UA101078U

UA101078U - POTENTIOMETRIC BIOSENSOR BASED ON CREATININDEYMINASES FOR DETERMINATION OF CREATININ CONCENTRATIONS IN AQUATIC SOLUTIONS

Info

Publication number: UA101078U
Application number: UAU201501986U
Authority: UA
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2015-08-25

Abstract

Потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах складається з потенціометричного датчика на основі двох рН-чутливих польових транзисторів. На перший транзистор нанесено першу мембрану на основі силікаліту, на яку далі нанесено другу ферментну мембрану на основі креатиніндеімінази, що є чутливою до креатиніну. На другий транзистор також нанесено першу мембрану на основі силікаліту та другу референтну мембрану. Вказаний біосенсор призначений для підключення до приладу для потенціометричних вимірювань. Виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера.A creatinine deiminase potentiometric biosensor for the determination of creatinine concentration in aqueous solutions consists of a potentiometric sensor based on two pH-sensitive field-effect transistors. The first transistor is applied to the first membrane based on silicalite, which is then applied to the second enzyme membrane based on creatinine deiminase, which is sensitive to creatinine. The second transistor is also applied to the first membrane based on silicate and the second reference membrane. The specified biosensor is intended for connection to the device for potentiometric measurements. The outputs of this device are connected to the corresponding inputs of the computer.

Description

Заявлена корисна модель належить до галузі медицини та охорони здоров'я і може бути використана для перевірки функціональності нирок, печінки, а саме для визначення концентрації креатиніну під час процедури гемодіалізу та при прямому аналізі у сироватці крові, а більш конкретно до потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеіїмінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах.The claimed useful model belongs to the field of medicine and health care and can be used to check the functionality of kidneys, liver, namely to determine the concentration of creatinine during the hemodialysis procedure and in direct analysis in blood serum, and more specifically to a potentiometric biosensor based on creatinine deiminase to determine the concentration of creatinine in aqueous solutions.

Одним із основних кінцевих продуктів азотистого обміну людини є креатинін. В організмі людини креатинін продукується в результаті дефосфорилювання фосфокреатину або ж за рахунок дегідратації креатину |1). Визначення рівня креатиніну у різних фізіологічних рідинах є корисним для оцінки ниркової, м'язової та щитовидної дисфункції |2)|. Креатинін є маркером м'язової маси і є відображенням повільного обміну білка у м'язах. Креатиніновий показник можна розглядати як показник запасів азоту (наприклад, пацієнти з дистрофією мають низький вихід креатиніну). Фізіологічний рівень креатиніну сироватки крові знаходиться в межах 0,05- 0,11 мМ |З). Концентрація креатиніну вища, як 0,14 мМ вимагає додаткових лабораторних досліджень, тоді як рівень 0,5 мМ є індикатором ниркової дисфункції. За паталогічних екстремальних умов концентрація креатиніну може сягати 1 мМ |4, 5). Рівень креатиніну у діалізаті становить 0,05-0,35 мМ.Creatinine is one of the main end products of human nitrogen metabolism. In the human body, creatinine is produced as a result of dephosphorylation of phosphocreatine or due to dehydration of creatine |1). Determining the level of creatinine in various physiological fluids is useful for assessing renal, muscle, and thyroid dysfunction |2)|. Creatinine is a marker of muscle mass and is a reflection of slow protein metabolism in muscles. The creatinine indicator can be considered as an indicator of nitrogen reserves (for example, patients with dystrophy have a low output of creatinine). The physiological level of serum creatinine is in the range of 0.05-0.11 mM |Z). A creatinine concentration higher than 0.14 mM requires additional laboratory tests, while a level of 0.5 mM is an indicator of renal dysfunction. Under pathological extreme conditions, the concentration of creatinine can reach 1 mM |4, 5). The creatinine level in the dialysate is 0.05-0.35 mM.

Для моніторингу цього аналіту часто використовують колориметричні методи аналізу. Всі ці методи складні у використанні, оскільки необхідний контроль температури, рН, складна пробо підготовка аналізованого зразку, що значно сповільнює аналіз. Колориметричне визначення креатиніну базується на реакції Яффе з використанням пікрату ІЄ). Основним недоліком методуColorimetric methods of analysis are often used to monitor this analyte. All these methods are difficult to use, since temperature control, pH, and complex preparation of the analyzed sample are required, which significantly slows down the analysis. Colorimetric determination of creatinine is based on the Jaffe reaction using IE picrate). The main drawback of the method

Яффе є велика кількість інтерферентів, що призводять до хибних результатів. Відповідно, необхідно проводити додаткову обробку біозразків: адсорбцію, екстракцію, діаліз, використовувати ферменти, щоб видалити інтерферуючі речовини. Даний шлях призводить до зниження точності та підвищення вартості аналізу на креатинін.Jaffe has a large number of interferents that lead to false results. Accordingly, it is necessary to carry out additional processing of biosamples: adsorption, extraction, dialysis, use enzymes to remove interfering substances. This way leads to a decrease in accuracy and an increase in the cost of creatinine analysis.

Окрім колориметричного визначення креатиніну існує друга група методів більш специфічних, які грунтуються на ферментативних реакціях з колориметричною детекцією.In addition to the colorimetric determination of creatinine, there is a second group of more specific methods that are based on enzymatic reactions with colorimetric detection.

Найчастіше для визначення креатиніну використовують креатиніназу, що каталізує гідроліз креатиніну до креатину, який потім визначають в креатинкіназній реакції І/)|Ї. На жаль, ферментативні оптичні методи обмежені нестабільністю ферментів при зберіганні та експлуатації, складністю методики аналізу, а також високою вартістю обладнання і затратних матеріалів, крім того, необхідна наявність висококваліфікованого персоналу.Creatininase is most often used to determine creatinine, which catalyzes the hydrolysis of creatinine to creatine, which is then determined in the creatine kinase reaction II/)|II. Unfortunately, enzymatic optical methods are limited by the instability of enzymes during storage and operation, the complexity of the analysis technique, as well as the high cost of equipment and consumables, in addition, the presence of highly qualified personnel is necessary.

На сьогоднішній день існує низка повідомлень про розробку біосенсорів та біосенсорних систем для визначення креатиніну (5, 8-14|Ї. В основі роботи більшості цих систем лежать потенціометричні перетворювачі, які чутливі до амонію, тому ендогенний амоній, який присутній в біозразках, а також К", Ма", стають причиною інтерференції. Для видалення інтерферуючих речовин було розроблено декілька стратегічних напрямків, наприклад розділення за допомогою газової дифузії чи іонообмінної колонки, що в свою чергу, призводить до складної попередньої підготовки проби з використанням додаткового обладнання.To date, there are a number of reports on the development of biosensors and biosensor systems for the determination of creatinine (5, 8-14). The basis of the operation of most of these systems are potentiometric transducers that are sensitive to ammonium, therefore endogenous ammonium, which is present in biosamples, as well as K", Ma", become the cause of interference. Several strategic directions have been developed to remove interfering substances, such as separation using gas diffusion or an ion exchange column, which in turn leads to complex preliminary preparation of the sample using additional equipment.

В основі роботи меншої частини відомих біосенсорів (|11-14| лежать більш перспективні потенціометричні перетворювачі, які чутливі до протонів. Але зазвичай в процесі іммобілізації використовують шкідливі для здоров'я людини токсичні реагенти або ультрафіолетове випромінювання (12, 131).The basis of the work of a smaller part of known biosensors (|11-14|) are more promising potentiometric converters that are sensitive to protons. But usually in the process of immobilization, toxic reagents or ultraviolet radiation harmful to human health are used (12, 131).

В роботі І13)| описано потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеіїмінази для визначення креатиніну, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рн- чутливих польових транзисторів, на один з яких нанесена робоча ферментна мембрана на основі креатиніндеїмінази, іммобілізованої в РМА-5ВО, що є чутливою до креатиніну. Для виготовлення даного типу біосенсора необхідно використовувати шкідливе для опромінення людини ультрафіолетове випромінювання. Відповідно при виготовленні даного типу біосенсора з урахуванням усіх норм безпеки необхідно використовувати дуже складну методику іммобілізації ферменту. Крім того, з використанням даного типу іммобілізації отримані біосенсори характеризуються не найкращою чутливістю з границею визначення креатиніну - 20In work I13)| describes a potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining creatinine, consisting of a potentiometric sensor based on two pH-sensitive field-effect transistors, one of which has a working enzyme membrane based on creatinine deiminase immobilized in РМА-5ВО, which is sensitive to creatinine. For the manufacture of this type of biosensor, it is necessary to use ultraviolet radiation, which is harmful to human exposure. Accordingly, in the manufacture of this type of biosensor, taking into account all safety standards, it is necessary to use a very complex method of enzyme immobilization. In addition, with the use of this type of immobilization, the obtained biosensors are characterized by not the best sensitivity, with a detection limit of creatinine - 20

МКМ.MKM.

В роботі (14) описано відомий потенціометричний біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів та креатиніндеіїмінази коїммобілізованої з бичачим сироватковим альбуміном (БСА) на поверхні перетворювача зшиваючим токсичним реагентом глутаровим альдегідом (ГА). Оскільки відомо, що глутаровий альдегід це токсична речовина при виготовленні даного типу біосенсора з урахуванням усіх норм безпеки, необхідно також використовувати дуже складну методику іммобілізації ферменту. Крім того, з використанням даного типу іммобілізації отримані біосенсори також характеризуються не найкращою чутливістю та швидкістю сигналу бо (3-4 хв) з границею визначення креатиніну - 20 мкМ.The work (14) describes a well-known potentiometric biosensor based on pH-sensitive field-effect transistors and creatine deiiminase co-immobilized with bovine serum albumin (BSA) on the surface of the transducer by the cross-linking toxic reagent glutaraldehyde (GA). Since it is known that glutaraldehyde is a toxic substance in the manufacture of this type of biosensor taking into account all safety standards, it is also necessary to use a very complex method of enzyme immobilization. In addition, the obtained biosensors using this type of immobilization are also characterized by not the best sensitivity and speed of the signal (3-4 min) with a detection limit of creatinine - 20 μM.

В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача створення такого потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеіїмінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах, який би характеризувався кращою чутливістю до креатиніну (границя визначення - 2 мкМ) та був більш перспективним та дешевим для подальшого масового виробництва.The basis of the proposed useful model is the task of creating such a potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions, which would be characterized by better sensitivity to creatinine (detection limit - 2 µM) and would be more promising and cheaper for further mass production.

Поставлена задача вирішується запропонованим потенціометричним біосенсором на основі креатиніндеїмінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах, що складається з потенціометричного датчика на основі двох рН-чутливих польових транзисторів, а відповідно до пропозиції, на перший транзистор нанесено першу мембрану на основі силікаліту, на яку далі нанесено другу ферментну мембрану на основі креатиніндеімінази, що є чутливою до креатиніну, на другий транзистор також нанесено першу мембрану на основі силікаліту та другу референтну мембрану, а вказаний біосенсор призначений для підключення до приладу для потенціометричних вимірювань, а виходи цього приладу підключені до відповідних входів комп'ютера.The task is solved by the proposed potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions, which consists of a potentiometric sensor based on two pH-sensitive field-effect transistors, and according to the proposal, the first membrane based on silicalite is applied to the first transistor, which is then applied a second enzyme membrane based on creatine deiminase sensitive to creatinine, a first membrane based on silicalite and a second reference membrane are also applied to the second transistor, and said biosensor is intended to be connected to a device for potentiometric measurements, and the outputs of this device are connected to the corresponding inputs of the computer the computer

Поставлена задача вирішується за рахунок безпечної, простої та швидкої процедури іммобілізації, а саме адсорбцією креатиніндеімінази на силікаліті.The task is solved by a safe, simple and quick immobilization procedure, namely, adsorption of creatine deiminase on silicalite.

Прилад для потенціометричних вимірювань, розроблений та виготовлений в Інституті фізики напівпровідників ім. В.Є. Лашкарьова НАН України (15)The device for potentiometric measurements, developed and manufactured at the Institute of Semiconductor Physics named after V.E. Lashkaryev National Academy of Sciences of Ukraine (15)

Визначення креатиніну запропонованим потенціометричним біосенсором на основі креатиніндеімінази для визначення концентрацій креатиніну у водних розчинах, дозволило проводити більш швидкий та точний аналіз біозразків, а сам біосенсор став більш перспективним для подальшого виробництва, за рахунок відмови, в процесі іммобілізації, від токсичних речовин та шкідливого УФ випромінювання. В іншу чергу, застосування при створенні біосенсора методу адсорбції креатиніндеіїмінази на силікаліті зменшило границю визначення креатиніну.Determination of creatinine by the proposed potentiometric biosensor based on creatine deaminase for determining creatinine concentrations in aqueous solutions made it possible to conduct a faster and more accurate analysis of biosamples, and the biosensor itself became more promising for further production due to the rejection of toxic substances and harmful UV radiation during the immobilization process . On the other hand, the use of the creatinine deiminase adsorption method on silicalite during the creation of the biosensor reduced the limit of creatinine determination.

В основі роботи потенціометричниого біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах лежить наступна ферментативна реакція:The basis of the potentiometric biosensor based on creatinine deaminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions is the following enzymatic reaction:

Креатиніндеїіміназа Креатинін ж НгО -» М-метилгідантоїн я МНа"Creatinine dei-iminase Creatinine and HgO -» M-methylhydantoin and MNa"

Зо В процесі проходження ферментативної реакції креатиніндеімінази розщеплює креатинін при цьому змінюється концентрація протонів у ферментній мембрані, відповідно, відбувається зміна рнН, яку і можна реєструвати за допомогою рН-чутливого польового транзистора (16).In the course of the enzymatic reaction, creatinine deiminase splits creatinine, while the concentration of protons in the enzyme membrane changes, accordingly, there is a change in pH, which can be recorded using a pH-sensitive field-effect transistor (16).

Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на фіг. 1 схематично представлено пропонований ферментний біосенсор на основі рН-пПтТThe essence of the proposed useful model is explained by graphic materials, where fig. 1 schematically presents the proposed enzyme biosensor based on pH-pPtT

З5 для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах; на фіг.2 показано блок-схему портативної потенціометричної біосенсорної системи для визначення концентрації креатиніну; на фіг. З наведено калібрувальні графіки залежності величини відгуків біосенсорів на основі креатиніндеімінази адсорбованої на силікаліті та іммобілізованої в парах ГА від концентрації креатиніну; а на фіг 4 продемонстровано таблицю порівняння основних робочих характеристик потенціометричного біосенсору на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах.C5 for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions; Fig. 2 shows a block diagram of a portable potentiometric biosensor system for determining creatinine concentration; in fig. From are calibration graphs of the dependence of the value of responses of biosensors based on creatinine deiminase adsorbed on silicalite and immobilized in HA vapors on the concentration of creatinine; and Fig. 4 shows a comparison table of the main performance characteristics of a potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions.

Пропонований потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеіїмінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах (Фіг. 1) складається з двох рН-ПТ (зигзагоподібні області затворів) - 1, 2, на які спочатку наносяться перші ідентичні мембрани на основі силікаліту - З та 4, відповідно. Далі на перший транзистор з мембраною на основі силікаліту (3) наносять другу робочу мембрану з креатиніндеіїміназою селективною до креатиніну (5), а на другий транзистор з першою мембраною на основі силікаліту (4) наносять другу референтну мембрану з сироватковим альбуміном бика (6). Зигзагоподібна геометрія затворних областей транзисторів має відношення довжини каналу до його ширини рівним 100, що забезпечує достатній рівень крутизни перехідної характеристики. р'-дифузійні шини (7) з контактами до стоку і витоку кожного з транзисторів виведені на край чипу, як і виводи до вбудованих мікроелектродів порівняння - 8. В центрі транзисторів розташовані контакти до п-підкладок - 9.The proposed potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions (Fig. 1) consists of two pH-PT (zigzag gate regions) - 1, 2, on which the first identical membranes based on silicalite - C and 4 are applied, respectively . Next, a second working membrane with creatinine-selective creatinine deiminase (5) is applied to the first transistor with a membrane based on silicalite (3), and a second reference membrane with bovine serum albumin (6) is applied to the second transistor with the first membrane based on silicalite (4). The zigzag geometry of the gate regions of the transistors has a ratio of the length of the channel to its width equal to 100, which provides a sufficient level of steepness of the transient characteristic. p'-diffusion buses (7) with contacts to the drain and drain of each of the transistors are placed on the edge of the chip, as well as the terminals to the built-in microelectrodes of comparison - 8. In the center of the transistors there are contacts to p-substrates - 9.

Алюмінієві контактні площини до усіх транзисторних виходів, виведені на край кожного з чипів - 10. Вказаний потенціометричний біосенсор 11 /ПБ/ (Ффіг.2) підключений до відповідних входів портативного потенціометричного приладу 12 /ПП/. Виходи приладу 12 /ПП/ підключені до відповідних входів блоку живлення 13 /БЖ/ та комп'ютера 14 /ПК/У.Aluminum contact planes to all transistor outputs, brought to the edge of each of the chips - 10. The specified potentiometric biosensor 11 /PB/ (Fig. 2) is connected to the corresponding inputs of the portable potentiometric device 12 /PP/. The outputs of the device 12 /PP/ are connected to the corresponding inputs of the power supply unit 13 /BZH/ and the computer 14 /PC/U.

Пропонований потенціометричний біосенсор на основі креатиніндеіїмінази для визначення 60 концентрації креатиніну у водних розчинах працює наступним чином.The proposed potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determination of creatinine concentration in aqueous solutions works as follows.

Попередньо виготовляли біоселективні мембрани. Для створення гелю для першої мембрани готували розчин з вмістом 5 95 силікаліту у 5 мМ калій-фосфатному буфері рН 7,4.Bioselective membranes were previously manufactured. To create a gel for the first membrane, a solution containing 5 95 silicalite in 5 mM potassium phosphate buffer pH 7.4 was prepared.

Отриманий розчин силікаліту поміщали в ультразвукову баню на дві години для гомогенізації розчину. Далі, на робочі поверхні обох рН-чутливих польових транзисторів, наносили 0,2 мкл гомогенного розчину силікаліту. Для фіксації силікаліту на поверхні транзисторів, датчик розміщували у сухо-жаровій шафі на 20-25 хвилин за температури 60-70 "С. Для створення гелю для другої ферментної мембрани готували розчин з вмістом 20 95 креатиніндеімінази, 20 95 БСА, 4 95 лактітол, 0,4 95 ОЕАЕ-декстран, 10 95 гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. До складу гелів додавався гліцерин для стабілізації ферменту при іммобілізації та запобігання передчасному підсиханню розчину, нанесеного на поверхню перетворювача. В свою чергу, сироватковий альбумін бика в складі ферментних мембран відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Гель для створення другої референтної мембрани готувався з вмістом 40 95 БСА, 10 95 гліцерину у 20 мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Далі приготовлені ферментний та референтний гелі наносили на поверхню транзисторів вкритих першими мембранами на основі силікаліту (по 0,1 мкл робочого та референтного) і залишали на відкритому повітрі на 15-20 хвилин до повного висихання.The resulting silicalite solution was placed in an ultrasonic bath for two hours to homogenize the solution. Next, 0.2 μl of a homogeneous solution of silicalite was applied to the working surfaces of both pH-sensitive field-effect transistors. To fix the silicalite on the surface of the transistors, the sensor was placed in a dry oven for 20-25 minutes at a temperature of 60-70 "C. To create a gel for the second enzyme membrane, a solution was prepared containing 20 95 creatine deiminase, 20 95 BSA, 4 95 lactitol, 0.4 95 OEAE-dextran, 10 95 glycerol in 20 mM phosphate buffer, pH 7.4. Glycerin was added to the composition of the gels to stabilize the enzyme during immobilization and prevent premature drying of the solution applied to the surface of the transducer. In turn, bovine serum albumin in the composition of enzyme membranes, it played the role of a stabilizing agent for enzymes. The gel for creating the second reference membrane was prepared with a content of 40 95 BSA, 10 95 glycerol in 20 mM phosphate buffer, pH 7.4. Next, the prepared enzyme and reference gels were applied to the surface of the transistors covered by the first membranes based on silicalite (0.1 μl of working and reference each) and left in the open air for 15-20 minutes until completely dry.

Таким чином, біоселективна мембрана біосенсора, нанесена на робочу область першого рН-чутливого польового транзистора, складалась з 20 мМ фосфатного буфера, рн 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас Об): 2-10 силікаліт, 5-15 креатиніндеїміназа, 5-15 БСА, 5-15 гліцерин, 1-5 лактітол, 0,1-0,6 ОЕАЕ-декстран.Thus, the bioselective membrane of the biosensor applied to the working area of the first pH-sensitive field-effect transistor consisted of 20 mM phosphate buffer, pH 7.4, and the following ingredients in the following ratio (by mass of Ob): 2-10 silicalite, 5 -15 creatine deiminase, 5-15 BSA, 5-15 glycerol, 1-5 lactitol, 0.1-0.6 OEAE-dextran.

Ідентична референтна мембрана наносились на робочі області обох біосенсорів, і складались з 20 мМ фосфатного буфера, рН 7,4, та з наступних інгредієнтів у такому їх співвідношенні (у мас 95): 2-10 силікаліт,An identical reference membrane was applied to the working areas of both biosensors, and consisted of 20 mM phosphate buffer, pH 7.4, and the following ingredients in the following ratio (in mass 95): 2-10 silicalite,

Коо) 10-30 БСА, 5-15 гліцерин 1-5 лактітол, 0,1-0,6 ОЕАЕ-декстран.Koo) 10-30 BSA, 5-15 glycerin, 1-5 lactitol, 0.1-0.6 OEAE-dextran.

Співвідношення компонентів біоселективних мембран біосенсорної системи було отримано експериментально. Його підібрали для покращення аналітичних характеристик біосенсорів, таких як селективність, чутливість, операційна стабільність та ін.The ratio of the components of the bioselective membranes of the biosensor system was obtained experimentally. It was selected to improve the analytical characteristics of biosensors, such as selectivity, sensitivity, operational stability, etc.

Після процесу іммобілізації біосенсори висушували 15 хвилин на повітрі за кімнатної температури. Перед початком роботи, для видалення надлишку незв'язаних силікаліту, ферменту та інших компонентів мембран, біосенсори відмивали протягом 20 хвилин у буфері, в якому і проводили подальші досліди.After the immobilization process, the biosensors were dried for 15 minutes in air at room temperature. Before starting work, to remove excess unbound silicalite, enzyme and other membrane components, the biosensors were washed for 20 minutes in the buffer in which further experiments were carried out.

Приклад аналізу вмісту креатиніну в розчині.Example of analysis of creatinine content in solution.

Біосенсор заздалегідь під'єднаний до приладу для потенціометричних вимірювань поміщали до вимірювальної комірки 1,5 мл, заповненої 5 мМ фосфатним буфером, рН 7,4, та витримували декілька хвилин для отримання стабільної базової лінії. Потім додавали певну аліквоту модельного розчину креатиніну, отримували сигнал. Сигнал від біосенсора автоматично оброблявся комп'ютером і виводився у графічному вигляді на екран монітора.The biosensor, previously connected to the device for potentiometric measurements, was placed in a 1.5 ml measuring cell filled with 5 mM phosphate buffer, pH 7.4, and kept for several minutes to obtain a stable baseline. Then a certain aliquot of creatinine model solution was added, and a signal was obtained. The signal from the biosensor was automatically processed by the computer and displayed graphically on the monitor screen.

Шляхом додавання різної кількості певних аліквот модельних розчинів креатиніну було побудовано калібрувальну криву для визначення концентрації креатиніну (Фіг.3). Після отримання кожного відгуку біосенсор відмивали від продукту, змінюючи робочий буфер мінімумBy adding different amounts of specific aliquots of creatinine model solutions, a calibration curve was constructed to determine the creatinine concentration (Fig. 3). After receiving each response, the biosensor was washed from the product, changing the working buffer to a minimum

З рази кожні 15-30 с, до виходу сигналу на базову лінію. Границя визначення креатиніну становила - 2 мкМ, що в 10 разів нижче ніж у найбільш близького за технічною суттю біосенсора з границею визначення 20 мкМ.From times every 15-30 s, until the signal is output to the base line. The detection limit of creatinine was 2 μM, which is 10 times lower than that of the closest biosensor with a detection limit of 20 μM.

Визначення концентрації креатиніну в аналізованих зразках діалізату та крові здійснювали за калібрувальною кривою. Спочатку додавали аліквоту проби до вимірювальної комірки та отримували відгук біосенсора. Далі за калібрувальною кривою вираховували концентрацію креатиніну в невідомій пробі Основні робочі характеристики запропонованого потенціометричного біосенсора на основі креатиніндеімінази для визначення концентрації креатиніну у водних розчинах та найбільш близького до нього за технічною суттю біосенсора на основі креатиніндеїмінази іммобілізованої в парах ГА дуже відрізнялись (Фіг.4). Наприклад, час бо відгуку запропанованого біосенсора на основі креатиніндеамінази адсорбованої на силікаліті та його час регенерації складали - 1 хв, що щонайменше в три рази швидше, ніж у біосенсора на основі фермента іммобілізованого в парах ГА. Також запропонований біосенсор характеризувався ширшим лінійним діапазоном, кращою чутливістю до субстрату та в 10 разів меншою похибкою вимірювання.Determination of creatinine concentration in the analyzed samples of dialysate and blood was carried out according to the calibration curve. First, an aliquot of the sample was added to the measuring cell and the response of the biosensor was obtained. Next, the concentration of creatinine in the unknown sample was calculated from the calibration curve. The main performance characteristics of the proposed potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions and the closest to it in terms of technical essence biosensor based on creatinine deiminase immobilized in HA vapors were very different (Fig. 4). For example, the response time of the proposed biosensor based on creatine deaminase adsorbed on silicalite and its regeneration time was 1 min, which is at least three times faster than that of the biosensor based on the enzyme immobilized in HA vapors. Also, the proposed biosensor was characterized by a wider linear range, better sensitivity to the substrate, and 10 times less measurement error.

Джерела інформації:: 1. М. Сгацадегпа, уУ.Комаїсгук, Зітріє, зеїІесіїме, апа взепвійме теавзигтетепі ої шгєа іп родуSources of information:: 1. M. Sgatsadegpa, uU. Komaisguk, Zitrie, zeiIesiime, apa zzepviime teavzygtetepi oi shgea ip rodu

Тцід5 ої таттаї!5 Бу гемегзед-рназе ийга-таві Іїдцід спготаїйодгарну // Сгесй у. Апіт. Зсі. -2012.-Tcid5 oi tattai!5 Bu gemegzed-rnaze yiga-tavi Iidtsid spgotaiyodgarnu // Sgesy u. Appetite All together. -2012.-

Мої. 57. -УНІ.-Р. 19-27. 2. 4.-б. Спеп, А.5. Китаг!, Н.-Н. Спипд, 5.-Н. Спієп, М.-С. Кио, 9У.-М. 2еп, Ап еплутеїЇевз5 еіесігоспетіса! вепзог їог Ше зеїесіїме деїептіпайоп ої сгеаїййпіпе іп питап шгіпе // Зепзог апаMy. 57. -UNI.-R. 19-27. 2. 4.-b. Spep, A.5. Kitag!, N.-N. Spipd, 5.-N. Spiep, M.-S. Kyo, 9U.-M. 2ep, Ap epluteiIevz5 eiesigospetisa! vepzog yog She zeyesiime deieptipayop oi sgeaiyypipe ip pitap shgipe // Zepzog apa

Асіцайогз В. - 2006. - Мої. 115. - Р. 473-480.Asitsayogz V. - 2006. - My. 115. - R. 473-480.

З. Копскі В., Несепі аемеІортепі іп роїепіотейіс Біозепзоїг5 Тог Біотеадісаї апаї|увів // АпаіуїїсаZ. Kopski V., Nesepi aemeIortepi ip roiepioteiis Biozepzoig5 Tog Bioteadisai apai|uviv // Apaiuiiisa

СНітіса Асіа. - 2007. - Мої. 599. - Р. 7-15. 4. Р.С. Рапавєу, А.Р. Мізнга, Моме! роїепіотеїгіс зепвіпу ої сгеаїйїпіпе // Зепвзог апа Асіцайогв5SNitis Asia. - 2007. - Mine. 599. - R. 7-15. 4. R.S. Rapavieu, A.R. Miznga, Mom! roiepioteigis zepvipu oi sgeaiyipipe // Zepvzog apa Asitsayogv5

В. - 2004. - Мої. 99. - Р. 230-235. 5. А.Р. БоідаїКіп, у). Мопіогпо!ї, МУ. Запі, С Мапеївї, М. Уантегіс-Вепації, Стєаїїпіпе зепзййме ріозепзог разей оп ІЗЕЕТ5 апа стгєаїїпіпе деїітіпазе ітторбіїведй іп ВБА тетрбгапе // ТаїІапіа. - 2002. - Мої. 58. - Р. 351-357. б. М. Чане, Обег деп Мієдет5спіІад, меїІснеп РіКтіпзацше іп поттаЇеп Нат еггецді. ипа іїрег єіпе пеце ВНеасійп апа К'єаїїіпіпз // 2. Рпузіо!ї. Спет. - 1886. - Мої. 10. - Р. 391-400. 7. Р.К. Уаупез, В.О. Ред, С.Р. донпзоп, Ап епгутаїййс геасііоп-гаїе аззау тюг зепит сгєаїіпіпе м/ їй а сепіттидаї! апаїугег // Сіп. Спет. - 1982. - Мої. 28. - Р. 114-117. 8. Аппа НадотвзкКа, Вобегп Копсекі, Кгузіупа руггуп5Ка, єтапівіам/ Сіа Б, Віопапа|уїїса! взувієтV. - 2004. - My. 99. - R. 230-235. 5. A.R. BoidaiKip, u). Mopiogpo!i, MU. Zapi, S. Mapeivi, M. Uantegis-Vepacii, Steaiyipipe zepzyyme riozepsog razey op IZEET5 apa stgeaiyipipe deiiitipase ittorbiyivedy ip VBA tetrgbape // TaiIapia. - 2002. - Mine. 58. - R. 351-357. b. M. Chane, Obeg dep Miedet5spiIad, meiIsnep RiKtipzatsshe ip pottaYep Nat eggecdi. ipa iireg eipe pece VNeasiip apa Kyeaiiiipipz // 2. Rpuzio!i. Spent - 1886. - Mine. 10. - R. 391-400. 7. R.K. Waupez, V.O. Red, S.R. donpzop, Ap epgutaiyys geasiiop-gaie azzau tyug zepit sgeaiipipe m/ her a sepittidai! apaiugeg // Sip. Spent - 1982. - Mine. 28. - R. 114-117. 8. Appa NadotvzkKa, Vobegp Kopseki, Kguziupa ruggup5Ka, etapiviam/ Sia B, Viopapa|uiyisa! shoes

Тог сопігої ої петодаіаїувзів ігеайтепі Базей оп роїепіотеїйіс Біозепзог ог игеа апа сгеаїїпіпе //Tog sopigoi oi petodaiaiiuvziv igeaiitepi Basei op roiepioteiiis Biozepsog og igea apa sgeaiiiipipe //

Апа/уїіса Спітіса Асіа. - 2004. - Мої. 523. - Р. 193-200. 9. Чижієміс: М, АїІєдгеї 5., АІтігаї! У., Сагсіа М, Рабгедаз Е., Оємеіортенпі ої а БірагатетісApa/uiisa Spitis Asia. - 2004. - Mine. 523. - R. 193-200. 9. Chizhiemis: M, AiIedgei 5., AItigai! U., Sagsia M, Rabgedaz E., Oyemeiortenpi oi a Biragatetis

Біоапа!узег ог сгєаййпіпе апа цгеа. Маїїдайоп ої Ше аеїептіпайоп ої ріоспетіса! рагатеїетг5 аззосіаїей мій петодіа!увів // Апаїувзі. - 1998. - Мої. 123. - Р. 1321-1327. 10. Мапиєї Сшієгте, Заїмадог АїІедгеї, Мапиєї дае! Маїїє, Віоевієсієюпіс їопдиє ог Ше вітийапеоив аеєїегтіпайоп ої игеа, сгеаїйіпіпе апа аїКаїїпе іоп5 іп сіїпіса! затріев // Віозепзог апаBioapa!uzeg og sgeayypipe apa tsgea. Maiidayop oi She aeieptipaiop oi riospetisa! ragateiietg5 azzosiaiei my petodia!uviv // Apaiuvzi. - 1998. - Mine. 123. - R. 1321-1327. 10. Mapiyei Sshiegte, Zaimadog AiIedgeyi, Mapiyei dae! Mayiye, Vioeviesiyupis iopdiye og She vitiyapeoiv aeeieigtipaiop oi igea, sgeaiiipipe apa aiKaiiipe iop5 ip siipisa! Zatriev // Viozepzog apa

ВіовІесігопісв. - 2008. - Мої. 23. - Р. 795-802. 11. О.А. 7іпспепко, 5.М. МагспепКо, Т.А. бегдеуєма, А. КиКіа, А.5. Раміуиспепко, Е.К.ViovIesigopisv - 2008. - Mine. 23. - R. 795-802. 11. O.A. 7ipspepko, 5.M. MagspepKo, T.A. begdeuema, A. KiKia, A.5. Ramiuyspepko, E.K.

Кгазуик, А.Р. БоїЇдаїКіп, А.М. ЕГзКауа, Арріїсайоп ої стеаїйіпіпе-зеп5ййме Біозепзог ог Петодіаїувів сопігої // Віозепзої:5 апа ВіоєІесітопісв. - 2012,- Мої. 35. - Р. 466-469. 12. А.Р. БоідаїКіп, У. Мопіогіої, МУ. Запі, С. Мапеївї, М. дайтегіс-Вепацшії, ЮОемеІортепі ої роїепіотеїйнс сгеаїйпіпе-5епвійме Біозепзог Базейд оп ІЗЕЕТ апа стгеєаїйпіпе деітіпазе ітторбіїївеа іп РМА/5БО рпоїороїЇутетгіс тетбгапе // МаїйегіаІ5 5сіеєпсе апа Епадіпеегіпд С - 2002. - Мої. 21. - Р. 75-79. 13. Марченко С.В., Зінченко О.А., Поляков Л.С., Герешко А.М., Дзядевич С.В., СолдаткінKgazuyk, A.R. BoiYidaiKip, A.M. ЕГзКауа, Arriisayop oi steaiyipipe-zep5yme Biozepsog og Petodiaiuviv sopigoi // Viozepzoi:5 apa VioyeIesitopisv. - 2012, - Mine. 35. - R. 466-469. 12. A.R. BoidaiKip, U. Mopiogioi, MU. Zapi, S. Mapeivi, M. Daitegis-Vepatshii, YuOemeIortepi oi roiepioteiins sgeaiipipe-5epviime Biozepsog Baseid op IZEET apa stgeeaiipipe deitipase ittorbiiiivea ip RMA/5BO rpoioiroiYutetgis tetbgape // MaiyegiaI5 5sieepse apa 20 Epadipai - 20 Mo. 21. - R. 75-79. 13. Marchenko S.V., Zinchenko O.A., Polyakov L.S., Gereshko A.M., Dzyadevich S.V., Soldatkin

О.П.// Біосенсор на основі креатиніндеіїмінази та рН-чутливого польового транзистора для аналізу креатиніну в сироватці крові // Віоїтесппоіодіа Асіа. - 2013. - Мої. б, Ме5.-с.79-86. 14. Марченко С.В., Назаренко О.А., Кукла О.Л., Павлюченко О.С., Красюк Е.К., СолдаткінO.P.// Biosensor based on creatinine deiminase and pH-sensitive field-effect transistor for the analysis of creatinine in blood serum // Vioitesppoiodia Asia. - 2013. - Mine. b, Me5.-p.79-86. 14. Marchenko S.V., Nazarenko O.A., Kukla O.L., Pavlyuchenko O.S., Krasyuk E.K., Soldatkin

О.П. Розробка креатинін-чутливого біосенсора для медичного застосування // бепзог ЕІесігопісв апа Містгозузієт Тесппо!одіев. - 2009. - Мої. 4. - с 55-62. 15. Кукла О.Л., Павлюченко 0.С., Бушма О.В., Голтвянський Ю.В., Дзядевич С.В., СолдаткінO.P. Development of a creatinine-sensitive biosensor for medical use // bepzog Eiesigopisv apa Mistgozuziet Tesppo!odiev. - 2009. - Mine. 4. - pp. 55-62. 15. Kukla O.L., Pavlyuchenko O.S., Bushma O.V., Holtvyanskyi Y.V., Dzyadevich S.V., Soldatkin

О.П., Патент України на корисну модель "Аналого-дифровий іонно-сенсорний вимірювач параметрів рідких середовищ", ША Мео48359 МПК С01М 27/26, 27/27, заявл.26.10.2009, опубл. 10.03.2010, Бюл. Мо5. 16. 5.М.О2уадемуси, А.Р.Боідаїкіп, А.М.ЕІ5Кауа, С.Мапйеївєї, М.дайтегіс-Вепації. ЕпгутеO.P., Patent of Ukraine for the utility model "Analog-difference ion-sensor parameter meter of liquid media", Shaa Meo48359 MPK S01M 27/26, 27/27, application 10/26/2009, publ. 10.03.2010, Bull. Mo5. 16. 5. M. O2uademusy, A. R. Boidaikip, A. M. Ei5 Kaua, S. Mapyeivye, M. Daitegis-Vepacii. Epgut

Біозепзого разей оп іоп-зеїЇеєсіїме їієЇїд-енесі ігапвівіог5 // Апаїуїйса СПітіса Асіа. - 2006, 568.-Biozepzogo razei op iop-zeiYeeesiime iiieYid-enesi igapviviog5 // Apaiuiisa SPitis Asia. - 2006, 568.-

Р.248-258.R. 248-258.

Claims

USEFUL MODEL FORMULA

A potentiometric biosensor based on creatinine deiminase for determining the concentration of creatinine in aqueous solutions, consisting of a potentiometric sensor based on two pH-sensitive field-effect transistors, which is distinguished by the fact that the first transistor is coated with a first membrane based on silicalite, which is then coated with a second enzyme membrane on based on creatinine deiminase, which is sensitive to creatinine, is also applied to the second transistor

60 the first membrane based on silicalite and the second reference membrane, and the specified biosensor is connected to the inputs of the device for potentiometric measurements, and the outputs of this device are connected to the corresponding inputs of the computer. Mkzhzhyakh shk zhk i Shk -: y rai Sho I N g y N v i E dit i . di i v i Z i sova h E nn roya i Shi i N feny pn u third sht det 4 : i Ps o: M yti ! shoi: in OO i i shi S r vo VM di p i gi p shchi GOD tn she i | ! shi ' b N NN EV EYA NE I N Shen y i ri EE y NE ШY In us Ki I OO Dn j janv i r En DYA Z j Y I i BObronh Z roshit - ! ! - Esh SHE Ne dent N N h i Zo E rys i Pec i i 5 th day: oi OB still i i in Rio 0 bo . в в Я и ши и и: EV EMV ZON Ne en My s sho a Kn V Fig 11 le 13 AV/ 14 tyu 135 BU

Fig. 2 va Z i nn, 2, 1 ve Aderrotsia na sitet h ti ra GK E 2 Gi) Y ke ke) I Ky ke Z ia rev) ii KE sh 4 in B, KU 1 g Ye rya Ya ek y 7 her Number 2: . yiv Imomebinization in saturated vapors HA V g V raki Time E and niv tini iii ions zim zdo poni failure o e 4 y V no) ICreatinine, mm

Fig. Z N Roikizi harayutelnotnih and Adeonvye kp enlikaliti Immebilizatsiv z ke hA T i : I | and: : about Time-Repeat! (5- izhe | Z-Yah 00 : Time of regeneration and i min i rode I N ApNVNNH ACTIONS of KM hi Krevtvivu Mk u m KETI, N Tiniizhiy acted i Z VM hroveanivu | 0-5 mm blood I Kohiki measurement EVENT PO i Moh Y BE roya! TO: i o non pnya i ptn KA KAAA Kk AAAAAAlAnnnn Chun st oesevosyuma: also Y i and B that PI zva mA | ia mKA i: o fvideuk on 1 ME kreatvnyni | V U udlllkllnnklnnnn nan tt AKA tt KAN KAAKAAKKAAKA KK AKAKAKKAAKAAKKAAAAAAAAAAALI CHANNEL

Fig. 4