TWM484099U - 可檢測Ｈｅｘ螢光濃度的綠光檢測高頻電路裝置 - Google Patents

Description

可檢測Hex螢光濃度的綠光檢測高頻電路裝置

本創作係關於一種螢光檢測裝置，尤指基於雷射光激發螢光物質會產生螢光，再將激發出的螢光照射在光檢測器上則會導致光電流改變或是光檢測器等效阻抗的變化，而間接影響高頻電路的頻率響應的裝置。

先前相關於本創作之技術見於本國專利第M329777號之「串聯式光檢測振盪電路裝置」，該主要是以48MHz串聯式光檢測高頻電路裝置(series photodetector frequency circuit,SPFC)的頻率變化特性來檢測螢光濃度之定量分析。本創作研製以光檢測器匹配的串聯式光檢測高頻電路，其輸出頻率對於光檢測器的響應度具有良好的解析靈敏度，適合進行螢光檢測。經由不同響應度的光檢測器來匹配高頻電路，可以得知在相同波長的激發雷射光源中，光響應度越高的光檢測器，所量測到的頻率變化越大。由實驗中可以測得PT(phototransistor)匹配的串聯式光檢測裝置之最低螢光濃度檢測極限為100amol/3μl。根據螢光染劑U1392-HEX不同的螢光濃度100pmol/3μl~100amol/3μl與裝置的頻率變化，可以整合實驗數據建立線性相關係數R² =0.9964的檢量曲線。

而創作人之前另一申請案「可檢測Cy5螢光濃度的串聯式光檢測高頻電路裝置」(案號103203329)係具48MHz振盪頻率的串聯式光檢測高頻電路裝置(series photodetector frequency circuit,SPFC)，其頻率變化特性可用來 檢測螢光濃度。此種SPFC檢測裝置的輸出頻率對於光檢測器的響應度具有良好的解析靈敏度，適合進行螢光檢測。經由光檢測器PT來匹配高頻電路，可以得知在相同波長635nm的紅光激發雷射光源中，基本振盪頻率越高的SPFC檢測裝置，所量測到的頻率變化越大。根據螢光染劑ET996-Cy5不同的螢光濃度100pmol/5μl~1amol/5μl與裝置的頻率變化的實驗中，經整合實驗數據得到PT(phototransistor)匹配的48MHz串聯式光檢測裝置之最低螢光濃度檢測極限達到了100amol/5μl。

生物晶片是結合基因生物學與奈米技術，應用半導體製程技術以矽晶片、玻璃或高分子材料為基材，並整合樣品製備、生化反應與定量定性分析於基材上，用以執行疾病檢驗，食品檢驗、環境檢測、藥品開發與軍事防禦等用途的精密微小化裝置。

DNA雜合的檢驗方法包括了：(1)利用能量衰減的比例與高折射率介值表面的折射率的表面電漿共振法(Surface Plasmon Resonance)；(2)利用奈米金粒吸附及銀染效應來量測DNA分子的電導或電容等阻抗特性的阻抗分析法(Impedamce analysis)；(3)具有電化學活性的指示劑作為雜合指示劑來提升檢測靈敏度的循環伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)；(4)利用壓電效應產生的頻率響應可檢測極微小質量變化的石英晶體微天平(QCM，Quartz Crystal Microbalance)；(5)雷射激發螢光來產生更長範圍波長的螢光標定法；(6)將激發出的螢光訊號照射光檢測器，會產生光電流或電壓等電訊號來偵測DNA雜合狀態。然而，目前雖已有前述之紅光檢測電路裝置，但仍尚欠相關之綠光檢測電路裝置，此即為本創作所欲解決之問題。

本創作所解決問題之技術手段為提出一新型光電檢測裝置，綠光檢測高頻電路，以螢光檢測原理為基礎，將光檢測器量測到的電信號結合到串聯諧振的高頻電路，藉此將螢光訊號的強弱轉換成頻率的變化，進而測得不同螢光濃度的頻率變化。此裝置不僅架構簡單、便宜且具有高頻的高靈敏度特性，可以偵測到較低的螢光濃度，並根據不同的螢光標定濃度和頻率變化而建立出兩者的線性曲線。在本創作中，將設計以光檢測器PT匹配的48MHz串聯式光檢測高頻電路來分析SPFC檢測裝置的頻率響應與螢光濃度之間的關係，並探討這種頻率檢測裝置量測螢光濃度之極限能力且為未來將綠光檢測高頻電路裝置應用於經由Hex螢光標定的DNA雜合實驗的基礎。

而發展本創作所經過之實驗的設備如下。

綠光檢測高頻電路裝置之架構：

綠光檢測高頻電路裝置(第一圖)，包括(1)5mW綠色雷射光源100(Green Laser GLM Module，M&T OPTICS，Taiwan)及其所照射的Hex螢光樣品200使產生被激發的螢光300(2)可過濾掉550nm以下波長的濾光鏡400(FSQ-OG550，NEWPORT，USA)(3)自製48MHz高頻振盪電路600，和PT(Phototransistor，TYNTEK，Taiwan)光檢測器500以搭配高頻電路(4)Agilent 53131A計頻器700(有效頻率範圍1Hz~255MHz，Agilent，USA)(5)配合GPIB卡的電腦800，利用程式將頻率信號讀取並顯示在螢幕上。全部檢測裝置與設備被安置在溫度約25℃的暗房內，以利於雷射激發螢光的實驗操作。

光檢測高頻電路：

電路是以巴克豪生準則(Bark-hausen criterion)為基礎，符合(1)必須為正回授，即輸入與輸出的相位相差0度(2)起始頻率的開迴路增益大於1，以石英晶體、邏輯閘電路與光檢測器500架構成串聯諧振高頻電路(第二圖)。

實驗材料與樣品：

(1)TE3緩衝液(TRIS/pH8.0 10mM+EDTA 1mM，BIO BASIC，USA)。

(2)螢光染劑：U1392-Hex(PURIGO，Taiwan)，最佳吸收波長535nm與最佳螢光放射波長556nm。

(3)Probe U1392-Hex以TE3緩衝液調製為十倍稀釋的濃度如下：100pmol/3μl，10pmol/3μl，1pmol/3μl，100fmol/3μl，10fmol/3μl，1fmol/3μl，100amol/3μl，10amol/3μl與1amol/3μl。

綠光檢測高頻電路裝置實驗步驟：

(1)將含有螢光染劑的樣品放置於螢光檢測機台上。

(2)以532nm波長的雷射激發光照射螢光材料，產生556nm波長的螢光。

(3)光檢測器500被安置在濾光片(過濾掉550nm以下的激發光)上方，以檢測出被激發之螢光。

(4)激發的螢光照射在光檢測器500時會產生光電流，並引發高頻電路頻率的改變，螢光量測裝置產生的頻率資料則由Agilent 53131A計頻器700來擷取並透過GPIB卡連接到電腦800，再應用Agilent VEE 7.5的視窗程式每隔五秒量測不同的螢光濃度的頻率變化，並將頻率資料顯示在螢幕上。

光檢測器響應度量測裝置：

光檢測器響應度量測裝置包括：(1)175W氙燈光源，光源色溫5600°K，波長範圍200nm~1100nm(Model ASB-XE-175-BF，SPECTRAL PRODUCTS,USA)。(2)帶通(Bandpass)濾光片組(濾片中心波長分別為400、450、500、550、600、650和694nm)。(3)標準光功率檢測模組，含detector(Model 818-UV，NEWPORT，USA)和optical power meter(Model 1815C，NEWPORT,USA)。

光檢測器響應度量測步驟如下：(1)光源搭配濾光片濾出各波長之光源。(2)濾得之光源以標準光功率檢測模組量測其光通量強度。(3)待測之光檢測元件(PT光檢測器500)以各波長光源照射並量測其光電流值，配合單位面積光通量強度及該元件有效照光面積推得其各波長之光響應度。

本創作對照先前技術之功效為可以光檢測器500結合壓電石英晶體的新型高頻振盪電路600來檢測螢光強度變化並進行Hex螢光濃度的定量檢測。由實驗可知，經由光檢測器PT匹配的48MHz高頻電路裝置可量測到不同的螢光濃度。

串聯式光檢測高頻電路裝置具有簡單，便宜以及高靈敏度的特性，且基本振盪頻率越高的SPFC裝置，能檢測的螢光濃度越低。但要注意的是，雖然基本頻率越高的SPFC檢測裝置可以檢測到更低的螢光濃度，但是基本頻率越高的SPFC裝置的頻率受外界雜訊干擾越大，亦即越不穩定。創作人會繼續改善SPFC高頻電路裝置，期望能檢測到更低的螢光濃度，並擴展到螢光標定的DNA雜合實驗來進行DNA的定性與定量分析。

1‧‧‧第一個反及閘之其中一個輸入端點

2‧‧‧第一個反及閘之另一個輸入端點

3‧‧‧第一個反及閘之輸出端點

4‧‧‧第二個反及閘之其中一個輸入端點

5‧‧‧第二個反及閘之另一個輸入端點

6‧‧‧第二個反及閘之輸出端點

8‧‧‧第四個反及閘之輸出端點

9‧‧‧第四個反及閘之其中一個輸入端點

10‧‧‧第四個反及閘之另一個輸入端點

11‧‧‧第三個反及閘之輸出端點

12‧‧‧第三個反及閘之其中一個輸入端點

13‧‧‧第三個反及閘之另一個輸入端點

100‧‧‧綠色雷射光源

200‧‧‧Hex螢光樣品

300‧‧‧被激發的螢光

400‧‧‧濾光鏡

500‧‧‧光檢測器

600‧‧‧48MHz高頻振盪電路

700‧‧‧計頻器

800‧‧‧電腦

第一圖係綠光檢測高頻電路裝置。

第二圖係綠光檢測高頻電路圖。

第三圖係在室溫25oC的情況下，以APT為光感測元件的48MHz高頻電路的頻率響應圖。

第四圖係在沒有裝設filter且用綠光雷射直接激發光檢測器的情況下，以(a)APT，(b)BPT，(c)CPT，(d)DPT與(e)EPN等光檢測器為感測元件的48MHz高頻電路所得到的頻率響應變化值揭示圖。

第五圖係五種光檢測器在沒有裝設filter的綠光雷射激發下，其光響應度與頻率變化的關係圖。

第六圖係未加樣品與含有HEX 100pmol/3μl的螢光染劑樣品的頻率變化與五種光檢測器響應度的關係圖。

第七圖係光檢測器APT匹配的48MHz高頻電路裝置應用於Hex螢光濃度100pmol/3μl~1amol/3μl檢測的頻率響應圖。

第八圖係APT光檢測高頻電路裝置的頻率變化與Hex螢光濃度(100pmol/3μl~100amol/3μl)的線性關係圖。

於第一圖中的光檢測器500與48MHz高頻振盪電路600係以串聯諧振高頻電路來實施，如第二圖所示，其中，訊號由端點1與2經第一個反及閘後，輸出至端點3，再串聯電阻R2，再由端點4與5經第二個反及閘後，輸出至端點6，再由端點12與13經第三個反及閘後，輸出至端點11，再由端點9與10經第四個反及閘後，輸出至端點8；且其中，第一個反及閘係與電阻R₁ 與電容C₁ 並聯，第二個反及閘係與電阻R₃ 並聯，石英晶體、光檢測器500與電容C₂ 串聯起來且將串聯後的輸入和輸出分別接至端點1、2和端點6。

而細節方面，如下。

石英晶體與光檢測器500等效電路：

石英晶體具有壓電效應(Piezoelectric Effect)，利用外電壓加於晶片的兩側產生電場，由於壓電材料本身之機械與電性耦合作用，使晶體本身產生機械變形，由晶體的切割面受到機械應力的作用，晶體的兩相對面又會產生一電位差。當在壓電晶體上下兩面加上交流電壓，可使晶體本身產生不同頻率的振盪。石英晶體切割之厚度與方向可決定其壓電效應造成的諧振頻率與溫度係數。一般而言，越薄，諧振頻率越高。

光檢測器500是將光信號轉變成電信號，比如電壓或電流。它的轉變是利用吸收光子而產生自由的電子電洞對(free electron hole pairs)，也就是在傳導帶產生電子，在價電帶產生電洞。光二極體操作在逆向偏壓模式，光檢測器500材料吸收光子後釋放電子產生光電流，因此可得到光電流大小和輸入光強度的比例關係。光檢測器500有光二極體如PN，PIN，APD以及光電晶體等不同型態，以電路結構來解釋可以等效成電阻Rp與電容Cp並聯的等效電路。

光檢測高頻電路理論：

因此如果在驅動電路的設計上，使用一個相位差θ的放大器時，回授的電路就必需是具有-θ的相位差來符合先前所說的巴克豪生振盪條件。在本創作中SPFC系統是使用放大器產生正回授振盪，因此它的電路阻抗的實數部分與虛數部分必須符合相位差的要求：-θ=tan^-1 (X/R) (1)

由式(9)的等式中設A=tanθ可歸納化簡出下式：

從式(10)中計算出頻率與光檢測器500的電導G_p 的相關式，經泰勒級數(Taylor series)展開來簡化得光檢測器500電導G_p 和角頻率ω的關係式如下： 其中ω ₀ =2πF ₀ ， F ₀ 為石英晶體共振頻率等式(11)是SPFC的頻率響應之數學函數。

頻率響應靈敏度即是電導G_p 和角頻率ω的微分，本創作可以偏微分計算求出：

E ₃ =(ω ₀ C _p -AG _p )(2G _p -ω ₀ C ₀ A )

另外，光檢測器500電容效應C_p 對於角頻率ω的微分，亦可以偏微分得到：

從等式(4)(5)中，可以看出SPFC的靈敏度隨著電路的參數和光檢測器500等效電導Gp與等效電容Cp而改變，且與皆為常數，(4)(5)兩式的結果代表著串聯式光檢測高頻電路系統的頻率響應會隨著光檢測器500的阻抗變化(Gp與Cp)而呈現線性關係。以高頻率的石英晶體來進行SPFC的實驗，有較好的靈敏度。又假如將振盪電路之各項參數固定，則SPFC的頻率就單純受光檢測器500的電導G _p ，和等效電容C _p 影響。

而實施結果與討論，如下。

隨著分子生物學的發展，人們能夠用各種不同的方法對不同物種的同源資訊大分子進行比較研究。這種同源資訊大分子之間的差異，能定量地反映出不同物種在進化中的分歧速度，DNA雜合方法就是其中之一。DNA雜合是用來比較不同物種遺傳物質差異的有效方法，它是利用DNA上鹼基間獨特的一種配對模式，A與T配對或C與G配對的方式來偵測及定量DNA的濃度。本創作中，提出以光檢測器500為偵測元件的石英高頻振盪電路600搭配在螢光檢測系統上，用來定量檢測螢光濃度。藉由不同螢光濃度與高頻電路頻率變化的檢測特性，以期望未來能應用於具有螢光標定的DNA雜合實驗來達到DNA濃度的定量分析。

光檢測器500是將光信號轉變成電信號，比如電壓或電流；在許多的光檢測器500中，比如光導體和光二極體，它的轉變是利用吸收光子而產生出自由的電子電洞對(free electron hole pairs)，也就是在傳導帶產生電子，在價電帶產生電洞，形成了所謂的光電流(photocurrent)效應。光檢測器500 中包含PN光二極體，PIN光二極體，APD雪崩光二極體等都屬於逆向偏壓的模式。當光檢測器500加上逆向偏壓，並接收光源照射時，在光檢測器500內部會產生自由電子電洞對的漂移而形成光電流，接收不同波長的光源會有不同的光電流反應。光電晶體為另一種光檢測器500，它是一種雙極性電晶體BJT的結構，其具有光電流增益的效果，因此光電晶體的光響應度較大。光電晶體是一個加逆向偏壓的光二極體與電晶體組合而成，與光二極體比較，反應速度慢但感度卻比光二極體高。光電晶體與光二極體一樣會有電子流與電洞流會通過空乏區而影響到光電晶體的阻抗特性。用另一種角度說，光檢測器500接收不同強度的光源也會造成光檢測器500等效電阻與電容的阻抗變化。在本創作中，主要針對光檢測器PT所匹配的SPFC檢測系統來進行螢光濃度的實驗分析。因此，本創作可以阻抗分析儀(Agilent 4294A，USA)來量測在48MHz頻率時光檢測器PT的阻抗效應，如表1所示，光檢測器PT是以RC並聯的等效阻抗來表示。

光檢測器500需加上偏壓並以光源照射在光檢測器500接收端，才能量得光電壓或光電流的效應，故無法直接以阻抗分析儀來量測加上偏壓後的光檢測器500的等效阻抗。之前，創作人利用光二極體與光電晶體的光響應度(Responsivity)來推論不同的光檢測器500在不同強度的激發螢光下所產生的 頻率響應。並且得到在相同濃度的螢光激發下，光檢測器500的響應度越大，其所匹配的高頻電路頻率則下降越多。

本創作中，為了解串聯式光檢測高頻電路的頻率特性與光響應度的特性，創作人利用光檢測器APT為基本感測元件來製作頻率為48MHz的SPFC高頻電路，在不同螢光濃度的條件下，針對底下幾個實驗來做說明與分析。

48Hz SPFC系統應用於綠光雷射模組實驗：

(1)頻率的穩定度

以APT光檢測器為感測元件的高頻電路在室溫約25℃下，所得到的頻率響應如第三圖所示。當高頻電路加上5V直流電源時，因為振盪電路元件本身功率消耗與熱能產生，導致初始頻率開始下降，直到元件熱消耗穩定後頻率漸漸趨於穩定，從頻率開始振盪到穩定的時間約6分鐘(360秒)，頻率共下降236Hz。

(2)響應度的效應(沒裝設filter的高頻電路檢測系統)

實驗結果如第三圖所示，在沒有filter的情況下，以APT為光檢測器500的高頻電路在沒有接收綠光雷射照射時的頻率為47998294Hz，而當綠光雷射照射在光檢測器500時的頻率為47998036Hz，頻率下降258Hz。其次是以BPT為主的光檢測式高頻電路，沒有綠光雷射照射時的頻率為47997901Hz，照射到3PT的頻率值則為47997663Hz，頻率下降238Hz。其餘CPT，DPT與EPN等三種光檢測式高頻電路系統的頻率變化分別為192HZ，178Hz以及144Hz。由結果可知，其下降的頻率響應曲線與理論推導式符合。而且，APT在五種光檢測器500中響應度最大，在接受綠光雷射照射時所造成的頻率變化也最大，其次是P的高頻電路的頻率變化。若將五種光響應度與其對應之 高頻電路的頻率變化作分析，可以得到如第四圖的關係。

由實驗結果可知，在沒有filter的情況下，光檢測器500的響應度越大，其受到綠光雷射照光時的檢測電路頻率變化也越大。

(3)HEX螢光濃度100pmol/3μl的基本頻率實驗(有裝設filter)

為了測試螢光染劑在經由綠光雷射激發後是否具有穿透filter(FSQ-OG550，NEWPORT，USA)的螢光反應，創作人準備了濃度為100pmol/3μl的Hex螢光染劑來觀察串聯式光檢測高頻系統的頻率變化。同樣的針對APT，BPT，CPT，DPT與EPN等五種光檢測器500匹配的高頻電路來觀察未加樣品及含有螢光染劑的樣品的頻率差異，實驗結果如第五圖。含有螢光染劑的樣品所量得的頻率值為F1，未加樣品所量得的頻率值為F2，有螢光染劑薄膜與空白薄膜的頻率響應差異為△F=F1-F2，APT，BPT，CPT，DPT與EPN等五種光檢測器500匹配的SPFC系統的頻率響應變化△F分別為140Hz，116Hz，68Hz，51Hz與31Hz。依據所量測得到的頻率變化值與五種光檢測器500響應度的關係可知(第六圖)，HEX螢光濃度100pmol/3μl在綠光雷射的激發下，所產生的螢光波長確實可穿透filter改變光檢測器500的光電流而影響頻率。光響應度越高的光檢測器高頻電路系統所得到的頻率差異越大，反之，響應度越低的光檢測器高頻電路系統所得到的頻率差異(△F)越小。

(4)48MHz串聯式光檢測高頻電路的螢光濃度檢測極限

為了了解APT光檢測器匹配的48MHz高頻電路所能量測到的螢光濃度極限，本創作將Hex染劑以十倍稀釋調配為不同的螢光濃度100pmol/3μl~1amol/3μl，每隔五秒量測不同螢光濃度的頻率響應，來測試光檢測高頻電路 的響應。SPFC系統實驗所得的頻率響應如第七圖所示。❶則為未加樣品所對應的頻率值，❷~❿分別為稀釋的螢光濃度1amol/3μl~100pmol/3μl所對應的頻率值。由第七圖，對於螢光濃度由高至低，其頻率響應曲線呈現下降曲線，說明了高頻電路會隨著螢光濃度的降低而有下降的頻率變化，且其下降的頻率響應曲線與理論推導式符合。由實驗結果可以得知48MHz SPFC搭配光檢測器APT的螢光濃度檢測極限為100amol/3μl。。根據不同螢光濃度頻率與未加樣品頻率的頻率差異值(△F)與螢光濃度(取Log值)，可得到線性迴歸分析如第八圖所示。

y=0.052x-17.434 (6)

R² =0.997

於實施方式所述僅為本創作之一個實施例，即：經由光檢測器PT匹配的48MHz高頻電路裝置可量測到不同的螢光濃度，然，本創作仍可隨時因應需要而作多方面之更改、擴充、應用，使更擴大其功能，該些亦仍屬本創作的申請專利範圍內。

1‧‧‧第一個反及閘之其中一個輸入端點

2‧‧‧第一個反及閘之另一個輸入端點

3‧‧‧第一個反及閘之輸出端點

4‧‧‧第二個反及閘之其中一個輸入端點

5‧‧‧第二個反及閘之另一個輸入端點

6‧‧‧第二個反及閘之輸出端點

8‧‧‧第四個反及閘之輸出端點

9‧‧‧第四個反及閘之其中一個輸入端點

10‧‧‧第四個反及閘之另一個輸入端點

11‧‧‧第三個反及閘之輸出端點

12‧‧‧第三個反及閘之其中一個輸入端點

13‧‧‧第三個反及閘之另一個輸入端點

500‧‧‧光檢測器

Claims (2)

1. 一種可檢測Hex螢光濃度的綠光檢測高頻電路裝置，包含：可發出5mW綠色雷射光的光源、位於該光源側上方的可過濾掉550nm以下波長之光的濾光鏡、置於該濾光鏡上方之光檢測器、連接該光檢測器之48MHz高頻振盪電路、接至該48MHz高頻振盪電路輸出端之1Hz~255MHz計頻器以及連接該計頻器之具介面卡與匯流排的電腦，其中的光檢測器係為搭配高頻電路之用。
2. 如請求項1所述的可檢測Hex螢光濃度的綠光檢測高頻電路裝置，其中的48MHz高頻振盪電路與光檢測器係以串聯諧振高頻電路來連接，即該連接後的電路除含光檢測器外，亦含四個反及閘、三個電阻、二個電容以及一個石英晶體；第一個反及閘之二輸入點相接且輸出點串聯至電阻R₂ ，該電阻R₂ 亦串聯至第二個反及閘之二輸入點，其輸出點串聯至第三個反及閘之二輸入點，其輸出點串聯至第四個反及閘之二輸入點；且其中，第一個反及閘係與電阻R₁ 與電容C₁ 並聯，第二個反及閘係與電阻R₃ 並聯，石英晶體、光檢測器與電容C₂ 串聯起來且將串聯後的輸入點和輸出點分別接至第一個反及閘之二輸入點和第四個反及閘之輸出點，該輸出點則接至1Hz~255MHz計頻器。