TWI839797B - Itih4蛋白質在治療氣喘上的用途 - Google Patents

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莊校奇
劉怡萱
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Abstract

本發明揭示ITIH4蛋白質可被用來治療氣喘並改善呼吸道功能以及過敏反應。

Description

ITIH4蛋白質在治療氣喘上的用途
本發明是有關於使用互聯α胰蛋白酶抑制因子重鏈4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4)來治療氣喘(asthma)。
氣喘(asthma)是一種呼吸道疾病，除了會受到遺傳影響，過敏原、空氣汙染、病毒感染、溫度和/或濕度的改變以及劇烈運動等皆可能是誘發氣喘的因素。氣喘主要的症狀包括喘鳴(wheezing)、咳嗽(cough)、胸悶(chest tightness)以及呼吸困難，嚴重者可能會致命。
臨床上在進行氣喘的治療前，通常會先排除慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的誤診可能，由於這兩者的症狀部分相似但治療手段有明顯的區隔。例如，長效型乙二型交感神經促效劑(long acting β2 agonist, LABA)的單獨使用被建議用來治療COPD而不建議用來治療氣喘，因其可能會導致氣喘嚴重惡化並提高死亡的風險；相對地，而吸入型皮質類固醇(inhaled corticosteroid, ICS)被建議用來治療氣喘而不建議用來治療COPD，因其可能會提高肺炎的風險。
在一先前研究中，申請人發現在PM 10-暴露的COPD患者血清中互聯α胰蛋白酶抑制因子重鏈4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4)蛋白質表現量會明顯地減低，並預期血清ITIH4蛋白質可作為COPD上的PM 10-特異性生物標記[Lee K.Y. et al. (2015), Int. J. Chron. Obstruct. Pulmon. Dis., 10:831–841]。
就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示ITIH4蛋白質可被用來治療氣喘。
發明概要
雖然存在上述關於互聯α胰蛋白酶抑制因子重鏈4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4)蛋白質的先前研究，在本發明中申請人意外地發現，ITIH4蛋白質能夠在帶有OVA-誘發的氣喘(OVA-induced asthma)之個體中有效地改善肺功能並降低過敏情形，而被預期可供用於治療氣喘。
於是，在第一個方面，本發明提供一種ITIH4蛋白質供應用於製備一用來治療氣喘之組成物的用途。
在第二個方面，本發明提供一種用於治療氣喘的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的ITIH4蛋白質。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種互聯α胰蛋白酶抑制因子重鏈4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4)蛋白質供應用於製備一用來治療氣喘之組成物的用途。
依據本發明，本發明所適用的氣喘包括，但不限於：過敏性氣喘(allergic asthma)、非過敏性氣喘(non-allergic asthma)、職業性氣喘(occupational asthma)、運動所導致的氣喘(exercise induced asthma)、遲發性氣喘(late-onset asthma)、間歇性氣喘(intermittent asthma)、輕度持續型氣喘(mild persistent asthma)、中度持續型氣喘(moderate persistent asthma)以及重度持續型氣喘(severe persistent asthma)。
如本文中所用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指預防(preventing)、減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。
依據本發明，ITIH4蛋白質可以是商業上可購得的產品，例如酵母菌衍生的人類重組型ITIH4蛋白質(Cosmo Bio USA)；或者利用化學家所熟知的傳統化學合成方法而被製得，例如，使用一商業上可獲得的合成套組(synthesis kit)或固相胜肽合成法(solid phase peptide synthesis)。
依據本發明，ITIH4蛋白質亦可採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的遺傳工程技術而被製備。例如，利用重組DNA技術(recombinant DNA technology)，將ITIH4蛋白質的編碼序列插入至一表現載體(expression vector)內，繼而將之轉形(transformation)或轉染(transfection)至一合適的宿主細胞中，接著令該編碼序列於該宿主細胞內被表現，藉此而獲得ITIH4蛋白質。這些技術都是熟悉此項技術人士可根據本身的專業素養來實施，並且可參考本技藝中所詳知的教科書，例如：Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York；以及Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel ed., John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)。
依據本發明，該組成物可為一藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明，該藥學組成物可呈一適合於呼吸道投藥(respiratory tract administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明，該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的呼吸道途徑來投藥：經口吸入(oral inhalation)以及經鼻吸入(nasal inhalation)。較佳地，該藥學組成物被製造成適於經鼻吸入而被投藥的劑型。
依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於呼吸道投藥的劑型，這包括，但不限於：煙霧(smoke)、蒸氣(vapor)，以及呈氣體、液體或乾燥粉末(dry powder)型態的氣溶膠(aerosol)與噴霧(spray)。適用於遞送上述氣溶膠、噴霧、煙霧或蒸氣的裝置包括，但不限於：霧化器(nebulizer)、計量吸入劑(metered-dose inhaler, MDI)、壓力式計量吸入劑(pressurized metered-dose inhaler, pMDI)，以及乾粉吸入劑(dry powder inhaler, DPI)。
本發明亦提供一種用於治療氣喘的方法，其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的ITIH4蛋白質。
如本文中所使用的，術語“投予(administering)”以及“投藥(administration)”可被交換地使用，並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的，術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類，諸如人類(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明，該組成物的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的組成物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被呼吸道地投藥。 較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。 實施例 一般實驗方法： 1.  統計學分析(Statistical analysis)：
在下面的實施例中，所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, SD)”來表示，並且採用Graphpad Prism軟體第9版來進行統計分析，其中所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, ANOVA)合併塔基事後檢定(Tukey’s post hoc test)來進行分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的分析結果是 p＜0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。 實施例 1. 互聯 α 胰蛋白酶抑制因子重鏈 4 (inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4, ITIH4) 蛋白質在治療氣喘上的效用評估 實驗材料： A、 ITIH4 蛋白質：
為了使用酵母菌來生產人類的ITIH4蛋白質 [Genbank登錄編號(accession number)：AAI36393.1]，將人類的ITIH4的編碼序列作鹼基的最適化調整，並且使其5’端帶有一個六員組胺酸標幟(6xHis tag)的編碼序列，繼而委託臺北醫學大學藥學院(College of Pharmacy at Taipei Medical University)來進行DNA序列合成。將所得到的重組DNA序列選殖至pCI-neo哺乳動物表現載體(pCI-neo Mammalian Expression Vector)(Promega, E184A)中，繼而轉染至勝任畢赤酵母菌GS115 (competent Pichia PastorisGS115)(Thermo Fisher)中來進行蛋白質表現，以及藉由使用AmMag™ Ni磁珠(AmMag™ Ni magnetic beads)(GenScript, L00776-4)並依據製造商的操作指南來進行蛋白質純化。 B、 實驗動物：
在下面實施例中所使用的雄性BALB/c小鼠(6週大)購自於樂斯科生物科技股份有限公司(BioLasco Taiwan Co., Ltd)。所有的實驗動物個別地被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在20-24℃以及相對濕度維持在45-65%的動物房中，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的一切實驗程序是由臺北醫學大學實驗動物照護及使用委員會所認可的方式來進行。 實驗方法： A 、 氣喘的誘發與 ITIH4 蛋白質的投藥：
在本實驗中氣喘的誘發大體上是參考Chuang H.C. et al. (2013), Int. J. Nanomedicine, 8:4495-506當中所述的方法來進行。
首先，將雄性BALB/c小鼠隨機地分成4組(每組n＝8)，其中包括1個正常對照組、1個病理對照組以及2個實驗組(亦即，實驗組1與2)，繼而藉由腹膜內注射(intraperitoneal injection)的方式來對病理對照組以及各個實驗組的小鼠投予以劑量為50 μg/隻的卵白蛋白(ovalbumin, OVA)(Thermo scientific, A5503)[配於氫氧化鋁佐劑(Thermo scientific, 77161)中]，並且在開始注射OVA之後的第7、14以及21天改為投予劑量為25 μg/隻的OVA，俾以進行免疫接種(immunized)，而正常對照組的小鼠則被腹膜內注射以等量的PBS。
接著，在開始注射OVA之後的第22天，藉由鼻內滴注(intranasal instillation)的方式來分別對實驗組1與2的小鼠投予劑量為1.25 μg/隻以及2.5 μg/隻的ITIH4蛋白質(配於PBS中)，而病理對照組與正常對照組的小鼠是被投予等體積的PBS。各組小鼠每天被投藥1次，總共歷時7天。
在開始注射OVA之後的第29天，藉由鼻內滴注的方式來對病理對照組以及各個實驗組的小鼠投予劑量為100 μg/隻的OVA，每天1次，總共歷時3天，俾以誘發氣喘的產生。至於正常對照組的小鼠亦是藉由鼻內滴注的方式而被投予劑量為100 μg/隻的OVA，每天1次，總共歷時3天。 B 、 肺功能的檢測：
在開始注射OVA之後的第32天，藉由flexiVent肺功能儀(flexiVent respiratory mechanics)(SCIREQ, FX2)來測量各組小鼠在乙醯甲膽鹼-誘發的氣流阻塞(methacholine-induced airflow obstruction)下的呼吸道反應性(airway responsiveness)。簡言之，使小鼠吸入氣溶膠化(aerosolized)的PBS來測量呼吸道阻力(airway resistance)(cmH 2O/mL/s)並作為基準值，接著使小鼠吸入濃度漸增5 mg/mL、10 mg/mL以及25 mg/mL之氣溶膠化的乙醯甲膽鹼(Merck, A2251)並測量呼吸道阻力的提升。若所測得的呼吸道阻力越低，代表呼吸道功能越佳。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 C 、 血清中 IgE 的含量分析：
在開始注射OVA之後的第32天且在完成上面第B項的檢測後，藉由穿刺(puncture)從各組小鼠的面靜脈(facial vein)來採集血液，繼而在4℃下以1,500 g進行離心歷時20分鐘並收取上清液，然後使用IgE ELISA套組(FineTest, EM0211)並依據製造商的操作指南來測量所得到的血清樣品中的IgE濃度(ng/mL)。
之後，依照上面“一般實驗方法”的第1項當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。 D 、 支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 中嗜酸性球 (eosinophil) 的含量分析：
在開始注射OVA之後的第33天，將各組小鼠犧牲，繼而使用一支氣管鏡(bronchoscope)來將1 mL鹽水經由氣管注射至肺臟中並收取所注入的液體，然後將由此所得到的支氣管肺泡灌洗液在4℃下以1,500 g進行離心歷時20分鐘並移除上清液。接著，將由此所得到的白血球細胞以PBS予以洗滌並重新懸浮於PBS中，之後使用一血液學分析儀(Hematology Analyzer)(IDEXX Laboratories, Procyte Dx)來測定嗜酸性球在總白血球數中的含量(%)。 結果： A 、 肺功能的檢測：
圖1顯示各組小鼠在不同濃度的乙醯甲膽鹼下所測得的呼吸道阻力。從圖1可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的呼吸道阻力會隨著乙醯甲膽鹼濃度的增加而快速地升高，這表示OVA成功地誘發氣喘並對肺功能產生負面影響，而有呼吸道阻塞的情形。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的呼吸道阻力的上升幅度皆有顯著的降低。這個實驗結果顯示：ITIH4蛋白質能夠有效地緩解氣喘並改善小鼠的呼吸道阻塞。 B 、 血清中 IgE 的含量分析：
圖2顯示各組小鼠血清中所測得的IgE濃度。從圖2可見，與正常對照組相較之下，病理對照組的IgE濃度有顯著的升高，這表示OVA成功地誘發氣喘並造成過敏。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的IgE濃度皆有明顯的降低。這個實驗結果顯示：ITIH4蛋白質能夠有效地緩解氣喘並降低血清中的過敏指標。 C 、 支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性球的含量分析：
圖3顯示各組小鼠BALF中所測得的嗜酸性球的含量百分比。由圖3可見，與正常對照組相較之下，病理對照組在BALF中的嗜酸性球顯著的升高，這表示OVA成功地誘發氣喘並造成肺部發炎。而與病理對照組相較之下，各個實驗組的嗜酸性球含量皆有顯著的降低，甚至低於正常對照組所具者。這個實驗結果顯示：ITIH4蛋白質能夠有效地緩解氣喘並改善肺部發炎。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示各組小鼠在不同濃度的乙醯甲膽鹼下所測得的呼吸道阻力，其中“*”表示當與病理對照組作比較， p＜0.05； 圖2顯示各組小鼠血清中所測得的IgE濃度，其中“****”表示當與病理對照組作比較， p＜0.0001；以及 圖3顯示各組小鼠BALF中所測得的嗜酸性球的含量百分比，其中“**”與“****”分別表示當與病理對照組作比較， p＜0.01與 p＜0.0001。

Claims (4)

  1. 一種ITIH4蛋白質供應用於製備一用來治療氣喘之組成物的用途。
  2. 如請求項1的用途，其中該組成物是一藥學組成物。
  3. 如請求項2的用途，其中該藥學組成物進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
  4. 如請求項2的用途，其中該藥學組成物是呈一供呼吸道投藥的劑型。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20210401934A1 (en) * 2017-04-10 2021-12-30 King Abdulaziz City For Science And Technology Protein functionalized hyaluronic acid coated chitosan nanoparticle and method of preparation

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