TWM587176U - 具仿生微結構的細胞培養基質及含此的細胞培養裝置 - Google Patents

Abstract

本創作提出一種具仿生微結構的細胞培養基質，其為天然高分子材料所組成，且包含：一基底部、以及複數個突出於基底部的突出部，且每一突出部形成有多個皺褶。

Description

具仿生微結構的細胞培養基質及含此的細胞培養裝置

本創作關於一種細胞培養基質，且特別攸關一種具仿生微結構的細胞培養基質及含此的細胞培養裝置。

於胚胎發育或幹細胞分化的過程，微環境所產生的力效應對於細胞分化與移動及組織成型扮演著重要角色。近年來，科學家嘗試結合各種材料工程技術或結構元件來設計模擬出細胞外基質，進而提供細胞不同的生物化學或機械力學刺激。有別於發育生物學著重於生物發育基因表現的探討，組織工程學則選擇以工程角度於體外打造仿生組織發育摺疊的微環境，以探討仿生微環境的力學刺激對細胞生長發育的影響。力學微環境除了來自細胞本身所附著的細胞外基質二維回饋給細胞的機械應力訊號外，如：軟硬度與表面拓樸結構等，尚包括體內剪力流體刺激及動作引發的拉伸收縮三維機械力學刺激。細胞外基質隨著組織的不同有著極大的差異，其可由多種蛋白質、蛋白多醣、碳水化合物或其衍生物組成產生不同的二維機械應力訊號，也可因應組織特性產生不同動作導致三維機械應力訊號的刺激。更重要的是，其蘊含著不同生長素，而可產生各種生物化學及機械性質組合。從基質的二維機械應力訊號、三維機械應力訊號到生長因子訊號，每一個細微的變化都大大地影響胚胎中幹細胞的增生與分化。

進一步地深入探究胚胎發育與幹細胞分化，會發現微觀組織下細胞的排列規則，使得組織摺疊存在於人體各種軟組織中，如：腦、小腸、血管、心臟、與肝等器官的組織。於組織發育的微環境中，在不同時期的胚胎發育過程中細胞亦同時深受這些摺疊所產生微應力影響，若再加上組織發育時所面臨的多元生物化學及物理刺激，便造就胚胎中多樣化組織發育與複雜度。於2017年，Ozdoganlar所屬的研究團隊模仿天然生理組織的幾何形狀，而利用多孔明膠-硫酸軟骨素-透明質酸(gelatin-chondroitin-6-sulfate-hyaluronic acid，Gel-C6S-HA)製備出3D波形微形貌表面的支架，進而於起伏的支架表面上成功培養出人類成纖維細胞，並建構出仿生真皮組織中的乳頭層，這項研究證明透過組織摺疊的調控，可精確控制複雜組織發育的3D微形貌表面及功能。於2018年，Gartner所屬的研究團隊利用有限元素分析模擬及三維細胞圖案技術來證明細胞外基質的機械壓實能夠循著程式化的軌跡驅動組織摺疊，並引起由細胞自組形成的團聚物周圍和膠原蛋白之間的排列圖案化，促使組織沿著預期軌跡產生介面摺疊。此外，Jianping Fu所屬的研究團隊亦發表一種微型組織工程技術，此研究證實可透過細胞收縮力引起細胞負載的膠原蛋白薄膜來有效地引入結構異向性並控制膠原蛋白薄膜的自我摺疊方向，並能真正仿造組織發育過程產生的摺疊、力學變化與形貌。然而，上述透過細胞收縮力產生的材料摺疊行為無法有效控制最終材料形狀，且耗費時間通常較長，同時會增加未來應用上的困難度。若能有效控制材料摺疊與皺摺表現，深入研究材料結構與外來環境刺激的牽引力對於細胞生長分化與基因表現產生 的影響，勢必於未來帶動組織工程技術突飛猛進。

職是之故，藉由生物胚胎發育的啟發，透過創新材料結構的操控及模擬生態環境的物化刺激(生長因子與光、電、磁、力)，從材料組織工程角度切入，藉由仿生概念來建構一種有可能在體外培養出仿生組織或器官的應用技術平台確實為本創作所屬技術領域人士積極解決的課題之一。

本創作之一目的在於提供一種細胞培養基質，其具有仿生摺疊與皺摺的微環境，而可提供如同生物體內的環境條件，進而於體外培養出仿生組織或器官。

是以，本創作提出一種具仿生微結構的細胞培養基質，其為天然高分子材料所組成，且包含：一基底部、以及複數個突出於基底部的突出部，且每一突出部形成有多個皺褶。

依一實施例，天然高分子材料為蛋白質、多醣、或其衍生物。

依另一實施例，蛋白質為膠原蛋白或動物明膠。

依又一實施例，多醣為玻尿酸、幾丁聚醣、或褐藻酸鹽。

依再一實施例，培養基質的製造方法包含以下步驟：提供一可溶性模仁；添加一天然高分子溶液至可溶性模仁的複數個模穴內；固化天然高分子溶液以形成一培養基質前驅體；溶解可溶性模仁使培養基質前驅體脫模；乾燥培養基質前驅體；以及對培養基質前驅體復水。

依另一實施例，可溶性模仁為採3D列印所取得的。

依又一實施例，可溶性模仁為熱可逆材料所組成。

依再一實施例，熱可逆材料為poloxamer 407(商品名為：Pluronic FP407)。

依本創作，由於此細胞培養基質為天然高分子所組成，故對細胞幾乎無毒性具生物相容性。此外，於細胞培養於細胞培養基質時，可與皺褶接觸而產生二維機械應力訊號，並搭配培養液的流動與成分組成產生三維機械應力訊號與生長因子訊號，進而使細胞彷彿置身於生物體內培養而生長並分化成仿生組織或器官。

(1)‧‧‧培養容器

(2)‧‧‧細胞培養基質

(21)‧‧‧基底部

(22)‧‧‧突出部

(23)‧‧‧皺摺

(3)‧‧‧可溶性模仁

(31)‧‧‧模穴

(32)‧‧‧外壁

(33)‧‧‧分隔壁

(4)‧‧‧天然高分子溶液

(5)‧‧‧培養基質前驅體

(D1至D2)‧‧‧高度

圖1為一剖面圖，說明著本創作之一實施方式的細胞培養裝置。

圖2為一系列剖面圖，說明著培養基質的製造。

圖3為一剖面圖，說明著可溶性模仁。

為讓本創作上述及/或其他目的、功效、特徵更明顯易懂，下文特舉較佳實施方式，作詳細說明於下：組織工程乃由初始「由上到下(top-down)」方式發展至「由下到上(bottom-up)」方式。「由上到下」方式也就是傳統組織工程技術，其透過將細胞由人體內組織分離，並種於可分解性高分子支架上且賦予生長所需之生長、傳遞等因子，待再生組織逐漸擴展並取代高分子支架後，最後形成一具有原來型態與功能的器官或組織；而「由下到上」方式則是 近十年來學者提倡的新概念，其提供更多自由度與可控性，可透過多種不同方法準備三維單位元素(building block)或組織模組(modular tissue)，進而將其排列而形成更大空間、更複雜結構、且包含多種異質細胞共培養的三維仿生組織，甚至有可能於時間上操控共培養條件與環境，達到動態共培養來研究細胞間的互動(cell-cell interaction)。基於天然高分子水膠於多元組織適用性與可控性，本創作乃基於以下所完成的：採用天然多醣或天然蛋白質衍生物為基礎，並搭配3D列印技術形成的模仁來產生出仿生的摺疊構形，製備出一複合仿生微環境的細胞培養基質，藉以模擬真實組織微環境與調控幹細胞分化。

請參照圖1，繪示著本創作之一實施方式的細胞培養裝置，其可培養細胞(如：幹細胞或胚胎細胞)並生長分化成仿生組織或器官，且此裝置含有一培養容器(1)及一具仿生微結構的細胞培養基質(2)。

培養容器(1)可供細胞與培養液容置，其實例可為但不限於細胞培養盤或細胞培養皿。

細胞培養基質(2)為設置於培養容器(1)內，其為天然高分子材料所組成，且包含：一基底部(21)、以及複數個突出於基底部(21)的突出部(22)，每一突出部(22)形成有多個皺褶(23)。天然高分子材料的實例可為但不限於蛋白質、多醣、或其衍生物；蛋白質的實例可為但不限於膠原蛋白或動物明膠，多醣的實例可為但不限於玻尿酸、幾丁聚醣、或褐藻酸鹽。

另請參照圖2，說明著上述細胞培養基質(2)的製造方法： 首先，提供一可溶性模仁(3)。此可溶性模仁(3)如圖3所示具有多個模穴(31)，其中此等模穴(31)中的最外側者為相鄰的外壁(32)與分隔壁(33)所界定，其餘者則為相鄰的二分隔壁(33)所界定。由於模穴(31)對應於後續得到之細胞培養基質(2)的突出部(22)，故為得到細胞培養基質(2)的基底部(21)，外壁(32)的高度(D1)高於任一分隔壁(33)的高度(D2)為宜。此外，目前公認3D列印技術能應用於高度且重複的快速製造，並且可透過參數的控制生產具有精確尺寸、幾何形狀、與高水平機械強度的列印產物，故可溶性模仁(3)可為採3D列印所取得的，但不以此為限。3D列印可溶性模仁(3)的好處在於：可簡單地控制參數(如：分隔壁(33)高度(D2)或外壁(32)與分隔壁(33)的高度差)來調整突出部(22)的間距或高度，進而使細胞培養基質(2)的突出部(22)於結構上更貼近於生物體內的環境。另外，可溶性模仁(3)可為但不限於熱可逆材料所組成；熱可逆材料的實例可為但不限於poloxamer 407(商品名為：Pluronic FP407)，而選擇poloxamer 407的好處在於：其為美國食品藥物管理局(Food And Drug Administration，FDA)核准的醫用高分子材料，於37℃下為凝膠，低溫下為液態，而便於後續進行的脫模且即便部分殘留於細胞培養基質(2)亦不致對細胞造成傷害。

其次，添加一天然高分子溶液(4)至可溶性模仁(3)的複數個模穴(31)內，並固化天然高分子溶液(4)以形成一培養基質前驅體(5)。一般而言，固化方式可依天然高分子溶液(4)中添加的固化劑種類而定，其可為但不限於光固化方式。此外，為進行光固化，所添加的天然 高分子溶液(4)含有光固化劑。

然後，溶解可溶性模仁(3)使培養基質前驅體(5)脫模。一般而言，溶解方式可依可溶性模仁(3)的種類與性質而定。於可溶性模仁(3)為熱可逆材料所組成的條件下，可將可溶性模仁(3)置於低溫(如：4℃)下，使可溶性模仁(3)自凝膠轉變為液態而使培養基質前驅體(5)脫模。

最後，乾燥培養基質前驅體(5)，並對培養基質前驅體(5)復水。乾燥主要讓培養基質前驅體(5)的表面殘留物去除，而乾燥可採用但不限於風吹的方式實現。復水主要透過培養基質前驅體(5)各部位厚薄度不同，使得不同部位的吸水度亦不同，進而使得培養基質前驅體(5)產生不規則皺褶(23)而作為細胞培養基質(2)。

綜上所述，本實施方式的細胞培養基質具有不規則的仿生摺疊與皺褶，且為天然高分子所組成，故於培養細胞時不僅對細胞無毒具有相容性外，細胞與皺褶的接觸亦可產生二維機械應力訊號。此外，培養液的添加除了成分引發的生長因子訊號外，液體流動產生的物理現象亦可引起細胞產生三維機械應力訊號。透過上述方式，細胞於此細胞培養基質的培養即如同培養於生物體內，而可生長並分化成仿生組織或器官。

惟以上所述者，僅為本創作之較佳實施例，但不能以此限定本創作實施之範圍；故，凡依本創作申請專利範圍及說明書內容所作之簡單的等效改變與修飾，皆仍屬本創作專利涵蓋之範圍內。

Claims (8)

1. 一種具仿生微結構的細胞培養基質，其為天然高分子材料所組成，且包括：一基底部；以及複數個突出部，係突出於該基底部，且每一突出部形成有多個皺褶。
2. 如請求項第1項所述之細胞培養基質，其中該天然高分子材料為蛋白質、多醣、或其衍生物。
3. 如請求項第2項所述之細胞培養基質，其中該蛋白質為膠原蛋白或動物明膠。
4. 如請求項第2項所述之細胞培養基質，其中該多醣為玻尿酸、幾丁聚醣、或褐藻酸鹽。
5. 如請求項第1項所述之細胞培養基質，其中該培養基質的製造方法包含以下步驟：提供一可溶性模仁；添加一天然高分子溶液至該可溶性模仁的複數個模穴內；固化該天然高分子溶液以形成一培養基質前驅體；溶解該可溶性模仁使該培養基質前驅體脫模；乾燥該培養基質前驅體；以及對該培養基質前驅體復水。
6. 如請求項第5項所述之細胞培養基質，其中該可溶性模仁為熱可逆材料所組成。
7. 如請求項第5項所述之細胞培養基質，其中該熱可逆材料為poloxamer 407。
8. 一種細胞培養裝置，係包括：一培養容器；以及一如請求項第1至7項中任一所述的細胞培養基質，係設置於該培養容器內。