TWI835026B - 偵測溶液中之分析物的可重複使用試劑匣 - Google Patents

Abstract

本揭示涉及製備包含基質的可重複使用且可乾燥的試劑匣之方法，該等基質包含偵測分子，例如抗體，以用於偵測或富集樣品中之分析物，例如被抗體識別的抗原。在一些實施方案中，該試劑匣包含保持該基質的管或孔。在一些實施方案中，該基質或相關試劑匣可以濕性或乾燥儲存。本揭示亦涉及該等試劑匣及其使用方法。

Description

偵測溶液中之分析物的可重複使用試劑匣

本揭示涉及製備包含基質的可重複使用且可乾燥的試劑匣之方法，該等基質包含偵測分子，例如抗體，以用於偵測或富集樣品中之分析物，例如被抗體識別的抗原。在一些實施方案中，該試劑匣包含保持該基質的管或孔。在一些實施方案中，該基質或相關試劑匣可以濕性或乾燥儲存。本揭示亦涉及該等試劑匣及其使用方法。

各種可商購的基質可用於偵測溶液樣品中之特定分析物。例如，包含塗覆有蛋白質 A、蛋白質 G 及/或蛋白質 L 之材料的基質可用於在基質上捕獲抗體恆定區，從而與溶液中的其他成分相比檢測和富集它們。基質可以直接或透過基質上之蛋白質 A、蛋白質 G 及/或蛋白質 L 用抗體塗覆，例如，以偵測或富集樣品中之抗原分析物。基質可以用抗原塗覆，例如，以偵測或富集針對該等抗原的抗體。塗覆有不全抗原的基質亦可用於偵測溶液中之分析物。形成基質的材料是多種多樣的，例如樹脂、珠粒等。

然而，許多基質及容納此等基質之試劑匣一旦被用於偵測溶液中之分析物，例如，特定而言細胞裂解物中之分析物，便不能有效地重複使用，並且在單次使用之後即被丟棄。因此，例如在常規篩選實驗中，使用此等試劑匣可能非常昂貴，因為用於塗覆試劑匣之蛋白質試劑可能需要大量連續供應，並且相當耗時，因為可能需要定期製備新鮮試劑匣。例如，可能需要製備特定之偵測分子，然後將其附著於基質上，之後才能使用，這可能需要許多處理步驟。並且對於一些必要試劑，例如商業抗體或抗原，購買製備足夠的經塗覆之基質所需之數量可能非常昂貴。因此，如果基質可以重複使用，則可以節省大量時間及資源。

尤其是，本文之揭示描述了製備包含基質的試劑匣之方法，該等試劑匣可以重複使用例如多次，並且亦可在使用之間於乾燥狀態儲存以便更容易處理，用於偵測溶液 (包括複雜溶液，例如細胞裂解物) 中之分析物；以及相關的可重複使用的試劑匣。本文之揭示亦描述了使用本文所述之試劑匣偵測溶液樣品中之特定分析物的示例性方法，該特定分析物為例如生物流體及細胞裂解物中的主要組織相容性複合物 I 類 (MHC-I) 分子以及其他蛋白質。

本揭示尤其包括一種用於偵測溶液中之分析物的可重複使用試劑匣，其中該試劑匣包含：a) 基質，b) 附著於該基質的偵測分子，其中該等偵測分子與該分析物特異性結合，並且其中該等偵測分子視情況與該基質交聯； c) 至少一種冷凍保護劑，其中該試劑匣可用於偵測溶液中之該分析物至少 10、20、50 或 100 次，且其中，每次使用之後，視情況用該冷凍保護劑將該基質於乾燥狀態儲存。在一些態樣中，試劑匣為兩端開口管、一端開口管、孔、帶孔或不帶孔平盤、或能夠容納該基質之晶片。在一些態樣中，基質包含含有二氧化矽或瓊脂糖的粒子 (例如珠粒、顆粒、碎片或丸粒)，其中該等粒子視情況為磁性的。在一些情況下，基質包含蛋白質 A、蛋白質 G 及/或蛋白質 L。在一些情況下，偵測分子為抗體。在一些情況下，偵測分子與基質交聯。在一些情況下，多於一種類型之偵測分子附著於基質，例如用於偵測溶液中兩種不同抗原分析物的兩種不同抗體。在一些態樣中，偵測分子用選自庚二醯亞胺酸二甲酯 (DMP)、氰酸酯、NHS 酯、吖內酯、羰基二咪唑 (CDI)、順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、吡啶二硫化物、醯肼或碳二亞胺的交聯劑與該基質交聯。在一些態樣中，能夠藉由基質上的偵測分子偵測的分析物為蛋白質或肽。例如，在一些情況下，分析物為主要組織相容性複合物 I (MHC-I) 分子。在一些情況下，試劑匣可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少 10 次。在一些情況下，可重複使用試劑匣於乾燥狀態儲存。在一些態樣中，試劑匣可在製備後於乾燥狀態儲存，然後在每次使用後於濕性狀態儲存後用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 10 次。在一些態樣中，試劑匣可在每次使用後於乾燥狀態儲存後用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 10 次。在一些態樣中，試劑匣可在製備後於乾燥狀態儲存，然後在每次使用後於濕性狀態儲存後用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 20 次。在一些情況下，試劑匣可在每次使用後於乾燥狀態儲存後，用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 20 次。在一些態樣中，試劑匣可在製備後於乾燥狀態儲存，然後在每次使用後於濕性狀態儲存後用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 50 次。在一些情況下，試劑匣可在每次使用後於乾燥狀態儲存後，用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 50 次。在一些態樣中，試劑匣可在製備後於乾燥狀態儲存，然後在每次使用後於濕性狀態儲存後用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 100 次。在一些情況下，試劑匣可在每次使用後於乾燥狀態儲存後，用於偵測細胞裂解物或生物流體中之蛋白質分析物至少 100 次。在一些態樣中，基質以酸性 pH 儲存。在一些態樣中，基質於 2 至 8℃ 儲存。在一些態樣中，基質於濕性狀態儲存。在一些態樣中，基質儲以酸性 pH 值且視情況於 2 至 8℃ 儲存。在一些情況下，冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇 (MPD) 或二甲基亞碸 (DMSO) 中之一者或多者。

本揭示亦涉及一種製備先前使用過的 (例如，如上文或本文中其他地方所描述) 試劑匣以供再次使用的方法，其包含：在從該試劑匣溶析分析物後，在 1 至 10% 乙酸、1% 甲酸或 1% 三氟乙酸 (TFA) 中洗滌基質，在包含冷凍保護劑的緩衝液中洗滌基質，以及使該基質乾燥。在一些態樣中，冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇 (MPD) 或二甲基亞碸 (DMSO) 中之一者或多者。在一些情況下，藉由加熱試劑匣至至少 30℃ 使基質乾燥，之後於室溫儲存至少 1 小時。在一些情況下，藉由加熱試劑匣至 37℃ 使基質乾燥，之後於室溫儲存至少 1 小時。在一些情況下，使基質乾燥，將試劑匣在 2 至 8℃ 於乾燥狀態儲存直至再次使用。

本揭示進一步涉及製備如上文或本文中其他地方所描述之可重複使用試劑匣之方法，其包含：獲得包含基質之試劑匣，將該基質與偵測分子接觸，及將該等偵測分子與該基質交聯。

本揭示進一步涉及偵測溶液中之分析物之方法，其包含：將上述或本文中其他地方所描述之可重複使用試劑匣之基質與包含該分析物之溶液接觸，以及視情況從該試劑匣溶析該分析物。在一些態樣中，分析物為肽或蛋白質。在一些態樣中，分析物為 MHC-I 分子。在一些情況下，溶液為生物流體或細胞裂解物。在一些情況下，在與基質接觸之前，將溶液過濾或處理以去除細胞碎片及膜物質。在一些情況下，在將試劑匣用於該方法之前，該試劑匣先前已用於偵測分析物至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50 或 100 次.  在一些情況下，在分析物溶析之後，藉由本文之製備先前使用過的試劑匣 (例如上述之彼等) 的方法處理該試劑匣。

本揭示亦涵蓋套組，其包含至少一個如本文所述之可重複使用試劑匣，例如上述之彼等。在一些態樣中，套組包含至少一個如本文所述之試劑匣以及：(a) 至少一種緩衝液；(b) 不含偵測分子或具有對照偵測分子的至少一個對照試劑匣；(c) 用於製備該試劑匣以供儲存及再次使用的試劑；及/或 (d) 使用說明書。

應理解，前述一般描述及以下詳細描述均僅為例示性及說明性的，且不限制申請專利範圍。併入本說明書中且構成其一部分之隨附圖式說明了某些實施例或態樣，且與說明書一起用於解釋本文所述之原理。

定義

除非另外定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解的含義。

在本申請案中，除非另外陳述，否則所用之「或」意指「及/或」。在多重附屬請求項之背景中，所用之「或」僅以替代形式重新提及多於一個前述獨立或附屬請求項。同樣，除非另外具體陳述，否則諸如「要素」或「組分」等術語涵蓋包含一個單元之要素及組分以及包含多於一個次單元之要素及組分兩種情況。

如本文所闡述，除非另外指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括於所引述範圍及 (在適當時) 其分數部分 (諸如整數之十分之一及百分之一) 內的任何整數值。

單位、前綴、及符號係以其國際單位製 (Système International de Unite，SI) 接受之形式來表示。數值範圍包括界定該範圍之數字。本文所提供之標題並不限制本揭露的各個方面，該等方面可參照整體說明書來掌握。因此，下文即將定義之術語係參照說明書全文來更全面地定義。

應理解，除非另外指示，否則根據本揭露所用之下列術語具有下列含義：

本文所用之「樣品」指代可含有用於偵測或富集之分析物的任何試樣。本文中之「溶液」指代液體形式的樣品。

本文中之「分析物」以最廣泛含義使用，指代可在樣品或溶液中發現的分子或物質，該分子或物質旨在與基質上之偵測分子結合 (亦即，被該等偵測分子識別或偵測)，且從而被偵測或富集。在一些情況下，分析物可以為蛋白質或肽或另一種類型的生物分子。

如本文所用，「偵測分子」為直接或間接與分析物特異性結合的任何分子。偵測分子可以為例如抗體、抗原分子、不全抗原分子或與分析物特異性結合且與基質相容的任何分子。如本文所用，附著於基質的「偵測分子」可以為單一分子種類之分子，或者替代性地，可以為兩種或更多種不同分子種類之分子的混合物。

在一些實施方案中，分析物及/或偵測分子可以為蛋白質或多肽或肽分子。術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物。該等胺基酸殘基聚合物可含有天然及/或非天然胺基酸殘基，且包括但不限於胺基酸殘基之胜肽、寡肽、二聚體、三聚體、及多聚體。術語亦包括具有修飾 (諸如例如醣基化、唾液酸化、及諸如此類) 之胺基酸聚合物或與其他分子複合者。本文中之「肽」為相對較短的胺基酸聚合物，諸如大約 4 至 50 個胺基酸。

在一些情況下，蛋白質可以為抗體。術語「抗體」或「Ab」在本文中以最廣泛含義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體 (「mAb」)、多株抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體)、抗體結合體及抗原結合片段，只要其展現所需抗原結合活性。如本文所用，該術語指代包含重鏈之至少互補決定區 (CDR) 1、CDR2 及 CDR3 以及輕鏈之至少 CDR1、CDR2 及 CDR3 的分子，其中該分子能夠與抗原結合。該術語亦涵蓋抗原結合片段。術語「抗原結合片段」包括但不限於能夠結合抗原之抗體的片段，諸如 Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab’ 及 (Fab’) ₂。相比之下，「全長抗體」係指包含其所有正常可變區及恆定區部分的抗體分子。抗體結合體可包含直接或間接連接至另一分子的全長抗體或抗原結合片段。如同其他蛋白質及肽，在一些實施例中，抗體可含有各種類型之轉譯後修飾，諸如醣基化。

本文中之「偵測」以最廣泛含義使用，以涵蓋溶液中分析物比溶液中其他分子更具選擇性之結合，例如，以測定溶液中是否存在分析物以及將分析物與該溶液中之其他組分分離，從而富集分析物。在一些情況下，本文中之方法用於偵測分析物的存在。在一些情況下，例如，本文中之方法用於與溶液中之其他分子相比「富集」或「分離」分析物，因此可以對分析物進行進一步分析。術語「富集」與「分離」在本文的上下文中可互換使用。

「試劑匣」在廣義上用於指代容納或保持「基質」的整體產品。「試劑匣」可以具有任何可用之形狀或結構並且可以由任何可用之材料製成，例如玻璃或塑膠材料或聚合材料。「試劑匣」可以包含任何可用之材料，其組態或成形為使得它可以包圍或容納基質並將其保持在適當的位置。通常，試劑匣允許流體流過及/或流經基質。在一些實施方案中，基質可以被放置在兩端具有開口之管形或圓柱形試劑匣中 (例如，如在移液管尖端、毛細管、管柱或其他組態中)，以促進在使用期間將液體溶液移入試劑匣及從試劑匣移出，例如經由自動液體分配裝置。例如，在一些情況下，試劑匣可以具有 U 形，或包含一個孔，允許從基質之一端轉移流體，或者它可以具有其中或其上定位有基質的平盤狀或扁平的晶片狀結構，允許流體流過其表面。

「基質」廣義上指代可以附著偵測分子的物質。本文中之適合之基質包括層析基質，例如 C4、C8 或 C18，或各種類型之珠粒、粒子或樹脂，例如二氧化矽、聚合物珠粒及/或金屬珠粒。在一些情況下，基質可以塗覆有蛋白質，例如可以識別偵測分子的抗體、抗原、抗體恆定區結合蛋白質或不全抗原。例如，蛋白質 A、G 或 L 可以存在於基質上以識別抗體偵測分子，或者可以在基質上使用鏈黴親和素以識別生物素化的偵測分子。在由珠粒或樹脂粒子組成的基質中，該等粒子可以為任何適宜之形狀或大小，只要它們能容納偵測分子，例如球形或大致球形的珠粒，或其他形狀，例如丸粒、碎片、片狀等。在一些實施方案中，該等基質粒子可以為磁性的。

偵測分子可以共價或非共價地「附著」於基質上。在一些實施方案中，可使用交聯劑以便使偵測分子與基質交聯。附著亦可以為直接或間接的，亦即，在基質材料與偵測分子之間沒有或具有中間分子。

如果試劑匣可用於偵測第一溶液中之分析物，然後清洗並再次平衡以偵測第二溶液中之分析物，而在使用相同技術方案之多次測試中偵測分析物的能力沒有顯著、可觀察的差異，則該試劑匣可以為「可重複使用的」。

本文中之基質可以於濕性或乾燥狀態儲存。以「濕性狀態」儲存意指基質保持浸沒於液體溶液中，例如緩衝溶液。以「乾燥狀態」儲存意指基質在儲存期間至少部分地暴露於空氣，或者在儲存之前或期間允許液體從基質蒸發。

「特異性結合」或「特異性地結合至」或「特異性識別」或如本文所用的關於偵測分子與分析物之間的結合的類似術語意指，結合之親和力比分析物與偵測分子間之結合係由於非特異性結合時具有的親和力將更高。

「質譜儀」或「MS」係指量測樣品中之一種或多種分子之質荷比 (m/z) 的技術。如本文所用，「串聯式 MS」或「MS/MS」係指將單個離子、多個離子或整個質量包絡 (前驅體) 移動至片段化腔室且接著將片段化產物送至質量分析儀。根據質譜儀之設計，片段化事件可能發生在單個質量分析儀之前、兩個或多個不同分析儀之間或單個質量分析儀內。 用於初次使用及再次使用之試劑匣以及製備試劑匣之方法

本揭示尤其涉及用於偵測溶液中之分析物的可重複使用的試劑匣，其中該試劑匣包含基質，其視情況由試劑匣或試劑匣內包含的結構保持在適當位置，其中特異性識別分析物的偵測分子例如藉由與基質中之物質非共價地結合而附著於該基質。在一些情況下，偵測分子可以與基質交聯，例如，以避免在各種處理過程中從基質上脫落。

本文中之可重複使用試劑匣可以為用於保持基質的任何合適之形狀，因此可以進行分析物的偵測。在一些實施例中，起始試劑匣可包含用於保持基質的管或圓柱形部件。例如，試劑匣可以為自旋或重力流動管柱或移液管尖端或層析管柱之形狀，允許流體藉由離心或重力流動流過包埋於內部的基質。替代性地，試劑匣可包含保持基質的柔性管路或毛細管。在一些情況下，基質可能被過濾器包圍，過濾器足夠粗以允許溶液成分自由通過，但足夠細以將基質材料保持在適當位置。在一些實施方案中，試劑匣可具有在一端開口之管狀或孔狀結構，或將基質保持在適當位置的平盤狀結構或扁平的晶片狀結構。例如，管、孔或平盤可以在一端或一側開口，以允許與緩衝液接觸以及與含有分析物之溶液接觸並去除該等溶液。

在一些實施方案中，單個試劑匣包含多於一個包含基質的空間、空腔、位置或孔，使得一個試劑匣可用於運行若干個不同的偵測反應。在其他實施方案中，單個試劑匣包含單個基質成分，因此為了平行運行不同的偵測反應，需要多個試劑匣。在一些實施方案中，試劑匣可以佈置成多樣品系統，例如 96 樣品或 384 樣品系統等，例如用於自動處理及液體分配。

在一些實施方案中，試劑匣具有例如 2 μL 至 1 mL 的體積容量，例如 10 μL 至 500 μL、2 μL 至 50 μL、2 μL 至 25 μL、2 μL 至 10 μL、10 μL 至 50 µL、20 µL 至 30 µL、20 µL 至 100 µL、20 µL 至 200 µL、或 50 µL 至 500 µL、或 100 µL 至 1 mL、或 200 µL 至 1 mL。在一些實施方案中，試劑匣具有例如 5 μL 或 10 μL 或 20 μL 或 25 μL 或 50 μL 或 100 μL 的體積容量。

在一些實施方案中，基質包含任何形狀的粒子，例如，可供偵測分子附著於其上的粒子，例如顆粒或珠粒或碎片或球體或丸粒或片狀等。在一些實施方案中，粒子可以由例如二氧化矽或瓊脂糖等物質製成。在一些實施方案中，粒子可以為磁性的，例如，以允許它們在需要時於分析期間移動，或者被保持在試劑匣中的適當位置。例如，在一些情況下，磁性粒子可能會於分析期間移入及移出試劑匣。在其他實施方案中，基質為偵測分子可以附著於其上的薄膜或薄片。在一些實施方案中，可以例如經由過濾器 (例如在每端具有開口的管中) 或藉由重力 (例如在一端具有開口的管中) 或藉由與試劑匣表面之疏水或靜電交互作用 (例如放置在平盤或晶片上之基質薄片或薄膜) 將基質保持在適當位置。

在一些實施方案中，偵測分子直接附著於基質，例如藉由非共價結合。在一些實施方案中，它們經由共價結合與基質中之分子連接。在一些實施方案中，偵測分子經由本身附著於基質的中間分子間接地附著於基質。例如，在一些實施方案中，基質包含與特定類型之偵測分子結合的分子，例如與生物素化分子結合之鏈黴親和素，或識別免疫球蛋白的分子，例如蛋白質 A、蛋白質 G 或蛋白質 L，或該等分子中兩者或更多者之組合。例如，將包含蛋白質 A 的基質與抗體偵測分子接觸允許抗體偵測分子透過其與基質上之蛋白質 A 結合而併入到基質上。在一些實施方案中，雖然基質可包含試劑例如鏈黴親和素或蛋白質 A 及/或 G，但該等分子並非本文所用術語之「偵測分子」，因為它們不用於特異性地識別特定分析物，而僅為本文中偵測分子所連接之分子。因此，例如，在一些實施方案中，如果基質包含蛋白質 A，則偵測分子可包含抗體或其他免疫球蛋白或含有 Fc 之分子，其藉由蛋白質 A 與基質結合。蛋白質 A用作基質粒子與偵測分子之間的中間鏈接，而非用作偵測分子本身。

在一些實施方案中，添加到基質中之偵測分子亦可與基質交聯。例如，交聯試劑例如庚二醯亞胺酸二甲酯 (DMP)、或氰酸酯、NHS 酯、吖內酯、羰基二咪唑 (CDI)、順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、吡啶二硫化物、醯肼或碳二亞胺試劑，或其他適合將親和性試劑固定於基質上的試劑可用於將偵測分子附著於基質。(參見，例如，www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/covalent-immobilization-affinity-ligands.html，用於進一步討論如何使用該等及另外之交聯試劑將分子附著於瓊脂糖基質。)  在其他實施方案中，依據試劑匣之預期用途及偵測分子之特性，可能不需要交聯。在一些實施方案中，當 DMP 用作交聯劑時，1 至 10 mM DMP、1 至 5 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM 或 10 mM DMP 用於將偵測分子與基質交聯。在本文的一些實施方案中，用於交聯反應的 DMP 之濃度為通常用於該反應之濃度的約四分之一至五分之一。

在一些實施方案中，本文中之試劑匣亦包含至少一種冷凍保護劑，例如蔗糖、海藻糖、二醇例如乙二醇或丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇 (MPD) 或二甲基亞碸 (DMSO)。例如，冷凍保護劑可以與基質接觸，例如以保護偵測分子及/或其他基質成分於儲存期間例如於乾燥狀態下儲存期間免受損壞或變性。在一些情況下，冷凍保護劑包含葡萄糖及/或海藻糖。在一些情況下，冷凍保護劑包含海藻糖。

因此，在一些實施方案中，本文中之可重複使用試劑匣包含 (a) 基質及 (b) 附著於該基質的偵測分子，其中該等偵測分子與分析物特異性結合，並且其中該等偵測分子視情況與該基質交聯。在一些實施方案中，本文中之可重複使用試劑匣包含 (a) 基質；(b) 附著於該基質的偵測分子，其中該等偵測分子與分析物特異性結合，並且其中該等偵測分子視情況與該基質交聯；及 (c) 至少一種冷凍保護劑。

某些用於分析物偵測的市售試劑匣及基質通常預期僅使用一次並丟棄，並且亦預期在使用前保持為濕性狀態。(參見，例如，AssayMap® Bravo 試劑匣，Agilent。) 本揭示令人驚訝地顯示，本文所述之試劑匣可以重複使用多次而不會顯著損失訊號以偵測細胞培養物上清液或細胞裂解物中之分析物，並且試劑匣可以於乾燥狀態儲存。在一些實施方案中，試劑匣於乾燥狀態儲存。在一些該等情況下，試劑匣包含冷凍保護劑並且於乾燥狀態儲存。在一些情況下，試劑匣於 2 至 8℃ 於乾燥狀態儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或於 4℃ 儲存。在一些情況下，在用於偵測分析物之前再次潤濕於乾燥狀態儲存的試劑匣。在一些情況下，在再次使用之前視情況於降低溫度儲存之前，可以藉由下述乾燥試劑匣基質：加熱至至少 30℃，例如加熱至 30 至 45℃、30 至 37℃、30℃ 或 37℃，例如持續至少 30 分鐘，持續 30 至 60分鐘，或 60 至 120 分鐘，接著使其於室溫冷卻至少 1 小時，例如至少 2 小時、至少 4 小時、至少 8 小時、至少 12 小時或隔夜。在一些實施方案中，試劑匣於濕性狀態儲存，例如，其中基質浸沒於緩衝溶液中。在一些情況下，試劑匣於 2 至 8℃ 於濕性狀態儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或於 4℃ 儲存。在一些該等情況下，試劑匣包含冷凍保護劑並且於濕性狀態儲存。

在一些實施方案中，試劑匣如上所述以 7.0 或更低之 pH 儲存。在一些實施方案中，試劑匣以酸性 pH (亦即，低於 7.0 之 pH) 儲存。在一些實施方案中，試劑匣以 pH 4 至 7，例如 pH 4 至 6、pH 4 至 6.5、pH 4.5 至 6.5、pH 4.8 至 6.8、pH 5 至 7、pH 4 至 5、pH 5 至 6、pH 6 至 6.5 或 pH 6 至 7 儲存。在一些實施方案中，試劑匣在包含 EDTA 及/或疊氮化鈉之緩衝液中儲存。

在本文的一些實施方案中，試劑匣為先前已使用過至少一次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。例如，在一些實施方案中，試劑匣可用於偵測溶液中之分析物，並且所偵測之分析物被溶析以將其從試劑匣中移除，並且試劑匣基質與包含冷凍保護劑之緩衝液接觸以在使用之間儲存。在一些實施方案中，緩衝液視情況處於酸性 pH 及/或包含 EDTA 及/或疊氮化鈉。在一些實施方案中，試劑匣可以重複使用至少 9 次而偵測能力沒有明顯的可觀察到的降低。例如，在一些情況下，在第一次到最後一次運行之間所偵測之來自樣品至分析物的組成或量沒有顯著變化的情況下，對於相同樣品可以重複使用試劑匣至少 9 次。(參見，例如，圖 6A-H。) 在一些實施例中，試劑匣可以重複使用至少 10、20、50 或 100 次而偵測能力沒有明顯的可觀察到的降低。例如，在一些實施方案中，相較於第一次使用時溶析的分析物，具有包含抗體偵測分子之基質的試劑匣在使用至少 10、20、50 或 100 次後，仍然能夠從細胞裂解物或生物流體中溶析至少 90% 的蛋白質分析物。在一些實施方案中，相較於第一次使用時溶析的分析物，具有包含抗體偵測分子之基質的試劑匣在使用至少 10、20、50 或 100 次後，仍然能夠從細胞裂解物或生物流體中溶析至少 95% 的蛋白質分析物。在一些實施方案中，相較於第一次使用時試劑匣之效率，具有包含抗體偵測分子之基質的試劑匣在使用至少 10、20、50 或 100 次後，仍然能夠以至少 90% 的效率偵測及富集生物樣品中之蛋白質分析物。在一些實施方案中，相較於第一次使用時試劑匣之效率，具有包含抗體偵測分子之基質的試劑匣在使用至少 10、20、50 或 100 次後，仍然能夠以至少 95% 的效率偵測及富集生物樣品中之蛋白質分析物。在一些該等情況下，試劑匣在每次使用之間於乾燥狀態與冷凍保護劑一起儲存。在一些該等情況下，試劑匣在每次使用之間於濕性狀態與或不與冷凍保護劑一起儲存。在一些情況下，試劑匣在使用之間於 2 至 8℃ 於乾燥或濕性狀態儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或於 4℃ 儲存。在一些況下，在每次使用之間將其與酸性 pH 且/或包含 EDTA 及/或疊氮化鈉的緩衝液一起儲存。

在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少兩次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少三次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少四次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少五次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少六次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少七次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少八次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少九次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少十次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少 20 次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少 50 次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些實施例中，試劑匣為已使用過至少 100 次以偵測溶液中之分析物的試劑匣。在一些該等情況下，在先前一次或多次使用之後，試劑匣已於乾燥狀態與冷凍保護劑一起儲存。在一些該等情況下，試劑匣在每次使用之後已於濕性狀態與或不與冷凍保護劑一起儲存。在一些情況下，試劑匣在使用之間已於 2 至 8℃ 於乾燥或濕性狀態儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或於 4℃ 儲存。在一些況下，在每次使用之間將其與酸性 pH 且/或包含 EDTA 及/或疊氮化鈉的緩衝液一起濕性儲存。在一些情況下，在每次使用之間將其與冷凍保護劑一起乾燥儲存，但在已經用包含 EDTA 及/或疊氮化鈉之酸性 pH 緩衝液處理後乾燥。

在一些情況下，試劑匣於 2 至 8℃ 於乾燥狀態儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或例如於 4℃ 儲存，試劑匣可能儲存至少 24 小時、至少 48 小時、至少 1 週、至少 2 週、至少 1 個月、至少 3 個月或至少 6 個月。在一些情況下，它可以在添加冷凍保護劑之後，於乾燥狀態於 2 至 8℃ 儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或例如於 4℃ 儲存，儲存至少 24 小時，至少 48 小時，至少 1 週，至少 2 週、至少 1 個月、至少 3 個月或至少 6 個月。此外，在一些實施方案中，在乾燥之前，在用包含 EDTA 及/或疊氮化鈉之酸性緩衝液進行預先處理之後，它可以在上述條件下儲存。在一些情況下，若試劑匣濕性儲存，則它可以在使用之間於包含 EDTA 及/或疊氮化鈉之酸性 pH 緩衝液中於 2 至 8℃ 儲存，例如在冰箱或冷藏室中，或例如於 4℃ 儲存，儲存至少 24 小時，至少 48 小時，至少 1 週，至少 2 週、至少 1 個月、至少 3 個月、至少 6 個月或至少 1 年。在其他情況下，試劑匣可以於室溫濕性儲存於該緩衝液中，前提條件是其儲存在使得基質保持浸沒於緩衝液中亦即使其保持濕性之條件下。本揭示亦涉及製備用於在使用之間儲存的可重複使用試劑匣的方法。例如，在一些方法中，在先前之分析物偵測溶析之後，將試劑匣於緩衝液中洗滌至少一次，該緩衝液例如 1% 至 10% 乙酸例如 1%、5% 或 10% 乙酸，1% 甲酸或 1% 三氟乙酸 (TFA)，且隨後將基質與冷凍保護劑例如在 pH 7 或更低之緩衝液中接觸，或在例如 pH 4 至 7 之緩衝液中接觸，或在例如 pH 4 至 6、pH 4 至 6.5、pH 4.5 至 6.5、pH 4.8 至 6.8、pH 5 至 7、pH 4 至 5、pH 5 至 6、pH 6 至 6.5、or pH 6 至 7 之酸性緩衝液中接觸。在一些實施方案中，該冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇 (MPD) 或二甲基亞碸 (DMSO) 中之一者或多者。在一些實施方案中，冷凍保護劑包含蔗糖及/或海藻糖。在一些實施方案中，冷凍保護劑包含海藻糖。在一些實施方案中，包含冷凍保護劑之緩衝液亦包含 EDTA 及/或疊氮化鈉。在一些實施方案中，然後允許試劑匣乾燥。在一些情況下，在再次使用之前視情況於降低溫度儲存之前，可以藉由下述乾燥試劑匣基質：加熱至至少 30℃，例如加熱至 30 至 45℃、30 至 37℃、30℃ 或 37℃，例如持續至少 30 分鐘，持續 30 至 60分鐘，或 60 至 120 分鐘，接著使其於室溫冷卻至少 1 小時，例如至少 2 小時、至少 4 小時、至少 8 小時、至少 12 小時或隔夜。

在一些實施方案中，可重複使用試劑匣係藉由下述製備：獲得包含基質之試劑匣，或視情況將基質添加到試劑匣中，將基質與偵測分子接觸，使該等分子附著於該基質，以及視情況將該等偵測分子與該基質交聯。在一些情況下，然後去除多餘的、未附著之偵測分子。使用前，可使用適當的緩衝液平衡試劑匣。

在一些實施方案中，可重複使用試劑匣係使用抗體作為偵測分子製備。在一些該等情況下，基質可包含一種分子，該分子特異性地識別抗體之部分例如 Fc 域或其他恆定區，理想地允許抗體在不干擾其抗原結合功能的區域與基質結合。例如，在一些實施方案中，將經純化或分離之抗體暴露於包含例如蛋白質 A、蛋白質 G 或蛋白質 L 或該等之組合例如蛋白質 A 及蛋白質 G 的基質，使之與基質結合，然後去除多餘的抗體。在一些情況下，使用交聯劑將抗體偵測分子與包含蛋白質 A、G 及/或 L 的基質交聯。類似地，當使用其他偵測分子例如待偵測之分析物的不全抗原或其他結合劑時，它們亦可與基質交聯。

在一些實施方案中，一種類型的偵測分子附著於基質，例如對特定抗原具有特異性之抗體。在其他實施方案中，可以將兩種或更多種類型之偵測分子附著於基質。在一些情況下，識別多於一種分析物的偵測分子可以包括在單個基質中，例如靶向兩種不同抗原的兩種不同抗體，或靶向一組分析物的若干種不同抗體。在其他情況下，例如，可以將識別相同抗原之不同部分的兩種或更多種不同抗體附著於基質。因此，在一些實施方案中，例如，基質可以結合有 2、3、4、5、10、20、100 或 2 至 5、5 至 10、10 至 20、10 至 50、10 至 100 或 50 至 100 種不同的偵測分子，因此基質能夠識別溶液中之一系列或一組分析物。

在一些情況下，偵測分子與基質交聯，例如，以防止它們在重複使用時從基質中浸出。在一些實施方案中，交聯劑選自庚二醯亞胺酸二甲酯 (DMP)、氰酸酯、NHS 酯、吖內酯、羰基二咪唑 (CDI)、順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、吡啶二硫化物、醯肼或碳二亞胺。在一些實施方案中，使用 DMP 進行交聯。在一些實施方案中，與 DMP 之交聯反應在試劑匣中進行，該 DMP 之濃度為該交聯反應之通常推薦濃度的四分之一至五分之一。因此，例如，可推薦使用約 20 至 25 mM DMP，但在本案中，小於 10 mM DMP 可用於將蛋白質偵測分子 (例如抗體) 與基質交聯。在一些情況下，可以使用 3 至 10 mM DMP、3 至 7 mM DMP、5 至 10 mM DMP 或 4 至 6 mM DMP。在一些情況下，可以使用 5 mM DMP。在一些實施方案中，與通常推薦濃度相比，降低交聯劑之濃度提高了試劑匣重複使用的能力而不顯著削弱試劑匣基質偵測分析物的能力。 用於偵測多肽的可重複使用試劑匣的示例性用途

本揭示亦涵蓋在本文中使用及重複使用試劑匣的方法。在一些實施方案中，分析物為例如肽或蛋白質。例如，分析物可以為被抗體偵測分子特異性識別的肽或蛋白質。例如，如本文所述，一種示例蛋白質分析物為 MHC-I 複合物分子。

在一些情況下，可以在生物溶液例如體液 (例如血液、血漿、尿液等) 或細胞裂解物中偵測分析物例如蛋白質或其他生物分子。例如，本文中之方法可以允許從生物流體或細胞裂解物中富集 MHC-I 複合物分子，使得它們可以在後續步驟如層析法及質譜法中進一步分析。

在一些實施方案中，在將溶液暴露於試劑匣之前過濾溶液。例如，過濾可能有助於去除可能堵塞基質或干擾其後續再次使用的大顆粒。在一些實施方案中，溶液在 0.1 至 1 μm 過濾器上過濾，例如在 0.1 μm、0.2 μm、0.22 μm、0.3 μm、0.4 μm、0.45 μm、0.5 μm、0.6 μm、0.7 μm 或 0.8 μm 過濾器上過濾，或在 0.1 至 0.5 µm 過濾器上，例如在 0.1 至 0.5 µm 過濾器上，例如 0.1 µm、0.2 µm、0.22 µm、0.3 µm、0.4 µm、0.45 µm 或 0.5 µm 過濾器上過濾。在一些實施方案中，其中生物流體或細胞裂解物用於分析物偵測，該流體在與試劑匣基質接觸之前冷卻，例如在冰上冷卻，或冷卻到例如 2 至 15℃ 之溫度。例如，在一些實施方案中，將樣品冷卻至 2 至 10℃ 或 4 至 10℃ 或 10 至 15℃ 之溫度。在一些實施方案中，在降低溫度之前，將冷凍保護劑添加到溶液中，例如蔗糖、甘油或海藻糖。在一些實施方案中，在添加冷凍保護劑後快速冷凍溶液。在一些實施方案中，生物流體或細胞裂解物在與試劑匣基質接觸之前被稀釋，例如在等張緩衝液中。在一些實施方案中，溶液中之總蛋白質濃度可以在與基質接觸之前測定，例如在二辛可寧酸 (bicinchoninic acid (BCA)) 分析中。

在一些實施方案中，一旦分析物已從本文中之試劑匣中溶析，其可藉由例如電泳、層析法或結構分析、或質譜法或層析法後聯質譜法之類的過程進一步分析。

在一些實施方案中，亦可以定量與基質結合之分析物的量。例如，分析物之量可以藉由例如電泳及光密度測定法或藉由將來自分析物之訊號整合到層析峰中來測定。

在一些情況下，使用方法包括使用先前已經用於偵測或富集相同或相似分析物的試劑匣來偵測或富集分析物。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少一次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少兩次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少三次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少四次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少五次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少六次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少七次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少八次。在一些情況下，試劑匣之前已經使用過至少九次。

在一些情況下，該用途包括在溶析分析物後製備試劑匣以供後續使用，例如藉由在緩衝液中將其洗滌至少一次，該緩衝液例如 1% 至 10% 乙酸例如 1%、5%、或 10% 乙酸、1% 甲酸或 1% 三氟乙酸 (TFA)，並且視情況將基質與冷凍保護劑接觸。冷凍保護劑可以在緩衝液中，例如在 pH 7 或更低之緩衝液中，或在例如 pH 4 至 7 之緩衝液中，或在例如 pH 4 至 6、pH 4 至 6.5、pH 4.5 至 6.5、pH 4.8 至 6.8、pH 5 至 7、pH 4 至 5、pH 5 至 6、pH 6 至 6.5 或 pH 6 至 7 之酸性緩衝液中。在一些實施方案中，該冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇 (MPD) 或二甲基亞碸 (DMSO) 中之一者或多者。在一些實施方案中，冷凍保護劑包含蔗糖及/或海藻糖。在一些實施方案中，冷凍保護劑包含海藻糖。在一些實施方案中，包含冷凍保護劑之緩衝液亦包含 EDTA 及/或疊氮化鈉。在一些實施方案中，然後允許試劑匣乾燥。在一些情況下，在再次使用之前視情況於降低溫度儲存之前，可以藉由下述乾燥試劑匣基質：加熱至至少 30℃，例如加熱至 30 至 45℃、30 至 37℃、30℃ 或 37℃，例如持續至少 30 分鐘，持續 30 至 60分鐘，或 60 至 120 分鐘，接著使其於室溫冷卻至少 1 小時，例如至少 2 小時、至少 4 小時、至少 8 小時、至少 12 小時或隔夜。 包含試劑匣之套組

本揭示亦涵蓋包含本文中之試劑匣的套組。在一些實施方案中，試劑匣尚未使用。在其他實施方案中，它們先前已經使用過至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50 或 100 次。在一些實施方案中，套組包括以如上所述之於乾燥狀態儲存的試劑匣。在一些實施方案中，套組包括以如上所述之於濕性狀態儲存的試劑匣。在一些實施方案中，套組進一步包括使用說明書。在一些實施方案中，套組進一步包含用於偵測或富集樣品中之分析物的試劑，例如平衡、洗滌及/或溶析緩衝液。在一些實施方案中，套組亦包括對照，例如不含偵測分子之空白試劑匣或具有不旨在識別分析物的結構相似之偵測分子的試劑匣。在一些實施方案中，套組可以被包裝以運送到其他地點。在一些實施方案中，包含試劑匣的套組可如上所述於乾燥狀態儲存至少 24 小時、48 小時、至少 1 週、至少 2 週、至少 1 個月、至少 3 個月、或至少 6 個月，在一些情況下在室溫儲存，在其他情況下於 2 至 8℃ 儲存。在一些實施方案中，包含試劑匣的套組可如上所述於濕性狀態儲存至少 24 小時、48 小時、至少 1 週、至少 2 週、至少 1 個月、至少 3 個月、至少 6 個月、或至少 1 年，在一些情況下在室溫儲存，在其他情況下於 2 至 8℃ 儲存。在一些實施方案中，套組亦可包含用於清潔及儲存試劑匣的試劑，例如包含冷凍保護劑、EDTA 及疊氮化鈉中之一者或多者的緩衝液。在一些實施方案中，套組包含一包試劑匣，例如，10、50、100 個 (例如，包括 96 孔試劑匣的 96 孔平盤；或裝入 96 孔平盤系統內的一組約 100 個管狀試劑匣)、500 或 1000 個試劑匣。

以下實施例提供了對本文中之示例性試劑匣以及製備、儲存及使用它們的方法的進一步描述，但不旨在限製本文揭示之範圍。 實例 實例 1. 製備及測試可重複使用的試劑匣 試劑匣製備

獲得以下材料用於製備經抗體塗覆之試劑匣：6 個大型 AssayMAP™ 蛋白質 A 試劑匣 (Agilent)、一個 Seahorse 1 孔µ平盤、Eppendorf PCR 平盤 (深孔平盤)、PBS、TBS 及 25 mM Tris 緩衝液、1% 乙酸溶析緩衝液、以及抗人 HLA A、B、C 抗體 w6/32 溶液 (1 mg/mL，於 PBS 中)。將試劑匣組裝到平盤中之預定義行中並且用 PBS 平衡，與抗體溶液接觸，使抗體與試劑匣基質上之蛋白質 A 結合，洗滌，然後暴露於交聯試劑。詳言之，將試劑匣佈置於多孔平盤中，並使用自動液體分配裝置 (Agilent AssayMAP™ Bravo)，首先用 PBS 灌注並平衡試劑匣，先後使用流速為 300 µL/min 的 250 µL PBS 以及流速為 20 µL/分鐘的 150 µL PBS 進行。然後以 20 µL/min 的流速添加 1 mL 抗體溶液，然後用 PBS 洗滌試劑匣以去除多餘的抗體。

然後用交聯劑處理試劑匣以將抗體與蛋白質 A 基質交聯。試劑匣首先用 200 mM 三乙醇胺 (TEA) 緩衝液 pH 8.2 灌注及平衡，然後用體積為 200 µL 的 5 mM DMP 以 5 µL/min 的流速處理。然後首先用 250 µL TBS 清洗試劑匣，接著用 250 µL 25 mM Tris 清洗，每次流速皆為 20 µL/min，然後與 1% 乙酸的溶析緩衝液 (50 µL，10 µL/min) 接觸。然後用乙酸、Tris 及 TBS 緩衝液 (分別為 100 µL、200 µL 及 200 µL 體積，流速分別為 20 µL/min) 對試劑匣進行第二次處理，並將試劑匣置於 190 µL TBS 以及 1 mM EDTA 及 0.025% 疊氮化鈉的儲存緩衝液中，確保液體保持在每個試劑匣管柱中的基質頂部上方。

某些試劑匣如下乾燥，而其他試劑匣則儲存在儲存緩衝液中。製備了 20 mM His-乙酸鹽、200 mM 海藻糖、pH 6 的乾燥緩衝液。將 270 µL 乾燥緩衝液添加到選擇用於乾燥儲存的試劑匣中。然後將試劑匣於 37℃ 放置 1 小時使其乾燥，然後在使用前於室溫儲存隔夜。 試劑匣測試

然後在 AssayMap™ Bravo 系統中測試如上所述製備的於濕性狀態儲存以及在使用前於乾燥狀態儲存的經抗體塗覆及交聯之試劑匣與溶液中之分析物的結合。詳言之，使用 3 個濕性儲存及 3 個乾燥儲存的 w6/32 抗體試劑匣進行測試。試劑匣在 TBS 中灌注及平衡 (150 µL 以 300 µL/min 進行灌注，然後 100 µL 以 20 µL/min 進行平衡)，添加分析物溶液 (50 µL，10 µL/min)。將含有 HLA 的溶液添加到濕性或乾燥儲存的 w6/32 試劑匣中。然後用 250 μL TBS 以 20 μL/min 的流速洗滌試劑匣，然後用 250 μL 25 mM Tris pH 8.0 以 20 μL/min 洗滌，隨後用 50 μL 1% 乙酸以 10 μL/min 流速溶析。然後將溶析物加載到丙烯醯胺電泳凝膠上，然後藉由在微波爐中加熱 1.5 分鐘用 SimplyBlue™ (ThermoFisher Scientific) 染色，接著搖動 10 分鐘並在水中脫色 1 小時。

凝膠泳道如下，結果如圖 2 所示。

泳道	樣品	體積 (µL)
1	HLA 標準品	10
2	HLA 標準品	5
3	HLA 標準品	2
4	從 w6/32 濕性儲存試劑匣 1 溶析	15
5	從 w6/32 濕性儲存試劑匣 2 溶析	15
6	從 w6/32 濕性儲存試劑匣 3 溶析	15
7	從 w6/32 乾燥儲存試劑匣 1 溶析	15
8	從 w6/32 乾燥儲存試劑匣 2 溶析	15
9	從 w6/32 乾燥儲存試劑匣 3 溶析	15

從圖 2 中可以看出，從濕性儲存及乾燥儲存的試劑匣 (圖 2 右側第 4 至 9 泳道) 中的 HLA 溶析看起來相等，表明試劑匣可以在濕性儲存或乾燥儲存後使用。 實例 2 ：使用試劑匣富集生物樣品中之 MHC-I 複合物 材料與多肽合成

除非另有說明，否則所有化學品皆購自 Sigma-Aldrich。抗體購自 CST (Danvers, MA) 或 Abcam (Burlingame, CA)。dTag13 降解劑化合物購自 Tocris。通用塑膠器皿購自康寧公司 (Corning)，而 AssayMAP™ 塑膠器皿購自安捷倫公司 (Agilent)，如用戶手冊中指定用於 AssayMAP™ Bravo。肽購自 JPT Peptide Technologies (Berlin, Germany)，溶解於 50% 乙二醇 (Sigma) 中，並在 -20℃ 儲存。 HLA 及 B2M 純化

將重組 HLA 等位基因及 β2M 在大腸桿菌 ( E. Coli) 中過度表現，自包涵體中純化，並於變性緩衝液 (6M 胍 HCL、25 mM Tris (pH 8.0)) 中於 -80℃ 儲存。簡而言，將 β2M 及 HLA 生質丸粒以 5 mL/g 之濃度再懸浮於裂解緩衝液 (PBS+1% Triton X-114) 中。再懸浮之丸粒在 1000 巴下進行微流化兩次。將所得懸浮液在超離心器中以 30,000 g 旋轉 20 min。收集丸粒，用 500 mL 裂解緩衝液洗滌，並以 30,000 g 離心 20 min。如上所述再次收集丸粒並進行第二次洗滌。然後將經純化之包涵體以 10 mL/g 之濃度溶解於變性緩衝液 (20 mM MES (pH 6.0)、6M 胍 HCl) 中。然後將懸浮液於 4℃ 攪拌隔夜。將經溶解之丸粒以 40,000 g 離心 60 min，收集上清液，並透過 0.22 µ 過濾器過濾。使用 BCA 測定來確定濃度。將樣品速凍，並且在用於生成 MHC 複合物之前於 -80℃ 儲存。 重組 MHC-I 複合物之生成

在 5 L 反應中，將所選肽 (0.01 mM)、經氧化之麩胱甘肽及經還原之麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA 等位基因 (0.03 mg/ml) 及 β2M (0.01 mg/ml) 全部於再摺疊緩衝液 (100 mM Tris (pH 8.0)、400 mM L-精胺酸、2 mM EDTA) 中組合。將再摺疊混合物於 4℃ 攪拌 4 天。再摺疊溶液透過 0.22 µm 過濾器過濾，濃縮且藉由切向流過濾 (TFF) (Millipore) 緩衝液交換至 25 mM Tris (pH 7.5) 中。然後藉由 LC/MS 分析蛋白質組分以確保 HLA 處於適當還原狀態中。藉由陰離子交換層析，使用 5 mL HiTrap™ Q HP 管柱在 AKTA Avant FPLC 上純化再摺疊之 MHC-I 複合物。使用 10 管柱體積 (CV) 之 25 mM Tris (pH 7.5) 以 5 mL/min 之流速平衡管柱。將 MHC-I 複合物以 5 mL/min 流速加載於管柱上並使用超過 30 CV 之 0 至 60% 25 mM Tris (pH 7.5)、1 M NaCl 梯度溶析。在 SDS-PAGE 上運行溶析峰之分級分離，且彙集含有 β2M 帶及 HLA 帶之彼等分級分離物。將所彙集之分級分離物緩衝液交換至儲存緩衝液 (25 mM Tris (pH 8.0)、150 mM NaCl) 中。藉由 280 nm 處之 UV 吸光度測定蛋白質濃度，且將樣品速凍並於 -80℃ 儲存。 附著及懸浮細胞培養

MC38 細胞以冷凍原液形式獲得並立即培養成工作原液，並且於生長培養基 +10% DMSO 中冷凍。MC38 於 RPMI-1640、10% FBS、2 mM 麩醯胺酸、1X 青黴素-鏈黴素及 25 mM HEPES 中生長。細胞於 37℃ 及 5% CO ₂下以 18 小時的倍增時間繼代。GRANTA-519 (GRANTA) 細胞亦如上述者培養成工作原液。GRANTA 細胞於 RPMI-1640、10% FBS、2 mM 麩醯胺酸及 1X 青黴素-鏈黴素中培養。在 110 rpm 之 Infors Minitron 中，將細胞於 37℃ 及 5% CO ₂下以 48 小時的倍增時間繼代。 細胞處理與收穫

細胞於 37℃ 及 5% CO ₂(附著 MC38 細胞) 及 110 rpm (懸浮 GRANTA 細胞) 下處理並孵育。為了收穫附著 MC38 細胞，吸出培養基並立即將冷 Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.) 添加到平盤中。在使用攪拌將細胞從平盤上提起之前，將平盤於室溫靜置 5 分鐘。然後將 Accutase 細胞混合物添加到含有生長培養基的離心管 (falcon tube) 中，使用 ViCell XR 對細胞進行計數並測定每毫升之活細胞濃度，然後在每種條件下，將 2.5 億個細胞轉移到 50 mL 離心管中。為了收穫懸浮 GRANTA 細胞，如上所述對細胞進行計數及轉移。然後經由離心使全部細胞沉澱，去除上清液，將丸粒在液氮中快速冷凍，然後放置於 -80℃。 細胞裂解與儲存

從 -80℃ 取出細胞丸粒，並在置於冰上之前於 37℃ 水浴中快速解凍。將 2.5 億個細胞 GRANTA 丸粒在 5mL 非變性 OG 清潔劑緩衝液 (PBS、0.25% 去氧膽酸鈉、0.2 mM 碘乙醯胺、1 mM EDTA、1% 辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷 (OG) 及 1X 蛋白酶 + 磷酸酶抑製劑 (Sigma)) 中裂解，並將裂解物轉移到一個 5 mL 微量離心管 (eppendorf tube) 中。將 2.5 億個細胞 MC38 丸粒在每個 10 mL OG 緩衝液中裂解並轉移到兩個 5 mL 微量離心管中。將裂解物置於冰上 30 分鐘，然後在 4℃ 以 20,000 g 離心沉降 60 分鐘以澄清。澄清的裂解物立即傾倒至 50 mL 離心管真空過濾器 (0.45 µm，康寧公司) 中，並在溫和真空下過濾。將經過濾之溶液以 4 mL 等分試樣 (完整的 GRANTA 250 M 細胞裂解物或 MC38 250 M 細胞裂解物的一半) 轉移到各自的 15 mL 離心管中，接著各自添加 1.33 mL 的 50% 甘油及 1 M 蔗糖 (最終濃度為 10% 甘油及 200 mM 蔗糖)。試管藉由倒置混合直至均勻，取出 10 µL 用於 BCA 分析，取出 30 µL 用於西方墨點法及凝膠內消化 (用於全局蛋白質組學)。然後快速冷凍離心管，並於 -80℃ 放置。 試劑匣製備、儲存及再次使用

如下所述進行試劑匣交聯。簡而言，在以 1 mg/mL 的濃度加載 1 mg 抗體之前，將乾燥的蛋白質 A 試劑匣在 PBS 中灌注，然後用 PBS 洗滌 (對於所有試劑匣尺寸，灌注以 300 µL/min 進行。洗滌及裝載小試劑匣分別以 10 µL 及 5 µL/min 進行。洗滌及裝載大試劑匣以 20 µL/min 進行)。然後將試劑匣平衡到 200 mM 三乙醇胺 (TEA，Sigma) 中，於室溫歷時 40 分鐘加載 TEA (pH 8.2) 中之 5 mM 庚二醯亞胺酸二甲酯 (DMP，Sigma)，然後接連地用 TBS、25 mM Tris (pH 8.0) (Tris 緩衝液)、1% 乙酸、Tris 緩衝液、以及最後之 TBS 洗滌。然後將試劑匣在裝有 TBS、1 mM EDTA、0.025% 疊氮化鈉的空試劑匣架中於 4℃ 儲存，然後封膜。為了製作乾燥的試劑匣，將試劑匣緩衝液更換為 20 mM 組胺酸、200 mM 海藻糖、pH 6.0，於 37℃ 放置 1 小時，然後於室溫在黑暗中放置至少 18 小時以完成乾燥。然後以與乾燥蛋白質 A 試劑匣相同的方式重構經乾燥之試劑匣。

將重複使用的試劑匣轉移至 AssayMAP™ Bravo，每個試劑匣之頸部用棉籤擦乾 (如果從 4℃ 轉移)，然後用水灌注，用 1% 乙酸灌注，並在再次使用前用水清洗。 使用試劑匣進行 MHC 富集

將經稀釋之冷凍細胞裂解物從 -80℃ 的乾冰冷凍器中取出，並於 37℃ 水浴中快速解凍，然後放置在濕冰上，無需混合。將經交聯之試劑匣從冰箱中取出並轉移至 AssayMAP™ 系統，使用 Qtip 將杯子擦乾，然後用水灌注，用 1% 乙酸灌注，並用水洗滌。

將 500 µL 之每種裂解物轉移至 0.45 µm Costar 旋轉過濾管，在 4℃ 以 16,000 g 離心沉降 1 分鐘，然後置於冰上。檢查旋轉過濾管是否在過濾器頂部滯留有裂解物。如果滯留之裂解物體積大於 10 至 20 µL，則不會將材料用於試劑匣實驗，因為它被認為可能會堵塞試劑匣。將回流至相應 15 mL 離心管的流經液於冰上儲存。將樣品冷卻至 10℃。

從每個 8.3 mL 離心管中，將每孔 1.1 mL 轉移至 Deepwell™ 樣品平盤之四個孔中 (3.9 mL 樣品滯留在離心管中)。AssayMAP™ Bravo 系統用於灌注及平衡試劑匣並加載樣品，如下所述：  試劑匣 TBS 灌注 (150 µL，250 µL/min)、TBS 平衡 (100 µL，20 µL/min) 及加載樣品 (1 mL，20 µL/min)。更換流經平盤並向四個孔中至每個孔中添加另外的 800 µL 樣品。進一步加載樣品 (800 µL，20 µL/min)，然後進行 TBS 清洗 (250 µL，25 µL/min)、Tris 清洗 (250 µL，25 µL/min) 及 1% 醋酸鹽溶析 (60 µL，10 µL /min)。從每個孔中取出 10 µL，以藉由考馬斯染色電泳凝膠驗證對 MHC-I 複合物的富集。將剩餘 4 x 50 µL 合併到一個 1.5 mL 體積之管中，快速冷凍，並放置於 -80℃。然後將試劑匣用 1% 乙酸灌注，並用 Tris 緩衝液及 TBS 洗滌，然後於 4℃ 儲存在裝有 TBS、1 mM EDTA、0.025% 疊氮化鈉的空試劑匣架中，然後封膜。

圖 1D 顯示了製備及使用該等用於偵測細胞裂解物中之 MHC-I 複合物的套組的工作流程。最初，我們發現第一次使用後試劑匣的堵塞阻礙了我們再次使用它們的能力。然而，藉由減少 DMP 交聯劑之量 (例如從 25 mM 減少至 5 mM)，使用更大的裂解物過濾器，用甘油及蔗糖將經過濾之裂解物稀釋 1.33 倍，並在富集期間降低裂解物之溫度，我們發現沉澱得以最小化，再次使用時試劑匣不再被堵塞。

詳言之，如圖 5 中所示，在本文所述之條件下 (500 µL 置於 0.45 µm Costar 過濾器上，且於 4℃ 以 16,000 g 旋轉 1 分鐘)，水及裂解緩衝液顯示沒有滯留體積 (陰性對照)，而於室溫放置一天的 MC38 裂解物 (50M 細胞/毫升 B 緩衝液，陽性對照) 顯示滯留超過 400 µL。新鮮 GRANTA 裂解物 (50M 細胞/毫升 B 緩衝液) 顯示沒有滯留，而在室溫 (典型的、未優化的加載條件) 儲存 4 小時至裂解物顯示黏度顯著增加。將溫度降低至 4℃ 減少聚集，該方式保持 18 小時以上。如果裂解物用 PBS、蔗糖 (起始 1M，最終 200 mM) 或甘油 (起始 50% 甘油，最終 10%) 快速冷凍，然後解凍，則粘度低，即使於室溫放置 4 小時後亦如此 (然而，於室溫儲存 24 小時導致黏度大幅增加)。將蔗糖及甘油保存相結合 (導致更稀的裂解物溶液) 使得凍融循環時不會立即出現明顯滯留，且在室溫放置 4 小時後亦無明顯滯留。

使用該經優化之工作流程，我們證明了在上述分析中，單個試劑匣可用於富集裂解物至少九次，所觀察到之獨特肽幾乎沒有減少或所偵測到之肽的組成幾乎沒有變化 (參見圖 1E、圖6F-6H）來耗盡 CD8+ 細胞。即使抗體交聯試劑匣已經在交聯後乾燥，於乾燥狀態儲存，然後在使用前再次潤濕，該發現仍然成立。

除非本文另有說明，否則全部引證文件及參考文獻皆藉由引用以其整體併入本文。 參考文獻1.    Leko, V. & Rosenberg, S. A. Identifying and Targeting Human Tumor Antigens for T Cell-Based Immunotherapy of Solid Tumors. Cancer Cell(2020) doi:10.1016/j.ccell.2020.07.013。 2.    Laumont, C. M. 等人 Global proteogenomic analysis of human MHC class I-associated peptides derived from non-canonical reading frames. Nat. Commun.7, 10238 (2016)。 3.    Laumont, C. M. & Perreault, C. Exploiting non-canonical translation to identify new targets for T cell-based cancer immunotherapy. Cell. Mol. Life Sci.75, 607–621 (2018)。 4.    Kong, Y. 等人 Transposable element expression in tumors is associated with immune infiltration and increased antigenicity. Nat. Commun.10, 5228 (2019)。 5.    Ouspenskaia, T. 等人 Thousands of novel unannotated proteins expand the MHC I immunopeptidome in cancer. bioRxiv2020.02.12.945840 (2020) doi:10.1101/2020.02.12.945840。 6.    Ott, P. A. 等人 An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. 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本美國臨時申請包含至少一張彩色圖式。如果本美國臨時申請未來由於要求其優先權之非臨時申請或國際申請的公開發布而向公眾提供，則該局將根據要求以及在收取必要費用的前提下，提供帶有彩色圖式之該臨時申請的副本。 圖 1A-E顯示了在用於偵測 MHC-I 複合物之方法中使用如本文所述之可重複使用的試劑匣的概述。 圖 1A提供了 MHC-I 相關肽 (MAP) 內源性加工及呈遞富集工作流程的各個階段之概述，以及基於質譜之分析及定量。在典型呈遞中，細胞內蛋白質在細胞內被多泛素化且易位到蛋白酶體進行降解。所得之肽片段經由 TAP 蛋白轉運到內質網。然後將它們加載到 MHC-I 複合物 (由 MHC-I 重鏈及 B2M 組成) 中，藉由 ERAP 進一步修剪，且穩定的 MHC-I 肽複合物被易位到細胞表面。每個獨特肽之展示水平取決於其豐度、降解速率及對於給定細胞中 MHC-I 等位基因之親和力。富集包括將含有 MHC-I 複合物之裂解物施加到含有抗 MHC-I 抗體之固體支持物上，洗掉未結合之污染物，然後經由酸處理溶析 MHC-I 蛋白及相關肽。分析包括肽分離及脫鹽、層析分離及質譜分析，然後為涉及鑑定及定量步驟之資料處理。 圖 1B描繪了小容量及大容量試劑匣，且提供了小試劑匣及大試劑匣特性的表格，包括重組蛋白容量、細胞豐度及加載到定制抗體試劑匣上之量。 圖 1C描繪了使用標準的單次使用 AssayMAP™ 富集工作流程鑑定的獨特 MHC-I 肽，按物種及有效細胞計數進行分離。 圖 1D提供了抗體試劑匣再次使用方案及循環富集工作流程。蛋白質 A 試劑匣裝載有抗體並且經交聯，用於富集 MHC-I 複合物，且在酸溶析前進行洗滌。然後藉由用酸及 TBS 進行灌注清洗，在 4℃ 儲存，且以類似方式再次使用。 圖 1E顯示了在連續使用定制抗體試劑匣後，使用 GRANTA 裂解物，在始終濕性之試劑匣與乾燥然後再次潤濕之試劑匣上觀察到的獨特肽計數。 圖 2顯示了凝膠電泳，其比較使用重複使用的始終濕性試劑匣與乾燥並再次潤濕之試劑匣富集的分析物。左側泳道 1 至 3 顯示了經純化之 HLA 蛋白質標準品的滴定結果。Y 軸上之數字提供了分子量階梯帶之位置，單位為千道耳頓。泳道 4 至 6 顯示了從濕性儲存之試劑匣溶析出的 HLA 標準品之水平，而右側三個泳道 7 至 9 顯示了從乾燥儲存/再次潤濕之試劑匣溶析出的 HLA 之水平。每個泳道 4 至 9 中之相似水平表明，乾燥儲存及再次潤濕之試劑匣能夠偵測或富集標準蛋白質，類似於始終濕性儲存之試劑匣。 圖 3顯示了考馬斯電泳凝膠資料，用於創建校準曲線及在先前使用過的大容量抗體交聯試劑匣上估計重組 MHC-I 複合物之容量。 圖 4A-B顯示了交聯對從試劑匣中富集 MHC-I 分子的影響。 圖 4A描繪了在試劑匣上富集 MHC-I 分子後，重組 HLA 及 B2M 蛋白質 (MHC-I 分子之次單元) 以及樣品肽分子及識別 MHC-I 分子之抗體各自應在液相層析質譜 (LC-MS) 程序中溶析的時間。 圖 4B顯示了在 MHC-I 識別抗體與之交聯 (上圖) 或非交聯 (下圖) 之試劑匣上進行 MHC-I 富集後，LC-MS 運行結果的比較。結果表明，交聯對於 MHC-I 的富集沒有明顯影響 (比較「交聯」中之最大峰與正下方「非交聯」中之峰的大小。)  抗體峰 (「非交聯」中之最大峰) 在交聯溶析中不可見，表明抗體滯留。來自該管柱之第二次溶析 (溶析 2) 表明交聯亦不導致與試劑匣材料之另外的非特異性結合。 圖 5顯示了柱狀圖，其描繪基於在以下工作實施例中及該圖中柱下方描述的各種條件下滯留於旋轉過濾器頂部的體積對裂解物黏度進行之分析。在所述條件下 (500 µL 置於 0.45 µm Costar 過濾器上，且於 4℃ 以 16,000 g 旋轉 1 分鐘)，水及裂解緩衝液顯示沒有滯留體積 (陰性對照)，而於室溫放置一天的 MC38 裂解物 (50M 細胞/毫升 B 緩衝液，陽性對照) 顯示滯留超過 400 µL。新鮮 GRANTA 裂解物 (50M 細胞/毫升 B 緩衝液) 顯示沒有滯留，而在室溫 (典型的、未優化的加載條件) 放置 4 小時者顯示黏度顯著增加。將溫度降低至 4℃ 可以減少聚集，這種方式可以保持 18 小時以上。如果裂解物用 PBS、蔗糖 (1M 起始，200 mM 最終) 或甘油 (50% 甘油起始，10% 最終) 快速冷凍，然後解凍，則即使在室溫放置 4 小時後粘度仍很低 (然而室溫放置 24 小時導致黏度大幅增加)。將蔗糖及甘油保存相結合 (導致更稀的裂解物溶液) 使得凍融時不會立即出現明顯滯留，或在室溫放置 4 小時後無明顯滯留。 圖 6A-H顯示了若干文氏圖，其描繪同一批次之 GRANTA 裂解物的不同試劑匣富集之間的組成重疊 (參見實施例 2)。使用 TIC 訊號對每個資料集中之肽進行豐度加權 (因此豐度更高之肽對所計算之重疊的貢獻更大)，但未對豐度進行校正 (因此在計算中保持 LC-MS/MS 運行之間的不同訊號量)。數字代表在 MS/MS 運行中從包含 MHC-I 複合物之溶液中偵測到的獨特肽之數量。此處進行之比較包括「濕性」與「乾燥」試劑匣之間、相同類型的複製試劑匣之間、以及多次重複使用之間的比較。詳言之， 圖 6A將先前濕性儲存之試劑匣 (E1W1) 與乾燥儲存之試劑匣 (E1D1) 的第一次使用 (第一次溶析或 E1) 進行比較。 圖 6B及 圖 6C顯示了使用不同組之經濕性儲存與乾燥儲存之試劑匣 (W2/D2 與 W3/D3) 的類似比較。 圖 6D顯示了來自全部經乾燥儲存的相同類型之三種不同試劑匣 (D1、D2、D3) 的第一次溶析 (即第一次使用；E1) 之結果的重疊。 圖 6E顯示了來自經濕性儲存之三種不同試劑匣 (W1、W2 或W3) 的第二次溶析 (E2) 的重疊。 圖 6F 、 6G 及 6H顯示了對於三種不同的經乾燥儲存之試劑匣 (D1 ( 圖 6F)、D2 ( 圖 6G) 及 D3 ( 圖 6H)) 的第一次、第五次及第九次使用 (E1、E5 及 E9) 的比較。

Claims (37)

1. 一種偵測溶液中之分析物之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣包含：a)基質，b)附著於該基質的偵測分子，其中該等偵測分子與該分析物特異性結合，且其中該等偵測分子視情況與該基質交聯；及c)至少一種冷凍保護劑，其中該試劑匣可用於偵測溶液中之該分析物至少10、20、50或100次，且其中，每次使用之後，視情況用該冷凍保護劑將該基質於乾燥狀態儲存。
2. 如請求項1之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣為兩端開口管、一端開口管、孔、帶孔或不帶孔平盤、或能夠容納該基質之晶片。
3. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該基質包含含有二氧化矽或瓊脂糖的粒子，其中該等粒子視情況為磁性的。
4. 如請求項3之可重複使用試劑匣，其中該粒子為珠粒、顆粒、碎片或丸粒。
5. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該基質包含蛋白質A、蛋白質G及/或蛋白質L。
6. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該等偵測分子為抗體。
7. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該等偵測分子與該基質交聯。
8. 如請求項7之可重複使用試劑匣，其中該等偵測分子用選自選自庚二醯亞胺酸二甲酯(DMP)、氰酸酯、NHS酯、吖內酯、羰基二咪唑(CDI)、順丁烯二醯亞胺、碘乙醯基、吡啶二硫化物、醯肼或碳二亞胺的交聯劑與該基質交聯。
9. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中能夠藉由該基質上的該等偵測分子偵測的該分析物為蛋白質或肽。
10. 如請求項9之可重複使用試劑匣，其中該分析物為主要組織相容性複合物I(MHC-I)分子。
11. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少10次。
12. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其於該乾燥狀態儲存。
13. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣每次使用後於該乾燥狀態儲存後，可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少 10次。
14. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣每次使用後於該乾燥狀態儲存後，可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少20次。
15. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣每次使用後於該乾燥狀態儲存後，可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少50次。
16. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該試劑匣每次使用後於該乾燥狀態儲存後，可用於偵測細胞裂解物或生物流體中的蛋白質分析物至少100次。
17. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該基質以酸性pH儲存。
18. 如請求項12之可重複使用試劑匣，其中該基質於2至8℃儲存。
19. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該基質於濕性狀態儲存。
20. 如請求項19之可重複使用試劑匣，其中該基質以酸性pH儲存。
21. 如請求項19之可重複使用試劑匣，其中該基質於2至8℃儲存。
22. 如請求項1或2之可重複使用試劑匣，其中該冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)或二甲基亞碸(DMSO)中之一者或多者。
23. 一種製備先前使用過的如請求項1至22中任一項之試劑匣以供再次使用的方法，其包含：在從該試劑匣溶析分析物後，在1至10%乙酸、1%甲酸或1%三氟乙酸(TFA)中洗滌該基質，在包含冷凍保護劑的緩衝液中洗滌該基質，以及使該基質乾燥。
24. 如請求項23之方法，其中該冷凍保護劑包含蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)或二甲基亞碸(DMSO)中之一者或多者。
25. 如請求項23或24之方法，其中藉由加熱該試劑匣至至少30℃使該基質乾燥，之後於室溫儲存至少1小時。
26. 如請求項25之方法，其中藉由加熱該試劑匣至37℃使該基質乾燥，之後於室溫儲存至少1小時。
27. 如請求項23或24之方法，其中在使該基質乾燥後，將該試劑匣在2至8℃於乾燥狀態儲存直至再次使用。
28. 一種製備如請求項1至22中任一項之可重複使用試劑匣之方法，該方法包含：獲得包含基質之試劑匣，將該基質與偵測分子接觸，及將該等偵測分子與該基質交聯。
29. 一種偵測溶液中之分析物之方法，其包含：將如請求項1至22中任一項之可重複使用試劑匣之該基質與包含該分析物之溶液接觸，及視情況從該試劑匣溶析該分析物。
30. 如請求項29之方法，其中該分析物為肽或蛋白質。
31. 如請求項30之方法，其中該分析物為MHC-I分子。
32. 如請求項29至31中任一項之方法，其中該溶液為生物流體或細胞裂解物。
33. 如請求項32之方法，其中在與該基質接觸之前，將該溶液過濾或處理以去除細胞碎片及膜物質。
34. 如請求項29至31中任一項之方法，其中在將該試劑匣用於該方法之前，該試劑匣先前已用於偵測該分析物至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100次。
35. 如請求項29至31中任一項之方法，其中在溶析分析物之後，藉由如 請求項23至27中任一項之方法處理該試劑匣。
36. 一種套組，其包含至少一個如請求項1至22中任一項之可重複使用試劑匣。
37. 如請求項36之套組，其進一步包含：(a)至少一種緩衝液；(b)不含偵測分子或具有對照偵測分子的至少一個對照試劑匣；(c)用於製備該試劑匣以供儲存及再次使用的試劑；及/或(d)使用說明書。