TWM519242U - 快速高通量聚合酶連鎖反應設備 - Google Patents

Description

快速高通量聚合□連鎖反應設備

本新型是有關於一種熱循環裝置應用於高通量聚合□連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)。

聚合□連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)係一種將單一或數個待複製之一段去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)放大至多個數量級，產生數千至數十萬個複製之特定DNA序列。引子(primer，短DNA片段)包含與目標區域互補之序列，其與DNA聚合□為使選擇性且重複性放大可行之關鍵要素。此方法依靠熱循環，其係由重複加熱與冷卻反應之循環組成，以使DNA熔解以及DNA之酵素性複製。常見之PCR係由具有三個溫度步驟之循環所進行(請參照第1a圖)。每一循環所使用之溫度以及時間長度係基於多種參數決定。這些包含用於DNA合成之酵素、二價離子(divalent ion)以及去氧核□酸三磷酸(deoxynucleotide triphosphate，dNTP)於反應中之濃度以及引子之熔點(T _m)。

隨著執行PCR反應之需求的增加，減少與執行PCR相關之成本以及時間變得更加重要。成本的減少可透過微小化，藉由減少PCR反應所需材料之體積所實現。PCR反應整體的時間可藉由降低樣品暴露以及在PCR方案之每一設定溫度達到平衡所需之時間而減少。

目前係依靠多種手段以達到這些目標。每一種方法以及裝置包含一或多個下述防止PCR樣品之快速溫度變化的特性。必須改變熱能之一或多來源的溫度以設立每一溫度設定點。這所需的時間係由裝置材料之熱導率(thermal conductivity)所決定，而其係本身就較PCR樣品緩慢。

Juncosa等人提出之美國專利第7618811號描述一種熱循環裝置，用以執行PCR。在一配置中，設備包含第一層、鄰近第一層之第二層、鄰近第二層且與第一層相對之第三層以及連續通道。連續通道係於第一層、第二層以及第三層內形成。將試驗樣品引入連續通道，在第一層於第一溫度下執行循環之第一部分，將樣品移動至第三層。之後，在第三層於低於第一溫度之第二溫度下執行循環之第二部分，將樣品移動至第二層。之後，在第二層於介於第一溫度與第二溫度間之第三溫度下執行循環之第三部分。重複執行第一部分、第二部分以及第三部分至預定數量之循環以執行反應。

雖然前述裝置具有僅使用兩個熱能來源以執行需要三個不同溫度之PCR的優點，且藉由個別層之熱循環不具延遲的維持恆定溫度，但此裝置需要極大的泵功率(pump power)以汲取液體樣品進入窄且長之貫通熱循環裝置的流通道。此外，為了促進內部混合DNA溶液之平均溫度-時間歷程，以達到減少分散液的駐留時間之目的，需要複雜的流體閥時機控制以控制隔開試驗樣品片段的氣泡。內建熱層之結構以及流通道比較像是一次性使用(one-time use)，而非高通量PCR應用。

為克服習知PCR塑料壁以及樣品本身緩慢的熱塊升降溫速率(ramping rates)以及冗長的熱擴散，Miao等人提出之美國專利第7,442,542號提供一種可拋式淺且多孔塑料晶片，用以同時執行多個PCR。塑料晶片係由簡單的熱形成製程所製成，其中通過流體靜壓(hydrostatic pressure)，使一種或多種塑料片順應適當的模具表面。將可拋式晶片填滿液體樣品後，其會與一陣列之熱塊近距離接觸。晶片包含一陣列之孔作為樣品室，每一樣品室具有微通道以導入或導出液體樣品，同時用以排出空氣以避免氣泡形成於樣品室內。這種容納一陣列試驗腔室之淺薄壁盤適用於高通量PCR試驗，但手動將試驗盤置於不同溫度之熱塊上是低效率的。此外，無法保證試驗盤與熱塊之間具有緊密接觸，故無法確保快速PCR。在這種結構中，在共同支撐物43上之陣列熱塊42具有相同的溫度。同時控制這些陣列熱塊以達到三種PCR溫度。因為每一熱塊係用於達到三種不同溫度水平以進行熱循環，花費在加熱以及冷卻熱塊至各個溫度的時間致使過長的PCR時間。

本新型提供一種高通量聚合□連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)設備，包含PCR盤、熱循環裝置以及自動手段。PCR盤具有一陣列之淺孔用以承裝去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)樣品。熱循環裝置包含複數個熱塊，熱塊維持在不同PCR溫度。自動手段用以將熱循環裝置相對於PCR盤滑動至使熱塊與孔緊密接觸之位置，以使DNA樣品達到所述之PCR溫度。

在本新型之一實施方式中，熱循環裝置包含至少一具有三個熱塊之單元，每一熱塊保持在不同PCR溫度。

在本新型之一實施方式中，PCR盤與熱循環裝置間之緊密接觸係由在PCR盤與熱循環裝置間施加真空力而達成。

在本新型之一實施方式中，真空力之啟動係和熱塊與孔接觸之位置及時同步，且當移動熱塊遠離孔時，真空力係關閉。

在本新型之一實施方式中，真空力係建立在真空增壓室內之複數個流通開口，真空增壓室包含流動通道用以自真空增壓室透過真空增壓室出口抽出空氣。

熱循環裝置包含多個單元之三重熱塊(triple-heat-block)。每一熱塊單元係由三個恆溫之熱源組成，其中熱源係維持在三個PCR溫度。第一個熱源係維持在變性(denaturating)溫度(T ₁)，其約為95°C。第二個熱源係維持在黏合(annealing)溫度(T ₂)，其約為55°C。第三個熱源係維持在延展(elongation)溫度(T ₃)，其約為72°C。多孔PCR盤中之每列孔係被間隔開來，以使所有的孔在進行PCR之各個步驟時，可與具有相同溫度之熱塊接觸。孔的溫度改變係藉由驅動系統所產生之熱循環裝置的程式化往復移動(reciprocal movement)而實現。

此外，引入真空系統以建立真空力，將PCR盤相對於熱循環裝置緊緊地向下抓住，以確保PCR盤之孔與熱塊間在每一溫度步驟時之緊密接觸。真空力之啟動與關閉係滑動熱循環裝置的時機同步，以減少PCR盤與熱循環裝置之間的摩擦力，進而使磨損最小化，並促進熱循環裝置的移動。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文將參照附隨圖式來描述本新型之實施態樣與具體實施例；但這並非實施或運用本新型具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，可在無此等特定細節之情況下實踐本新型之實施例。

在以下的說明中，「井(well)」、「孔(cell)」以及「室(chamber)」之名詞可互換使用，以表示一體積空間用以承裝PCR測試樣品。

第1a圖係顯示典型之具有三個溫度步驟之PCR熱循環。在習知之PCR過程中，PCR盤係手動地放置於熱塊上。控制熱塊以依序達到並維持在所欲之三種PCR溫度。在Miao等人所提出之美國專利第7,442,542號的說明中，將第1b圖所示之多孔塑料晶片23，作為PCR盤。此塑料PCR晶片係針對熱性能最佳化，並為了熱循環而具有流體歧管(fluidic manifold)。塑料晶片包含一陣列之薄且淺的孔21，其不大於0.5 mm，作為PCR室以達到PCR樣品與熱塊42間之快速熱傳遞。為避免揮發，使用蓋板41以密封各個PCR孔。塑料晶片之薄壁有效地減少熱擴散延遲時間。在此種結構中，使用在共同支撐物43上之陣列熱塊42，此陣列熱塊42整體為同一溫度(uniform temperature)，並控制每一熱塊以達到三個PCR溫度。因為使用同一熱塊以在一個PCR循環改變PCR樣品之溫度，花費在加熱以及冷卻熱塊至各個溫度的時間致使過長的PCR時間。

本新型運用多個單元之三重熱塊，以提供快速且準確之用於高通量PCR操作的熱循環信息。使用恆溫之熱塊消除改變熱塊溫度之需求，因而消除相關之為了達到溫度平衡之時間延遲。

如第2a~2d圖所示，一個完整之熱循環係由移動熱循環單元2所達成，其包含多個單元之三重熱塊4，以使PCR盤8之所有樣品孔6在每一步驟時，與同一溫度之熱塊10接觸。每一加熱步驟之駐留時間(dwell time)係根據所欲之熱循環信息而設定。第2a圖係平面圖，其顯示出PCR盤8於熱循環單元2的頂部，其中在第一溫度之熱塊10係與樣品孔6接觸。PCR盤8之每列樣品孔6被適當間隔開，以因應熱塊10。較佳地，條狀之熱塊10係由空隙12分隔開，其可用以抽真空以藉由負壓將PCR盤8向下抓住。

第2b~2d圖顯示出PCR盤8於熱循環單元2的頂部，其中樣品孔分別與在第二溫度、第三溫度以及第一溫度之熱塊10接觸。當樣品孔6已經與在第三溫度之熱塊10接觸一預定時間後(請參照第2c圖)，反方向移動熱循環單元2以將樣品孔6帶回與在第一溫度之熱塊10接觸(請參照第2d圖)。

請參照第3a圖，其顯示熱循環單元2係安裝至驅動系統14，以產生走走停停(stop-and-go)以及來來回回(back-and-forth)之反覆運動。請參照沿著第3a圖所示之A-A剖線的剖視圖，第3b圖顯示具有一陣列PCR孔6之PCR盤8的平面圖。每一孔6具有用以填充PCR樣品之入口以及用以排出空氣之出口，以防止空氣受困於孔內。入口以及出口(未顯示)可與導管(未顯示)連接，並以礦物油覆蓋以防止揮發。樣品孔6之陣列係與條狀熱塊10精確排列。作為示例，熱塊組件可安裝至共同之齒條，並由安裝於馬達上之軸與齒輪驅動。

如第4a圖所示，添加真空系統16與其頂面上之孔洞18陣列至熱循環單元2與驅動系統14之組件。第4b圖係沿著第4a圖所示之A-A剖線的剖視圖，其顯示出條狀熱塊10之間具有孔洞20陣列。在每一溫度步驟，當樣品孔6與條狀熱塊10排列時，熱塊10間之孔洞20陣列會與真空系統16上之孔洞18陣列排列，以形成流動通道(flow channel)。這些流動通道係匯集成共同之流動路徑，以與真空來源(例如：泵，pump)連通。藉由真空來源所產生之負壓讓PCR盤8與條狀熱塊10緊密接觸，進而使兩者間之熱接觸阻抗(thermal contact resistance)最小化。由流動通道之閥開口(未繪示)程序化控制施加真空力之時機，使得熱循環單元2在移動及滑動時，施加於PCR盤8之真空力係處於關閉狀態，以減少PCR盤8與熱循環單元2之間的摩擦力。當熱循環單元2移動至預定位置並與樣品孔6排列以達到緊密接觸時，施加於PCR盤8之真空力係處於開啟狀態。值得注意的是，真空力一直都是開啟的狀態，只有藉由切換調節閥至開啟及關閉的位置，以控制是否施加真空力於PCR盤8。此外，薄壁塑料PCR盤8在真空力的作用下，可與熱循環單元2的加熱表面緊密接觸。替代地，PCR盤可加載彈簧與熱循環單元接觸，從而使均勻壓力施加於PCR盤與熱循環單元之間，以確保兩者之間以及PCR樣品之良好的熱量傳遞。

為確保PCR樣品達到PCR溫度，可安裝溫度感測器於所選擇之熱循環單元之熱塊頂面上。較佳地，當熱塊就定位以與對應之PCR孔接觸時，所選擇之熱塊頂面係與對應之PCR孔底面接觸。本新型之裝置可更包含溫度控制系統，用以控制熱循環單元之每一熱塊之動力輸入。當溫度感測信號低於預定之最小值時，溫度控制系統可啟動相對應之電子電路以引進額外電流至熱塊。當溫度感測信號達到預定之最大值時，溫度控制系統便停止引進額外電流。藉由來自動力來源之輸入以及至PCR盤之輸出，每一熱塊在PCR過程中具有一範圍的溫度變化。在前述依據第2a~2d圖以及第3a圖說明之PCR溫度T ₁、T ₂以及T ₃，這些溫度包含於所述範圍內之變化，其係由啟動及關閉額外電流以維持在指定溫度所造成。為了功率控制，每一PCR溫度之最小及最大設定值係取決於所使用之PCR盤及熱塊的幾何形狀、尺寸及熱特性。相較於PCR孔6之小尺寸，熱塊10為大尺寸，其熱容量(heat capacity)接近無限，以在微不足道之溫度變化下維持恆溫條件。然而，對於有限尺寸之熱塊而言，溫度變化可能是顯著的。在這種情況下，最小及最大設定值係經過實驗決定，且包含在熱循環控制設備中查找表格。

此外，溫度控制系統係與熱循環單元2之驅動控制系統通信。驅動控制系統控制在每一PCR溫度之駐留時間，在此期間具有PCR溫度之熱塊10在接觸壓力下，保持與PCR盤8接觸。驅動控制系統亦控制切換熱塊10的時機，以改變PCR溫度，以及再切換時，關閉PCR盤8與熱循環單元2間之接觸壓力的時機。施加接觸壓力可通過彈簧力，其可藉由螺線管作用而被加載及卸載。較佳地，接觸壓力係通過真空力實現。如第4a圖所示，用於PCR過程之設備中的真空增壓室(plenum)係用以建立PCR盤8與熱循環裝置間之真空力。真空增壓室係安裝於熱循環裝置之底部。真空增壓室係由具有頂面平台之外殼、閘板(shutter plate)以及出口所組成，外殼之頂面平台具有流通口。這些流通口致使熱塊10之間的流動通道以及PCR孔6之間的槽(slot)。這些流動通道及槽係與熱塊10及PCR孔6熱絕緣，且係用以在空氣自真空增壓室出口抽出時，建立圍繞PCR孔6之真空力。閘板係可相對於真空增壓室之頂面滑動，以開啟或關閉流動開口。當熱塊10與PCR孔6接觸時，閘板開啟流動開口，以建立真空力，使PCR盤8能與熱塊10緊密接觸。當熱塊10於移動運輸過程時，閘板關閉流動開口，以停用真空力，使具有不同PCR溫度之熱塊10與PCR孔6接觸。當真空力關閉時，PCR盤8與熱塊10間之摩擦力係大幅地減少，從而最大限度地減少接觸表面上的磨損，並促進熱塊10的滑動。驅動控制系統將真空力的開啟及關閉與具有不同PCR溫度之熱塊的切換同步。

雖然以上說明敘述了三個PCR溫度，本新型可容易地應用之任何具有多個溫度步驟之熱循環。亦有多種開啟及關閉PCR盤與熱循環裝置間之接觸壓力或真空力，並結合結合移動熱塊的方法。所有這些變化皆落入本新型之精神內。

雖然本新型已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本新型，任何熟習此技藝者，在不脫離本新型之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本新型之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

21‧‧‧孔
23‧‧‧多孔塑料晶片
41‧‧‧蓋板
42‧‧‧熱塊
43‧‧‧支撐物
2‧‧‧熱循環單元
4‧‧‧三重熱塊
6‧‧‧孔
8‧‧‧PCR盤
10‧‧‧熱塊
12‧‧‧空隙
14‧‧‧驅動系統
16‧‧‧真空系統
18‧‧‧孔洞
20‧‧‧孔洞

為使本新型之特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1a圖係具有三個溫度步驟之PCR熱循環的示意圖。 第1b圖係習知之PCR盤與熱塊之剖視圖。 第2a~2d圖係顯示之PCR盤在具有三個溫度步驟之一個熱循環過程中，與具有三種不同溫度之熱塊單元接觸，其中溫度改變係藉由滑動熱循環單元所達成。 第3a圖係顯示熱循環單元安裝於驅動裝置上以重覆進行熱循環。 第3b圖係第3a圖之上視圖，其顯示條狀熱塊與PCR盤之樣品孔陣列之排列。 第4a圖係顯示真空系統於熱循環裝置之頂部，向下抓住PCR盤，以維持緊密熱傳遞接觸。 第4b圖係第4a圖之上視圖，其顯示置於條狀熱塊間之圓柱形孔洞用於在真空系統作為空氣通道。

2‧‧‧熱循環單元

6‧‧‧孔

8‧‧‧PCR盤

10‧‧‧熱塊

12‧‧‧空隙

14‧‧‧驅動系統

Claims (5)

1. 一種聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)設備，包含：一PCR盤，具有一陣列之淺孔用以承裝去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)樣品；一熱循環裝置，位於該PCR盤之下，該熱循環裝置包含複數個熱塊，該些熱塊維持在不同PCR溫度；以及一驅動系統，連結於該熱循環裝置之下，用以驅動該熱循環裝置之該些熱塊滑動至與該PCR盤之該些孔緊密接觸之位置，以使該DNA樣品達到該些PCR溫度。
2. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應設備，其中該熱循環裝置包含至少一具有三個熱塊之單元，每一該熱塊保持在不同PCR溫度。
3. 如申請專利範圍第1項所述之聚合酶連鎖反應設備，其中該PCR盤與該熱循環裝置間之該緊密接觸係由在該PCR盤與該熱循環裝置間施加一真空力而達成。
4. 如申請專利範圍第3項所述之聚合酶連鎖反應設備，其中該真空力之啟動係和該些熱塊與該些孔接觸之位置及時同步，且當移動該些熱塊遠離該些孔時，該真空力係關閉。
5. 如申請專利範圍第3項所述之聚合酶連鎖反應設備，其中該真空力係建立在一真空增壓室內之複數個流通開口，該真空增壓室包含一流動通道用以自該真空增壓室透過一真空增壓室出口抽出空氣。