполука 22); (Б, 5)-2-метоксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонової кислоти (сполука 35); (В, 5)- 2-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти (сполука 34), а також енантіомери, наприклад, (у 2-5-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти; (-) 2-В-метоксі-3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти. У деяких варіантах здійснення переважними сполуками є (К,5)-2-гідроксі-3-(4- амінофеніл)упропіонова кислота (сполука 21) або (ж)-2-гідроксі-3-(3'-амінофеніл)пропіонова кислота (сполука 20).

Інші типи рацемічних сумішей сполук за даним винаходом включають, наприклад: (хж)-2- гідроксі-2-(3'-амінофеніл)уоцтову кислоту (сполука 10); (ж)-2-гідроксі-2-(4'-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 11); (ж)-2-гідроксі-3-(4'-амінофеніл)упропіонову кислоту (сполука 21) ї (ж)-2- метоксі-2-(3'-амінофеніл)оцтову кислоту (сполука 22).

Зо Інші сполуки, застосування яких передбачено в способах за даним винаходом, включають:

Б5-аміносаліцил-гідроксамову кислоту (сполука 5); З-диметиламіносаліцилову кислоту (сполука 6); 2-метоксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 7); 2-метоксі-5-амінобензойну кислоту (сполука 8); б-метиламіносаліцилову кислоту (сполука 9); 4-метиламіносаліцилову кислоту (сполука 12);

4-ацетиламіносаліцилову кислоту (сполука 16); 2-етоксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 18); 2-етоксі-5-амінобензойну кислоту (сполука 19); 4-диметиламіносаліцилову кислоту (сполука 24); 2-етоксі-4-амінобензоїлгідроксамову кислоту (сполука 25); б-гідроксихінолін-5--карбонову кислоту (сполука 27); 2-(2-пропіл)оксі-4-амінобензойну кислоту (сполука 30); 4-(1- піперазиніл)саліцилову кислоту (сполука 41); (К, 5)-5-оксахінолін-б6-карбонову кислоту (сполука 15); б-метоксихінолін-5-карбонову кислоту (сполука 36); б-метокси-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5- карбонову кислоту (сполука 37); 5-дізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 38); і 4- діізопропіламіносаліцилову кислоту (сполука 42).

Сполуки за даним винаходом і фармацевтичні композиції, які включають як мінімум одну сполуку, можуть бути вибрані з групи, яка складається з: М-ацетил-(Н)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2- метоксипропіонової кислоти, М-ацетил-(5)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2-метоксипропіонової кислоти; і рацемічної /М-ацетил-(5)-(-)-3-(4-амінофеніл)-2-метоксипропіонової кислоти або сполуки, вибраної з:

Мех, (в) (в) й но Ме но - но т он он о Ме, Ме , о Ме, Ме , Ме , р Мех, 6) Мн-ОоН о.

М он он й МмНн-оН н м

ЖО Ар Х 07 "Ме, О7 Ме ме ,Ме Й ,

Ох ИчН-ОН Н ох, ИМН-оН

Сг

Д Д Х

Ме М Ме М Ме М

Ме: че й о о ОХ ме

Ме або їх фармацевтично прийнятних солей або М-оксидів.

Інші сполуки за даним винаходом включають сполуку 20, сполуку 21, 4-ацетамідо-М- гідрокси-2-метоксибензамід; 1-ацетил-б-метокси-1,2,3,4-тетрагідрохінолін-5-карбонову кислоту,

Б-ацетамідо-2-гідроксибензойну кислоту (наприклад, ацетальовану 5-аміносаліцилову кислоту) або їхні фармацевтично прийнятні солі або М-оксиди.

Крім того, для застосування в способах за даним винаходом передбачається застосування композицій, які включають сполуки, представлені наведеними формулами, і, наприклад, фармацевтично прийнятний носій.

Способи одержання сполук за даним винаходом можна знайти, наприклад, у заявках

ММО2007/010516 ії УМО2007/010514, кожна з який включена в дану заявку в повному обсязі за допомогою посилання.

СПОСОБИ

Частиною даного опису є способи профілактики або лікування фіброзу, наприклад, фіброзу печінки і/або фіброзу кишечнику. Ці способи можуть включати введення пацієнту, якому це необхідно, або для якого існує ризик захворювання, фармацевтичних препаратів, які включають

РРАКу-агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці, наприклад, сполуку формули І, Па або ІБ, наприклад, сполуки 17, 29, 34 або 39. Наприклад, у винаході запропонований спосіб профілактики або лікування фіброзу печінки, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, сполуки за даним винаходом. Як альтернатива, у винаході запропонований спосіб профілактики або лікування фіброзу кишечнику, що включає введення пацієнту, якому це необхідно, сполуки за даним винаходом.

Пацієнти, яких лікують із застосуванням вказаного вище способу, можуть мати або не мати фіброзу, що виявляється. У деяких варіантах здійснення в пацієнта спостерігається зменшення рівня наявного фіброзу, як мінімум, приблизно на 5 95, 10 95, 20 95, 30 95, 40 95 або навіть на 50 95 або більше після введення сполук за даним винаходом, наприклад, сполук 17, 29, 34 або 39, через, наприклад, 1 день, 2 дні, 1 тиждень, 1 місяць або 6 місяців або більше. Уведення згаданої сполуки може здійснюватися, наприклад, щонайменше на щоденній основі. Сполуки можуть вводитися перорально. Відстрочка клінічних проявів фіброзу в пацієнта унаслідок введення сполук за даним винаходом може становити, як мінімум, наприклад, 6 місяців, 1 рік, 18 місяців або навіть 2 роки або більше, порівняно з пацієнтом, якому не вводили згадану сполуку, наприклад, сполуку за даним винаходом.

У пацієнта, якому необхідне лікування, може бути фіброз печінки, що перейшов у цироз.

Пацієнти, у яких є ризик виникнення фіброзу печінки, можуть включати пацієнтів із гепатитом В, гепатитом С або неалкогольним стеатогепатитом (НАСГ). НАСГ входить у коло захворювань, пов'язаних з неалююогольним жировим переродженням печінки, що включає стеатоз і цироз.

НАСГ є складовою частиною метаболічного синдрому, що характеризується ожирінням, цукровим діабетом ІІ типу і дисліпідимією, і може поступово приводити до гепатоклітинної

Зо карциноми.

У даному винаході запропоновані також способи лікування розладів, пов'язаних з фіброзом печінки, наприклад, лікування щонайменше одного захворювання з-поміж деяких хвороб накопичення й уроджених порушень метаболізму, наприклад, дефіциту альфа 1-антитрипсину, хвороб накопичення міді (наприклад, хвороби Вільсона), фруктоземії, галактоземії, хвороб накопичення глікогену (наприклад, ПШ, ІМ, МІ ї Х типів), синдромів перенасичення залізом (наприклад, гемохроматозу), ліпідних аномалій (наприклад, хвороби Гоше), пероксисомних розладів (наприклад, синдрому Цельвегера) і тирозинемії; бактеріальних інфекцій (наприклад, бруцельозу); паразитарних інфекцій (наприклад, ехінококозу); НАСГ; вірусних інфекцій (наприклад, гепатиту В або гепатиту С, включаючи хронічний гепатит В або С); синдрому Бада-

Кіари; серцевої недостатності; захворювань, пов'язаних з оклюзією печінкових вен; і тромбозу ворітної вени. Крім цього, винахід стосується способів лікування уродженого фіброзу печінки.

Композиції, застосовувані в цих способах, можна вводити перорально.

Винахід охоплює також способи лікування наркотичної і/або алкогольної залежності, у випадку, якщо ця залежність приводить до фіброзу печінки. У винаході передбачені способи лікування фіброзу печінки у пацієнта з історією наркотичної і/або алкогольної залежності.

Наприклад, пацієнта з історією залежності принаймні від однієї з наступних речовин: спирту, аміодарону, хлорпромазину, ізоніазиду, метотрексату, метилдопи, оксифенізатину і толбутаміду.

Пацієнти з ризиком фіброзу кишечнику можуть включати пацієнтів з виразковим колітом, запальною хворобою кишечнику або хворобою Крона. Пацієнти з ризиком фіброзу кишечнику можуть також включати пацієнтів раннього віку, у яких діагностована хвороба Крона або коліт, велике і/або важке захворювання ободової кишки, пацієнтів із первинним склерозуючим холангітом і/або пацієнтів з випадками захворювання раком у родині.

У винаході запропоновані також способи лікування розладів, пов'язаних з фіброзом кишечнику, наприклад, лікування як мінімум одного захворювання з-поміж виразкового коліту, запальної хвороби кишечнику або хвороби Крона.

Крім того, даний винахід стосується способів профілактики або лікування фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу або нефрогенного системного фіброзу, що включає введення пацієнту,

якому це необхідно, фармацевтичного препарату, що включає РРАКУу агент, наприклад, сполуку, розкриту в даній заявці.

Сполуки за даним винаходом можуть застосовуватися індивідуально або в комбінації одна з одною, коли як мінімум дві сполуки за даним винаходом застосовуються спільно в одній композиції або як складові частини схеми лікування. Сполуки за даним винаходом можуть також застосовуватися в комбінації з іншими лікарськими засобами для лікування наркотичної і/або алкогольної залежності, фіброзу нирок, фіброзу серця, ендоміокардіального фіброзу, ідіопатичного фіброзу легень, мієлофіброзу, заочеревинного фіброзу або нефрогенного системного фіброзу.

Як правило, терапевтично ефективна кількість діючого компонента буде знаходитися в діапазоні від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, необов'язково від приблизно 1 мг/кг до приблизно 100 мг/кг, необов'язково від приблизно 1 мг/кг до 10 мг/кг. Кількість, що вводиться, буде залежати від таких параметрів, як тип і ступінь захворювання або симптому, яке передбачається лікувати, загальний стан здоров'я конкретного пацієнта, відносної біологічної ефективності доставленого зв'язувального білка, складу зв'язувального білка, наявності і типів ексципієнтів, що входять до складу, а також шляху введення. Спочатку введена доза може перевищувати верхні вказані рівні для швидкого досягнення бажаних рівнів діючої речовини в крові або тканині, або ж первісне дозування може бути менш оптимальним, причому денне дозування можна послідовно збільшувати під час курсу лікування, залежно від конкретної ситуації Дозування препарату для людей можна оптимізувати, наприклад, шляхом стандартного підвищення дозувань під час фази !| клінічного дослідження з охопленням дозувань від 0,5 мг/кг до 20 мг/кг. Частоту введення препарату можна змінювати залежно від таких факторів, як шлях уведення, ввідна кількість і стан або захворювання, що піддається лікуванню. Типовою частотою введення є введення один раз на день, один раз на тиждень і один раз кожні два тижні.

Склади або композиції за даним винаходом включають розкриті в заявці сполуки, а також фармацевтично прийнятний носій.

Сполуки за даним винаходом можна вводити різними шляхами залежно від наміченої мети їхнього застосування, що добре відомо в техніці. Наприклад, якщо композицію за даним

Зо винаходом передбачається вводити перорально, їй можна надати форму таблеток, капсул, гранул, порошків або сиропів. Як альтернатива, склади за даним винаходом можна вводити парентерально у формі ін'єкцій (внутрішньовенних, внутрішньом'язових або підшкірних), препаратів для краплинних інфузій або супозиторіїв. Для введення через слизувату оболонку ока композиціям за даним винаходом можна надати форму очних крапель або очних мазей. Ці склади можна одержувати із застосуванням стандартних засобів і, якщо це бажано, композиції можна змішувати з будь-якими традиційними добавками, наприклад, ексципієнтами, зв'язувальними речовинами, дезінтегруючими агентами, змащувальними речовинами, корегуючими речовинами, солюбілізуючими агентами, суспендуючими засобами, емульгуючими агентами або покривними агентами.

У складах за даним винаходом можуть бути присутніми такі допоміжні агенти, як змочувальні агенти, емульгатори і змащувальні речовини, наприклад, лаурилсульфат натрію і стеарат магнію, а також барвники, агенти, що сприяють вивільненню, покривні агенти, підсолоджувачі, смакові й ароматичні агенти, консерванти й антиоксиданти.

Композиції за даним винаходом можуть бути призначені для перорального, назального, місцевого (включаючи букальне і сублінгвальне), ректального, вагінального, аерозольного і/або парентерального введення. Зручно одержувати склади у вигляді дозованих лікарських форм, і ці форми можна одержувати будь-якими способами, добре відомими у фармацевтичній галузі техніки. Кількість композиції яку можна змішати з носієм для одержання однієї одиниці дозованої форми, змінюється залежно від суб'єкта, що піддається лікуванню, і конкретного шляху введення.

Способи одержання цих складів включають стадію змішування композиції за даним винаходом з носієм і, необов'язково, одним або декількома допоміжними інгредієнтами. Як правило, склади одержують шляхом однорідного і ретельного змішування агентів з рідкими носіями або тонкоподрібненими твердими носіями, або носіями обох типів, з наступним додаванням продукту відповідної форми, якщо це необхідно.

Склади, що підходять для перорального введення, можуть мати форму капсул, крохмальних капсул, пігулок, таблеток, льодяників (в яких використовується смакоароматична основа, звичайно сахароза і гуміарабік або трагакант), порошків, гранул, або розчинів, або суспензій у водних або неводних рідинах, або рідких емульсій масло-у-воді або вода-в-масло, або еліксиру бо або сиропу, або пастилок (в яких застосовується інертна основа, така, як желатин і гліцерин,

або сахароза і гуміарабік), кожна одиниця яких містить попередньо встановлену кількість сполуки за даним винаходом як діючий інгредієнт. Композиції за даним винаходом можна також вводити у формі болюсів, електуарію або пасти.

У твердих дозованих формах для перорального введення (капсулах, таблетках, пігулках, таблетках із плівковим покриттям, таблетках із цукровим покриттям, порошках, гранулах і т. п.) композиції за даним винаходом змішані з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, наприклад, цитратом натрію або дикальцій фосфатом і/або будь-яким з наступних компонентів: (1) наповнювачами або збільшувачами об'єму, наприклад, крохмалями, лактозою, сахарозою, глюкозою, манітом і/або кремнієвою кислотою; (2) зв'язувальними речовинами, наприклад, карбоксиметилцелюлозою, альгінатами, желатином, полівінілпіролідоном, сахарозою і/або гуміарабіком; (3) зволожувачами, наприклад, гліцерином; (4) дезінтегруючими агентами, наприклад, агар-агаром, карбонатом кальцію, крохмалем картоплі або маніоки, альгіновою кислотою, деякими силікатами і карбонатом натрію; (5) агентами, що сповільнюють розчинення, наприклад, парафіном; (6) прискорювачами абсорбції, наприклад, сполуками четвертинного амонію; (7) змочувальними агентами, наприклад, етиловим спиртом і моностеаратом гліцерину; (8) абсорбентами, наприклад, каоліном і бентонітовою глиною; (9) змащувальними засобами, наприклад, тальком, стеаратом кальцію, стеаратом магнію, твердими поліетиленгліколями, лаурилсульфатом натрію і їх сумішами; і (10) забарвлювальними агентами. У випадку капсул, таблеток і пігулок композиції можуть включати також буферні агенти. Тверді композиції аналогічного типу можуть також застосовуватися як наповнювачі у м'яких і твердих желатинових капсулах із застосуванням таких ексципієнтів, як лактоза або молочні цукри, а також поліетиленгліколі високої молекулярної маси і т. п.

Склади і композиції можуть включати тонкоподрібнені кристали сполук за даним винаходом.

Можна здійснювати здрібнювання кристалів індивідуальних сполук або суміші кристалів сполуки за даним винаходом з фармацевтичними ексципієнтами або носіями, або їх частиною. Середній розмір частинок тонкоподрібнених кристалів за даним винаходом може становити, наприклад, від приблизно 5 до приблизно 200 мікронів або від приблизно 10 до приблизно 110 мікронів.

Таблетки можна одержувати пресуванням або формуванням, необов'язково (із застосуванням одного або декількох допоміжних інгредієнтів. Пресовані таблетки можна

Зо одержувати із застосуванням зв'язувальних речовин (наприклад, желатину або гідроксипропілметилцелюлози), змащувальних речовин, інертних розріджувачів, консервантів, дезінтегруючих речовин (наприклад, натрій крохмаль гліколяту або поперечно-зшитої натрій карбоксиметилцелюлози), поверхнево-активних або диспергуючих агентів. Формування таблетки можна одержувати формуванням у придатному агрегаті суміші сполуки за даним винаходом, змоченої інертним рідким розріджувачем. Таблетки й інші тверді дозовані форми, наприклад, таблетки з плівковим покриттям або таблетки з цукровим покриттям, капсули, пігулки і гранули можуть необов'язково мати насічки або оснащені покриттями й оболонками, наприклад, кишковорозчинними покриттями й іншими покриттями, добре відомими в техніці одержання фармацевтичних складів.

Рідкі дозовані форми для перорального уведення включають фармацевтично прийнятні емульсії, мікроемульсії, розчини, суспензії сиропи й еліксири. Крім сполуки за даним винаходом, рідкі дозовані форми можуть містити інертні розріджувачі, традиційно застосовувані в техніці, як, наприклад, вода або інші розчинники, солюбілізуючі агенти і емульгатори, наприклад, етиловий спирт, ізопропіловий спирт, етилкарбонат, етилацетат, бензиловий спирт, бензилбензоат, пропіленгліколь, 1,3-бутиленгліколь, олії (зокрема, бавовняна, арахісова, кукурудзяна, зародкова, оливкова, касторова і кунжутна олії), гліцерин, тетрагідрофурфуриловий спирт, поліетиленгліколі і складні ефіри жирних кислот і сорбітану, циклодекстрини і їх суміші.

Суспензії, крім композиції за даним винаходом, можуть містити суспендуючі агенти, наприклад, етоксильовані ізостеарилові спирти, ефіри поліоксіетилену і сорбіту і сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, метагідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант, а також їх суміші.

Склади для ректального або вагінального введення можуть мати форму супозиторіїв, які можна одержувати змішуванням сполуки за даним винаходом з одним або декількома придатними, не подразнюючими ексципієнтами або носіями, зокрема, наприклад, олією какао, поліетиленгліколем, воском або саліцилатом для супозиторіїв, які є твердими при кімнатній температурі, але рідкими при температурі тіла і, отже, будуть плавитися в порожнинах організму і вивільняти діючий агент. Склади, що підходять для вагінального введення, включають також песарії, тампони, креми, гелі, пасти, піни або спреї, які містять носії, що бо вважаються придатними у фармацевтичній техніці.

Дозовані форми для трансдермального або місцевого введення сполуки за даним винаходом включають порошки, спреї, мазі, пасти, креми, лосьйони, гелі, розчини, пластирі і склади для інгаляції. Діючий компонент можна змішати в стерильних умовах з фармацевтично прийнятним носієм, а також з будь-якими необхідними консервантами, буферами або пропелентами.

Крім сполуки за даним винаходом, мазі, пасти, креми і гелі можуть містити такі ексципієнти, як тваринні і рослинні жири, олії, воски, парафіни, крохмаль, трагакант, похідні целюлози, полієтиленгліколі, силікони, бентоніти, кремнієву кислоту, тальк і оксид цинку, або їх суміші.

Порошки і спреї можуть містити, на додаток до сполуки за даним винаходом, такі ексципієнти, як лактоза, тальк, кремнієва кислота, гідроксид алюмінію, силікати кальцію і поліамідний порошок, або суміші цих речовин. Спреї можуть додатково містити стандартні пропеленти, наприклад, хлорфторвуглеводні і леткі незаміщені вуглеводні, наприклад, бутан і пропан.

Як альтернатива, композиції і сполуки за даним винаходом можна вводити у формі аерозолів. Таке введення здійснюється шляхом одержання аерозолів на водній основі, ліпосомальних препаратів або твердих частинок, що містять сполуку за даним винаходом.

Можна застосовувати не водні суспензії (наприклад, які включають фторвуглецевий пропелент).

Можна застосовувати ультразвукові інгалятори, оскільки в них здійснюється мінімальний механічний вплив на лікарський агент, що може приводити до руйнування сполук, які містяться в композиціях за даним винаходом.

Як правило, водні аерозолі одержують шляхом формування водного розчину або суспензії композиції за даним винаходом в комбінації з традиційними фармацевтично прийнятними носіями і стабілізаторами. Можна змінювати носії і стабілізатори відповідно до вимог до конкретної композиції за даним винаходом, але, як правило, ці компоненти включають неїонні

ПАР (Туееп5, Ріигопіс5 або поліетиленгліколь), нетоксичні білки, наприклад, альбумін сироватки, складні ефіри сорбітану, олеїнову кислоту, лецитин, амінокислоти, наприклад, гліцин, буфери, солі, цукри або цукрові спирти. Як правило, аерозолі одержують з ізотонічних розчинів.

Фармацевтичні композиції за даним винаходом, які підходять для парентерального

Зо введення, включають власне композицію в комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними стерильними ізотонічними водними або неводними розчинами, дисперсіями, суспензіями або емульсіями, або стерильні порошки, які можна відновити до стерильних розчинів або дисперсій для ін'єкції безпосередньо перед застосуванням, що можуть містити антиоксиданти, буфери, бактеріостатичні засоби, розчинені компоненти, які роблять склад ізотонічним крові наміченого реципієнта, або суспендуючі або загущувальні агенти.

Приклади придатних водних і неводних носіїв, що можуть застосовуватися у фармацевтичних композиціях за даним винаходом, включають воду, етанол, поліоли (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь і т. п.) і їх придатні суміші, рослинні олії, наприклад, оливкова олія, і придатні для ін'єкцій органічні складні ефіри, наприклад, етилолеат і циклодекстрини. Необхідну плинність складу можна підтримувати, наприклад, застосуванням покривних матеріалів, таких, як лецитин, підтримкою необхідного розміру частинок у випадку дисперсій, а також застосуванням ПАР. Ефективність лікування композиціями за даним винаходом можна визначити рядом способів, відомих фахівцю в даній галузі техніки.

У тексті даного опису, якщо вказано, що композиція має, включає або містить визначені компоненти, мається на увазі, що композиція також складається в основному з, або складається зі згаданих компонентів. Аналогічно, якщо вказано, що спосіб має, включає або містить визначені стадії, цей спосіб також складається в основному з, або складається зі згаданих стадій. За винятком випадків, коли вказане інше, порядок стадій або порядок здійснення визначених дій є несуттєвим, якщо винахід залишається працездатним. Крім того, якщо не вказане інше, дві або кілька стадій або операцій можуть здійснюватися одночасно.

ПРИКЛАДИ

Даний винахід додатково проілюстрований наступними прикладами. Ці приклади наведені тільки з ілюстративними цілями, і не потрібно вважати, що вони яким-небудь чином обмежують обсяг даного винаходу.

Приклад 1: дослідження фіброзу печінки

Фіброз печінки викликали в самців мишей С57БІ6 (Спагіез Кімег, ГТАгігевіє, Егапсе) ін'єкцією чотирихлористого вуглецю (ССіл-). Перед експериментом мишей С57рІіб масою 22-25 утримували в лабораторних умовах протягом 1 тижня. Тварин розселяли по 5 особин у клітці, 60 причому їжа і вода були доступні без обмежень.

У дослідженні було задіяно 5 тестових груп (дивитися таблицю 1): контрольна група з примусовим пероральним уведенням (СС), контрольна група з інтраперитонеальним уведенням (СІР), група, що одержувала чотирихлористий вуглець (ССІ4), групи, що одержували сполуку 34 і

УМ Н-133 (дивитися Диїеп еї аї!., (2005) СазігоепіегоІоду 128: 742-755 (для ознайомлення з УМ/Н- 133, СВ2-специфічним агоністом і антифіброгенним агентом)).

Таблиця 1

Контроль, примусове Розчин карбоксиметилцелюлози (носій для . : ща тижнів мишей) оливкова олія (носій для ССіІ4 інтраперитонеальне : ще .

М оливкова олія (носій для ССів) тижнів введення (5 мишей) - й (кожні два дні) (10 мишей) інтраперитонеальним шляхом (200 мкл) . протягом 25 тижнів 30 мМ розчин сполуки 34 у 0,5 95 СМС 34: Щодня протягом 5

Й вводили шляхом перорального тижнів:

Сполука 34 (10 мишей) примусового годування (200 мкл), і ССіх у СС: З рази на тиждень оливковій олії вводили : й протягом 25 тижнів інтраперитонеальним шляхом (200 мкл)

З мг/кг УМУН-133 у ДМСО/ жмееп вводили УМН: Щодня протягом -х | інтраперитонеальним шляхом (100 мкл), і |/|»5 тижнів;

Агент УМУН-133 (10 мишей) СОЇ у у оливковій олії вводили Сбіл: З рази на тиждень інтраперитонеальним шляхом (200 мкл) протягом 25 тижнів

Оцінювали ефективність сполуки 34 (специфічний ліганд РРАКаЯ) порівняно з УММН-133 (антифіброгенним агентом). Сполуку 34 вводили перорально в комбінації з ін'єкціями СсСід протягом приблизно 5 тижнів. Сполуку 34 вводили щодня в кількості 200 мкл 30 мМ розчину.

УМ/Н-133 вводили щодня шляхом інтраперитонеальної ін'єкції в кількості З мг/кг (об'єм ін'єкції-100 мкл). Модельний фіброз печінки викликали постійною дією збільшуваних доз СсСід протягом 5 тижнів. На першому тижні миші одержували інтраперитонеальну ін'єкцію СеСі», суспендованого в оливковій олії в дозуванні 80 мкл/кг маси тварини два рази на тиждень.

Протягом 2-ого тижня здійснювали З ін'єкції ССІї. у дозуванні 160 мкл/кг один раз на два дні.

Протягом 3-ого тижня здійснювали З ін'єкції ССІї у дозуванні 240 мкл/кг один раз на два дні.

Протягом 4-ого тижня здійснювали З інтраперитонеальні ін'єкції ССІх у дозуванні 320 мкл/кг один раз на два дні. На 5-ий тиждень через З дні після останнього введення ССі- мишей піддавали евтаназії.

Під час проведення експерименту реєстрували масу тіла тварин. Як видно на фіг. 1, не існує помітної різниці між зміною маси тіла в різних групах мишей.

Витягували печінку тварин, здійснювали швидке заморожування аліквот тканини печінки в рідкому азоті і зберігали при -809С до проведення аналізу. Частину печінки кожної тварини фіксували в 10 95 формаліні для гістологічного дослідження.

Приклад 2: гістологічний аналіз у дослідженні фіброзу печінки

Фіксовану у формаліні тканину печінки піддавали необхідній обробці і парафіновані зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином (НУЗЕ), а також обробляли барвником пікросиріус червоний (специфічне забарвлення для виявлення колагену на зрізах тканин) для оцінки ступеня фіброзу в печінці. Кожен препарат оцінювали три різні дослідники, що не мали

Зо даних про його походження, для кількісного визначення ступеня фіброзу в кожній частці печінки (5), використовуючи шкалу Меїаміг (див. фіг. 2А, на якій наведений графік результатів за шкалою Меїаміг). Фотографічні зображення, показані на фіг. 28, одержували за допомогою 20х об'єктива. Контрольна група мала результат БО, і група, що одержувала Ссі":, продемонструвала результат ЕЗ, який вказує на наявність фіброзу печінки. Сполука 34 (СЕВО) продемонструвала сильніше зменшення фіброзу, порівняно з групою УМ/Н-133, з результатами відповідно Е1 для сполуки 34 і Е2 для УМУН-133.

Як і очікувалося, фіброз не спостерігався в двох групах контрольних мишей (контрольне примусове пероральне введення носіїв (СО) і контрольне ІР уведення носіїв (СІР)). У групі мишей з фіброзом (група ССІх), що одержували тільки носій, був зареєстрований середній результат 2,5:20,5, що відповідає фіброзу в ступені від помірного до важкого відповідно до шкали Меїаміг (див. фіг. ЗА). Для мишей з фіброзом, що одержували УМУ/Н-133 або сполуку 34 (СЕВО), були зафіксовані результати 20 і 2,140,2 відповідно. Для обох препаратів, тобто УМУ/Н- 133 ї СЕО, спостерігалося зменшення ступеня фіброзу з важкого до помірного з приблизно аналогічною ефективністю.

Ці результати підтверджували з використанням адаптованої шкали Мегїаміг (фіг. З В); кожен зріз печінки аналізували 2 дослідники, які не мали даних про його походження, з метою кількісної оцінки при низькому збільшенні (х5) більше 30 препаратів портальних трактів, класифікованих за шкалою Меїаміг від БО до Б4 (результат (для 1 зрізу)-хУ (РТЕ14РТЕ22РТЕЗАРТЕ4)). З використанням одержаних результатів було продемонстровано, що УМ/Н і СЕО знижували ступінь фіброзу на 14,2 9б5 і 12,5 95 відповідно, порівняно з тваринами, які не одержували препаратів, і що терапевтична дія двох протестованих речовин була приблизно однаковою.

Приклад 3: аналіз експресії генів у дослідженні фіброзу печінки

Визначали вплив уведення сполуки 34 (СЕБ) і специфічного агоніста СВ2 (УМ/Н-133) на рівень експресії генів цитокінів (І--18, ТМЕ-а) і генів, залучених у механізм розвитку фіброзу, за допомогою реакції РОК у режимі реального часу.

РНК повністю ізолювали з печінки, використовуючи набір Кпеазу (Маспегеу Мадеї, Ноегаї,

Егапсе) відповідно до інструкції виробника. Кількісне визначення РНК здійснювали з використанням спектрофотометрії. Після обробки при 37 С протягом 30 хвилин 20-50 одиницями ОМабзе 1 (дезоксирибонуклеази 1), яка не містить КМазе (рибонуклеази) (Коспе

Оіадповійс5 Согрогайоп, Іпаіапароїї5, ІМ, О5БА), використовували оліго-4ї праймери (Коспе

Оіадповійс5 Согрогайоп, Іпаіапароїїх5, ОБА) для синтезу одноланцюгової кДНК. Кількісне визначення мРНК здійснювали з використанням суміші ЗУВК дгееп Мабзієг Міх (Аррієга,

Соипаброецшї, Егапсе) зі специфічними для мишей олігонуклеотидами (див. таблицю 2) у термоциклері СепеАтр Абіргізт 7000 (Арріега, Сошгпароеці, Егапсе). У кожен аналіз включали калібровані і такі, що не містили матриці, контрольні зразки. Для кожного зразка проводили три паралельні аналізи. Інтенсивність барвника ЗУВЕ. дгееп визначали за допомогою програмного забезпечення Абіргізт 7000 505 (Аррієега, Соипароеші, Егапсе). Усі результати нормалізували

Зо за конститутивним геном р-актину, не залученим в аналітичні реакції.

Таблиця 2

Е5У во ТСАвААвроАТТОССТАТ»-3" (БЕО ПО МО: 1) р-актин КЕ У-я6ТСТСАААСАТеАТСТов-3" (5ЕО І МО: 2)

ТМЕ ЕУ-Теве Ав ТАвАСААвсоТАСААССС-3" (ЗЕОО МО: З) ч КУ САТСТІТСТСААААТТСеАвТеАСАА-3У" (5ЕО О МО: 4)

ЕУ-"АТССАСАСТСТОССА»СТеСА-3" (5ЕО ІЮ МО: 5) пр В:5-СААССААСААеТеАТАТТСТССАТо-3" (8ЕО І МО: 6) і Е: 5- САС ТАС ТО АТС САС ССТ ААС САА -3" (ЗЕОСИЮ МО: 7) колаген В: 5'- АСА САС СТС ТОА ССТ ОТО ТОСАТ-3 0 (ВЕ ПО МО: 8) а-9МА Е У- ССТ САС ССО САС СТО АТС -3 (ЗЕО І МО: 9)

КІУ- АТО ААА САТ СОС ТО ДАО АСА ОТ ТТ -3" (5БОЮ МО: 10)

У різних групах мишей не спостерігалося значних змін експресії генів цитокінів. Що стосується генів, залучених у механізм розвитку фіброзу, мало місце помітне збільшення експресії 5МА і колагену-ї у тварин з фіброзом (ССі- група) порівняно з контрольними тваринами (СО і СІР групи). Як можна бачити на фіг. 4 і в таблиці 3, у групах мишей, які одержували СЕО і УМУН-133, мало місце зниження рівнів -З5МА і колагену-1 порівняно з ССід групою (контрольною групою з фіброзом). Що стосується рівня колагену-1, зниження було статистично значущим для групи мишей, що одержували сполуку 34, порівняно з мишами, що одержували СсСі», з результатами, відповідно 42,8:214,81, р-0,03 проти 75,15:255,23. Ці біологічні дані, поряд з поліпшенням результатів гістології в мишей, які одержували сполуку 34, дають підставу припустити, що сполука 34 може мати терапевтичні анти-фібротичні властивості.

Таблиця З

Приклад 4: визначення ферментів печінки в крові в дослідженні фіброзу печінки

Оцінювали вплив перорального введення сполуки 34 (ЗЕ) і специфічного агоніста СВ2 (УМ/Н-133) на різні біохімічні параметри сироватки мишей, пов'язані з печінкою, а саме: рівні печінкових ферментів (аланінамінотрансферази (А5Т) і аспартатамінотрансферази (АЇЛТ)), гамма СТ і лужної фосфатази.

Як і очікувалося, через 4 дні після останнього введення ССіїх, у всіх групах мишей не спостерігалося збільшення рівнів А5Т, АТ і АЇК Р. Сполука 34 не викликала якого-небудь підвищення рівнів печінкових ферментів у крові, що вказує на відсутність токсичності для печінки.

Згідно з даними гістології і дослідження печінкових маркерів, УМУН-133 і сполука 34 мають подібну анти-фібротичну дію в мишей з фіброзом печінки, викликаним багаторазовими ін'єкціями ССіл. Як і очікувалося, УМУН знижував ураження печінки фіброзом на 1495 і нормалізував концентрацію мРНК колагену-1 у печінці. Сполука 34 здійснювала аналогічну дію, не виявляючи токсичності відносно печінки. Ці дані дозволяють припустити, що сполука 34 може бути першою сполукою, яка виявляє як протизапальні, так і анти-фібротичні властивості.

Приклад 5: дослідження фіброзу кишечнику

У цьому прикладі описаний експеримент для оцінки впливу сполуки 34 на фіброз кишечнику.

Хронічний коліт викликали в мишей С57ріІб, здійснюючи З цикли введення 2,5 95 055 (декстран сульфату натрію) (М.маса 40 000-50 000, ТаВв сопзиКапсу АВ, Буледеп), розчиненого в стерильній питній воді протягом 5 днів, з наступним прийомом звичайної питної води протягом 7 днів.

У дослідженні були задіяні З тестові групи (дивитися таблицю 4): контрольна група, контрольна група, яка одержувала 055, група, яка одержувала сСЕО (сполуку 34).

Таблиця 4 5 днів уведення О55, 7 днів 055 контрольна група 2,5 956 055 у питній НгО відсутність О55 протягом 36 (25 мишей) днів здійснювали пероральне введення 30 мМ | спол. 34: щодня в дні 13-36; сполука 34 (25 мишей) розчину сполуки 34 у 0,5 96 СМС за р: 5 днів уведення 055, 7 допомогою примусового годування (200 |днів відсутність О55 мкл) і 2,5 96 055 у питній НгО протягом 36 днів

Сполуку 34 використовували в оптимальному дозуванні (30 мм) і здійснювали пероральне введення шляхом примусового годування щодня після другого циклу введення О55 і до моменту здійснення евтаназії. Мишей, які одержували Ю55, обстежували двічі на тиждень,

Зо виявляючи розвиток коліту шляхом спостереження за масою тіла. Евтаназію мишей здійснювали через один тиждень після третього циклу введення 055 (див. фіг. 5). Здійснювали посмертне визначення розміру і маси ободової кишки мишей.

Приклад 6: аналіз результатів дослідження фіброзу кишечнику

А: співвідношення маса/розмір ободової кишки

Фіброз кишечнику характеризується зменшенням довжини і стовщенням ободової кишки, а також утворенням спайок. Величина співвідношення маса/розмір ободової кишки є індикатором рівня запалення і фіброзу. Як видно на фіг. бА, статистично значуще збільшення на 124 95 співвідношення маса/розмір ободової кишки спостерігалося в мишей ОЮ55, які одержували носій, порівняно з контрольними мишами, які одержували тільки звичайну воду, при значеннях вказаного співвідношення відповідно 44,9826,31 і 20,11-3,91, р«0,05. Ці результати ілюструються істотним скороченням довжини ободової кишки в 55 мишей (фіг. 6В). Сполука 34 викликає 34 95 зменшення профібротичної дії 055, приводячи до значного зменшення співвідношення маса/розмір ободової кишки, при значеннях вказаного співвідношення 38,13257,82 проти 44,98:26,31 (р«е0,05), порівняно з 055 мишами, які одержували тільки носій (фіг. бА). Відповідно, сполука 34 зменшує морфологічні ознаки фіброзу, такі, як зменшення довжини і стовщення ободової кишки, а також зменшує відкладення колагену в ободовій кишці (фіг. 68).

В. Рівень запалення за даними гістологічних досліджень

Відбирали кільцеві зразки поперечної ділянки ободової кишки (посмертно), фіксували в 4 95 формальдегіді і заливали парафіном для гістологічного аналізу. Зрізи (товщиною 4 мкм) забарвлювали барвником Мея-Грюнвальда-Гімзи і проводили мультипараметричну гістологічну оцінку (результат від 0 до 18) із залученням двох дослідників, які не були інформовані про походження препаратів. Проведене забарвлення давало можливість кількісної оцінки запалення. Гістологічні бали, що відбивають рівень запалення, привласнювали, виходячи з інтенсивності клітинного інфільтрату в слизуватій оболонці, його поширення в шари підслизуватої оболонки і наявності уражень епітелію (див. таблицю 5).

Таблиця 5 - Ж 1 легкий ступінь вага пе . 2 помірний ступінь

З важкий ступінь тешнн | 0 нн 1 слизувата оболонка поширення 27. 2 слизувата і підслизувата оболонки

З наскрізне 4 немає відновлення тканин

З ушкоджено поверхневий епітелій регенерація 2 регенерація з виснаженням кишкових крипт 1 практично повна регенерація 0 повна регенерація або нормальна тканина 0 відсутнє 1 уражена нижня 1/3 ураження крипт 2 уражені нижні 2/3

З не зачеплений тільки поверхневий епітелій 4 повна втрата крипт і епітелію 1 1-25 95 процентна частка 2 26-50 Фо уражених тканин З 51-75 95 4 76-100 95

Ступінь запалення оцінювали на гістологічному рівні для кожного зразка ободової кишки миші, використовуючи класичне забарвлення МО. Як і очікувалося, значне і сильне запалення спостерігалося в групі мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду, при значеннях 3,77-0,80 проти 0,50-0,33, р«е0,05 (див. фіг. 7). Цей результат підтверджує, що З цикли введення Ю55 викликають запалення. Статистично значуще зниження рівня запалення спостерігалося в 055 мишей, які одержували сполуку 34, порівняно з мишами 055, які одержували тільки носій, при значеннях відповідно 2,18:20,48 проти 3,77-0,80, р-0,05.

С. Рівень фіброзу

С1. Оцінка при забарвлюванні барвником пікросиріус червоний

Одержані зразки тканин кишечнику швидко фіксували 10 95 буферованим формаліном у РВ5 (рН 7,4) протягом З год., дегідратували в очищеному етанолі і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Фіксовані формаліном тканини ободової кишки піддавали необхідній

Зо обробці і парафінові зрізи товщиною 5 мкм забарвлювали барвником пікросиріус червоний для гістологічного аналізу. Зображення препаратів одержували з використанням об'єктива х20.

Кожен зріз був досліджений З різними експериментаторами, які не мали інформації про його походження, для кількісної оцінки ступеня фіброзу з використанням балів від 0 до 4.

Статистично значуще збільшення рівня фіброзу спостерігалося в ободовій кишці 055 мишей порівняно з контрольними мишами при сумі балів відповідно 2,27520,12 проти 1,12:20,07 (див. фіг. 8). Цей результат підтверджує, що хронічне запалення, викликане З циклами введення Ю55, приводить до фіброзу кишечнику. Дані експериментів підтверджують також, що введення сполуки 34 мишам 055 знижує рівень фіброзу порівняно з мишами О55, які одержували тільки носій (1,625:0,15 проти 2,2750,12, р«0,05).

С2. дослідження із застосуванням забарвлення трихромом за Масоном

У даній оцінці рівня фіброзу ободової кишки застосовували забарвлення трихромом за

Масоном і забарвлення колагену. Одержані зразки ободової кишки швидко фіксували 10 95 буферованим формаліном у РВ5 (рН 7,4) протягом З год., дегідратували в очищеному етанолі і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Послідовно одержані З мкм зрізи інкубували протягом 40 хвилин у метанолі і З 95 розчині пероксиду водню, після чого промивали

РВ5. Фіброз кишечнику оцінювали в термінах "відсутність", "помірний" або "важкий" залежно від густини і поширеності забарвлення трихром-позитивної сполучної тканини, а також порушення структури тканини.

С3. визначення рівнів колагену

Для здійснення імуногістохімічного аналізу, зразки тканин з ободової кишки фіксували у свіжому 4 95 розчині параформальдегіду (РЕА) у РВЗ протягом З год. при кімнатній температурі, дегідратували в декількох порціях очищеного етанолу і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Зрізи товщиною З мкм інкубували в метанолі протягом 40 хв. і потім у

З 96 пероксиді водню протягом 5 хв. Зразки інкубували протягом ночі зі специфічними антитілами проти колагену типів І-І (Абсат), фактора росту сполучної тканини (СТОР) (Абсат), тромбоцитарного фактора росту (РОСЕ), ЗМАЮ2/3, тобто основних маркерів фіброзу. Зразки промивали РВ5 протягом 5 хв. і інкубували зі стрептавідин-біотин-пероксидаза кон'югованим вторинним антитілом (ШаКко ЗАВ Согрогайоп, код КОб75, БаКо-Суїотацоп, Мііїапо). Після промивання РВ5 протягом 10 хвилин зрізи піддавали інкубуванню з 3,3-діамінобензидин тетрагідрохлоридом протягом 1-3 хвилин.

Специфічність імунної реакції визначали, пропускаючи обробку первинними антитілами. На завершення зразки забарвлювали гематоксиліном Майєра і досліджували за допомогою

Зо світлового мікроскопа ОїІутрив ВХ51 Гідні Місгозсоре (ОіІутривз, Оріїса! Со., Ца., ТоКуо, щдарап).

В імуногістохімічному аналізі (х20) колагенів І-МІ у зразках ободової кишки 055 і контрольних мишей, забарвлення колагенів І-МІ у товстому кишечнику 055 мишей було локалізоване головним чином у сполучній тканині підслизуватого шару і м'язової оболонки, де спостерігалося сильне забарвлення колагену (див. фіг. 9). Як показано на фіг. 9, уведення сполуки 34 пов'язане зі зменшенням забарвлення колагену, що вказує на зменшення фіброзу й ослаблення поширення фіброзу кишечнику.

На додаток до протизапальної дії, уведення сполуки 34 швидко ослаблює явища, які ведуть до фіброзу, на молекулярному рівні і попереджає фібротичне ураження кишечнику в мишей, викликані О55.

Для проведення Вестерн-блотингу, 0,5 см заморожених зразків ободової кишки гомогенізували в буфері КІРА, що містить 50 мМ Ттгі5 НСІ рН 7,6, 150 мМ Масі, 1,5 мм Масі», 5

ММ ЕОТА, 195 Тийоп-Х і 1095 гліцерину з добавкою 100 мМ фториду натрію (Має), 2 мМ ортованадату натрію (МазмО»), 10 мМ пірофосфату натрію (МарРРі), 1 мМ фенілметансульфону (РМ5БЕ) і класичної суміші інгібіторів протеази, що містить 10 мкг/мл леупептину й апротиніну.

Для кожного зразка 30 мг білка виділяли за допомогою РАСЕ і розділяли електрофорезом.

Мембрани з нітроцелюлози (з чистотою 100 95) інкубували (відповідно до окремого протоколу для кожного антитіла) з первинними антитілами, спрямованими проти СТОБЕ, колагену-ї і

САРОН (придбаними в Абсат, Сатрьгідде, ОК; 1:1000 протягом 2 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,195 ТВ5-ї. Потім мембрани промивали 0,1 95 ТВ5-ї і інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (анти-кролячим і анти-мишачим;

Зідта Аїагісп; 1:20000 протягом 1 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,1 95

ТВ5-ї. На завершення здійснювали імунологічний аналіз із хемолюмінісцентним субстратом зирегзідпа! УУебі Рісо (Тпепто зЗсіепіййс Ріегсе, Егетродедет) відповідно до протоколу виробника. Мембрани реєстрували на ауторадіографічну плівку (Еції Рпоїо Рйт Со., би5зеїдоті,

Септапу). Оптичну густину цільових смуг визначали за допомогою денситометра з комп'ютерним керуванням і загальнодоступною програмою Ітадеу (М/.5.,Вазбрапа, Ітаде,

И.5.Маїйопаї! Іпзійшев ої Неанй, Веїйезаа, МО; пир://15Б.іпго.пій.дом/|/, 1997-2011). Рівні молекул, які цікавлять, у тканинах виражали в одиницях оптичної густини (00) відносно загальної кількості білка, нормалізованого за внутрішнім контролем САРОН, і результати виражали в 60 процентних частках відносно контрольної групи.

Використовуючи ІГХ (імуногістохімічні) методики і специфічні антитіла, спостерігали зменшення рівнів основних маркерів фіброзу (колагену І-Ш, СТОР, 5МАО 2/3, РОСЕ, а-ЗМА і такг-В1) в ободовій кишці 055 мишей, які одержували СЕО, порівняно з мишами з колітом, які одержували носій (див. фіг. ЗА-9Е).

Ці результати підтверджували з використанням методики Вестерн-блотингу, і кількісне визначення різних маркерів фіброзу проводили на цілісних зразках ободової кишки (дивіться фіг. 10). Як можна бачити з даних таблиці 6, значуще ослаблення експресії колагену І, СТОК і

І/-13 спостерігалося в мишей з колітом, які одержували СЗЕО, порівняно з мишами, які одержували тільки носій (колаген !| 90,75:2419,91 проти 284,4:63,86, р-0,012; для СТО 55,75:217,53 проти 115,1216,88, р-0,029; і для 1-13 88,88:-14,0 проти 189,5:28,71, р-0,007).

Таблиця 6 1111111 Ї7771111111055... | о555БО | -::( Р

Приклад 7: дослідження фіброзу кишечнику

У цьому прикладі описаний експеримент з оцінки ефекту сполуки 34 (СЗЕБО) при лікуванні фіброзу кишечнику.

Матеріали і методики

Експерименти іп мімо

У дослідженні використовували в цілому 60 мишей С57ВІ /6 дикого типу, придбаних у фірми

Уапмієг (Ге Сепеві-5І-ІзІе, Егапсе). Усіх мишей утримували на спеціальному кормі, вільному від патогенів, Інституту Пастера в Ліллі (Франція). Експерименти над тваринами проводили відповідно до урядових директив Мо 68/609/СЕЕ.

Провокування хронічного коліту

Хронічний коліт і фіброз у мишей викликали шляхом перорального введення 2,5 95 (маса/об'єм) 055 у питній воді протягом трьох циклів (5 днів 055, 7 днів вода). Щодня стежили за споживанням їжі і рідини тваринами, і зважували їх на початку дослідження і потім регулярно кожні три дні.

План експерименту

Мишей випадковим чином ділили на дві групи: і. групу, що одержувала О55, і ії. групу, що одержувала О555-0Е0О. Кожна група складалася з 25 мишей і результати цих груп порівнювали

Зо з результатами для 10 контрольних тварин, які одержували тільки воду. СЕО (30 мг/кг/імиша) розчиняли в розчині, що містить 0,5 95 натрієвої солі карбоксиметилцелюлози (СМС; мол. маса: 90 000 Дальтон; 5ідта Аїагістп) ії 1 95 Тмееп 80, і щодня вводили за допомогою примусового годування через рот (100 мкл/миша). ЗЕО вводили на початку другого циклу.

Оцінка перебігу коліту

Здійснювали щоденне спостереження за тваринами, визначаючи споживання рідини, зміну маси і виявляючи ознаки коліту, зокрема утрату маси, діарею, кровотечу з прямої кишки і випадання прямої кишки, а також симптоми системного запалення, наприклад, пілоерекцію, в'ялість і утворення навколоочноямкових ексудатів.

Відбір і приготування препаратів

На завершення експерименту, через сім днів після останнього циклу введення 055, тварин усіх груп умертвляли зміщенням шийних хребців під глибокою анестезією СО» і здійснювали розкриття черевної порожнини. Знаходили пряму кишку і швидко висікали її. Визначали сумарну довжину ободової і прямої кишки і вимірювали масу дистального відрізка ободової і прямої кишки довжиною 8 см.

Дослідження макроскопічних і мікроскопічних уражень ободової кишки

Макроскопічні ураження ободової кишки, включаючи дилатацію (розширення), стовщення і стеноз, оцінювалися незалежними спостерігачами, які не мали інформації про препарати, уведені мишам. Зразки тканин з ободової кишки висікали, негайно заморожували або фіксували у свіжоприготовленому 4 95 розчині формальдегіду (БА) у РВ5 протягом З годин при кімнатній температурі і потім заливали парафіном за стандартною методикою. Залиті парафіном тканини, розділені на поперечні зрізи товщиною З мкм, піддавали забарвленню гематоксиліном/еозином для оцінки ступеня запалення і здійснювали забарвлення трихромом за Масоном для більш точної оцінки наявності сполучної тканини і фіброзу. Потім забарвленні зрізи спостерігалися двома патоморфологами, не обізнаними про їх походження, з використанням світлового мікроскопа ОіЇутри5 ВХ51 (ОІутривз, Оріїса! Со. Ца., ТоКуо, дарап), що здійснювали гістологічну оцінку в балах за наступною шкалою: і. наявність виразок (О-відсутність, 1-невеликі виразки, 2 великі виразки); ії. ступінь запалення (0-відсутність, 1-невелике, 2-помірне і З-важке); ії. глибина ураження (О-відсутність уражень, 1-ураження поширюються в підслизувату оболонку, 2хураження в м'язовій оболонці і З-ураження в серозній оболонці); ім. ступінь розвитку фіброзу (О-відсутній, ї-легкий, 2-помірний і З-важкий). Ступінь запалення кишечнику оцінювали за густиною і величиною хронічного запального інфільтрату, втратою келихоподібних клітин і стовщенням стінки кишечнику. Загальну суму балів при мікроскопічному дослідженні одержували у вигляді суми балів за окремими позиціями (максимально можлива сума-10).

Фіброз кишечнику оцінювали, як відсутній, легкий або важкий залежно від густини і площі забарвлення трихром-позитивної сполучної тканини і руйнування структури тканини.

Імуногістохімічні дослідження

Зразки тканини ободової кишки, висічені і зафіксовані у свіжому 4 95 розчині формальдегіду (ГА) у РВ5 протягом З годин при кімнатній температурі, дегідратували в декількох порціях очищеного етанолу і заливали парафіном з низькою температурою плавлення. Зрізи товщиною

З мкм інкубували в розчині метанолу і З 95 пероксиду водню протягом 45 хвилин.

Зразки інкубували протягом ночі зі специфічними антитілами проти альфа-актину гладких м'язів (Ї-ЗМА, Абсат), колагену типів І-Ш (Абсат), ТИБ-В1 (Абсат), фактора росту сполучної тканини (СТОР) (Абсат), р5таазЗз і 5тааз (Сеї! Бідпаїйп9д), Зтаа7 (Ітдепех), РРАКУ (Сеїї

Зідпаїїпо). Зразки промивали РВ5 протягом 5 хвилин і інкубували зі стрептавідин-біотин- пероксидази кон'юЮюгованим вторинним антитілом (бако ЗАВ Согрогайоп, код КОб675, Бако-

Суїотаїйоп, Мііапо). Після одного промивання РВЗ протягом 10 хвилин зрізи інкубували з 3,3- діамінобензидин-тетрагідрохлоридом протягом 1-3 хвилин. Контрастне забарвлювання ядер здійснювали за допомогою гематоксилін еозину. Специфічності імунної реакції домагалися, усуваючи первинні антитіла. На завершення зразки забарвлювали гематоксиліном Майєра і спостерігали з використанням світлового мікроскопа Оіїутри5 ВХ51 (ОІутриз, Оріїса! Со. ЦЕ.,

ТоКуо, дарап).

Зо Вестерн-блотинг

Відрізали 0,5 см зразки замороженої ободової кишки і механічним шляхом гомогенізували в буфері КІРА, який містить 50 мМ Тті5 НСІ рН 7,6, 150 мМ Масі, 1,5 мм Маосі», 5 мМ ЕОТА, 1 95

Тийоп-Х і 10 95 гліцерину з добавкою 100 мМ фториду натрію (Маг), 2 мМ ортованадату натрію (МазуО4), 10 мМ пірофосфату натрію (МаРРі), 1 мМ фенілметансульфону (РМЗБЕ) і класичної суміші інгібіторів протеази, що містить 10 мкг/мл леупептину й апротиніну.

З кожного зразка виділяли 30 мг білка за допомогою РАСЕ і розділяли електрофорезом.

Мембрани з нітроцелюлози 100 95 чистоти інкубували (відповідно до окремого протоколу для кожного антитіла) з первинними антитілами, спрямованими проти ТОБ-В1, СТОЕ, а-З5МА, колагену-І і ЗАРОН (придбаними в Абсат, Сатьгідде, ОК; 1:1000 протягом 2 год. при кт) і І -13 (придбаного в Апііродіе5 опіїпе; 1:1000 протягом 2 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,195 ТВ5-ї. Потім мембрани промивали 0,195 ТВ5-ї і інкубували з вторинними антитілами, кон'югованими з пероксидазою хрону (анти-кролячим і анти-мишачим; 5Зідта

Аїдгісп; 1:20000 протягом 1 год. при кт), розведеними 5 95 знежиреним молоком у 0,1 95 ТВ5-ї.

На завершення здійснювали імунологічний аналіз із хемолюмінісцентним субстратом зирегзідпа! УМевзі Рісо (Тпегто зЗсіепіййс Ріегсе, Егетродедет) відповідно до протоколу виробника. Мембрани реєстрували на ауторадіографічну плівку (Рції Рпоїо Ріїт Со., Би5зеїдогі,

Септапу). Оптичну густину цільових смуг визначали за допомогою денситометра з комп'ютерним керуванням і загальнодоступною програмою Ітадеу (М/.5.,Вазбрапа, Ітаде,

И.5.Маїйопаї! Іпзійшев ої Неанй, Веїйезаа, МО; пир//т5Б.іпто.пін.дом/)/, 1997-2011). Рівні молекул, які цікавлять, у тканинах виражали в одиницях оптичної густини (00) відносно загальної кількості білка, нормалізованого за внутрішнім контролем САРОН, і результати виражали в процентних частках відносно контрольної групи.

Експерименти іп мімо

Клітинні культури

Клітини лінії раку ободової кишки людини НТ-29 (АТОС НТВ-38) і фібробласти ободової кишки людини (АТСС питап СВВ-18 со) вирощували в середовищі Ігла, модифікованому

Дульбеко (ОМЕМ) і альфа-модифікованому середовищі Ігла, відповідно, що включали 100

Од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину з додаванням 10 95 ембріональної сироватки телят (ЕВ5). Клітинні культури утримували у вологій атмосфері, яка складалася з 95 9о повітря і 5 Фо 60 Со», при 3726.

Одержання клітин з пригніченою експресією РРАКУ

Клітини НТ29 з пригніченою експресією РРАКу одержували з використанням системи рРЗОРЕК.сгеїго (ОіідоЕпдіпе). Прямі і зворотні цільові послідовності, що відповідають нуклеотидам 105-123 МРНК РРАКУу людини (5-А4СССТТСАСТАСТаттТалдс-з3) (5ЕО І МО 11)), клонували в сайти рестрикції ВоПШ/Хпо! вектора реШРЕКгеїго (рКк5), одержуючи генетичну конструкцію 5ПРРАК. Також як негативний контроль одержували плазміду рК5, яка включає послідовність 5-АСасСстаАсаТАСТТССАААТ-3 (5БО 10 МО:12), націлену проти гена люциферази (генетичну конструкцію ЗП ис). Обидві конструкції трансфікували в клітини НТ-29 і

Сасо-2 з використанням технології Мисіеоїтесіог фірми АтахаВіозубєієет5 відповідно до протоколу виробника. Стійко трансфіковані клони відбирали через 24 години після трансфекції з використанням повного культурального середовища з додаванням пуроміцину (5 мкг/мл).

Пригнічення експресії РРАКу перевіряли за допомогою кількісної ЕТ-РСК і вестерн-блотингу.

Одержані клітинні лінії ЗПРРАК і ЗП ис утримували в повному середовищі з додаванням 2,5 мкг/мл пуроміцину.

План експерименту

Появу фібротичного фенотипу викликали шляхом стимулювання пССО-18 і НТ29 дією, відповідно, 1 нг/мл і 10 нг/мл ТОЕ-ВД протягом 4 днів, розчиненого в середовищі, яке не містить сироватки. Під час періоду диференціювання, вводили ї мМ СЕО (195,22 г/мль). Крім того, потенційну залежність від активації РРАКУу досліджували з використанням 5УУ9662, тобто специфічного антагоніста цього рецептора. 109М (3УМ9662 вводили за 4 год. до початку диференціювання, викликаного ТОЕ-Д.

Кількісна КТ-РСК (полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією)

Усю масу РНК витягали з використанням набору Мисіеозріп ЕМА Кії (Маспегеу-Маадеї, Ноегаї,

Егапсе). Після інактивації РНКази усю масу РНК очищували від слідів геномної ДНК обробкою

ДНКазою і промивали у воді, яка не містить РНКази і ЮЕРС. Чистоту РНК визначали за допомогою УФ-спектроскопії на системі Мапоагір у діапазоні 220-350 нм і аналізуючи профіль на біоаналізаторі Адіїепі 2100. Для проведення кількісної реакції КТ-РСК використовували 1 мкг загальної маси РНК і реакцію проводили за допомогою реакційної суміші ПідпСусіегРазієагі

ОМА Мабіег 5ЗУВЕ Сгееп І виробництва Коспе Оіадповіїс5 (Іпаіапароїїє, ІМ) відповідно до

Зо протоколу виробника.

Результати

Експерименти іп мімо

Клінічні і макроскопічні дані з хронічного коліту у мишей

Тривале пероральне введення О55 викликало втрату маси тіла у всіх мишей, починаючи з останнього дня першого циклу введення О55 (дня 5). На 10 день миші, які одержували О55, продемонстрували нижчу масу тіла порівняно з контрольними мишами, зі значеннями маси тіла відповідно 23,88:20,31 проти 25,2750,35, р«е0,05 (фіг. 11).

Діарея в ступені від помірної до важкої спостерігалася в 70 96 мишей, що одержували О55, і 5096 мишей, що одержували СЕЮО, на сьомий день перорального введення 055. У той же період часу, системні симптоми, наприклад, пілоерекція, навколоочноямковий ексудат і/або в'ялість, спостерігалися в 4095 мишей 055 і 3095 ЗЕО мишей. На жодній зі стадій не спостерігалося явної кровотечі з прямої кишки або випадання прямої кишки. Мишей умертвляли на 15 і 30 день відповідно, і робили макроскопічне обстеження ободової кишки, вимірюючи її масу (масу останніх 8 см дистальної частини товстого кишечнику), довжину і визначаючи наявність спайок, звужень, розширень, стовщень, які оцінювали за наступною шкалою: 0 - у випадку відсутності ознаки; 1 - при наявності легкої або помірної виразності ознаки; 2 - при наявності явно вираженої ознаки. Загальний результат макроскопічного обстеження обчислювали як суму балів за окремими позиціями.

Вплив уведення СЕО на перебіг і макроскопічні ознаки О55-індукованого хронічного коліту представлено в таблиці 7, і ці дані показують, що введення ЗЕЮО полегшує макроскопічне ураження при хронічному коліті, викликаному Ю55, і зменшує морфологічні ознаки фіброзу.

Усі макроскопічні ознаки, що спостерігаються при введенні 055, демонстрували значні варіації в обох моделях, що вказує на ефективність 055 при необхідності викликати важке ураження тканин. Усі макроскопічні ознаки полегшувалися при введенні СЕО, визначаючи статистично значущі розходження суми балів макроскопічних ознак для груп О55 і Ю0555-6Е0.

Такі параметри, як маса ободової кишки і співвідношення маси ободової кишки/маса тіла не продемонстрували значущих змін у результаті введення СЕО, тоді як довжина ободової кишки, очевидно, статистично значущо поверталася до нормальних значень. Дійсно, безпосереднє обстеження ободових кишок показало явне скорочення і розширення для більшості зразків, 60 оброблених Ю55, а також ослаблення цих змін у мишей, які одержували СЕО.

Таблиця 7

Вплив уведення СЕО на перебіг і макроскопічні ознаки хронічного коліту

Смертністьтгумишей)ї | (:07717Ї..777071010712 0 |1110 кишки/маса тіла макроскопічного обстеження

Дані представлені у вигляді середнє значення х стандартна помилка; пр-відсутній; "-р«0,05 відносно НгО; 7р-«0,01 відносно НгО; 7" р-«0,005 відносно НгО; "-р«0,05 відносно О55;

УуЕр-«0,01 відносно 055; """р-«0,005 відносно О55

Так, наприклад, співвідношення маса/розмір ободової кишки використовували як додатковий індикатор рівня запалення і фіброзу. Статистично значуще збільшення цього співвідношення на 124 95 спостерігалося в мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували тільки звичайну воду, при значеннях вказаного співвідношення 44,9826,31 проти 20,1153,91 (р«0,053. Уведення СЕЮО приводило до статистично значущого зменшення співвідношення маса/розмір ободової кишки порівняно з мишами 055 (38,1357,82 проти 44,98:6,31 (р«0,05)), викликаючи 2695 зменшення цього співвідношення порівняно з профібротичним ефектом 055. Відповідно, СЕЮО здатний послабляти морфологічні ознаки фіброзу, такі, як зменшення довжини і стовщення ободової кишки.

Мікроскопічні дані з хронічного коліту

Проводили оцінку ряду гістологічних параметрів, визначаючи інтенсивність клітинного інфільтрату в слизувату оболонку, поширення запалення в шари підслизуватої оболонки, а також наявність уражень епітелію і відкладення колагену. Статистично значуще і сильне запалення спостерігалося в групі мишей, які одержували 055, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду. Гістологічні характеристики для обох моделей включали виразку і дегенерацію слизуватої оболонки, зменшення кількості келихоподібних клітин, значну запальну інфільтрацію клітин і набряк підслизуватої оболонки. Усі ці ознаки були більш вираженими при хронічному коліті, викликаному Ю5З5, і значне стовщення стінки ободової кишки було очевидним. Крім того, хронічна модель продемонструвала явну регенерацію крипт і можливе мимовільне відновлення ступеня запалення при довгостроковому введенні (фіг. 12).

Рівень фіброзу визначали із використанням забарвлення трихромом за Масоном, що вибірково виявляє відкладення колагену. Статистично значуще збільшення рівня фіброзу спостерігалося не тільки в ободовій кишці 055 мишей порівняно з контрольними мишами, а також між двома групами, які одержували Ю55 (фіг. 12). Ця обставина, а також виявлення нижчого ступеня запалення, очевидно, узгоджується з припущенням про те, що фіброз починається з запальної реакції, але потім може розвиватися незалежно від неї.

Результати мікроскопічних досліджень виражали у вигляді суми балів і одержані результати

Зо показали, що високий ступінь запалення і рівні фіброзу, викликані 1 і З циклами введення Ю55, статистично значущо знижувалися в результаті щоденного перорального введення СЕЮО (3,36:20,55 для СЕО проти 6,45:0,82 для О55, р«е0,01) (фіг. 12).

Визначення рівнів основних маркерів фіброзу в тканинах

Рівні основних маркерів фіброзу в тканинах у хронічній моделі О55-індукованого коліту визначали за допомогою імуногістохімічного аналізу і підтверджували імуноблотингом. Так, наприклад, спостерігалося помітне зменшення рівнів колагену І-І (фіг. 1За) ії а-ЗМА (фіг. 1360), тобто специфічних маркерів диференціювання фібробластів, в ободовій кишці мишей, яким здійснювали пероральне введення СЕО, порівняно з мишами, які одержували тільки О55. Рівні експресії колагену І-Ш ї 0-5МА вимірювали в 6 контрольних мишей, 8 мишей 055 і 8 мишей р55ОЕ0О. Як імуногістохімія, так і вестерн-блотинг показали, що рівні всіх основних маркерів фіброзу значуще підвищувалися в групі мишей, які одержували Ю55, порівняно з контрольними мишами, які одержували звичайну воду, і що щоденне введення ЗЕО супроводжувалося зменшенням їхньої експресії. Рівні експресії кожного з білків виражали в процентних частках відносно середнього значення для контрольної групи, і дані для кожного маркера, який цікавить, нормалізували відносно конститутивного білка, наприклад, САРОН. Спостерігалося помітне збільшення експресії колагену І-Ш (18495) у мишей, які одержували 055, порівняно з контрольною групою, а також помірне підвищення експресії для 4-5МА, що дорівнює 25 95.

Пероральне введення ЗЕЮО у мишей із хронічним колітом, викликаним Ю55, приводило до зменшення рівнів експресії вказаних білків, що було більш значущим у випадку колагенів І1-ПІ (90,75 9У6ж-19,9 95 для СЕЮО проти 284.4 95-63,8 95 для Ю55, р«е0,005).

СЕО регулює сигнальний шлях ТОЕгр/5Ітаай і його специфічний активатор, а саме - І -13

Здатність СЕЮО регулювати сигнальний шлях ТОЕр/5таай при різних рівнях спостерігали з використанням імуногістохімічного аналізу, при цьому було продемонстровано помітне зменшення рівнів різних молекул, залучених у цей сигнальний шлях, наприклад, ТОЕ-Р1, зтааЗз, СТОБЕ (дані не показані).

Спостерігався позитивний результат від застосування СЕО при профілактиці або лікуванні фіброзу кишечнику, що стосується зміни рівнів експресії І -13 (фіг. 14а). І -13 є специфічним активатором сигнального шляху ТОЕрВ/бЗтай і ця обставина підтверджується наступним зниженням рівнів експресії ТОЕ-В1 (фіг. 145) ії СТОР (фіг. 14с). Підвищена експресія 1-13 у мишей, які одержували 055, статистично значущо поверталася у вихідний стан при пероральному введенні СЕО при значеннях 88,88 90ж214,1 95 для ЗЕО проти 189,5 9ож28,71 95 для 055, р«0,01. Наступне зменшення рівнів експресії ТОБ-В1 і СТОР підтверджувалося імуноблотингом з достатньою статистичною значущістю для СТОР (55,57 90ж-17,53 96 для СЕЮО проти 115,1 90-416,88 95 для 055, р«0,05). Рівні експресії виражали в процентних частках оптичної густини відносно контрольної групи і нормалізували відносно САРОН.

Включення за допомогою посилання

Вміст кожного з патентних документів і наукових статей, згаданих у тексті даної заявки, повністю включено в заявку у всіх змістах за допомогою посилання.

Еквіваленти

Даний винахід можна втілити в інших конкретних формах, не відступаючи від його суті або основних характеристик. Таким чином, описані вище варіанти здійснення варто вважати у всіх відношеннях ілюстративними, а не такими, що обмежують описаний в заявці винахід. Тому обсяг винаходу обмежений прикладеною формулою винаходу, а не попереднім описом, і мається на увазі, що всі зміни, які за змістом і межами застосовності є еквівалентами формули винаходу, охоплені даним винаходом.

«ЗО» мОоЄва рнайма їТМутТЕВ «З» Способи нікування БібвВОхуУ «302 РОЗОБЕСТ «аа» вотувиа З ОВеНІУ «141» 2313-02-05 «1505 бу Бая, 544 «їх КО Е ЦЮ «ЇМ» БР БЯеЗОХИ.

Я «БУ Ка ца «БО а «ДИ» бакевстй тУузгяїой 3.5 «а 3 «Ха я «вай» ДНК «кож Штучна послідовність хайї» джерено о, я илнилия «сеї» /приміткає едис штучної послідовності: синтетичний праймер" «вав У зашксвваза саке сетаєо 70 «а й «ка КИ «Яїй» ДНК | І «У» штучна послідовна єт» «ах «ееїх дЖаВет | й й й . «еїз /прннітеас сопнє штучнеаї песнздевнасті: єннтетичний праннавВ" «це 4 зв зассісазає ахолеескооз в «ек» З «З1ї» 23 «ії» Штучна люеспідовнітсть «ва» клей» джепана й , Й й «йеЯ» упричіткає опиє штучної послідовності: синуетичний праймер" «Од» й смоаотяоз сазоскясня ес Її «я Я «вій» ДНЕ «МіЗ» штучна песвідевність «й хааі» джерело | ; й т каеїМ епримітиае сис штУчНОЇ послідавнесті: сянтетичний праймер"

«а» Я І «ВЕСТ ЕсІЄ зазаттсвао свдасав «о «в» 3 «В3ї2 Кі «і» Штучна песліданніств «ие «йЕі» джерела ! і | Щ «пий» гприміткає опис штучної послідовності: синтетичний праймер" «йо» 5 сабссасасх стссвоссоє в І «М в «Вії ж ЖХ «вїЖ» днк ї г «вії» Штучна послідовність

Б

«Олі» джервлю | Щі «З» гприніткає опис штучнНОЇ послідовності: сннтетичняй займе «ай» Є ! єзвассаасах дедатаєтеї ссака І «дах 7 «ад ща хаї2е» ДНЕ Е і «еаЇ» Штучна послідовність «иа» «а2і» джерело | | шо «веЯ» л/приміткає опис штучної послідовності: синтетичний прайнеюв" зашнасцюа їсозсоєтяа свй І «ее В «Щі» 53 «ее ДНК ! «Від» йтучна послідовність «Я «Кам ДЖЕОВАЄ Ї Що чех» упримітка Опис штуУчНОЇ послідовності: єкУтетавчний позна «400» асасзоцєст дасссовсєх са 23 «о» З «еїжУ ДНК «Ії» Штучна послідовність «аа «я» джерело й. КЕ ге ша ІЧ ка х ся джедя - чек мк - у я. «гої» гприміткає опис впучнНаї послідовності: свнтетнчмий пракнав" «МКК» З сстдасорос зорсдате

«Бо» 10 «ак аз «ві» ДНК , й «аї3» Штучна послідвиність «Ва» деерено . І й . . «дай» гпринітках опис штучнаї послідовності: синтетичний пракмев" «ще | | ще зкозазавто зссчоааоза зас Ж «Ех 3 «ом» В «ах ДНК й й «ії» штучна заспідовність ке» «еаї» дЖжевкяє й «Кай» гпринітнах опис штуна послідовність: синтетичний олігонуклевтид «ак» Що щфессттсаєт зстосс 18 «ке 15 «гі1їх і1З «ій» ДНЕ Й й «ІЗ» втУчна послідовність «зо» «пні» джерело ше я н «й2ї» упр ітка»е опис штуна пеоєвідовність: синтетичний еАтгениклеетих «0» й зсестзанта сс рнак їз

Claims (14)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування фіброзу, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз, терапевтично ефективної кількості сполуки ОМе (в) он МН, або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера, причому фіброз являє собою фіброз кишечнику або фіброз печінки.

2. Спосіб за п. 1, де стереоїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4'-амінофеніл)упропіонову кислоту.

3. Спосіб лікування фіброзу печінки, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз печінки, фармацевтичного препарату, що включає терапевтично ефективну кількість 2-метоксі- 3-(4-амінофеніл)пропіонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера.

4. Спосіб за п. 3, де фармацевтичний препарат вводять перорально.

5. Спосіб за п. З або 4, де пацієнт є людиною.

6. Спосіб за будь-яким з пп. 3-5, де в пацієнта вже є або був гепатит В або гепатит С.

7. Спосіб за будь-яким з пп. 3-6, де в пацієнта є цироз.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 3-7, де в пацієнта є також хвороба Крона, запальна хвороба кишечнику або виразковий коліт.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 3-8, де стереоїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту.

10. Спосіб лікування фіброзу кишечнику, який включає введення пацієнту, який страждає на фіброз кишечнику, фармацевтичного препарату, що включає терапевтично ефективну кількість 2-метоксі-3-(4"-амінофеніл)упропіонової кислоти або її фармацевтично прийнятної солі або стереоізомера.

11. Спосіб за п. 10, де фармацевтичний препарат вводять перорально.

12. Спосіб за п. 10 або 11, де пацієнт є людиною.

13. Спосіб за будь-яким з пп. 10-12, де в пацієнта є також хвороба Крона, запальна хвороба кишечнику або виразковий коліт.

14. Спосіб за будь-яким з пп. 10-13, де стереоіїзомер являє собою (5)-2-метоксі-3-(4- амінофеніл)пропіонову кислоту. її Її ' Н . Ї і -- ші сін я пе ї - : як - І ча 4 ри: Мо: рис "пт Й ла ну ря я а яю АК т Г. х он п а ни нн ря п! те Ід т- Контроль ДМСО їж М зак Контроль СЕ Ше - я - ОСА т КН х -ж- СА УН- 133 З ї зн Ст СОБІ - х 5 х у І х 2 КІ ії 2 5 ї 1» г з ЕЯ КУ час у днях

Фіг. 1 І Бали за шкалою Меіачіг (активність І : АО-тАЗ І фіброз РО- Р Ро гннпошітннірнтнвня ст печені пчнтчнтннинниніотнтнтееттенетеснтят нт нт ї Я СОЯ Центральна нена й КО куле ! о Активність |у Я ЦЕ . | 7. Ше / (некрозі /(РІОрОВ. Ко. Зо ДЛеВ запалення) рот ; зн 7 те ня РО Ямброз порталюнолу тракту численні сет дечисленні септи (перегородки) ! ши о | іа в лає вит А Важка АХ ві ща ; й ран й у нити ть чт чт сс сс снпнесжиюююньї є . р що І Цироз мі

Фіг. 2А

Контроль (фіброз відсутній) сей Ко ВЕК ВН ПИШНИМИ КМИН ПО ОО ОО МИХ Кен СЕНИК ПЕН ИМЕНИ КК ПЕК КК КВ НК ХНН ХК ПЕК КЕКВ КЕ КК НК КК КН КК СОПКО КК КН НК ОК ВЕКПИКН НК НК НН НН ДИМ ВК Я МО Я п а М М а Я ПЕК ПЕН я ПО Я ОК СЕП М М КОКО ОО Я ЕК В Я КЕКВ КЕ КК КЕ ЩЕ АК ВХ ОО М а ПЕКИ Ми о ПАК М А и і в ДИВНО ОО ПОКОККНя ПИЕИИИНН Кн КО КО ПЕН ПН ОО ЕК КН ПШИМЕЦИИКК НИКИ ОО ТИНИ М я ЕКС КВ КК КВК КК КК ПЕКИ НК НН КОКО ПЕ ОО ОО Я ПО С ХОККЕНННККе ок М В Я М В ПИМИЕИИМИНИЕ НИВКИ ВКЕ р ія І І ЕІ зе Ку ев т В: сон КЕ ВАННЯ каз БО УНК КУ ДННИКИНННННИВ КИМ В ОО КОМ В Я ХЕПИМШНННН НКИ А -г '''г'гФФФФч ПЕКИ ОО Я В ОО ОКО в о о я РМ оо НН ОО й ПЕ КК Ю ОО У КО Я НО А о я о Я ОО о Я КОКО М М Я СХИДИМИДИМ КИНЕ Кен ОО ООН п а КК НКЮ ОО М М КК ОК Я ОН Я ОО ОВО ОО ОО А ПН М о в і Я ПЕН ПЕКИ ПК КК, НО М М М о ня ОО М о НН о о Я ПИ НН НН Жах ОО ОО и КН я ОО Я ОК Я ПИЛИ о я ПЕКОННМНИКК КК КК КЕ КОМ КН

Фіг. 28 пот лок ре га к 4 «ук че й ак УЗ З їх я о. Її рах що ПРОВ і - и г І де я ПІК і і ння, ТПУ Е. -ї ке К їн, Н ПП я ії ПИЙ р; 1 ПИЛА І-ах Н ТУ Ех ї ПЕС - | НЯ К ре ї Ж ха Ох - пу су З - з т -е у т хз г. ік св ще Ж тая сВНяо Кикі нені ш Кв х ща «з З що що й Кк з си Га Б шк: - й за рн: у їх й Тож ее : теж: ЗОБУ й Ох ПИ Але й г -к 5 МЛС :

а. -ї їх ПИТАЄ, ще с ЗЛІ ї Вовщо Ю: век З АЛ КИ: х тва «І а СМ, В о; у - з ; я ен соя ССлУУн сСМ-оЕВ ная щ Ген Гр й «5МА 1 с зо яю ов їй в з а в ; : к Ба З я рт надій щ зі пк заня в в з 2 ха х. Е- щ Е г Ї шт о тю З - т а т-6О- ; - й с ОР сою сов лим сині Колаген- 1 зво. вео і М рон ДОМ ЩІ 1-6 й - 43 на з «зві щ ко В НИЙ 128 1 р: о й но З т я БЕ » я ч : во з й ща в: ЩО Е чи а мул | зн й р: я - С і. Н се ща се тес са ВУВ. «ев ій їх

Фіг. 4 25 мишей Вс ВО ЗВ о 055 ВЕН. еВ 2 миней О55 Ес т вм ан в В сх маш не НО ВВС Лв 7 двів З днів 7 їнів З днів 7 днів Евтавазія

Фіг. 5

Співвідношення маса ободової кишки/довжина ободової кишки Ж й щої ях "пвкнва я УК ЗХ з що щ ж с п їх їі щщї зі мний м бмншей, | же но хе пове . херефдо

Фіг. бА Бо ок реє 5 СЕ З о що ве хе» ОБО с . о т ЗЕ . о : з ОК ПИШЕ

Фіг. Б пен че диу и, но: о сш и пхуи 17 АМту па. и АХ кое ав ВЕНИ тане а жут я ПІВ Орт Ма ден тити Бо и ВИНИ ЕК ЕК Ка ДК пт пт, і: 55. сснненяннннння - . сома я ул зує ши С оххсю. | я Сума балів, шо характеризу щ- хіти я ДНК и Вимк -4 Би ор Тит ЕН дей в, Ш-ї запапення шен Маре Іс Ко МЕ М паосоовоюсе - ВЕ ракет ЛЕМ НИ Шов х КАК нс соя КВЕя ЗИМ, пол ув я КПІ Мейя Ти ЗЕ - п БО 5. нок пут ян пока ВЕН Ї кру Й ЗХ ой Хе лиш ТЕЖ КА Н Й БЕ шли. «реавАе ста ние ей ож В ад ши ИН ек НО нок о ШІ ин як ей і «ВИК. вро тва Ве ПЕДА ве Кан Яд лек ек м АН вн в ИЙ Я ва- ше жу це "Ван с НЯ ант х ------- 1. ТЕ ть я ВО СЕК СІ пек І | й що ПК Кожна: ки: ВБИВ 224 і 23 вний Пд фр аЕ и олені, фер л я А и ЯНА в Ех пе я | 22 міні Пежо АК Кент Ор Ів ВШ ТВЕН со КК пр ве щен н: в А ма вк ес В шко СК і КЕ Авия с Й був ан я ОВ кова с ДЕ ібн дини митне що Ба деко коро юна НИЙ ово 1---- ' й те реве ше ев ох сфе я КІ ке ж свя сиди на жо киев А Я сво ЕН нн ВЕЖ ена пане. ся Що Кк ст о о Й в Во ся Вкж М | я р0,05 рент пяти ос ВС еВи тнє. и вх сег Щ м их их, Бе Псел кава а я шо тя по я іх КО УНК ОК еаее 4 по ве Ех о рони До Я тр ІА МН НЮ Ка ек ОІВ Б Бр Зоя А в ВОК ни ншя Но Ко луч и ои ре- й ання й В Вуж ЗЕ сн в ОЛІЇ оди й З СДН Б о у М НЕ НЯ Пелех ОК ее ВИН ДЕли ой ду о ННЯ а ШНМ АТ ке я ВИ пло, й НН оку: УК шир . зу; І екон В с уж ЗІ : іча зизує І оди пк вва сей З Сума балів, що ханактеризу п копит ВВ по ерчлс нон у пен Ффюроз Е ск нд танк дея в ду пе ве й З ж.

ВОК М Кей ВИК нн ДЖ о Й " ш- дм ел п ВК КК ВИ У с увів не Ом о КК МНЕ ЖЕ ЖИХ СМ МР своє ЯН ут Й ОО Ве ув ех се тай ше В Ж 4 є шо ву ев у шо Зо Ве ин пен щі ОВСЖОХ Ох ке З и т ж. : т У НН ом; мк ку омани Ко селян Кк ою ІекК у З анае п м ПІ МО ок и п ее. во п ШК ни ПЕ ДК М Ти вас ск пани Зк с Ох С кни Как «5 еся З яні пд на в 5 ЕВ пока с. ко В око ХО МО я я шо я ж во Шк х ит В неви ев о їх По вдо : Ул мимо. п ВО ВИХ КК т ВАК: 3 Не сь «ТКУ МА Й м рат ен сни востей С в В де. сосовія Бе дурно КеЖУ у НК КК УМ Кк МК я ДОЛЕ КТ ДЕ МЕ ех ВК. с Еней дну пт п но ОВ п ЕЕ Я и КОНЯ в пен, ; т нн я а кох СИХ ов В ке рууеЕю Бо лови ГК ПО я их пис на и Ах ОН УнНННЯ Кох З ах НЄ лою Де НК и пити шо а ЕК ера пн понят нн нн ПОН я же КО о ВН пляжі пня У иня сш З пою зви ІК п М Бах як и пет аекБтя ек що ах й и в Не МЕ не КВН НН ку ий Уа вин Ок о Б шк от и У ОК Кк Ве ся З ИШе Аа ос осо МН ТТ ра п ДЕ Хоктроїь Б ма -щА ше . сотні ококейн ки в Калагоні Щ пяти з і калкднь ія Се; ха ит ї СОБСАСЕМ АНІ суша й Що Й ; схіж ТИЖ ек до, Ки Кф ки мот, тя З тАссуда явних км жів Я ет КНАИ НК ПОН СЕЮОЯ незвованвзиьнйнинк слесн ме зів 5 Ж Хек - Колаген ї Ку да в ви Ки орга бе еВ ВЕ в їк нан х ж А сей с: ЗИ нин п нев а де ЖК ВО пт Я ШЕ сн ко В В : хо ве ек НИЙ Мо а Вс. кана М б Бен Ме КУ не А ек иа фе и З : З мех Мам ев. ДМА Ву «їх В дві Уа Кр о щ ВІ у ВО в. Ан МК ся у Ну ХУ сне ВЕ КН Ж : сит ж Ки и ки и по ут» Н Моне У Ме т и зві лей Ов Кия який я и. 2 і СЕК ші ко і нн со НЕ е - ЕЕ ЕХ се ВК. пеки Се Ж 4 я що Кк зе ьо Кохтрадь п Ен жо т і т чо в к. ЗОСЕ сс зверне киев нмо. СТО Сто в на Н н ми Ше я гі: п я в ут ре їй пон Дт ВЛ ВЕ ВН с о рр інн півні рнерея А БАРБІ: п ее я и Его т п оку о кВ ИЙ стає о ей шу с ЕВ вс роз . ооо МВ жк шлю дя що пиши и паху ен сих Хомко Ей Жодучн Ко Кк и М у ще КК: пд Мая кін як ті - ле ви в З; ту о ТВ ов -к " БО не і С шк шк ік де зіжько й те ке ох А й КЗ є ! і МУден К о а вет жи, ЗЛО - с жк о ТЕ ше У я кв йо : вся о в я ок КА й В ! и Зак и ей Ве в у т Ж д що ен Иу ж пав фа Ве ефе е" Вени ще не а КЕ у Кн му я а п, вв чув | пен Я в В нн й БЕ» ; ря а НН Ко дві Б «Е є с ж гуни а о ; я й Р І й саддеттндкн ; Й славне з одежерсю Ка В У ; 2/3 у ее зндфня нь ЗИ Аа ей о 5 5 я ; крива в НАВ С ЗОН споюхждк Ж дВовиеєюта В бе но БО ше Шк і я ПЕ ших ; ло ис С АК Х М жк а В Ь Ок сова МУ по ее ПК хо щх я кров Щі» Ки 4 ук АК ее я шо А о я В сей Ж я ма я да око: щй Як и є сла ВИ ЕН КАН тай: В нс зма А А в. шо и, Ех шк я ще а ХЕ ОКУ ее но, п, зх ках ТО вх З й хх ви пе а по шн в в. ра ИН і Яни а ке п, во З ня ЕН ша поп вела ве ее в Я ну всех Ох Й ПЕК пох шин м я КИ й ВО ля Ов Й Пд тн у нн Е ян й ше в о в я Кк а ож епори о у ях еле ВН поши Кн ПАКИ В У ТНО ие Ко о ЛИН ЗА Ве ож о СПЕ МЕНЯ ПаЕККт пон й Коса в МАХ пе ри он а Ж А ке я: ви ке ай св щі С а в. КМ, ше. нн ж шо ки НКТ и о ій ЗМО т Ел поуная оТшЕ тн Бена КО І г. . Сх я ноя осо а шия п я І шо же кс КО :

Контроль ДІ ОБЕ ЦО БЕ альфа-ЗМА о вісі іі кий ОКО В АНЯ з ооо нев кі ор оно ЛВ ОМА тн о поко о НК си сни м ижечетих . пждікиня Щк - нт Ме сх МОН в Пасти ні Б пе в п НК Кк ик В в М В и: са НИ ВК ка тк ПЕК М щу 5 и т ОВК ОЯ 1 й А ке о Я - а о. ее еВ ша ШАРОМ ект ВВА НН У яь а СИ и НН Й Шо ие пт са ан. ах м с о а в. ж ва ма в Ве е п НО пл Ка ям по я ша - й КК о и Я В В НН деп В ВК і ХМ и в Б в ОО ус жи 6, Ши вия с ИН в Й - нтежнх п они А Ма ев ми Я жо п и ак ВО В ов КУ гхЗ Пн и Б ЛО є аа до шт ОМ в М с в и ЕЯ сеее АК Зо кеди и Мн нн в ННЯ ве, Як Коня Вк и В о нн Ко ки ви Се ОО о У В дО зв пе вн па ОК, що в КЕ КК КЕ. Кн а о КАН с ша пок і я ще Контролі Ток п Ж ЕВ тарг-бета 1 пиши нн ОО АН ЕН и М таг-бета З С Ж: и золот мене «я сснсораетм з клік мдквкдааь о А Енн не Ме о ВВ шо Б я о о б ов а й а, ще я виш З ГО Яка ке ВЕН рок у я и а М ух - они нн У САМ НИКА сн ово о ЕВ» В и Ж м Й 5 і кас Ж з кох Ж мл я Бо ее У ВО 7 Соя км В САРОН Мо о ПО ой вок КІ В дин в ак и дише ан зак 5 повин МЕЕЕУКАТ В ек Й ек С в в и іх ак ва з ее о и так ща ЕК п в о ско а ТК С ах УОИе зліва. и и и их. Я я и 5. яко им и я Ко в. о. ої пня и Ко ох Й Вк с а соні я НН БО ТІ ОК ан в і. ек шо. ди в НК и в и я М сих косий й ха Ох о У 8 1 Ме оЯ Адм Вк ши М о и М ВК Я Є Н Ван с В ж ри и м В НІК ис Бех) з дн Жив ему се и ОК а В и НЯ ТОЖ: и ев М з и ши і ий Е : о КЕ Б ух Пеня ВХ о ня Ко З Ко Я п Он АЖ Ж Й КК й ВК ня и ен в а дн : нн В ЕХ шк но я и МО Й г КА У й а осв а : ск :ЗНВВВа я й як

Фіг. ЗЕ КСВ С. в г Пн ки В я : досві НА СИХ КВ жк ЯЯ пут вої З хх ШОМУ опт ВАН СО С КК. нн каф ОКУ нев Ор вв р о нов НН в В А Ка З хх. те у ВК ЕЕ Ге ще КК Ен м ВО і, Н ее й ють - Та Де ж ск, ді їх ее як фусеесеєтеттесттнннннинннннннннннннннняї ох. " Я кю сникжнікжря : а Н КО Е й РЕЯ ! ше це й «Фа їх

4. иа по ш шо ХЕ 5» межи ун вк Бо в й А дребосок я КАВИ ай с що і зо Ах Шк а пет . ЕК ех НЯ пе БЕо Ех як НН я

5. ХМ й а 10 ро во Дні

Фіг. 11 Тривале введення - 8 ж Ж» є Її. 44 в 2 ; с но тт ке А : я БОЯР еджшоя са с 7 й КУ ий «ее дк «

Фіг. 12

(з) тт ромен, ! ЯМА 00 в ово п НН ОВ я зиефа ем: ; шо ун о» нн нн КМ иа ях У ДЕК ее В ет і

М о. ГЕ. м - і ! ї ОКА СУ ИМЯ рОщо Ук вн ДКЗ, маку Н Н дня тя ДН ха и в А Я ех ї Н ер КК не ве о Ки Кк. вежу за ІЗ М ке Ов Б Не З ШОВ, А ВХ й |: ШЕ 00 вн м ШЕ 5 Б г і Титов ос КВ ОА т 1 ОО і 3 ВО в МАН УК и є і я а Н І Бе ОА пива шо; ув Б ; і шою ОО Б и. І меня МОМ Е і АТ ОВ в й Кк с Й МЕ ОХ ІЗ і п я ! а щи. БУ Я ї і КАК А - плллодлчян М кчн ННЕННВИЙ..... ЯН ГУ х - й ; ї Яд д дк КЕ. Ей В « Я ! с, в ІЗ ЛЕ їх ІЗ пі. оеикхикчжичижіючх юю пон А ХХ ллотіт не тнене ене Ке еееечеекетечеене іє ' Колаген КЕНЕ оса я ! Ат кА ДАЖКаК Ц кими мо ик ВЖЕ дк шо щк Щ ТИ 7 І НАЕК у р п у и вк В, о клтути в дао Спмюв й ; ще ЯК У ос ково п ке я Кевиец ШЕ у Бе В В о кавнеаки с ШИ Н ВХ вен ов, ВІ Ме и я З ОМ НЕ САРІ ше она: В баню з і Та КО о жк АТ фен ння яд і а с М ВЕ МУ КОР Их Как а ЖИ р . ! ПО а Кв а 2 і УВК и а в З : ; Я і по и и о ШЕ но і і ШЕ а А 8 Дек ооо кН А дя Ь и со иа НК к пи ве в ек сх : ЕК Кк си ДЯ оси с ОХ У. З КВК Е кі я ВУ СК Я УМ дкхжєюсн ЩОКУ пт ЕЕ и о в кн дк им СЯ ок и о о ся Я Вк ЯКО щи оо БО : ЯЛЕОЯ тя МЕЖ ВК нн ВИШКИ. і Е як 4 Я З, хх я го ху е Е . я

Фіг. 13 їв коамтрогх р дюни конт КК Ки МАМ сій Ех БО КУ Фронт нення З ї зд

ОН. тео вою Ве Ж КЖАЯ 2 ла ся. ВК Масенся їй Її ВЕК а в ші 5 КУ і І ВО 5 ї БО ОВК 2ї ї Ве З: У: чн. ЯН. що ра С пк ани кн по і (ві МН І ОД, ід В Я о НИ НИ ШЕ ПИ двух МИ ди сівкя ех леж ікрі хатини мо нев Ше" ТОМІ ЖКТАТИх, ще ОБУ сосна оон ОО -- Ем КИ З Б ; : Ем: ММ ре ї у щ ОТ їх ВО ке ще ЕК од В КО зу В сте Бо : а Мао и Ас» В що - ОБУ и КУ о ж ше " ЖК Б щук ва ше ві Б ЛЕ Мт ВКНЖ. ВЕ

00.2... БИ Но . а З жо с: о НН нн ня х о ї « 3 ї Га Е шо