TWI851676B - 溶瘤病毒用於治療癌症之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明關於溶瘤病毒（例如，修飾的HSV-1病毒）用於治療各種類型癌症之用途。此外，本發明關於關於溶瘤病毒的此類用途之組成物及套組。
Description
本申請要求2019年3月5日提交的美國臨時申請案號62/813,961的優先權和權益，將其藉由引用以其全文併入本文。
本申請包含電腦可讀形式的序列表。序列表以標題為A-2353-WO-PCT_SeqListing_ST25.txt的文字檔案提供，該檔案創建於2020年1月10日，大小為37,667位元組。電子格式的序列表中的資訊藉由引用以其全文併入本文。
在許多形式的癌症的治療上的最新進展極大地改善了男性和女性對於最常見類型的癌症(例如肺癌、結腸癌、乳癌和前列腺癌)之存活期。成功地引導患者的免疫系統攻擊某些形式的癌症的檢查點抑制劑的出現極大地改善了患者對於某些癌症之存活期。例如，已證明伊匹單抗(ipilimumab)(抗CTLA-4抗體)、派姆單抗(pembrolizumab)和納武單抗(nivolumab)(抗PD-1抗體)和阿特珠單抗(抗PD-L1抗體)等檢查點抑制劑對多種腫瘤類型均具有功效。參
見Grosso等人，Cancer Immun.[癌症免疫]，13：5(2013)；Pardoll,Nat Rev Cancer[自然癌症評論]，12：252-264(2012)；和Chen等人，Immunity[免疫力]，39：1-10(2013)。
溶瘤病毒還已經顯示出在治療某些形式的癌症中具有臨床功效。溶瘤病毒通常經過基因工程化以優先在癌細胞(相較於健康細胞)中複製，並包含可用於增強抗腫瘤應答之「有效載荷」。此類基因工程最初集中於使用無複製能力的病毒，以防止病毒誘導的對非腫瘤細胞之損害。最近，溶瘤病毒的基因工程已經集中於「條件複製型」病毒的生成，以避免全身感染，同時允許病毒傳播到其他腫瘤細胞。
目前，在美國和歐洲唯一批准的基於溶瘤病毒的藥物係拉他莫金(talimogene laherparepvec，IMLYGIC®)。拉他莫金係衍生自臨床毒株JS1的HSV-1(保藏於歐洲細胞培養物保藏中心(European collection of cell cultures，ECAAC)，保藏號01010209)。在拉他莫金中，編碼ICP34.5和ICP47的HSV-1病毒基因已功能性缺失。ICP47的功能性缺失導致US11的較早表現，US11係促進腫瘤細胞中病毒生長而不降低腫瘤選擇性之基因。另外，人GM-CSF的編碼序列已插入病毒基因組中的ICP34.5基因前位點處。參見Liu等人，Gene Ther.[基因療法]，10：292-303,2003。
已經探索了溶瘤病毒和檢查點抑制劑的治療性組合。例如，目前正在黑色素瘤(NCT01740297和NCT02263508)和頭頸部鱗狀細胞癌(NCT02626000)的臨床試驗中研究拉他莫金和免疫療法(例如伊匹單抗和派姆單抗)之組合。
儘管溶瘤病毒在癌症的治療中已顯示出巨大的前景，但仍然需要開發這樣的溶瘤病毒，此類溶瘤病毒不僅限制它們複製和對癌細胞的裂解損傷，而且還能夠幫助建立和維持穩健的全身性抗腫瘤免疫應答。
本發明解決該等和其他需求。
本發明關於溶瘤病毒，其包含編碼異源樹突細胞生長因子的核酸和編碼第一異源細胞介素之核酸。異源樹突細胞生長因子和第一異源細胞介素可以藉由多順反子(polycistronic)連接子(linker)元件連接。在一些實施方式中，多順反子連接子元件係豬捷申病毒2a(P2A)或內部核糖體進入位點(IRES)。溶瘤病毒可以是單純皰疹病毒，例如單純皰疹1型病毒。在一個特定的實施方式中，溶瘤病毒衍生自HSV-1毒株JS1。
溶瘤病毒可以被進一步修飾，以使其缺乏功能性ICP 34.5基因並缺乏功能性ICP 47基因。
另外，溶瘤病毒可進一步包含啟動子，其中編碼樹突細胞生長因子和第一細胞介素之核酸序列均在同一啟動子的控制下。在其他實施方式中，溶瘤病毒可包含第一啟動子，其中編碼樹突細胞生長因子之核酸序列在第一啟動子的控制下；和第二啟動子，其中編碼第一細胞介素之核酸序列在第二啟動子的控制下。
第一異源細胞介素可以是介白素，例如介白素-12(IL12)。異源樹突細胞生長因子可以是第二細胞介素，例如Fms相關酪胺酸激酶3配位基(FLT3L)。
在一個特定的實施方式中，本發明之溶瘤病毒包含HSV-1(其缺乏功能性ICP34.5編碼基因且缺乏功能性ICP47編碼基因)，包含編碼FLT3L的核酸，並且還包含編碼IL12之核酸。在一些實施方式中，編碼IL12的核酸和編碼FLT3L的核酸存在於ICP34.5編碼基因之前位點中。在一個實施方式中，編碼IL12的核酸和編碼FLT3L的核酸藉由P2A連接。
編碼IL12、FLT3L和P2A的核酸可以以[Flt3L]-[P2A]-[IL12]存在，其中[Flt3L]-[P2A]-[IL12]構建體在單個啟動子控制下，並且該構建體存在於ICP34.5編碼基因之前位點中。合適的啟動子包括：巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α啟動子(EF1a)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1啟動子(PGK)、泛素C啟動子(UBC)和鼠幹細胞病毒(MSCV)。在一個特定的實施方式中，啟動子係CMV。
本發明之溶瘤病毒可以包含牛生長激素聚腺苷酸化訊息序列(BGHpA)。本發明之溶瘤病毒還可包含增強哺乳動物轉譯的核酸。在一些實施方式中，增強哺乳動物轉譯的核酸係Kozak序列或共有Kozak序列。在一個特定的實施方式中，共有Kozak序列在SEQ ID NO：20中列出。
在一個實施方式中，溶瘤病毒包含編碼[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]的一種或多種核酸(也稱為構建體或表現盒)。在另一個實施方式中，IL12以[P40亞基]-[GGGGS]-[P35亞基]存在。在另一個實施方式中，IL12 P35亞基中的訊息肽係不存在的。在另一個實施方式中，溶瘤病毒包含編碼[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)]-[BGHpA]的一種或多種核酸。在又另一個實施方式中，構建體存在於ICP34.5編碼基因之前位點。圖9顯示了用於生成HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的構建體在ICP34.5編碼基因之前位點中的取向，但可生成/利用表現盒在ICP34.5編碼基因之前位點中的多個取向。
在一些實施方式中，溶瘤病毒包含含有SEQ ID NO：1的FLT3L序列和含有SEQ ID NO：7的IL12序列。
在一些實施方式中，溶瘤病毒包含含有SEQ ID NO：24的CMV啟動子，含有SEQ ID NO：20的Kozak序列，含有SEQ ID NO：1的FLT3L序列，含有SEQ ID NO：17的P2A序列(GSG-P2A)，含有SEQ ID NO：7的IL12序列和含有SEQ ID NO：21的BGHpA序列。
本發明還包括使用本發明之溶瘤病毒治療癌症之方法。另外，本發明包括治療有效量的溶瘤病毒，用於在治療癌症中使用。
本發明還包括藥物組成物，用於在治療癌症中使用。藥物組成物可以進一步包含檢查點抑制劑。
在一些實施方式中，本發明包括包含本發明之溶瘤病毒之套組(kit)。
[圖1].圖1顯示了針對IL12p35和IL12p40鏈融合產生單鏈細胞介素產物而評估的連接子之電腦建模。
[圖2].圖2顯示了針對IL12p35和IL12p40鏈融合而評估的連接子之能量構象建模。
[圖3].圖3顯示了IL12融合蛋白的工程化，以優化表現，包括評估鏈的取向，訊息肽的放置以及所用的連接子。
[圖4].圖4顯示了用豬2A病毒(P2A)序列或內部核糖體進入位點(IRES)序列表現時，FLT3L和單鏈IL12之表現。
[圖5].圖5顯示了將KOZAK序列摻入DNA構建體中對產生的細胞介素產物水平之影響。
[圖6].圖6顯示了P2A胺基酸添加對於FLT3L對其同源受體FLT3的活性和FLT3L與其同源受體FLT3的受體結合之結構影響。
[圖7].圖7顯示了在體外報告基因測定中重組人IL12(A)和由FLT3L-P2A-IL12構建體產生的單鏈IL12(B)之活性。
[圖8].圖8顯示了在體外細胞增殖測定中重組人FLT3L(A)和由FLT3L-P2A-IL12構建體產生的FLT3L(B)之活性。
[圖9].圖9顯示了同源重組方法，以產生包含插入到HSV1基因組的兩個34.5座位中的FLT3-IL12序列之工程化病毒。
[圖10].圖10顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒在VERO(A)和A375(B)細胞系中之體外複製能力。
[圖11].圖11顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒在小鼠CT26細胞(A)以及人HT-29(B)、SK-MEL-5(C)、FADU(D)和BxPC-3細胞系(E)中之體外感染和裂解能力。
[圖12].圖12顯示了來自HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的FLT3L和IL12在受感染的人VERO、SK-MEL-5和A375細胞中之表現。
[圖13].圖13顯示了IL12當被在體外感染了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的人SK-MEL-5(A)或A375(B)細胞表現時之活性。
[圖14].圖14顯示了FLT3L當被在體外感染了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒的人SK-MEL-5(A)或VERO(B)細胞表現時之活性。
[圖15].圖15顯示了來自植入BALB/c動物和經瘤內注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的1e6PFU/動物的A20腫瘤細胞的小鼠FLT3L和IL12之體內表現。
[圖16].圖16顯示了來自植入C57BL6動物和經瘤內注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的5e6PFU/動物的B16F10腫瘤細胞的小鼠FLT3L和IL12之體內表現。
[圖17].圖17顯示了由於注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12病毒而產生的抗腫瘤T細胞應答。
[圖18].圖18顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在雙側小鼠同系B細胞淋巴瘤(A20細胞系)腫瘤模型中之抗腫瘤功效，其中病毒藉由瘤內僅遞送至其中一個腫瘤(右側)，而另一個腫瘤未經處理(左側)。
[圖19].圖19顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在雙側小鼠同系神經母細胞瘤(Neuro2A細胞系)腫瘤模型中之抗腫瘤功效，其中病毒藉由瘤內僅遞送至其中一個腫瘤(右側)，而另一個腫瘤未經處理(左側)。
[圖20].圖20顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在雙側小鼠同系結直腸(CT26細胞系)腫瘤模型中之抗腫瘤功效，其中病毒藉由瘤內僅遞送至其中一個腫瘤(右側)，而另一個腫瘤未經處理(左側)。
[圖21].圖21顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12結合檢查點阻斷(抗PD1 mAb)在雙側小鼠同系結直腸(MC38細胞系)腫瘤模型中之抗腫瘤功效，其中病毒藉由瘤內僅遞送至其中一個腫瘤(右側)，而另一個腫瘤未經處理(左側)。
[圖22].圖22顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在單個小鼠同系結直腸(CT26細胞系)腫瘤模型中之細胞介素/有效載荷產生，其中病毒經瘤內遞送至腫瘤(右側)。
[圖23].圖23顯示了在雙側小鼠同系結直腸(MC38細胞系)腫瘤模型中單獨注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或結合抗PD1抗體所產生之抗腫瘤應答(藉由ELISpot測量)。X軸下方的線表示線上的起點和終點指示的各組之間的統計分析結果(雙尾學生T檢驗)。P值表示如下：*係p
0.05；**係p
0.01，***係p
0.001，****係p
0.0001
[圖24].圖24顯示了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12結合抗4-1BB激動劑抗體在雙側小鼠同系結直腸(MC38細胞系)腫瘤模型中之抗腫瘤功效，其中病毒藉由瘤內僅遞送至其中一個腫瘤(右側)，而另一個腫瘤未經處理(左側)。
本文中所使用的部分標題僅出於組織目的，而不應被視為限制所描述之主題內容。在本說明書正文中引用的所有參考文獻都藉由引用以其全文明確地併入。
除非本文中另外定義，否則結合本申請所使用的科學及技術術語具有熟悉該項技術者通常所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。
一般而言，結合本文中所描述的細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交而使用的命名法及其技術係本領域中眾所周知且通常使用的那些命名法及技術。除非另外指示，否
則本申請之方法及技術可根據本領域中眾所周知的常規方法且如貫穿本說明書所引用及論述的各種通用及更特定參考文獻中所描述來進行。參見，例如，Sambrook等人.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)[分子選殖：實驗室手冊，第3版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約洲(2001)]；Ausubel等人.，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)[分子生物學現代方法，格林出版聯合公司(1992)]；以及Harlow和Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)[抗體：實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約州(1990)]，將該等文獻藉由引用併入本文中。酶促反應及純化技術係根據製造商的說明書、如本領域中通常所實現或如本文中所描述來進行。結合本文中所描述的分析化學、合成有機化學以及醫學及藥物化學而使用的術語及其實驗程序及技術係本領域中眾所周知且通常使用的那些術語以及實驗程序及技術。標準技術可用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製物及遞送、以及治療患者。
應理解，本發明不限於本文中所描述的特定方法、方案及試劑等且因而可能變化。本文中所使用的術語僅出於描述特定實施方式的目的，而不意欲限制本揭露的範疇，本揭露的範疇將僅由申請專利範圍來限定。
除了操作實例中或另外指示的情況，表述本文中所使用的成分的量或反應條件的所有數字均應理解為在所有情況下均由術語「約」加以修飾。術語「約」當結合百分比使用時可意指±1%。
以任何方式都比由本文特定段落所定義的變型範圍更窄的所有實施方式應被認為包括在本揭露中。例如，某些方面被描述為一類，並且應當理解，屬於一類的每個成員可以分別是實施方式。同樣，被描述為一類的方面或選擇屬於一類的成員應被理解為包括該類中兩個或更多個成員的組合。還應
理解，雖然說明書中的多個實施方式係使用「包含」語言呈現的，但在多種情況下，也可以使用「由......組成」或「基本上由......組成」語言來描述相關實施方式。
當涉及基因時，術語「功能性缺失」係指該基因被修飾(例如，藉由部分或完全缺失、替換、重排或以其他方式改變該基因)，使得功能性蛋白不再由該基因表現。在單純皰疹病毒(例如溶瘤病毒)的情況下，當病毒基因在單純皰疹基因組中被修飾，從而單純皰疹病毒不再由該基因表現功能性病毒蛋白時，該基因發生「功能性缺失」。
當涉及病毒基因組中存在的核酸(或由核酸編碼的蛋白質)時，術語「異源」係指病毒中非天然存在的核酸(或由病毒非天然產生的蛋白質)。例如，相對於HSV-1，編碼人IL12的核酸或編碼人FLT3L之核酸係「異源的」。
術語「溶瘤病毒」係指天然地或由於修飾而相對於非癌細胞優先感染並殺死癌細胞之病毒。
如本文所用，術語「患者」或「受試者」可互換使用並且意指哺乳動物，包括但不限於人或非人哺乳動物(如牛、馬、犬、綿羊或貓)。較佳的是，患者係人。
術語「HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12」係指衍生自毒株JS1的修飾的HSV-1，其中HSV-1缺乏功能性ICP34.5編碼基因，缺乏功能性ICP47編碼基因，包括插入ICP 34.5基因前位點的以下：[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)]-[BGHpA]。
任何病毒都可以用於產生本發明之溶瘤病毒。通常，可以對病毒進行修飾，例如以調節其複製(例如，相對於在健康細胞中，優先在腫瘤細胞中複製)、其被宿主的免疫系統檢測的能力，以及包括外源核酸。
在一些實施方式中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒(HSV)。在其他實施方式中，溶瘤病毒係單純皰疹1型病毒(HSV-1)。在又其他實施方式中，溶瘤病毒衍生自JS1(HSV-1)。JS1保藏在歐洲細胞培養物保藏中心(ECAAC)，保藏號為01010209。
在一些實施方式中，溶瘤病毒係其中編碼ICP34.5的病毒基因功能性缺失的HSV-1。在HSV感染期間充當毒力因子的ICP34.5的功能性缺失限制了在非分裂細胞中之複製並使得病毒呈非致病性。ICP34.5功能性缺失的HSV的安全性已在多項臨床研究中得到證明(MacKie等人，Lancet[柳葉刀]357：525-526,2001；Markert等人，Gene Ther[基因療法]7：867-874,2000；Rampling等人，Gene Ther[基因療法]7：859-866,2000；Sundaresan等人，J.Virol[病毒學雜誌]74：3822-3841,2000；Hunter等人，J Virol[病毒學雜誌]，八月；73(8)：6319-6326,1999)。
在其他實施方式中，溶瘤病毒係HSV-1，其中編碼ICP47的病毒基因(其阻止病毒抗原呈遞給主要的組織相容性複合物I和II類分子)功能性缺失。ICP47的功能性缺失也導致US11的較早表現，US11係促進腫瘤細胞中病毒生長而不降低腫瘤選擇性的基因。
在一些實施方式中，編碼ICP34.5之病毒基因缺失。在一些實施方式中，編碼ICP47之病毒基因缺失。在一些實施方式中，編碼ICP34.5的病毒基因和編碼ICP47之病毒基因均缺失。在一些實施方式中，編碼ICP34.5的病毒基因和編碼ICP47之病毒基因均缺失，並且ICP47的缺失導致US11的較早表現。
皰疹病毒株以及如何製備該等毒株描述於美國專利案號US 5824318、US 6764675、US 6,770,274、US 7,063,835、US 7,223,593、US 7749745、
US 7744899、US 8273568、US 8420071、US 8470577，WIPO公開案號：WO 199600007、WO 199639841、WO 199907394、WO 200054795、WO 2006002394、WO 201306795，中國專利案號：CN 128303、CN 10230334和CN 10230335，Varghese和Rabkin,(2002)Cancer Gene Therapy[癌症基因療法]9：967-97以及Cassady和Ness Parker,(2010)The Open Virology Journal[開放病毒學雜誌]4：103-108中，其每一篇均藉由引用併入本文。
本發明之溶瘤病毒也被修飾，使得它們包含編碼蛋白質的外源核酸。合理地選擇此類蛋白質以增強病毒之免疫刺激能力。增加免疫刺激能力使溶瘤病毒引起更穩健的抗腫瘤應答。因此，一方面，溶瘤病毒包含編碼異源樹突細胞生長因子、第一異源細胞介素或兩者的核酸。FLT3L增強樹突細胞，特別是cDC1子集的增殖和存活，這對於腫瘤抗原向T細胞的交叉呈遞係至關重要的。此外，IL12增強了1型T輔助細胞(Th1)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的功能，得到最大腫瘤殺傷活性。不受理論的束縛，認為這兩組屬性之組合將產生具有令人驚訝的例如誘導對癌細胞的全身免疫應答能力之溶瘤病毒。
在特定的實施方式中，溶瘤病毒包含編碼異源樹突細胞生長因子之核酸和編碼第一異源細胞介素的核酸(有時稱為「有效載荷」)。第一異源細胞介素的實例包括介白素-2(IL2)、IL7、IL12、IL15、IL21、TNF、以及能夠與免疫細胞上的受體結合和/或能夠增強T細胞功能或記憶形成的細胞介素和蛋白質的介白素家族之其他成員。在一個特定的實施方式中，第一異源細胞介素係IL12(鼠或人)。編碼muIL12a和muIL12b的核酸序列分別在SEQ ID NO：11和13中列出。編碼huIL12a和huIL12b的核酸序列分別在SEQ ID NO：3和5中列出。muIL12a和muIL12b的胺基酸序列分別在SEQ ID NO：12和14中列出。huIL12a和huIlL2b的胺基酸序列分別在SEQ ID NO：4和6中列出。
天然形式的IL12係包含IL12A(p35亞基)和IL12B(p40亞基)的異二聚體細胞介素，其中每個亞基由單獨的基因編碼。因此，在一些實施方式中，本發明之溶瘤病毒包含兩個異源核酸：一個編碼IL12 p35亞基，另一個編碼IL12 p40亞基。在其他實施方式中，本發明之溶瘤病毒包含單鏈IL12變體。在這樣的單鏈IL12變體中，p35和p40亞基可以彼此直接融合(即，沒有連接子)，或者可以經由(合成的或基於肽的)連接子彼此連接。合適的連接子的實例包括：基於彈性蛋白的連接子(VPGVGVPGVGGS；SEQ ID NO：22所示的核酸序列；SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列)、G4S、2x(G4S)、3x(G4S)、4x(G4S)、5x(G4S)、6x(G4S)、7x(G4S)、8x(G4S)、9x(G4S)和10x(G4S)。在一些實施方式中，連接子係VPGVGVPGVGGS、G4S、2x(G4S)或3x(G4S)。在一個特定的實施方式中，連接子係G4S。
IL12變體可以包含或可以排除天然IL12蛋白中存在的訊息肽(每個亞基一個)。在一些實施方式中，IL12變體包含零個、一個或兩個訊息肽。在一個具體的實施方式中，IL12變體包含單個訊息肽，例如[IL12(p40-GGGGS-No SP-p35)](SEQ ID NO：7中存在的核酸序列；SEQ ID NO：8中存在的胺基酸序列)，其中保留了p40訊息肽，並去除了p35訊息肽。參見圖3。
異源樹突細胞生長因子的實例包括細胞介素、C型凝集素和CD40L。在一些實施方式中，異源樹突細胞生長因子係選自包括以下的列表的細胞介素(即，第二細胞介素)：Fms相關酪胺酸激酶3配位基(FLT3L)、GMCSF、TNFα、IL36γ和IFN。在一個特定的實施方式中，異源樹突細胞生長因子係FLT3L。編碼muFLT3L的核酸序列在SEQ ID NO：9中列出。編碼huFLT3L的核酸序列在SEQ ID NO：1中列出。muFLT3L的胺基酸序列在SEQ ID NO：10中列出。huFLT3L的胺基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。
在一些實施方式中，溶瘤病毒包含編碼FLT3L和IL12的核酸。在其他實施方式中，溶瘤病毒係HSV-1，其中編碼ICP34.5的病毒基因和編碼ICP47的病毒基因缺失，並且溶瘤病毒包含編碼FLT3L和IL12的核酸。
外源核酸可以在相同啟動子或不同啟動子的控制下。在一個特定的實施方式中，編碼異源樹突細胞生長因子的核酸和編碼第一異源細胞介素的核酸在同一啟動子的控制下。使用單個啟動子(例如CMV啟動子)具有能夠在同一感染細胞中以相同的速率並同時產生異源樹突細胞生長因子和第一異源細胞介素的益處。
合適的啟動子的實例包括：巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α啟動子(EF1a)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1啟動子(PGK)、泛素C啟動子(UBC)和鼠幹細胞病毒(MSCV)。在一個特定的實施方式中，啟動子係CMV(SEQ ID NO：24中所示的核酸序列)。
當在同一啟動子的控制下，編碼有效載荷的核酸可以藉由另外的核酸連接，所述核酸例如允許多順反子轉譯(多順反子連接子元件)。合適的多順反子連接子元件的實例包括：核糖體進入位點(例如，內部核糖體進入位點(IRES)(SEQ ID NO：19))、2A序列(例如，豬捷申病毒2a(GSG-P2A；SEQ ID NO：17中所述的核酸序列；SEQ ID NO：18中所述的胺基酸序列)、明脈扁刺蛾β四體病毒(T2A)、口蹄疫病毒2A(F2A)和馬鼻炎A病毒(E2A))。此類序列可用於以任何取向連接兩個核酸。例如，病毒基因組中的核酸可以這樣定向：[異源樹突細胞生長因子]-[P2A]-[第一異源細胞介素]或[第一異源細胞介素]-[P2A]-[異源樹突細胞生長因子]。
已經觀察到，使用IRES導致構建體中IRES的第二核酸3'的產生減少。例如，[IL12]-[IRES]-[FLT3L]構建體中FLT3L的產生減少，同時
[FLT3L]-[IRES]-[IL12]中IL12的產生減少。參見實例4。因此，在一個實施方式中，多順反子連接元件為2A。在一個具體的實施方式中，多順反子連接元件係P2A。
本發明之溶瘤病毒還可包含增強外源核酸轉譯(例如哺乳動物轉譯)的序列。例如，已知KOZAK序列增強哺乳動物轉譯。因此，在一些實施方式中，溶瘤病毒包含Kozak序列。在一個實施方式中，Kozak序列係共有Kozak序列(SEQ ID NO：20)。
本發明之溶瘤病毒還可包含增強病毒表現的mRNA的穩定性的序列。這樣的序列的實例包括牛生長激素聚腺苷酸化訊息序列(BGHpA)和兔β珠蛋白(RBGpA)、SV40 polyA和hGH polyA。在一個具體的實施方式中，該序列係BGHpA(SEQ ID NO：21)。
可如本文所述進行修飾的其他溶瘤病毒包括RP1(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)；RP2(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/抗CTLA-4結合物；和RP3(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GM-CSF/GALV-GP R(-)/抗CTLA-4結合物/共刺激配位基(例如，CD40L、4-1BBL、GITRL、OX40L、ICOSL))。在此類溶瘤病毒中，GALV(長臂猿白血病病毒)已被R肽的特定缺失修飾，得到GALV-GP R(-)。此類溶瘤病毒在WO 2017118864、WO 2017118865、WO 2017118866、WO 2017118867、和WO 2018127713 A1中進行了討論，各自藉由引用以其全文併入。可如本文所述進行修飾的溶瘤病毒的其他實例包括NSC-733972、HF-10、BV-2711、JX-594、Myb34.5、AE-618、BrainwelTM、和HeapwelTM、Cavatak®(柯薩基病毒(coxsackievirus)、CVA21)、HF-10、Seprehvir®、Reolysin®、enadenotucirev、ONCR-177、以及在USP 10,105,404、WO 2018006005、WO
2018026872 A1、和WO 2017181420中描述的那些，其每一篇均藉由引用以其全文併入。
可如本文所述進行修飾的溶瘤病毒的其他實例包括：G207係源自野生型HSV-1毒株F的溶瘤HSV-1，其在HSV神經毒性的主要決定簇、ICP 34.5基因二者拷貝中具有缺失，並且在UL39中失活插入編碼感染的細胞蛋白6(ICP6)的大腸桿菌lacZ基因，參見Mineta等人(1995)Nat Med.[自然醫學]1：938-943。
OrienX010係一種單純皰疹病毒，其具有γ34.5和ICP47兩種基因拷貝的缺失以及ICP6基因的中斷和人GM-CSF基因的插入，參見Liu等人，(2013)World Journal of Gastroenterology[世界胃腸病學雜誌]19(31)：5138-5143。
NV1020係一種長(L)和短(S)區域的聯合區域缺失的單純皰疹病毒，其包括ICP34.5、UL24和UL56.34,35的一個拷貝。缺失區域被HSV-2 US DNA的片段(US2、US3(PK)、gJ和gG)替換，參見Todo，等人(2001)Proc Natl Acad Sci USA.[美國國家科學院院刊]98：6396-6401。
M032係一種單純皰疹病毒，其具有ICP34.5基因二者拷貝的缺失和白細胞介素12的插入，參見Cassady和Ness Parker,(2010)The Open Virology Journal[開放病毒學雜誌]4：103-108。
ImmunoVEX HSV-2係一種單純皰疹病毒(HSV2)，其具有編碼vhs、ICP47、ICP34.5、UL43和US5的基因的功能性缺失。
OncoVEXGALV/CD也衍生自HSV-1毒株JS1，其中編碼ICP34.5和ICP47的基因功能性缺失，並且編碼胞嘧啶脫胺酶和長臂猿白血病病毒融膜糖蛋白的基因插入病毒基因組中以替代ICP34.5基因。
在一個特定的實施方式中，本發明之溶瘤病毒係HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。在另一個實施方式中，本發明之溶瘤病毒係
HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12，其中所述病毒衍生自保藏於歐洲細胞培養物保藏中心(ECAAC)的HSV-1毒株JS1，保藏號為01010209。
本發明之溶瘤病毒可以用作治療癌症等疾病的單一藥劑。通常已經發現溶瘤病毒係安全的，並且具有良好的安全性。因此，本發明之溶瘤病毒可以與其他藥劑組合使用而對安全性沒有明顯的負面影響。
本發明之溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可與免疫檢查點抑制劑、免疫細胞介素、共刺激分子激動劑、靶向療法、以及標準護理療法組合使用。例如，本發明之溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可以與靶向癌症療法(例如，MEK抑制劑如考比替尼(cobimetinib)、曲美替尼(trametinib)和貝美替尼(binimetinib))和/或細胞介素(例如，聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin))組合使用。
免疫檢查點係調節某些類型的免疫系統細胞(如T細胞(其在細胞介導的免疫中起核心作用))的蛋白質。雖然免疫檢查點有助於在檢查中控制免疫應答，但它們也可以防止T細胞殺死癌細胞。免疫檢查點抑制劑(或簡稱「檢查點抑制劑」)可以阻斷免疫檢查點蛋白活性，從而釋放免疫系統上的「制動器」，並允許T細胞更好地殺死癌細胞。
如本文所用，術語「免疫檢查點抑制劑」或「檢查點抑制劑」係指完全或部分地減少、抑制、干擾或調節一種或多種檢查點蛋白的分子。檢查點蛋白調節T細胞激活或功能。許多檢查點蛋白係已知的，例如CTLA-4及其配位基CD80和CD86；以及PD-1及其配位基PD-L1和PD-L2(Pardoll,Nature Reviews Cancer[自然癌症綜述]12：252-264,2012)。該等蛋白質負責T細胞應答之共刺激
或抑制相互作用。免疫檢查點蛋白調節和維持自身耐受性以及生理免疫應答之持續時間和幅度。免疫檢查點抑制劑包括抗體或可以衍生自抗體。
檢查點抑制劑可以包括小分子抑制劑，或者可以包括結合並阻斷或抑制免疫檢查點受體的抗體或其抗原結合片段，或結合並阻斷或抑制免疫檢查點受體配位基的抗體。可以被靶向以便阻斷或抑制的示例性檢查點分子包括但不限於CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(屬於CD2分子家族並且在所有NK、γδ和記憶CD8+(αβ)T細胞上表現)、CD160(也稱為BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR和各種B-7家族配位基。B7家族配位基包括但不限於B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。檢查點抑制劑包括抗體或其抗原結合片段、其他結合蛋白、生物治療劑或小分子，該等檢查點抑制劑結合並阻斷或抑制CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD 160和CGEN-15049中一種或多種的活性。
細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)係一種免疫檢查點分子，其下調T細胞激活的途徑。CTLA-4係T細胞激活的負調節物。已顯示CTLA-4的阻斷增強了T細胞激活和增殖。單純皰疹病毒和抗CTLA-4抗體的組合旨在藉由兩種不同機制增強T細胞激活，從而增強對腫瘤中病毒裂解性複製後釋放的腫瘤抗原的抗腫瘤免疫應答。因此，單純皰疹病毒和抗CTLA-4抗體的組合可以增強經注射和未注射/遠端腫瘤的破壞，改善總體腫瘤應答以及延長總存活期，特別是總存活期與單獨使用抗CTLA-4抗體所獲得的總存活期相比延長。
計劃性細胞死亡蛋白1(PD-1)係在T細胞和pro-B細胞上表現的288個胺基酸細胞表面蛋白分子，並且在它們的命運/分化中起作用。PD-1的兩個配位基PD-L1和PD-L2係B7家族的成員。當對感染有炎性應答時PD-1限制周圍組
織中T細胞之活性，並且在體外限制自體免疫PD-1阻斷增強了T細胞增殖和細胞介素產生，以應答於混合的淋巴細胞應答中特異性抗原靶標或同種異體細胞之攻擊。PD-1表現與應答之間的強相關性顯示為PD-1的阻斷(Pardoll,Nature Reviews Cancer[自然癌症綜述]，12：252-264,2012)。PD-1阻斷可以藉由多種機制實現，包括結合PD-1或PD-L1的抗體。
計劃性死亡配位基1(PD-L1)也稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，該計劃性死亡配位基1係由CD274基因編碼之蛋白質。參見，Entrez Gene：CD274 CD274分子。PD-L1係一種在抑制免疫系統中起作用的40kDa 1型跨膜蛋白，其與激活的T細胞、B細胞和骨髓細胞上的受體(PD-1)結合以調節細胞激活或抑制。參見Chemnitz等人，Journal of Immunology[免疫學雜誌]，173(2)：945-54(2004)。
其他免疫檢查點抑制劑包括淋巴細胞激活基因-3(LAG-3)抑制劑，如IMP321即可溶性Ig融合蛋白(Brignone等人，2007,J.Immunol.[免疫學雜誌]179：4202-4211)。還包括B7抑制劑，如B7-H3和B7-H4抑制劑(例如，抗B7-H3抗體MGA271(Loo等人，2012,Clin.Cancer Res.[臨床癌症研究]7月15日(18)3834))。另一個檢查點抑制劑係TIM3(T細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域3)(Fourcade等人，2010,J.Exp.Med.[實驗醫學雜誌]207：2175-86和Sakuishi等人，2010,J.Exp.Med.[實驗醫學雜誌]207：2187-94)。
如本文進一步所述，在一個方面，本發明關於溶瘤病毒和檢查點抑制劑的組合用於治療癌症之用途。在另一方面，本發明關於包含溶瘤病毒和檢查點抑制劑的組合的藥物組成物。
因此，在本發明之一個方面，檢查點抑制劑係CTLA-4、PD-1、PD-L1或PD-L2的阻斷劑或抑制劑。在一些實施方式中，檢查點抑制劑係CTLA-4的阻斷劑或抑制劑，例如替西木單抗、伊匹單抗(也稱為10D1、MDX-D010)、BMS-
986249、AGEN-1884和抗CTLA-4抗體，如美國專利案號：5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238中所述，其每一篇均藉由引用併入本文。在一些實施方式中，檢查點抑制劑係PD-L1或PD-1的阻斷劑或抑制劑(例如，抑制PD-1與PD-L1和/或PD-L2抑制劑相互作用的分子)，例如包括派姆單抗(抗PD-1抗體)、納武單抗(抗PD-1抗體)、CT-011(抗PD-1抗體)、CX-072(抗PD-L1抗體)、IO-103(抗PD-L1)、BGB-A333(抗PD-L1)、WBP-3155(抗PD-L1)、MDX-1105(抗PD-L1)、LY-3300054(抗PD-L1)、KN-035(抗PD-L1)、FAZ-053(抗PD-L1)、CK-301(抗PD-L1)、AK-106(抗PD-L1)、M-7824(抗PD-L1)、CA-170(抗PD-L1)、CS-1001(抗PD-L1抗體)；SHR-1316(抗PD-L1抗體)；BMS 936558(抗PD-1抗體)、BMS-936559(抗PD-1抗體)、阿特珠單抗(抗PD-L1抗體)、AMP 224(PD-L2的細胞外結構域和設計成阻斷PD-L2/PD-1相互作用的IgGl抗體的融合蛋白)、MEDI4736(度伐單抗；抗PD-L1抗體)、MSB0010718C(抗PD-L1抗體)，以及美國專利案號7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149和PCT公開專利申請案號：W0 03042402、WO 2008156712、W0 2010089411、W0 2010036959、WO 2011066342、WO 2011159877、WO 2011082400和WO 2011161699中所述的那些，其中每一篇均藉由引用併入本文。另外的抗PD-1抗體包括PDR-001、SHR-1210、BGB-A317、BCD-100、JNJ-63723283、PF-06801591、BI-754091、JS-001、AGEN-2034、MGD-013、LZM-009、GLS-010、MGA-012、AK-103、傑諾單抗(genolimzumab)、dostarlimab、cemiplimab、IBI-308、坎利珠單抗、AMP-514、TSR-042、Sym-021、HX-008和ABBV-368。
BMS 936558係靶向PD-1的完全人IgG4單株抗體。在I期試驗中，BMS-936558的兩週一次向患有治療難治性晚期惡性腫瘤的受試者投與顯示出持久的部分或完全消退。在患有黑色素瘤(28%)和腎細胞癌(27%)的受試者
中觀察到最顯著的應答率，但在患有非小細胞肺癌(NSCLC)的受試者中也觀察到顯著的臨床活性，並且一些應答持續超過一年。
BMS 936559係靶向PD-1配位基PD-L1的完全人IgG4單株抗體。I期結果顯示此藥物的兩週一次投與導致持久的應答，尤其是在患有黑色素瘤之受試者中這樣。根據患有晚期NSCLC、黑色素瘤、RCC或卵巢癌的受試者中的癌症類型，客觀應答率的範圍為6%至17%，其中一些受試者經歷持續一年或更長時間的應答。
AMP 224係第二PD-1配位基、PD-L2和IgGl的細胞外結構域的融合蛋白，其具有阻斷PD-L2/PD-1相互作用的潛力。AMP-224目前作為單一療法在患有晚期癌症的受試者中正在進行I期測試。
MEDI4736係一種抗PD-L1抗體，其在此劑量遞增研究中已證明具有可接受的安全性特性和持久的臨床活性。作為單一療法和以組合的形式在多種癌症中的擴展和MEDI4736的開發正在進行中。
本發明還關於用溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)治療疾病或病症例如癌症之方法。本發明之溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)可用於治療任何可注射的癌症(即，在有或沒有指導的情況下(例如視覺或超音波指導)，可以用例如針頭注射的任何腫瘤)。在一些實施方式中，癌症係B細胞淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、頭頸鱗狀癌、肝細胞癌、胃癌、肉瘤(例如軟組織肉瘤、尤文肉瘤(Ewing sarcoma)、骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)、胃食管癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤、胰臟癌、膀胱癌、前列腺
癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、皮膚T細胞淋巴瘤、默克爾(merkel)細胞癌或多發性骨髓瘤。
術語「轉移性癌症」係指已經從其開始的身體部位(即主要部位)擴散到身體的其他部位的癌症。當癌症擴散到新的區域(即轉移)時，它仍以開始時的身體部位來命名。例如，已經擴散到胰腺的結腸癌被稱為「胰腺的轉移性結腸癌」，而不是胰臟癌。治療也基於癌症起源的地方。如果結腸癌擴散到骨骼，它仍然是結腸癌，並且相關醫生將推薦已被證明可對抗轉移性結腸癌之治療。
本發明還關於溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和其他藥劑(例如，檢查點抑制劑)的組合用於治療諸如上述那些的癌症之用途。
本發明還關於一種藉由投與以下治療疾病或障礙(如癌症)之方法：(i)治療有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)；和(ii)治療有效量的另一種藥劑(例如，檢查點抑制劑)。
在特定的實施方式中，本發明關於溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗PD-1抗體的組合、溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗PD-L1抗體的組合、或溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和抗CTLA-4抗體的組合。在具體的實施方式中，溶瘤病毒係HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。
在許多情況下，癌症作為原發性腫瘤(即在腫瘤進展開始的解剖部位生長的腫瘤並且繼續產生癌性腫塊)和作為繼發性腫瘤或轉移瘤(即，腫瘤從其原發部位擴散到身體的其他部位)兩種形式存在於患者中。本發明之溶瘤病毒可以經由裂解作用和全身免疫作用有效地治療腫瘤。例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12物理地裂解腫瘤細胞，導致原發性腫瘤細胞死
亡並釋放腫瘤來源的抗原，該等抗原然後被免疫系統識別。此外，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的複製會導致FLT3L和IL12的產生，這有助於(局部和全身)增加和維持抗腫瘤免疫應答，從而使免疫系統可以識別和攻擊原發性和繼發性腫瘤/轉移。因此，本發明預期單獨或與第二藥劑(例如檢查點抑制劑)組合使用溶瘤病毒(例如HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)治療原發性腫瘤、轉移瘤(即繼發性腫瘤)或兩者。
在一些實施方式中，本文所述的治療方法或用途包括與靶向癌症療法例如MEK抑制劑如考比替尼、曲美替尼和貝美替尼之組合治療。在其他實施方式中，本文所述的治療方法或用途包括用細胞介素例如聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin)治療。在又另一個實施方式中，本文所述的治療方法或用途包括用靶向療法和免疫調節劑之組合進行治療。
本發明之方法可以用於治療幾種不同分期的癌症。大多數分期系統包括與以下有關的資訊：癌症是否已擴散到附近淋巴結、腫瘤在體內的位置、細胞類型(例如，鱗狀細胞癌)、癌症是否已擴散到身體的不同部位、腫瘤的大小和腫瘤的等級(即，細胞異常的程度、腫瘤生長和擴散的可能性)。例如，0期係指存在尚未擴散到附近組織的異常細胞-即可能成為癌症的細胞。I期、II期和III期癌症係指癌症的存在。分期越高，癌症腫瘤越大，並且其擴散到附近組織中的越多。IV期癌症係已經擴散到身體遠端部位的癌症。在一些實施方式中，本發明之方法可以用於治療轉移性癌症。
本發明還關於藥物組成物，其包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，或包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和檢查點抑制劑、靶向癌症療法和/或其他
免疫調節劑的組合該藥物組成物可以含有用於修飾、維持、或保持組成物的例如pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的配製物材料。藥學活性劑可以藉由各種途徑給予至患者，包括例如口服或腸胃外，分別例如靜脈內、肌肉內、皮下、眼內、囊內、腹膜內、直腸內、腦池內、瘤內、血管內、皮內或藉由使用皮膚貼劑或透皮離子電滲療法穿過皮膚的被動或促進式吸收。在一個實施方式中，將溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)注射到腫瘤中(即，藉由瘤內注射)。在另一個實施方式中，將檢查點抑制劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體)全身(例如靜脈內)投與。在另一個實施方式中，靶向療法(例如MEK小分子激酶抑制劑，例如考比替尼、曲美替尼或貝美替尼)藉由口服途徑全身投與。在又另一個實施方式中，將細胞介素例如聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin)全身投與。
熟悉該項技術者將能夠根據本揭露之任何方面確定治療之劑量和持續時間。例如，技術人員可以監測患者以確定是否應該開始、繼續、中斷或恢復治療。對於特定患者的有效量可以根據因素(如正在治療的病症、患者的總體健康狀況以及投與的方法、途徑和劑量)而變化。臨床醫生使用本領域已知的參數確定適當的劑量。治療上待使用的藥物組成物的有效量將取決於例如治療背景和目的。熟悉該項技術者將理解，治療的適當劑量水平將因此部分地根據遞送的分子、使用結合劑分子的適應症、投與途徑以及患者的體型(體重、體表面積或器官大小)和狀況(年齡和一般健康狀況)而變化。因此，臨床醫師可滴定劑量並修改投與途徑以獲得最佳治療效應。
臨床研究已表明，可以將溶瘤病毒直接注射至皮膚、皮下或淋巴結病變中，該等病變係可見的、可觸知的；或者可以用超音波引導進行注射。因此，在一方面，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的藥物組成物藉由病變
內注射投與。在一些實施方式中，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12以固定給藥濃度以1mL單次使用小瓶提供：用於初始給藥的106pfu/mL和用於後續給藥的108pfu/mL。注射的體積可以根據腫瘤類型而變化。例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12可藉由瘤內注射在第1週的第1天以高達4.0mL 106空斑形成單位/mL(PFU/mL)的劑量，接著在第4週的第1天以高達4.0mL 108PFU/mL的劑量，並且此後每2週(±3天)投與至可注射的皮膚、皮下和結節腫瘤中。在另一個實施方式中，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12可藉由瘤內注射在第1週的第1天以高達4.0mL 106空斑形成單位/mL(PFU/mL)的劑量，接著在第4週的第1天以4.0mL 107PFU/mL的劑量，並且此後每2週(±3天)投與至可注射的皮膚、皮下和結節腫瘤中。
本發明之組成物可以包含一種或多種另外的組分，包括生理學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。例如，組成物可以包含緩衝液、抗氧化劑(如抗壞血酸)、低分子量多肽(例如，具有少於10個胺基酸)、蛋白質、胺基酸、碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(如EDTA)、麩胱甘肽、穩定劑和賦形劑中的一種或多種。可接受的稀釋劑包括例如中性緩衝鹽水或與特定血清白蛋白混合的鹽水。還可以添加防腐劑如苯甲醇。可以使用合適的賦形劑溶液(例如，蔗糖)作為稀釋劑將該組成物配製成凍乾物。
在某些實施方式中，將檢查點抑制劑以0.01mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、0.7mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg或其任何組合劑量投與。在某些實施方式中，將檢查點抑制劑每週一次、每週兩次、每週三次、每兩週一次或每月一次投與。在某些實施方式中，檢查點抑制劑以單個劑量、兩個劑量、三個劑量、四個劑量、五個劑量或6個或更多個劑量投與。
在某些實施方式中，將抗PD-1抗體藉由注射(例如，皮下或靜脈內)以約1至30mg/kg，例如約5至25mg/kg、約10至20mg/kg、約1至5mg/kg或約3mg/kg的劑量投與。給藥方案可以在例如每週一次與每2、3或4週一次之間變化。在一個實施方式中，將抗PD-1抗體以約10至20mg/kg的劑量每隔一週投與。
在一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，納武單抗)以約1mg/kg至3mg/kg(例如約1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg)的劑量每兩週靜脈內投與。在一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，納武單抗)以約2mg/kg的劑量按3週間隔靜脈內投與。在一個實施方式中，將納武單抗以約1mg/kg至5mg/kg(例如，3mg/kg)的量約每週一次至每2、3或4週一次投與，並且可以在60分鐘的時間段內投與。
在一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，派姆單抗)以約1mg/kg至3mg/kg(例如約1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg)的劑量每三週靜脈內投與。在一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，派姆單抗)以約2mg/kg的劑量按3週間隔靜脈內投與。在另一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，派姆單抗)以約100mg/kg至300mg/kg(例如約100mg/kg、200mg/kg或300mg/kg)的劑量每三週靜脈內投與。在一個實施方式中，將抗PD-1抗體分子(例如，派姆單抗)以約200mg/kg的劑量按3週間隔靜脈內投與。
在某些實施方式中，將抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗)藉由注射(例如，皮下或靜脈內)以如下劑量投與：約3mg/kg IV Q3W，最大4個劑量；約3mg/kg IV Q6W，最大4個劑量；約3mg/kg IV Q12W，最大4個劑量；約10mg/kg IV Q3W，最大4個劑量；或約10mg/kg IV Q12W，最大4個劑量。在某些實施方式中，將抗CTLA-4抗體(例如，替西木單抗)藉由注射(例如，皮下或靜脈內)以約10mg/kg Q4W；或約15mg/kg每3周的劑量施用。
在某些實施方式中，將抗PD-L1抗體(例如，阿特珠單抗)藉由注射(例如，皮下或靜脈內)以約1200mg IV Q3W的劑量投與，直至疾病進展或不可接受的毒性。
因此，在一個實施方式中，本發明關於一種用於治療任何可注射的癌症之方法的藥物組成物。在一些實施方式中，癌症係B細胞淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、頭頸鱗狀癌、肝細胞癌、胃癌、肉瘤(例如軟組織肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)、胃食管癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤、胰臟癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、皮膚T細胞淋巴瘤、默克爾細胞癌或多發性骨髓瘤，其中藥物組成物包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)、或溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和第二藥劑(例如，檢查點抑制劑)。
在其他實施方式中，本發明關於治療有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，其用於治療B細胞淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、頭頸鱗狀癌、肝細胞癌、胃癌、肉瘤(例如軟組織肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)、胃食管癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤、胰臟癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、皮膚T細胞淋巴瘤、默克爾細胞癌或多發性骨髓瘤。在又其他實施方式中，本發明關於治療有效量的溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)和第二藥劑(例如，檢查點抑制劑)，其用於治療B細胞淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤)、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、黑色素瘤(例如，葡萄膜黑色素瘤)、頭頸鱗狀癌、肝細胞癌、胃癌、肉瘤(例如軟組織肉瘤、尤文肉瘤、骨肉瘤或橫紋肌肉瘤)、胃食管癌、
腎細胞癌、膠質母細胞瘤、胰臟癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、皮膚T細胞淋巴瘤、默克爾細胞癌或多發性骨髓瘤。
在另一方面，本發明關於套組，其包含[1]溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)，該溶瘤病毒視需要與第二藥劑(例如，檢查點抑制劑)組合；和[2]向患者投與的說明書。例如，本發明之套組可以包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)以及用於治療患有癌症的患者的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。在一些實施方式中，該癌症係轉移性癌症。在另一個實施方式中，本發明之套組可以包含溶瘤病毒(例如，HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12)、檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體或抗CTLA-4抗體)和用於治療患有癌症的患者的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。
在一些實施方式中，第二藥劑係靶向癌症療法(例如，MEK抑制劑如考比替尼、曲美替尼和貝美替尼)或細胞介素(例如，聚乙二醇化IL2(例如，bempegaldesleukin)或聚乙二醇化IL10(例如，pegilodecakin))。
在一些實施方式中，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的套組包含藉由瘤內注射在第1週的第1天以高達4.0ml的106PFU/mL的劑量，接著在第4週的第1天以高達4.0ml的108PFU/mL的劑量，並且此後每2週投與(例如，直至完全應答)的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。在一些實施方式中，包含HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的套組包含藉由瘤內注射在第1週的第1天以高達4.0ml的106PFU/mL的劑量，接著在第4週的第1天以高達4.0ml的107PFU/mL的劑量，並且此後每2週投與(例如，直至完全應答)的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。
在套組包含抗PD-1抗體的實施方式中，該套組包含以本文所述劑量進行靜脈內投與的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。抗PD-1抗體的實例包括派姆單抗和納武單抗。
在套組包含抗PD-L1抗體的實施方式中，該套組包含以本文所述劑量進行靜脈內投與的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。抗PD-L1抗體的實例包括阿特珠單抗。
在套組包含抗CTLA-4抗體的實施方式中，該套組包含以本文所述劑量進行靜脈內投與的說明書(例如，在包裝插頁或標籤中)。抗CTLA-4抗體的實例包括伊匹單抗。
在另一個實施方式中提供了製造本發明之套組之方法。
提供以下實例係為了說明本發明之具體實施方式或特徵，而不是為了限制其範圍。
利用特定工程化標準的工程化單鏈IL12分子可導致細胞介素的最佳表現和活性。
藉由分析IL12(PDB ID 3HMX)的晶體結構來評估IL12的p40和p35亞基的最佳構型。由於亞基接近元件，因此單鏈蛋白預期具有更高程度的異源二聚化效率。由於C和N末端連接點的接近性，因此p40-p35取向(圖1A；虛線)在結構上優於p35-p40取向。這將導致跨越約36埃缺口的連接子(將p40的羧
基末端連接到p35的胺基起始末端)。相比之下，p35-p40肽的產生導致約60埃的缺口，這需要更長的連接子並不太有利。
為了建模p40與p35亞基之間的連接子，使用在RosettaScripts中具有0.5Å座標約束的FastRelax製備IL12(PDB 3HMX)的晶體結構之p40和p35亞基(S.J.Fleishman,A.Leaver-Fay,J.E.Corn,E.-M.Strauch,S.D.Khare,N.Koga,J.Ashworth,P.Murphy,F.Richter,G.Lemmon,J.Meiler和D.Baker.RosettaScripts：A Scripting Language Interface to the Rosetta Macromolecular Modeling Suite.[RosettaScripts：Rosetta大分子建模套件的指令碼語言介面]PLoS ONE.[公共科學圖書館．綜合]2011,6,6,e20161)。將生成的PDB文件連接到具有取向p40-p35的單鏈中，然後使用Rosetta Remodel在兩個結構域之間建模以下連接子：先前已描述的基於彈性蛋白的連接子(VPGVGVPGVGGS)、G4S(圖1B)、2x(G4S)(圖1C)、3x(G4S)和無連接子。未解析的p40的C末端殘基(S340)和成熟p35的前11個殘基(RNLPVATPDPG)包含在Remodel運行中。還運行了缺少未解析殘基的對照。預期需要連接子，因為當併入了連接子時，使用Rosetta回路建模仿真計算出的環閉合率將顯著提高。對於每個連接子，使用來自環片段的片段插入進行採樣並使用基於CCD的逆運動學進行環閉合來運行2880次Remodel軌跡。使用Remodel權重集對模型評分，並將具有成功環閉合(鏈斷裂評分<0.07)的模型作為PDB文件輸出。藉由評估滿足環閉合標準的軌跡百分比來確定環閉合率。對於每個連接子，藉由在RosettaScripts中使用RMSD Mover在不疊加下將每個模型的RMSD繪製到最低評分模型以測量構象收斂性。藉由每個殘基的Rosetta能量單位(REU)以及藉由連接子殘基的主鏈評分項，評估了每個連接子的前十個模型(表1)。在MOE中確定了具有Ramachandran異常值的模型(化學計算集團(Chemical Computing Group,Inc.))。
在沒有連接子的情況下或在截短的未解析的p40和p35末端下的Remodel運行的環閉合率<10%，這表明需要連接子來將p40和p35亞基連接成單鏈。相比之下，具有連接子的Remodel運行對於所有四個連接子序列均具有成功的環閉合率。在沒有主鏈應變或Ramachandran異常值的情況下，對於所有四個連接子的最高得分模型的得分都很高。更長的彈性蛋白和3x(G4S)連接子可能比G4S和2x(G4S)連接子更具構象柔性，因為前者的模型與後者的模型相比，RMSD與得分最高模型的差異更大。Rosetta Remodel用於識別p40-連接子-p35有效載荷的連接子。G4S連接的和2xG4S連接的構建體的最高評分模型表明，兩個連接子都是合適的，基於彈性蛋白的連接子也是合適的(圖2)。
環閉合率總結在下表1中。
[表1]：針對IL12p35和IL12p40鏈的融合評估的連接子之環閉合率。
為了藉由電腦建模證實單鏈IL12的功能，將各種形式的單鏈IL12構建體選殖到p△34.5(XS)載體中(參見構建體圖示，圖3A)，p△34.5(XS)載體係在CMV啟動子與BGH poly(A)尾部之間插入構建體的基於pcDNA3.1的載體。HSV-1反向重複序列位於CMV啟動子和BGH poly(A)尾部側翼，促進單鏈IL12構建體、CMV和BGH poly(A)尾部重組到HSV-1病毒中。p△34.5(XS)載體藉由限制性酶Hind III和Xho I線性化，這兩種酶分別位於CMV啟動子之後和BGH poly(A)尾部之前。對編碼單鏈IL12構建體的重疊DNA片段進行排序，並使用吉布森組裝法將其選殖到線性化p△34.5(XS)載體中。藉由DNA定序證實了單鏈IL12構建體的真實性。該等構建體用於體外轉染HEK 293細胞並比較IL12蛋白產生。在Optimem培養基中，用含8μl lipofectamine 2000的4μg DNA轉染細胞，並在5% CO2下於37℃孵育48小時。除去上清液，並使用Biolegend公司人IL12p70 ELISA測定法定量IL12表現。肽鏈的位置顯著改變了表現。含有p35-彈性蛋白-p40的構建體未產生可檢測水平的IL12，而含有p40-彈性蛋白-p35的構建體產生了IL12(圖3B)。
在天然形式中，IL12產生為兩條獨立鏈，兩者均包含蛋白質分泌所需的訊息肽。在修飾版本中，評估了第二訊息肽的必要性。將包含位於融合
物的5'端的單個訊息肽的構建體[IL12(p40-彈性蛋白-No SP-p35)]與編碼p35和p40亞基中訊息肽的構建體[IL12(p40-彈性蛋白-p35)]進行了比較。第二訊息肽的去除增加了由於轉染產生的IL12的總產量(圖3B)。最後，將具有彈性蛋白連接子的IL12表現與單個G4S連接子進行了比較(圖3B)。基於該等觀察，選擇摻入了具有從p35亞基中去除的訊息肽的p40-G4S連接子-p35的單鏈IL12盒，以包含在工程化病毒中。
該等實驗涉及使用豬捷申2A序列在單一啟動子的控制下以雙順反子形式生產生物活性FLT3L和IL12的工程化技術。
從病毒表現多種合理選擇的蛋白應增強病毒引發抗腫瘤應答之免疫刺激能力。選擇FLT3L和IL12作為免疫刺激細胞介素。單個啟動子(CMV啟動子)用於產生兩種細胞介素。這種方法的好處係可以在同一感染細胞中以相同的速率並同時產生兩種細胞介素。我們選擇了兩種方法從單個啟動子表現多種蛋白質：內部核糖體進入位點(IRES)和2A序列。設計併入FLT3L-IRES-IL12、IL12-IRES-FLT3L或FLT3L-P2A-IL12的DNA構建體。如前所述，在體外測試了DNA構建體(圖4A)。將DNA構建體轉染到293T細胞中，並藉由ELISA測試上清液(Biolegend IL12p70測定用於IL12和Thermo FLT3L測定用於FLT3L)。
在任一取向上(FLT3L作為第一基因，IL12作為第二基因，或IL12作為第一基因，FLT3L作為第二基因)，使用IRES時，第二基因的產生降低(圖4B和4C)。因此，選擇P2A序列作為功能性單元，以從單個啟動子產生兩種蛋白質。
在使用備用有效載荷(GMCSF)的單獨實驗中，評估了共有KOZAK序列之效果。已知KOZAK序列可增強哺乳動物轉譯，並預期改善完整盒之轉譯。與此相一致，藉由在轉譯起始位點上游併入KOZAK序列顯著增加5'蛋白(GMCSF)的表現，而與P2A或IRES使用無關(圖5；(在KOZAK存在下的平均ng/ML=660.9)；在KOZAK不存在下的平均ng/mL=102.5))。
添加P2A位點的潛在結果係，其會將幾個胺基酸附加到FLT3L蛋白的末端。P2A係導致在大多數哺乳動物細胞中產生兩條不同的多肽鏈之序列，但是產生的第一肽包括添加胺基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPG。進行了電腦建模，以確定在FLT3L的羧基末端添加胺基酸是否會影響與其受體FLT3的相互作用。使用PyMOL v.1.8.6.0以評估Flt3L/Flt3複合物的結構，以在雙有效載荷載體有效載荷1-P2A-有效載荷2盒中選擇構建體取向。P2A產生與有效載荷1的C末端融合的18個胺基酸的肽。Flt3L/Flt3的結構揭示了Flt3L的C末端被暴露出並位於受體結合位點和Flt3L二聚化介面的遠端。因此，Flt3L可能會容忍P2A標籤，因此被選作P2A序列上游的有效載荷(圖6)。然而，對FLT3L和IL12的生物活性加以證明以驗證活性。
對於IL12，將先前描述並用於ELISA測定以定量總IL12表現的上清液用於IL12細胞報告基因測定中。使用HEK-Blue IL12細胞(Invivogen #hkb-il12)測量IL12的生物活性。具有生物活性的IL12藉由HEK-Blue IL12細胞系誘導分泌型胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)之劑量依賴性產生，並且可以使用顯色劑QUANTI-Blue(Invivogen #rep-qb1)評估SEAP的水平。將DNA轉染的293T細胞的上清液以三倍系列稀釋的方式一式兩份與HEK-Blue IL12細胞一起直接添加到96孔平板中，並在5% CO2中於37℃孵育過夜。第二天，根據製造商的說明新鮮製備QUANTI-Blue試劑，預熱至37℃，持續15分鐘，並且與20μL過夜細胞培養上清液在37℃孵育1小時。藉由使用BioTek Synergy Neo2酶標儀(BioTek；Gen5
軟體v3.04)測量620-630nm處之吸光度來檢測SEAP水平。上清液在IL12報告基因測定中顯示出的活性與從商業供應商處購買的重組人IL12蛋白相當(R & D #219-IL-005；圖7)。
對於FLT3L，還在BaF3細胞增殖測定中測試了上清液，該測定已在文獻中描述為FLT3L敏感細胞系。將BaF3細胞以30,000個細胞/孔在24孔板中在RPMI+10% FBS+遺傳黴素中於37℃接種過夜。將用含有工程化有效載荷或重組人FLT3L的DNA構建體轉染的細胞的上清液添加到細胞中，將所有孔的總體積調整為500uL，然後在5% CO2中於37℃孵育14天。在第14天，藉由移液將BaF3細胞輕輕重懸，並從每個孔中取出樣本以使用Vi-CELL XR細胞活力分析儀(Beckman Coulter)進行細胞計數。從由Vi-CELL XR提供的活細胞濃度計算孔中的活細胞總數。包含人重組FLT3L作為對照，來自轉染的293T細胞的上清液顯示出對細胞增殖的相當的作用(圖8)。
基於該等觀察，藉由上述工程化技術，將待重組到HSV1基因組中的最終構建體選擇為人FLT3L-P2A-huIL12(p40-G4S-p35)。
HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12如下生成。
HSV-1源自保藏於歐洲細胞培養物保藏中心(ECAAC)，保藏號為01010209的毒株JS1。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中，如前所述，編碼ICP34.5和ICP47的HSV-1病毒基因已功能性缺失。參見，Liu等人，Gene Ther.[基因療法]，10：292-303,2003；美國專利案號7,223,593以及美國專利案號7,537,924。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中，ICP34.5和ICP47編碼基因的功能性缺失與US11的早期表現相結合，可改善腫瘤複製，同時維持安全性。將人FLT3L
和IL12的編碼序列在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的ICP34.5基因的兩個前位點處插入病毒基因組中(圖9)。人FLT3L和IL12表現盒幾乎替代了所有ICP34.5基因，從而確保HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12與野生型病毒之間的任何潛在重組事件只會導致有缺陷的非致病性病毒，不會導致攜帶人FLT3L和IL12基因的野生型病毒的產生。HSV胸苷激酶(TK)基因在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12中保持完整，這使病毒對諸如阿昔洛韋的抗病毒劑敏感。因此，如有必要，阿昔洛韋可用於阻斷HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12複製。
如前所述，包含人FLT3L和IL12表現盒的轉移質體由修飾的SP72載體(普洛麥格公司(Promega))創建(參見Liu等人，Gene Ther.[基因療法]，10：292-303,2003；美國專利案號7,223,593和美國專利案號7,537,924)。該質體包含HSV-1 17syn+的修飾的Sau3AI片段(核苷酸123462-126790，其去除了編碼大部分ICP34.5(核苷酸124948-125713)的NotI片段)。將含有CMV-KOZAK-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA的表現盒在原始Not1位點附近插入質體中。該插入導致表現盒側翼為被Sau3AI片段切除的HSV-1 17syn+區域(圖9)。
藉由同源重組過程將基因插入病毒基因組。用p△34.5轉移質體轉染Vero細胞。然後將轉染細胞用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GFP(JS1毒株)感染。該病毒在插入CMV-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA表現盒的基因組的ICP34.5編碼區域中包含GFP。繼續進行轉染-感染反應，直至觀察到完全的CPE(細胞病變效應)。將來自轉染-感染反應之細胞和上清液稀釋，並用於感染96孔板中的Vero細胞。2天後，藉由ELISA評估上清液以鑒定含有表現IL12和FLT3L的病毒粒子
的孔。收集來自IL12和FLT3L陽性孔的細胞和上清液，並在菌斑測定中與Vero細胞一起接種。2天後，藉由GFP標記基因的損失鑒定重組病毒。GFP標記基因的損失表明ICP34.5位點處的GFP被[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]表現盒替換(圖9)。在螢光顯微鏡下鑒定非GFP菌斑，並使用無菌移液管尖端將其轉移至裝有新鮮生長培養基之微量離心管中。藉由凍融將病毒從細胞中釋放出，並將病毒接種到新細胞上。每2到3天重複一次此過程，直到獲得同質群體(即，沒有菌斑呈現綠色)。藉由PCR和定序驗證了CMV-FLT3L-P2A-IL12-BGHPolyA表現盒的插入。
評價了重組病毒維持細胞感染、複製和裂解同時產生具有生物活性的FLT3L和IL12的能力。
為了證實工程化病毒能夠在人細胞內複製，感染了兩種人細胞系，並定量感染後病毒的總量。將100萬個A375或VERO細胞接種在6孔培養皿中，並在37℃下在5% CO2中在含5% FBS的DMEM中孵育過夜。用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒以0.1的MOI一式三份感染細胞，然後返回到培養箱。感染後48小時，收集細胞和上清液，並藉由在Vero細胞上進行菌斑測定來評估病毒滴定度。評估了工程化HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12病毒和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF病毒(圖10)。
為了證實引入病毒的修飾不影響病毒感染和裂解細胞之能力，進行了體外殺傷試驗。將小鼠(CT26)和人(HT-29、SK-MEL-5、FADU和BxPC3)來源的多種細胞系與多種感染複數(MOI)的病毒顆粒一起培養(圖11A-E)。結果在下面討論。
將CT26細胞以每孔6,000個細胞接種在96孔板中，並在37℃下孵育過夜。從100 MOI開始將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF進行系列稀釋(4倍，10孔)。孵育72小時後，使用CellTiter-Glo發光細胞活力測定(普洛麥格公司，麥迪森，威斯康辛州(Promega,Madison,WI))對每個孔中剩餘的細胞數量進行定量。
將各種人實體瘤細胞系(結直腸癌、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和胰臟癌)以每孔7,000-10,000個細胞接種在96孔板中，並在37℃下孵育過夜。從100 MOI開始將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF進行系列稀釋(4倍，10孔)。孵育72小時後，在SpectraMax M5酶標儀(分子設備有限公司(Molecular Devices Corporation))上使用CellTiter-Glo發光細胞活力測定(普洛麥格公司#G7571，麥迪森，威斯康辛州)對每個孔中剩餘的細胞數量進行定量。
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12對於所有測試的癌細胞系均是有效的。所有測試的細胞系的MOI IC50值均低於1。圖11顯示了藉由增加五個細胞系中每一個的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12的濃度達到的細胞生長抑制程度，以及MOI IC50值。該等結果表明，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12治療結直腸癌、黑色素瘤、頭頸癌和胰臟癌細胞系會強烈抑制腫瘤細胞生長，其MOI IC50值與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/GMCSF類似。
評估了由於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12感染而導致具有生物活性的FLT3L和IL12的體外產生。使用來自病毒感染細胞的上清液重複ELISA表現、IL12報告基因測定和FLT3L細胞增殖測定。如先前所述，篩選來自用於確認複製的A375和VERO細胞的上清液。IL12p70 ELISA證實了所有測試細
胞系(VERO、A375和SK-MEL-5)的IL12之表現(圖12A)。另外，FLT3L ELISA證明了所有測試細胞系的FLT3L之表現(圖12B)。使用先前描述的IL12報告基因測定和BaF3細胞系增殖測定證明了IL12之生物活性。病毒感染的細胞上清液在SK-MEL-5(圖13A)和A375細胞(圖13B)中均表現出呈劑量依賴性方式的活性IL12。使用用來自SK-MEL-5(圖14A)或A375(圖14B)細胞系的上清液刺激的BaF3細胞系證明了FLT3L生物活性。
在所有檢測的情況下，來自病毒感染細胞的上清液均含有具有生物活性的IL12和FLT3L，如基於工程化規格所預期的。
評估了由HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12編碼的雙細胞介素有效載荷在小鼠A20腫瘤模型中的表現。
在第0天，將A20腫瘤細胞(2 x 106個細胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤達到平均約230mm3，將動物隨機分成5組(每組4隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。小鼠接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12的單次瘤內注射(每種以1 x 106PFU/劑量)，然後在16小時後收集腫瘤和血漿。使用MSD測定(mGM-CSF和mIL12(SEQ ID NO：15中顯示的mIL-12核酸；SEQ ID NO：16中顯示的mIL-12胺基酸))或R & D Quantikine ELISA(mFLT3L)測量每個治療組的腫瘤裂解物和血漿中的mGM-CSF、mFLT3L和mIL12水平。
結果(圖15)表明，在16小時時，單次瘤內劑量的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12導致mFLT3L和mIL12均在A20腫瘤裂解物和血漿中的表現。
評估了由HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12編碼的雙細胞介素有效載荷在小鼠B16F10-mNectin1腫瘤模型中的表現。
在第0天，將B16F10-mNectin1腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性C57Bl/6小鼠的右側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤達到平均約210mm3，將動物隨機分成5組(每組4隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。小鼠接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mIL12的單次瘤內注射(每種以5 x 106PFU/劑量)，然後在16小時後收集腫瘤和血漿。使用MSD測定(mGM-CSF和mIL12)或R & D Quantikine ELISA(mFLT3L)測量每個治療組的腫瘤裂解物和血漿中的mGM-CSF、mFLT3L和mIL12水平。
結果(圖16)表明，在16小時時，單次瘤內劑量的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12導致mFLT3L和mIL12均在A20腫瘤裂解物和血漿中的表現。
評估了藉由用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12進行治療引起的全身性抗腫瘤T細胞應答。
在第0天，將A20腫瘤細胞(2 x 106個細胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤達到平均約100mm3(第11天)，將動物隨機分成3組(每組12隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。在研究的第11、14和17天，將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(3 x 104PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)。對側腫瘤(在動物的左側)未接受注射。該研究在第21天終止，並收集脾臟。從單個脾臟中分離脾細胞，並將其用於全細胞ELISpot測定(CTL，謝克海茨，俄亥俄州)中，以測量與A20腫瘤細胞混合時分泌mIFN-γ的T細胞的數量。簡而言之，將7.5×104個脾細胞與1.5×104個A20腫瘤細胞混合，並在37℃下孵育20小時。使用CTLS6螢光斑點分析儀(CTL，謝克海茨，俄亥俄州)讀取測定值並列舉IFN-γ+斑點。
結果(圖17A)表明，與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF治療相比，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治療導致全身性抗A20腫瘤活性明顯提高(分別為後者每7.5 x 104個脾細胞427個斑點，相對於前者的152個斑點；p=0.0008)。除了整個腫瘤細胞外，使用與A20細胞系相關的鑒定的病毒抗原AH1(圖17B)和在A20細胞系中鑒定的新抗原突變UV Rag(圖17C)進行EliSpot。
該研究旨在評估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在對側小鼠A20腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性。
在第0天，將A20腫瘤細胞(2 x 106個細胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分成6組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(3 x 104PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。對側腫瘤(在動物的左側)未接受注射。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中移除小鼠)直至研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF處理組中，在處理(右側)和未處理(左側)腫瘤中均觀察到以劑量依賴性形式的腫瘤生長抑制(圖18)。但是，與用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF處理的那些相比，在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理的動物中，在處理的腫瘤(10/10對7/10)和對側腫瘤(5/10對2/10)中的完全應答率增加。與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理組的中位存活期顯著增加(分別為32天和53天；p=0.048)。
該等數據表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治療可提高對側腫瘤清除率並改善總體存活期。
該研究旨在評估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在對側小鼠Neuro2A腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性
在第0天，將Neuro2A腫瘤細胞(1 x 106個細胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5 x 105或5 x 104PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中移除小鼠)直至研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
在5e5PFU/劑量下，與對照處理動物相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理組和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF處理組具有統計學顯著性。在5e4PFU/劑量下，
與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理組的總體存活期增加(雖然兩組的中位存活期均為20天；p=0.0056)。
該等數據表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治療可提高對側腫瘤清除率並改善總體存活期。
該研究旨在評估HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF在對側小鼠CT26(也稱為結腸26)腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性。
在第0天，將CT26腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性Balb/c小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF(5 x 106PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中移除小鼠)直至研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響之證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
在5 x 106PFU/劑量下，與對照處理動物相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理組和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF處理組的存活期明顯增加(對照相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF；p=0.0017以及對照相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12；p=0.0008)。此外，與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理組的總體存活期增加(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的中位存活期未定義，相比於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF為27天；p=0.0059)。參見圖20。
[該等數據表明，與對照治療或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mGMCSF治療相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12治療可提高對側腫瘤清除率並改善總體存活期。
該研究旨在評估單獨或結合抗計劃性細胞死亡蛋白1(PD1)單株抗體(mAb)的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在對側小鼠MC38腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性。
在第0天，將MC38腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5 x 106PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，
總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。將抗PD1單株抗體(200μg/劑量)藉由腹膜內注射按相同的時間表投與(每三天一次，總共三次注射)。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中移除小鼠)直至研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
與對照處理的動物相比，兩種單一處理(單獨的抗PD1 mAb和單獨5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)表現出存活期顯著增加(每次比較分別p<0.0001)。與單獨的5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，單獨的抗PD1 mAb處理的動物的存活期不具有統計學顯著性(p=0.246)。與所有其他治療組相比，兩種治療的組合(抗PD1 mAb加5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)顯示出存活期明顯增加(與單獨的5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，p=0.0016，與單獨的抗PD1 mAb相比，p<0.0001，以及與對照治療相比，p<0.0001)。參見圖21。
該等數據表明，雖然與對照治療相比，單獨的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或抗PD1 mAb治療顯著改善總體存活期，但與任一單獨的治療相比，兩種治療的組合顯著改善總體存活期。
該研究旨在評估當注射到小鼠CT26腫瘤模型中時，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的細胞介素表現之動力學。
在第0天，將CT26腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性BALB/c小鼠的右側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(對於對照，每組5隻小鼠，對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-，每組25隻小鼠，以及對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，每組25隻小鼠)。在治療投與開始時平均腫瘤體積和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-(5 x 106PFU/劑量的病毒；病毒不含細胞介素有效載荷)、HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5 x 106PFU/劑量的病毒)和配製物緩衝液對照各自藉由瘤內投與，每三天一次，總共三次注射。每週2次測量臨床體征和體重變化，直至研究終止。在投與病毒後4、24、72、168和240小時時，將每個病毒處理組中5隻小鼠安樂死。在配製物緩衝液對照注射後立即取出對照處理組中5隻小鼠。分離血液並製備成血清，從動物中切除腫瘤並製備成蛋白裂解物。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
分析了血清和腫瘤蛋白裂解物中小鼠FLT3L和IL-12的存在，它們係由病毒HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12編碼的兩種細胞介素。使用不含細胞介素的病毒(HSV-1/ICP34.5-/ICP47-)來控制內源性細胞介素表現。
在腫瘤裂解物中，注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有動物在注射後第7天(168小時)均在腫瘤裂解物中顯示出IL-12表現。5隻動物中有2隻在注射後第10天(240小時)顯示出IL-12表現(圖22A)。注射了對照或HSV-1/ICP34.5-/ICP47-病毒的所有動物的IL-12水平均低於檢測下限(LLOD)。在血漿中，在注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有5隻動物中在注射後4小時時均檢測到IL-12。在注射後24小時時，注射了
HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的5隻動物中有4隻具有可檢測的IL-12。24小時後採樣的所有時間點均低於LLOD(圖22B)。
在腫瘤裂解物中，注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的所有動物在注射後第3天(72小時)在腫瘤裂解物中FLT3L的表現顯示出統計學上顯著的增加(4小時HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p=0.0197；24小時HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p=0.0043，72小時HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p=0.0012；168小時HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p=0.2281；240小時HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相對於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12，p=0.4890；圖22C)。在血漿中，所有組中所有小鼠的所有樣本中均可檢測到FLT3L。在任何時間點，任何組之間都沒有統計學上的顯著差異(圖22D)。
在腫瘤裂解物中，與注射後4小時時的對照相比，僅注射了HSV-1/ICP34.5-/ICP47-和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的動物在腫瘤裂解物中的IFN-γ的表現顯示出顯著的增加(p=0.0057)。注射後24、72、168和240小時，在對照處理的腫瘤中沒有可檢測到的IFN-γ。注射後24小時，與HSV-1/ICP34.5-/ICP47-相比，接受HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12的動物表現出明顯升高的IFN-γ水平(p=0.0253)。在注射後72、168和240小時，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12中的IFN-γ水平趨於高於HSV-1/ICP34.5-/ICP47-，但未能達到統計學顯著性(分別為p=0.2306、0.1155和p=0.0693；圖22E)。注射後24小時持續產生IFN-γ與IL-12產生一致，並應引發增強的抗腫瘤免疫應答。在血漿中，在用對照注射處理的動物中未檢測到
IFN-γ。在用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和HSV-1/ICP34.5-/ICP47-處理的動物中，注射後4小時的血漿IFN-γ不具有統計學顯著差異(p=0.4803)，在注射後24小時顯著增加(p=0.0140)，並且在72小時時在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12中檢測到IFN-γ。所有其他時間點和條件均低於測定的檢測下限(LLOD)(圖22F)。
該研究評估了藉由在對側小鼠MC38腫瘤模型中注射HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12產生的抗腫瘤免疫應答。
在第0天，將MC38腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組12隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5 x 106PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。將抗PD1單株抗體(200μg/劑量)藉由腹膜內注射按相同的時間表投與(每三天一次，總共三次注射)。每週2次測量臨床體征、體重變化和腫瘤體積，直至在第21天研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
在第21天將小鼠安樂死，切除脾臟，並對脾細胞的單細胞懸液進行IFN-γ ELISpot測定(肽再刺激和全細胞)。對於肽再刺激測定，將5 x 105個脾細胞接種並用最終濃度為1μM的單個9-mer肽(代表MC38新抗原或病毒衍生的腫瘤抗原)刺激過夜。藉由將1.25 x 105個脾細胞與1.25 x 104個MC38細胞一起接種來建立全細胞測定。在每個測定中，斑點的計數指示表現IFN-γ的免疫細胞的總數。
在肽再刺激測定中，單獨用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12進行處理顯著提高對MC38腫瘤細胞的免疫反應性；在全細胞測定中，與對照和抗PD1處理的動物相比，用HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12進行處理顯著提高抗MC38活性(兩者均p<0.0001；圖23A)。與對照動物相比，在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理動物中，對病毒衍生的腫瘤抗原P15E的免疫反應性也顯著提高(p=0.0008；圖23B)。
MC38包含導致新抗原的幾種基因組突變。定量了對該等腫瘤特異性突變的免疫反應性。在HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理的動物中，與對照處理的小鼠相比，對Adpgk(圖23C)、2410127L17Rik(圖23D)、和Aatf(圖23E)的反應性顯著提高(分別為p=0.003，p=0.0416和p=0.0035)。此外，與單獨HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理相比，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12和抗PD1阻斷的組合顯著提高對Adpgk(p=0.002)、Aatf(p=0.040)、Cpne1(p=0.030)和P15E(p=0.0008)的反應性。該等數據表明，HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理可以增加MC38腫瘤模型中的抗腫瘤免疫應答。可以藉由添加抗PD1進一步增強這種增加。如本文的功效研究中所證明的，全身性抗腫瘤應答的產生及其藉由檢查點阻斷的增強應有助於針對注射和未注射的病變的抗腫瘤免疫性。
該研究評估了單獨或與激動性抗體靶向4-1BB(又名CD137)組合的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在對側小鼠MC38腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性。
在第0天，將MC38腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右側腹和左側腹中。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5 x 106PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。將抗4-1BB單株抗體(150μg/劑量)藉由腹膜內注射按相同的時間表投與(每三天一次，總共三次注射)。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中移除小鼠)直至研究終止。
所有動物在實驗中均存活，並且未顯示出與處理相關的不良健康影響的證據，如體重所證明的，並且在日常健康監測檢查中未發現值得注意的不良臨床體征。
與對照處理的動物相比，兩種單一處理(單獨的抗4-1BB mAb和單獨5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)表現出存活期顯著增加(每次比較分別p=0.0048和p<0.0001)。與單獨的抗4-1BB mAb相比，5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12處理的動物的存活期具有統計學顯著性(p=0.0175)。與所有其他治療組相比，兩種治療之組合(抗4-1BB mAb
加5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12)顯示出存活期明顯增加(與單獨的5 x 106PFU HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12相比，p=0.0246，與單獨的抗4-1BB mAb相比，p=0.0004，以及與對照治療相比，p<0.0001)。參見圖24。
該等數據表明，雖然與對照治療相比，單獨的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12或抗4-1BB mAb治療顯著改善總體存活期，但與任一單獨的治療相比，兩種治療的組合顯著改善總體存活期。
該研究評估了單獨或與雙特異性T細胞銜接子(BITE®)分子組合的HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12在過度表現人上皮細胞黏附分子(EpCAM)的對側小鼠MC38腫瘤模型中的耐受性和抗腫瘤活性。
在第0天，將工程化以表現人EpCAM的MC38腫瘤細胞(3 x 105個細胞)皮下注射到雌性C57BL/6小鼠的右側腹和左側腹中，該等小鼠被工程化以從內源性小鼠CD3座位表現人CD3。使用電子卡尺每週兩次(Q2W)測量腫瘤體積(mm3)。一旦腫瘤體積達到平均約100mm3，將動物隨機分組(每組10隻小鼠)，使得在治療投與開始時平均腫瘤體積(在兩側腹中)和腫瘤體積的可變性在治療組之間係一致的。將HSV-1/ICP34.5-/ICP47-/mFLT3L/mIL12(5 x 106PFU/劑量)或配製物緩衝液對照藉由瘤內投與(在動物的右側)，每三天一次，總共三次注射。未注射的腫瘤(對側；在動物的左側)未接受注射。將含有抗人CD3和抗人EpCAM結合結構域的BiTE®分子(150μg/kg)藉由靜脈內注射投
與，每週一次，總共兩次注射。每週2次測量臨床體征、體重變化和存活期(當腫瘤達到800mm3時從研究中去除小鼠)直至研究終止。
Claims (25)
- 一種溶瘤單純皰疹病毒，其包含：編碼Fms相關酪胺酸激酶3配位基(FLT3L)之核酸序列；編碼介白素-12(IL12)之核酸序列；其中所述編碼FLT3L之核酸序列和所述編碼IL12之核酸序列藉由多順反子(polycistronic)連接子元件連接，其中所述多順反子連接子元件係豬捷申病毒2a(P2A)；以及其中所述溶瘤單純皰疹病毒進一步：缺乏編碼ICP 34.5之功能性基因；以及缺乏編碼ICP 47之功能性基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述單純皰疹病毒係單純皰疹1型病毒(HSV-1)。
- 如申請專利範圍第2項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述HSV-1係衍生自毒株JS1，其係以保藏號01010209保藏於歐洲細胞培養物保藏中心(ECAAC)。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒進一步包含啟動子，以及所述編碼FLT3L之核酸序列和所述編碼IL12之核酸序列均在所述啟動子的控制下。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述編碼IL12的核酸序列和所述編碼FLT3L的核酸序列存在於編碼ICP34.5的基因之前位點中。
- 如申請專利範圍第4項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述編碼IL12的核酸序列和所述編碼FLT3L的核酸序列存在於編碼ICP34.5的基因之前位點中。
- 如申請專利範圍第5項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述編碼IL12、FLT3L和P2A的核酸以以下存在：[Flt3L]-[P2A]-[IL12]。
- 如申請專利範圍第6項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述編碼IL12、FLT3L和P2A的核酸以以下存在：[Flt3L]-[P2A]-[IL12]。
- 如申請專利範圍第7項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述[Flt3L]-[P2A]-[IL12]在單個啟動子控制下。
- 如申請專利範圍第8項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述[Flt3L]-[P2A]-[IL12]在單個啟動子控制下。
- 如申請專利範圍第9項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述啟動子選自包含以下的列表：巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α啟動子(EF1α)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1啟動子(PGK)、泛素C啟動子(UBC)和鼠幹細胞病毒(MSCV)。
- 如申請專利範圍第10項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述啟動子選自包含以下之清單：巨細胞病毒(CMV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、人延伸因子1α啟動子(EF1α)、猿猴病毒40早期啟動子(SV40)、磷酸甘油酸激酶1啟動子(PGK)、泛素C啟動子(UBC)和鼠幹細胞病毒(MSCV)。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒進一步包含牛生長激素聚腺苷酸化訊息序列(BGHpA)。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒進一步包含增強哺乳動物轉譯之核酸，且其中所述增強哺乳動物轉譯的核酸係Kozak序列或共有Kozak序列。
- 如申請專利範圍第14項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述共有Kozak序列在SEQ ID NO：20中列出。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒包含一種或多種編碼[CMV]-[Kozak]-[Flt3L]-[P2A]-[IL12]-[BGHpA]之核酸。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述IL12以[P40亞基]-[GGGGS]-[P35亞基]存在。
- 如申請專利範圍第17項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中IL12 P35亞基中的訊息肽係不存在的。
- 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒包含：含有SEQ ID NO：1的FLT3L序列；以及含有SEQ ID NO：7的IL12序列。
- 如申請專利範圍第19項所述之溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒包含：含有SEQ ID NO：24的CMV啟動子；含有SEQ ID NO：20的Kozak序列；含有SEQ ID NO：1的FLT3L序列；含有SEQ ID NO：17的P2A序列；含有SEQ ID NO：7的IL12序列；以及含有SEQ ID NO：21的BGHpA序列。
- 一種溶瘤單純皰疹病毒，其中所述溶瘤單純皰疹病毒係HSV1/ICP34.5-/ICP47-/FLT3L/IL12。
- 一種藥物組成物，其包含如申請專利範圍第1-21項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒。
- 如申請專利範圍第22項所述之藥物組成物，進一步包含檢查點抑制劑。
- 一種如申請專利範圍第1-21項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒或如申請專利範圍第22或23項所述之藥物組成物之用途，其係用於製備治療癌症之藥物。
- 一種套組，其包含如申請專利範圍第1-21項中任一項所述之溶瘤單純皰疹病毒或如申請專利範圍第22或23項所述之藥物組成物。
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2019023483A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Oncorus, Inc. | ONCOLYTIC VIRAL VECTORS AND USES THEREOF |
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