TWI831715B - 雙層凝膠、製造方法以及培養幹細胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本揭示內容提供一種雙層凝膠，包含內層凝膠結構以及外層凝膠結構。內層凝膠結構由內層聚合物經由內層交聯物經離子性交聯而得。外層凝膠結構由外層單體經由外層交聯物經共價性交聯聚合而得，其中外層凝膠結構包覆內層凝膠結構。
Description
本揭示內容是有關於雙層凝膠及其製造方法與用途，尤其是關於將雙層凝膠用於培養幹細胞的用途。
凝膠具有釋放所承載內容物，並延遲釋放的特性，在藥物釋放領域被廣泛應用。然而，習知的凝膠存在著易於崩解，結構強度不足的限制，難以提供長期且穩定地的內容物釋放。
因此，如何能提供結構強度提升，釋放時間延長的凝膠，是待解決的問題。
本揭示內容中的一些實施方式中提供一種雙層凝膠，包含內層凝膠結構以及外層凝膠結構。內層凝膠結構由內層聚合物經由內層交聯物經離子性交聯而得。外層凝膠結構由外層單體經由外層交聯物經共價性交聯聚合而得，其中外層凝膠結構包覆內層凝膠結構。
在一些實施方式中，內層凝膠結構呈多個內層片狀結構，並且內層片狀結構彼此相連並且以多個內層孔洞相互間隔。外層凝膠結構呈多個外層片狀結構，並且外層片狀結構彼此相連並且以多個外層孔洞相互間隔，其中各外層孔洞的孔徑小於各內層孔洞的孔徑。
在一些實施方式中，內層聚合物包含第一內層聚合物與第二內層聚合物，內層凝膠結構呈現第一內層聚合物與第二內層聚合物的互穿結構。
在一些實施方式中，當第一內層聚合物為海藻酸鈉時，第二內層聚合物為羧甲基纖維素。
在一些實施方式中，當第一內層聚合物為聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物時，第二內層聚合物為帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物。
在一些實施方式中，內層聚合物以及內層交聯物之間帶有相反的電性。
在一些實施方式中，外層單體包含N,N-二甲基丙烯醯胺、丙烯醯胺或其組合。
在一些實施方式中，外層交聯物包含N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺。
本揭示內容中的一些實施方式中提供一種製造雙層凝膠的方法，包含：提供內層聚合物以及內層交聯物；混合內層聚合物以及內層交聯物，使得內層聚合物以及內層交聯物經由離子性交聯而獲得內層凝膠結構；提供外層單體以及外層交聯物；混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物，使得外層單體以及外層交聯物經由共價性交聯聚合而得外層凝膠結構，並且外層凝膠結構包覆內層凝膠結構，從而獲得雙層凝膠。
在一些實施方式中，混合內層聚合物以及內層交聯物的步驟，包含混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水。
在一些實施方式中，第一內層聚合物與第二內層聚合物的重量比為1:5至5:1。
在一些實施方式中，第一內層聚合物為海藻酸鈉，第二內層聚合物為羧甲基纖維素，以及內層交聯物為鈣離子。
在一些實施方式中，第一內層聚合物為聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物，第二內層聚合物為帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物，以及內層交聯物為鈣離子。
在一些實施方式中，混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水的步驟，更包含添加二新戊四醇六(3-硫醇基丙酸酯)、胎牛血清蛋白或其組合。
在一些實施方式中，混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物的步驟，包含混合內層凝膠結構、N,N-二甲基丙烯醯胺、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺以及催化劑，或是混合內層凝膠結構、丙烯醯胺、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺以及催化劑。
在一些實施方式中，混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物的步驟中，混合時間為0.5分鐘至5分鐘。
本揭示內容的一些實施方式提供一種前述的雙層凝膠用於培養幹細胞的方法，包含：提供幹細胞以及前述的雙層凝膠；混合幹細胞以及雙層凝膠，獲得凝膠化培養基；以及將培養液添加至凝膠化培養基上。
在一些實施方式中，幹細胞包含胚胎幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間質幹細胞、內皮幹細胞、神經幹細胞、嗅幹細胞、脂肪幹細胞或其組合。
為了使本發明的敘述更加詳盡與完備，下文詳細描述本發明之實施方式與具體實施例；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭示的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。
於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，於本文中所使用之「包含」、「包括」、「具有」及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其它的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。
於本文中，術語「約」意指給定量的值，在值的5%內變化(例如，值的±1%、±2%、±3%、±4%、5%)的。此等值僅僅係實例，且不旨在具有限制性。應理解，術語「約」可意指由熟習相關技術者鑒於本文的教導所解釋的給定量的值的百分比。
於本文中，若未特別說明，則「%」預設為重量百分比 (wt%)。
雖然下文中利用一系列的操作或步驟來說明在此揭露之方法，但是這些操作或步驟所示的順序不應被解釋為本發明的限制。例如，某些操作或步驟可以按不同順序進行及/或與其它步驟同時進行。此外，並非必須執行所有操作、步驟及/或特徵才能實現本發明的實施方式。再者，在此所述的每一個操作或步驟可以包含數個子步驟或動作。
本揭示內容的一些實施方式提供一種雙層凝膠，包含內層凝膠結構以及外層凝膠結構。內層凝膠結構由內層聚合物經由內層交聯物經離子性交聯而得。外層凝膠結構由外層單體經由外層交聯物經共價性交聯聚合而得，其中外層凝膠結構包覆內層凝膠結構。
雙層凝膠的內層凝膠結構為離子性交聯的結構，存在結構易受環境pH值影響，或是因吸水膨脹造成離子力減弱而崩解的限制。本揭示內容中共價性鍵結而成的外層凝膠結構，可以對於內層凝膠結構提供物理性支撐，避免內層凝膠結構結構不穩定的問題，提升雙層凝膠的結構強度。此外，外層凝膠結構還可作為阻障層，進一步延緩所承載內容物 (例如營養分子) 的釋放時間，降低突釋的現象，使得所承載的內容物可以穩定長效釋放。
在一些實施方式中，外層凝膠結構呈多孔膜狀覆蓋於內層凝膠結構上，以包裹內層凝膠結構，其中外層凝膠結構的厚度小於內層凝膠結構，外層凝膠結構以及內層凝膠結構之間存在凡得瓦力彼此吸引，但並未存在共價性鍵結。
在一些實施方式中，內層凝膠結構呈多個內層片狀結構，並且內層片狀結構彼此相連並且以多個內層孔洞相互間隔；以及外層凝膠結構呈多個外層片狀結構，並且外層片狀結構彼此相連並且以多個外層孔洞相互間隔，其中各外層孔洞的孔徑小於各內層孔洞的孔徑。經由內層凝膠結構與外層凝膠結構的孔徑差異，可以使得外層凝膠結構具有較好的結構強度，並且經由外層凝膠結構的小孔徑設計，賦予雙層凝膠較好的內容物緩釋效果。
在一些實施方式中，在橫剖面視圖中，各內層片狀結構 (或外層片狀結構) 呈弧形，內層片狀結構之間以凹面相對，從而定義出內層孔洞 (或外層孔洞)。在一些實施方式中，內層孔洞的孔徑表示位於內層孔洞的相對兩側的二內層片狀結構之間的最長垂直距離；外層孔洞的孔徑表示位於外層孔洞的相對兩側的二外層片狀結構之間的最長垂直距離。在一些實施方式中，內層孔洞的孔徑為250微米至1000微米，例如250微米、500微米、750微米、1000微米或前述區間中的數值。在一些實施方式中，外層孔洞的孔徑為50微米至500微米，例如50微米、100微米、150微米、200微米、250微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米或前述區間中的數值。孔徑過大，則結構不穩定，內容物釋放速率過快，無法實現緩釋；孔徑過小，將過度阻隔所承載內容物，難以實現穩定長效的內容物釋放。
在一些實施方式中，外層凝膠結構的厚度為25微米至1000微米之間，例如25微米、50微米、100微米、200微米、300微米、400微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、1000微米或前述區間中的數值，厚度過厚則所承載內容物釋放率過慢，厚度過薄則所承載內容物釋放率過快且結構強度不足。可以理解的是，隨著厚度增加，可以延遲內容物 (例如脂溶性小分子 (分子量小於500克/莫耳，在非極性溶劑中的溶解度大於0.1微克/1克) 或是大分子蛋白質 (分子量至少大於500克/莫耳) 的釋放。
在一些實施方式中，內層聚合物包含第一內層聚合物與第二內層聚合物，內層凝膠結構呈現第一內層聚合物與第二內層聚合物的互穿結構 (也就是，第一內層聚合物與第二內層聚合物的聚合物鏈彼此交錯)，經由互穿結構的設計，可提供較好的支撐性，穩定內層凝膠結構的結構強度。
在一些實施方式中，內層聚合物以及內層交聯物之間帶有相反的電性，例如內層聚合物帶有負電，內層交聯物帶有正電，內層交聯物與內層聚合物經由正電以及負電之間所形成的離子性鍵結交聯，形成內層凝膠結構；或是內層聚合物帶有正電，而內層交聯物帶有負電。當內層聚合物於不同pH值具有不同的解離度時，經由離子性鍵結交聯而成的內層凝膠結構，具有pH值敏感性，會因pH值的改變，改變離子鍵結的強弱，從而改變內層凝膠結構。
在一些實施方式中，當第一內層聚合物為海藻酸鈉 (sodium alginate；SA) 時，第二內層聚合物為羧甲基纖維素 (carboxymethyl cellulose；CMC)。選用海藻酸鈉與羧甲基纖維素，具有易於保存與製備、安全無毒、常溫可成膠、人體易於吸收等優勢。此外，相較於僅使用海藻酸鈉，海藻酸鈉與羧甲基纖維素的搭配，可以提升內層凝膠結構的黏度以及結構強度，並經由調整海藻酸鈉與羧甲基纖維素的配比，調整內層孔洞的孔徑，為內層凝膠結構的選擇，提供更好的彈性。此外，當選用海藻酸鈉與羧甲基纖維素時，由於海藻酸鈉與羧甲基纖維素具有羧基，在酸性環境中不易游離，因此，內層凝膠結構所形成的內層凝膠結構較為緻密，鹼性環境則游離性較佳，因此，內層凝膠結構較為鬆散。
在一些實施方式中，當內層凝膠結構的重量百分比以100%來計，海藻酸鈉的重量百分比為0.1%至5%，例如0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%、2.5%、2.75%、3%、3.25%、3.5%、3.75%、4%、4.25%、4.5%、4.75%、5%、或前述區間中的數值。羧甲基纖維素的重量百分比為0.1%至5%，例如0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%、2.5%、2.75%、3%、3.25%、3.5%、3.75%、4%、4.25%、4.5%、4.75%、5%、或前述區間中的數值。兩者均過高時，則內層凝膠結構過於緻密，內層凝膠結構釋放效率受限，兩者均過低時，膠體結構鬆散不穩定，或是無法成膠。此外，隨著海藻酸鈉的重量百分比提升以及羧甲基纖維素的重量百分比下降，內層孔洞的孔徑將會增加，提升內層凝膠結構的吸水時的膨脹率以及內容物釋放效率；反之，隨著海藻酸鈉的重量百分比下降以及羧甲基纖維素的重量百分比提升，內層孔洞的孔徑將會縮小，降低內層凝膠結構的膨脹率以及釋放效率 (例如降低大分子蛋白質的釋放)。
在一些實施方式中，當第一內層聚合物為聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物時，第二內層聚合物為帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物。在一實施方式中，聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物包括聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的ABA型三區塊共聚物 (Tri-PCG)，以及醯基為丙烯酸酯基，因此，帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物為帶有丙烯酸酯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物 (Tri-PCG-acryl)。值得強調的是，選用Tri-PCG與Tri-PCG-acryl的內層凝膠結構，可以在人體適用溫度區間中，根據溫度的變化改變膠體性質 (例如25°C至37°C，自溶液轉變為膠體)，從而改變內層凝膠結構的黏性以及釋放能力，並且結構較為穩定不易崩解。在一些實施方式中，雙層凝膠更包含存在於內層凝膠結構之中的內層輔助分子 (例如二新戊四醇六(3-硫醇基丙酸酯)(dipentaerythritolhexakis(3-mercaptopropionate)；DPMP)，隨著溫度逐步提升，DPMP可以與Tri-PCG-acryl形成共價性結構，強化膠體性質，提升內層凝膠結構的溫度敏感性。
在一些實施方式中，當內層凝膠結構的重量百分比以100%來計，Tri-PCG以及Tri-PCG-acryl的總和的重量百分比為15%至30%，例如15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、或前述區間中的數值。重量百分比過高時，則內層凝膠結構過於緻密，內層凝膠結構釋放效率受限，重量百分比過低時，膠體結構鬆散不穩定，或是無法成膠。
在一些實施方式中，內層聚合物帶有負電時，內層交聯物包含鈣離子 (Ca
2+)，可與內層聚合物交聯。相對於其他內層交聯物，鈣離子具有易於取得、成本低、以及對環境危害較低等優勢。
在一些實施方式中，外層單體包含N,N-二甲基丙烯醯胺 (N,N-dimethylacrylamide；DMAA)、丙烯醯胺 (acrylamide；AA) 或其組合。相對於AA，當選用DMAA時，所形成的外層凝膠結構的外層孔洞的孔徑較大，所承載的內容物的釋放率較高 (例如提升大分子蛋白質的釋放率)，並且使得雙層凝膠在吸水時，具有較大的膨脹率。
在一些實施方式中，外層交聯物包含N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺(N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide (BIS))，可以與DMAA或是AA形成共價性鍵結，從而將DMAA交聯為聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(poly(N,N-dimethylacrylamide；PDMA)，或是將AA交聯為聚(丙烯酰胺)(poly (acrylamide；PAA)。
本揭示內容的一些實施方式提供一種製造雙層凝膠的方法，包含：提供內層聚合物以及內層交聯物；混合內層聚合物以及內層交聯物，使得內層聚合物以及內層交聯物經由離子性交聯而獲得內層凝膠結構；提供外層單體以及外層交聯物；混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物，使得外層單體以及外層交聯物經由共價性交聯聚合而得外層凝膠結構，並且外層凝膠結構包覆內層凝膠結構，從而獲得雙層凝膠。經由混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物，可以形成包覆內層凝膠結構的外層凝膠結構，外層凝膠結構可以對於內層凝膠結構提供物理性支撐，提升雙層凝膠的結構強度，並且延緩所承載內容物的釋放時間，實現穩定長效釋放。
在一些實施方式中，提供內層聚合物以及內層交聯物的步驟，包括提供第一內層聚合物、第二內層聚合物以及內層交聯物。
在一些實施方式中，第一內層聚合物為海藻酸鈉 (SA)，第二內層聚合物為羧甲基纖維素 (CMC)，具有易於保存與製備、安全無毒、常溫可成膠、人體易於吸收等優勢。
在一些實施方式中，第一內層聚合物為聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物時，第二內層聚合物為帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物。在一實施方式中，聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物包括聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的ABA型三區塊共聚物 (Tri-PCG)，帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物為帶有丙烯酸酯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物 (Tri-PCG-acryl)。Tri-PCG與Tri-PCG-acryl所製成的內層凝膠結構較為緻密，並且可以在人體適用溫度區間中，根據溫度的變化改變膠體性質 (例如25°C至37°C，自溶液轉變為膠體)，從而改變內層凝膠結構的黏性以及釋放能力，並且結構較為穩定不易崩解。
在一些實施方式中，內層聚合物以及內層交聯物之間帶有相反的電性。在一些實施方式中，內層聚合物帶有負電時，內層交聯物包含鈣離子。
在一些實施方式中，混合內層聚合物以及內層交聯物的步驟，包含混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水。經由在此步驟添加自由基產生劑，可以使得保存於內層凝膠結構的自由基產生劑，在後續添加外層單體、外層交聯物以及催化劑時擴散至外層，與外層單體、外層交聯物以及催化劑作用，從而在外層引發形成外層凝膠結構的反應。因此，在此步驟添加自由基產生劑，可以避免自由基產生劑與外層單體、外層交聯物以及催化劑共添加時的過早反應，或是外層凝膠結構未良好包覆內層凝膠結構的狀況。
在一些實施方式中，第一內層聚合物與第二內層聚合物的重量比為1:5至5:1，例如1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、或前述區間中的數值。相對於酸性環境，在鹼性環境中第一內層聚合物帶有較多可游離的負電基團 (例如羧基) 時，則隨著重量比提升，則內層凝膠結構的膨脹率較高。
在一些實施方式中，混合內層聚合物以及內層交聯物的步驟，包含混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水。
在一些實施方式中，當第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水的總和的重量百分比為100%，海藻酸鈉的重量百分比為0.1%至5%，以及羧甲基纖維素的重量百分比為0.1%至5%。重量百分比過高時，則內層凝膠結構過於緻密，內層凝膠結構釋放效率受限，重量百分比過低時，膠體結構鬆散不穩定，或是無法成膠。
在一些實施方式中，在一些實施方式中，當第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水的總和的重量百比為100%，聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物以及帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物的總和的重量百分比為15%至30%。重量百分比過高時，則內層凝膠結構過於緻密，內層凝膠結構釋放效率受限，重量百分比過低時，膠體結構鬆散不穩定，或是無法成膠。
在一些實施方式中，混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水的步驟，更包含添加二新戊四醇六(3-硫醇基丙酸酯)、胎牛血清蛋白或其組合。在一些實施方式中，混合第一內層聚合物、第二內層聚合物、內層交聯物、自由基產生劑以及水的步驟，包含混合第一溶液、第二溶液、鈣離子以及硫酸銨，其中第一溶液包含聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物，或是聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物以及二新戊四醇六(3-硫醇基丙酸酯)(DPMP)，以及第二溶液包含帶有醯基的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)共聚物的衍生物以及胎牛血清蛋白。
可以理解的是，由於隨著溫度提升，DPMP傾向與醯基形成共價性鍵結，從而提升內層凝膠結構的緻密度，因此，經由添加DPMP，可以在溫度提升時，提升內層凝膠結構的緩釋能力，有利於運用於人體。在一些實施方式中，當第一溶液的重量百分比以100%來計，DPMP的重量百分比為5%至15%，例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%或前述區間中的數值。此外，經由添加胎牛血清蛋白，可以使得胎牛血清蛋白被包覆於雙層凝膠中，當將雙層凝膠用於細胞培養時，胎牛血清蛋白可以持續釋放，長效性地提供細胞營養源。
在一些實施方式中，混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物的步驟，包含混合內層凝膠結構、N,N-二甲基丙烯醯胺 (DMAA)、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺 (BIS) 以及催化劑，或是混合內層凝膠結構、丙烯醯胺 (AA)、N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺以及催化劑。經由BIS與DMAA或是AA形成共價性的外層凝膠結構，可以提升內層凝膠結構物理性支撐，並形成相較於內層凝膠結構，更為緻密的孔洞，延長所承載內容物的釋放。
在一些實施方式中，當內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物的重量百分比的總和為100%時，內層凝膠結構的重量百分比為50%至80% (例如50%、60%、70%、80%或前述區間中的數值)，外層單體的重量百分比為15%至40% (例如15%、20%、25%、30%、35%、40%或前述區間中的數值)，以及外層交聯物的重量百分比為5%至10% (例如5%、6%、7%、8%、9%、10%或前述區間中的數值)。內層凝膠結構或是外層凝膠結構的重量百分比過低，則不易形成雙層凝膠。內層凝膠結構或是外層凝膠結構的重量百分比過高，則雙層凝膠所承載內容物的釋放率過低。
在一些實施方式中，內層凝膠結構與外層單體的重量比為5:4至16:3 (例如5:4、5:3、2:1、8:3、10:3、4:1、16:3、16:3或前述區間中的數值)。重量比過高，則雙層凝膠的結構不穩定；重量比過低，則雙層凝膠的外層過厚，所承載內容物的釋放率過低。
在一些實施方式中，混合內層凝膠結構、外層單體以及外層交聯物的步驟中，混合時間為0.5分鐘至5分鐘，例如0.5分鐘、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、或前述區間中的數值。經由控制混合時間，可以控制外層凝膠結構的厚度，從而控制雙層凝膠的結構強度以及釋放率。
本揭示內容的一些實施方式還提供一種前述的雙層凝膠用於培養幹細胞的方法，包含：提供幹細胞以及前述的雙層凝膠；混合幹細胞以及雙層凝膠，獲得凝膠化培養基；以及將培養液添加至凝膠化培養基上。雙層凝膠具有較佳結構穩定性，以及延長所承載內容物釋放時間的特性，因此，當使用雙層凝膠培養幹細胞，可以維持較長的時間才崩解，提升單位面積中的幹細胞培養量，以及避免內容物突釋，可以持續性將內容物釋放至幹細胞，從而延長幹細胞培養時間以及添加營養成分的次數，簡化培養流程。
在一些實施方式中，幹細胞包含胚胎幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間質幹細胞、內皮幹細胞、神經幹細胞、嗅幹細胞、脂肪幹細胞或其組合。
可以理解的是，根據幹細胞的不同特性，可以選用具有不同結構強度以及釋放率的雙層凝膠。舉例而言，當培養生長速度較快的脂肪幹細胞時，可以選用內層孔洞孔徑較大的海藻酸鈉以及羧甲基纖維素，當培養生長速度較慢的神經幹細胞時，可以選用內層孔洞孔徑較小的Tri-PCG以及Tri-PCG-acryl。
為進一步說明本揭示內容之各種實施方式所提供之雙層凝膠、製造雙層凝膠的方法以及培養幹細胞的方法，遂進行以下實施。應注意的是，下述實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。
實施例1、雙層凝膠的製造方法
1. 內層凝膠結構
以下提供不同的內層聚合物所對應的製程。
1.1、海藻酸鈉以及羧甲基纖維素
將海藻酸鈉 (SA) 與羧甲基纖維素 (CMC) 分別以不同重量比 (SA:CMC=4:1、2:3、3:2、1:4) 混合後，倒入含有1.5%過硫酸銨 (ammonium persulfate；APS) 的5%氯化鈣水溶液 (calcium chloride；CaCl
2) 中形成混合溶液，攪拌20分鐘，使SA以及CMC經由鈣離子進行交聯，形成多組具有不同SA以及CMC濃度的內層凝膠結構，獲得內層水凝膠。各組的SA與CMC分別為2.0%/0.5%、1.0%/1.5%、1.5%/1.0%、0.5%/2.0%，APS的反應濃度為1%，鈣離子的反應濃度為4%。
可以理解的是，在形成混合溶液的過程中 (不限於使用海藻酸鈉以及羧甲基纖維素作為內層聚合物的示例)，可以依後續的幹細胞培養需求，添加培養液，或是添加營養成分 (例如生長因子) 至混合溶液中，並使營養成分的終濃度落在5毫克/毫升至10毫克/毫升，以供後續臨床上的應用。
1.2 聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的ABA型三區塊共聚物 (Tri-PCG) 以及帶有丙烯酸酯基的Tri-PCG衍生物 (或稱Tri-PCG-acryl)
1.2.1、Tri-PCG的製備
將聚乙二醇(poly(ethylene glycol)；PEG)(15.0克，10毫莫耳) 置於120°C下減壓乾燥3小時。將ε-己內酯 (ε-caprolactone)(33.3克，291毫莫耳)、乙醇酸 (glycolide)(5.87克，50.6毫莫耳)和作為催化劑的二乙基己酸錫 (tin 2-ethylhexanoate；Sn(Oct)2)(149毫克，367微莫耳) 添加到含有PEG的燒瓶中，獲得反應液。
接著，液態氮冷凍反應液，並減壓乾燥，獲得反應物。隨後，將含有反應物的燒瓶浸入160°C油浴中反應12小時，以進行開環聚合反應。接著，將反應物溶解在100毫升的氯仿 (chloroform) 中，並使用1000毫升的二乙醚 (diethyl ether) 沉澱，重複3次溶解步驟以及沉澱步驟。接著，去除上清液，再將沉澱經由減壓乾燥處理，獲得白色固體，即為Tri-PCG。
1.2.2、Tri-PCG-acryl的製備
將丙烯酸 (acrylic acid)(2.0毫升，29.2毫莫耳) 溶解在250毫升二氯甲烷 (dichloromethane；CH
2Cl
2) 中，獲得丙烯酸溶液；以及將N,N'-二環己基碳二亞胺 (N,N’-dicyclohexyl carbodiimide；DCC)(6.24克，30.2毫莫耳) 溶解在250毫升二氯甲烷中，獲得N,N'-二環己基碳二亞胺溶液。接著，在冰浴中，將N,N'-二環己基碳二亞胺溶液加入丙烯酸溶液中攪拌1小時，其中N,N'-二環己基碳二亞胺溶液與丙烯酸溶液的體積比為1:1。接著，將溶解在250毫升二氯甲烷的Tri-PCG (20.3克，5.1毫莫耳) 和4-二甲氨基吡啶 (4-dimethylaminopyridine；DMAP) (299.5毫克，2.5毫莫耳) 添加到含有丙烯酸和N,N'-二環己基碳二亞胺的混合溶液中，並在 25°C下攪拌24小時。隨後，過濾除去副產物二環己基脲 (dicyclohexylurea)。待二氯甲烷蒸發後，以氯仿(chloroform) 為良溶劑 (對溶質具有較強溶解能力，與高分子溶質的相互作用參數小於 0.5的溶劑)，使得高分子長鏈在溶液中呈舒展狀態，正己烷 (n-hexane) 和乙醇 (ethanol) 的混合物 (正己烷與乙醇的體積比值為8/2) 為不良溶劑 (對溶質具有較弱溶解能力，與高分子溶質的相互作用參數接近或大於0.5的溶劑)，進行3次再沉澱。接著，經由減壓乾燥，獲得呈黃白色固體的Tri-PCG-acryl。
1.2.3、Tri-PCG水溶液、Tri-PCG-acryl水溶液以及Tri-PCG/DPMP水溶液的製備
針對Tri-PCG水溶液：首先，將 Tri-PCG (246.5毫克) 溶解在含有 10%胎牛血清的脂肪幹細胞培養液 (986微升，產品名：StemPro™ MSC SFM，產品編號：Gibco™ A1033201) 中。經浸泡於約90°C的水浴中5秒後，持續攪拌並於室溫冷卻，重複浸泡以及冷卻的步驟三次。接著，在水浴條件 (20°C至25°C) 中冷卻，並進行超聲波處理30分鐘去除氣泡，以及使用氫氧化鈉以及脂肪幹細胞培養液，將pH值調至7.4，獲得20%的Tri-PCG水溶液 (可根據膠體需求，與後續的Tri-PCG/DPMP水溶液替換)。
針對Tri-PCG-acryl水溶液：將 Tri-PCG-acryl (165毫克) 溶解在含有 10%胎牛血清的脂肪幹細胞培養液 (660微升) 中，4°C攪拌隔夜。接著，在低溫條件(20°C至25°C)中進行超聲波處理30分鐘去除氣泡，以及使用氫氧化鈉以及脂肪幹細胞培養液，將pH值調至7.4，獲得20%的Tri-PCG-acryl水溶液。
針對Tri-PCG/DPMP水溶液：將二新戊四醇六(3-硫醇基丙酸酯)(dipentaerythritolhexakis(3-mercaptopropionate)；DPMP)(90.4毫克) 溶解在1毫升丙酮後，獲得DPMP溶液。將DPMP溶液添加至含有750毫克Tri-PCG的樣品管中，補入7毫升丙酮後，獲得混合溶液。將混合溶液加入63毫升的水中，攪拌並經超聲波處理30分鐘，接著，除去丙酮並冷凍乾燥，獲得Tri-PCG/DPMP混合物 (DPMP於Tri-PCG/DPMP混合物中約佔10.8%)。
接著，將Tri-PCG/DPMP混合物溶解在含有10%胎牛血清的脂肪幹細胞培養液 (354微升) 中。經浸泡於約90°C的水浴中5秒後，持續攪拌並於室溫冷卻，重複浸泡以及冷卻的步驟三次。接著，在低溫條件 (20°C至25°C) 中進行超聲波處理30分鐘去除氣泡，以及使用氫氧化鈉以及脂肪幹細胞培養液，將pH值調至7.4，獲得20%的Tri-PCG/DPMP水溶液。
1.2.4、內層水凝膠的製備
將Tri-PCG/DPMP水溶液與Tri-PCG-acryl水溶液以適當比例混合後，倒入含有1.5%過硫酸銨 (ammonium persulfate；APS) 的5%氯化鈣水溶液 (calcium chloride；CaCl
2) 中形成混合溶液，攪拌20分鐘，使Tri-PCG以及Tri-PCG-acryl經由鈣離子進行交聯形成內層凝膠結構，獲得內層水凝膠，其中Tri-PCG/DPMP與Tri-PCG-acryl的反應濃度分別為70%至79%以及16%至25%，APS的反應濃度為1%，鈣離子的反應濃度為4%，內層凝膠結構Tri-PCG以及Tri-PCG-acryl的重量百分比的總和為16%至33%，以確保內層水凝膠在作用溫度範圍中呈膠體狀態。
可以了解的是，隨著溫度提升，Tri-PCG與Tri-PCG-acryl，或DPMP與Tri-PCG-acryl的丙烯酸酯基可產生共價鍵結，從而改變凝膠型態，因此，使用 Tri-PCG-acryl以及Tri-PCG/DPMP，或是使用與Tri-PCG-acryl以及Tri-PCG所製備而得的內膜凝膠結構，具有溫度敏感性。
例如請參第1圖，為Tri-PCG在不同濃度與溫度的凝膠狀態變化圖 (此示例中的Tri-PCG保存於磷酸鹽緩衝生理鹽水 (phosphate buffered saline；PBS) 中)，呈現出經由調整Tri-PCG濃度 (例如對應本實施例中的Tri-PCG/DPMP以及Tri-PCG-acryl的濃度總和) 或是溫度，改變凝膠狀態，以及根據凝膠狀態的改變，調整凝膠的黏滯度與釋放能力。
在其他示例中，也可以使用Tri-PCG水溶液取代Tri-PCG/DPMP水溶液，與Tri-PCG-acryl混合。可以了解的是，相對於Tri-PCG水溶液，由於Tri-PCG/DPMP水溶液存在可升溫時可與Tri-PCG-acryl產生共價性鍵結的DPMP，因此，使用Tri-PCG/DPMP水溶液所製備而得的內膜凝膠結構，具有較好的溫度敏感性。
可以理解的是，「1.1、海藻酸鈉以及羧甲基纖維素」所製備而得的內層凝膠結構與「1.2 聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的ABA型三區塊共聚物 (Tri-PCG) 以及帶有丙烯酸酯基的Tri-PCG衍生物 (或稱Tri-PCG-acryl)」所製備而得的內層凝膠結構，差異在於，使用Tri-PCG/DPMP與Tri-PCG-acryl的內層凝膠結構較為穩定不易崩解，但製備過程較為複雜且需使用有機溶劑。至於使用SA以及CMC的內層凝膠結構，則具有製備過程較為簡便，且環境友善度較高的優勢，但存在結構亦受pH值影響的限制。
因此，可以根據後續所欲培養的幹細胞生長特性，選用合適的成分製備內層凝膠結構，例如選用易於製備的SA與CMC，培養生長速度較快的脂肪幹細胞，選用結構強度較強的Tri-PCG/DPMP與Tri-PCG-acryl，培養生長速度較慢的神經幹細胞。
2. 外層凝膠結構以及雙層凝膠
接著，混合作為外層單體的N,N-二甲基丙烯醯胺 (DMAA) 或丙烯醯胺 (AA)、作為外層交聯物的N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺 (BIS)、作為催化劑的四甲基乙二胺(tetra-methylethylenediamine(TEMED)) 之後，加入先前製備的內層水凝膠 (此處選用「1.1、海藻酸鈉以及羧甲基纖維素」所獲得的內層水凝膠) 混合不同時間，使得DMAA或AA與BIS交聯形成聚(N，N-二甲基丙烯酰胺)(PDMA)或聚(丙烯酰胺)(PAA)，獲得具有不同外層凝膠結構厚度或不同外層成分的雙層凝膠，其中DMAA或AA的反應濃度為1莫耳/公升，BIS的反應濃度為2.2莫耳/公升、TEMED的反應濃度為15毫克/毫升。
具體而言，混合過程中內層水凝膠中的APS擴散至外部，提供自由基引發形成外層凝膠結構的反應。外層單體經由APS的自由基、TEMED的催化，與BIS共價性鍵結為PDMA或PAA，形成外層凝膠結構。
最後，通過攪拌以及水洗滌，除去未反應的外層單體。
實施例2、使用雙層凝膠培養幹細胞的方法
首先，將含有1x10
7顆/毫升的脂肪幹細胞的脂肪幹細胞懸浮液 (即，脂肪幹細胞懸浮於脂肪幹細胞培養液) 和雙層凝膠，以體積比1:1的方式混合為幹細胞混合凝膠，在37°C靜置30分鐘，提升凝膠化程度。
接著，將400微升的脂肪幹細胞培養液滴於幹細胞混合凝膠表面之後，放置於37°C、含有5%二氧化碳的環境中培養，每隔2天，取出200微升的脂肪幹細胞培養液 (上清液)，更換為新鮮的脂肪幹細胞培養液。培養至雙層凝膠破裂後，使用PBS收集脂肪幹細胞並移除其他培養成分。
可以了解的是，經由外層凝膠結構的設置，可以對於內層凝膠結構提供物理性的穩定度，防止內層凝膠結構吸水膨脹破裂或是鹼性時結構崩解，同時避免營養成分過度釋放以及外漏，維持營養成分穩定釋放。
實施例3、功效性測試
首先，根據前述實施例1的方法製備雙層凝膠，並調整特定成分、重量百分比以及外層凝膠結構的形成時間(即，「2. 外層凝膠結構以及雙層凝膠」中的混合時間)，比較不同雙層凝膠之間的結構特性與內容物釋放效率差異，各組條件例示如下：
表1、測試組別的條件
| 組別 | 內層 (wt%) | 外層 | 外層 交聯時間 (分鐘) | |
| SA | CMC | |||
| SA-CMC@PDMA-1 | 1.5 | 1 | PDMA | 1 |
| SA-CMC@PDMA-2 | 0.5 | 2 | PDMA | 1 |
| SA-CMC@PDMA-3 | 0.5 | 2 | PDMA | 3 |
| SA-CMC@PAA-1 | 1.5 | 1 | PAA | 1 |
1.電子顯微鏡中的凝膠型態
首先，經由掃描式電子顯微鏡，以不同放大倍率觀察各組的雙層凝膠，結果請參第2圖，其中最上排的a至c為SA-CMC@PDMA-1組別，第二排的d至f為SA-CMC@PDMA-3組別，最下排的g至i為SA-CMC@PAA-1組別。
第2圖可見，雙層凝膠的內層以及外層均呈彼此相連的片狀結構，並以三維孔洞相互間隔，內層以及外層之間呈現明顯的邊界。此外，內層凝膠結構以及外層凝膠結構之間呈現不同的孔洞大小，外層凝膠結構的孔徑小於內層凝膠結構的孔徑。
此外，對比第c圖(SA-CMC@PDMA-1組別)以及第f圖(SA-CMC@PDMA-3組別)，可以發現，當外層交聯時間從1分鐘增加到3分鐘時，外層凝膠結構的厚度從約100微米，增加到約450微米。
此外，對比第b圖(SA-CMC@PDMA-1組別)以及第e圖(SA-CMC@PDMA-3組別)，可以發現，隨著SA濃度降低，內層以及外層的孔洞孔徑發現顯著改變，SA比例越高，內層孔洞的孔徑較大。
根據第2圖，可以了解到，雙層凝膠具有雙層骨架結構，內層凝膠結構的孔洞孔徑較大，有利於吸附營養成分，外層凝膠結構較為緻密，可提供內層凝膠結構物理性的支撐，避免內層凝膠結構的崩解，以及避免營養成分過度釋放。因此，雙層凝膠可提供幹細胞3維生長的支架並長效保留營養成分，提升幹細胞的培養數量以及延長可持續培養的時間，以下將進一步驗證相關功效。
2.吸水膨脹性
為偵測單獨內層凝膠結構 (單層凝膠) 以及雙層凝膠的吸水膨脹性，將內層凝膠結構 (四組，各組的SA濃度以及CMC濃度分別為0.5% SA/2.0% CMC、1.0% SA/1.5% CMC、1.5% SA/1.0% CMC、2.0% SA/0.5% CMC) 以及雙層凝膠 (SA-CMC@PDMA-1組別、SA-CMC@PDMA-2組別、SA-CMC@PDMA-3組別、SA-CMC@PAA-1組別) 自然風乾，稱取適量的風乾後內層凝膠結構以及風乾後雙層凝膠 (後稱樣品)，進行膨脹性測試，流程如下。
首先，將樣品置於pH值為1.2的酸性溶液(0.5M的氫氯酸)中2小時，接著，轉換至pH值為7.4的鹼性溶液(1M的三羥甲基胺基甲烷)，直至重量達到平衡或下降 (表示開始溶解)，過程中，每30分鐘將樣品自溶液中取出，並去除殘餘溶液後秤重，使用以下公式計算各時間點的膨脹率SR (swelling ratio)。
SR=[(m0-mt)/m0]
SR是雙層凝膠的膨脹率，mt是雙層凝膠在時間點t的質量 (溶脹狀態)，m0是水凝膠的初始質量。
根據前述測試所得的內層凝膠結構膨脹率趨勢請參第3A圖，雙層凝膠膨脹率趨勢請參第3B圖。
第3A圖呈現不同內層凝膠結構的吸水膨脹特性。四種內層凝膠結構在酸性環境中的膨脹率較低，原因在於，SA和CMC中存在較多的羧基 (-COOH)，但在酸性溶液中，羧基較不游離，聚合物之間的靜電排斥力較低，凝膠網絡結構緻密，SA和CMC的親水性下降。因此，相較於鹼性溶液，在酸性溶液中，內層凝膠結構 (單層凝膠) 膨脹率較低。此外，還可可以觀察到，在酸性溶液中，隨著CMC濃度的降低，膨脹率亦隨之降低。
相對而言，在鹼性環境中，膨脹率隨時間增加，逐步增加後再降低。具體而言，羧基呈游離態 (COO
-)，羧基之間形成靜電排斥力，並隨時間增加，斥力逐漸增加，使得單層凝膠膨脹並擴大網絡間隙，結構改變，親水性增加，吸收水分子，從而提高膨脹率。作用後期，隨著結構改變，羧基和鈣離子形成的離子性交聯漸趨不穩定，羧基濃度降低，進而導致羧基與鈣離子的交聯反應更弱，導致單層凝膠逐步崩解。
第3B圖呈現具有不同凝膠結構的雙層凝膠的吸水膨脹特性。相較於第3A圖的單層凝膠 (僅內層凝膠結構)的吸水膨脹時間 (吸水直至崩解的時間) 為4.5小時)，第3B圖呈現雙層凝膠的吸水膨脹時間明顯地延長為12小時，並且總體的膨脹率高於單層凝膠。也就是，雙層凝膠的內層凝膠結構雖然對於pH值具有敏感性，但外層凝膠結構則較無pH值敏感性，因此，即使在鹼性環境，外層凝膠結構可以維持凝膠結構完整，不易崩解。
此外，比較SA-CMC@PDMA-2組別 (外層交聯時間2小時) 與SA-CMC@PDMA-3組別 (外層交聯時間3小時)，可以發現，經由提升外層交聯時間，以增加外層凝膠結構的厚度，可以延遲凝膠的崩解。
比較SA-CMC@PDMA-1組別 (1.5% SA/1.0% CMC) 與SA-CMC@PDMA-2組別 (0.5% SA/2.0% CMC)，可以發現，降低SA濃度的組別，在4小時之後，膨脹率較低。因此，在鹼性環境中，可以經由降低SA濃度，作為延長營養成分釋放時間的手段。
最後，比較SACMC@PDMA-1組別 (PDMA) 與SA-CMC@PAA-1組別 (PAA)，可以發現，相較於PAA，以PDMA作為外層凝膠結構，呈現更高的膨脹率，具有更好的吸水膨脹能力。
3. 內容物釋放行為
3.1、測試方法
為了測試各組雙層凝膠的內容物釋放行為，根據以下流程，執行內容物釋放測試。
首先，選擇具有不同分子量和溶解度特性的三種內容物，分別與不同組別的雙層凝膠混合，使得雙層凝膠承載各內容物，其中內容物分別選用維他命A酸 (tretinoin；TR) 代表脂溶性成分、青黴素 (ampicillin；AM) 代表水溶性成分、以及牛血清蛋白 (bovine serum；BS) 代表幹細胞培養液的成分，維他命A酸於雙層凝膠的濃度為0.5毫克/公升、青黴素於雙層凝膠的濃度為100毫克/毫升、以及牛血清蛋白於雙層凝膠的重量百分比為5%。將載有內容物的雙層凝膠浸入pH值為1.2的酸性溶液中2小時，並於36.5°C±0.5°C轉移至pH值為7.4的弱鹼性溶液。接著，將雙層凝膠秤重後，浸入100毫升的PBS，在溫度36.5°C±0.5°C的條件中，以適當轉速旋轉震盪，每隔一段時間，抽取定量的PBS，使用紫外光分光光度計，測定內容物濃度 (TR測定波長350奈米、AM測定波長463奈米、BS測定波長595奈米)，並補入等量的PBS。接著，根據以下公式，測定雙層凝膠的累積內容物釋放率Qn，並將結果整理於第4A圖至第6B圖。
Qn(%)=(V0Cn+VC(n-1))/(W)x100
Cn和C(n-1)為n次和n-1次採樣的內容物濃度，V0是PBS的初始體積，V是取樣體積，W是雙層凝膠中裝載的內容物重量。
3.2、結果分析
為便於理解雙層凝膠中的成分、重量百分比以及外層交聯時間對於內容物釋放行為的影響，後續將以第4A圖 (SA-CMC@PDMA-2) 與第4B圖 (SA-CMC@PDMA-3)、第5A圖 (SA-CMC@PDMA-1) 與第5B圖 (SA-CMC@PDMA-2)、以及第6A圖 (SA-CMC@PDMA-1) 與第6B圖 (SA-CMC@PAA-1) 相互對比的方式進行論述。
3.2.1、外層厚度對於內容物釋放行為的比較
首先，請參第4A圖以及第4B圖，兩組間雙層凝膠的差異在於，外層交聯時間自2分鐘(SA-CMC@PDMA-2組別) 延長至3分鐘(SA-CMC@PDMA-3組別)，使得外層凝膠結構的厚度增加。
第4A圖以及第4B圖結果呈現，在最初的酸性環境中，兩種雙層凝膠對脂溶性的維他命A酸 (TR) 和牛血清蛋白 (BS) 都具有良好的緩釋效果，但對水溶性的青黴素 (AM)，卻沒有產生同樣的控制作用。由於AM的分子量小，並且容易擴散至溶液中，因此AM產生嚴重釋放效應，在SA-CMC@PDMA-2組別中，2小時的釋放率高達約90%，而在外層較厚的SA-CMC@PDMA-3組別，因為增加擴散阻力，2小時的釋放率為約65%，代表外層的厚度在酸性環境中，對於水溶性成分AM，仍具有延緩釋放的效果。
在弱鹼性環境中，內層凝膠結構開始吸水膨脹，網絡結構崩解，從而逐漸釋放維他命A酸 (TR) 和牛血清蛋白 (BS)。SA-CMC@PDMA-2組別中，TR釋放率在36小時時，達到90%以上，至於分子結構較大的BS的釋放率，只達到約64%，代表雙層構造的設計，對於幹細胞培養液成分 (以BS代表) 的緩釋效果，更勝於脂溶性成分 (以TR代表)。相對而言，外層較厚的SA-CMC@PDMA-3組別，在36小時時，TM釋放率降低至約80%，BS釋放率則只達到35%，表示在弱鹼性環境中，對於脂溶性成份 (TR) 和幹細胞培養液成分 (BS)，更能發揮延緩與控制釋放的作用。
因此，根據第4A圖以及第4B圖，可以了解到，通過增加外層的厚度，可以提高擴散阻力，進而顯著延遲內容物釋放。
3.2.2、內層組成濃度對於內容物釋放行為的比較
請參第5A圖以及第5B圖，兩組間雙層凝膠的差異在於，內層聚合物的重量百分比不同 (SA-CMC@PDMA-1組別為1.5% SA/1.0% CMC；SA-CMC@PDMA-2組別為0.5% SA/2.0% CMC)。
第5A圖以及第5B圖結果呈現，在最初的酸性環境中，內層凝膠結構的組成，對於雙層水凝膠的緩釋作用並無明顯改變，脂溶性的維他命A酸 (TR) 和牛血清蛋白 (BS) 均具有良好的緩釋效果，水溶性的青黴素(AM) 仍然出現嚴重釋放效應，2小時的速率高達70%至90%。
在弱鹼性環境中，兩組間的TR以及AM的釋放率並無明顯差異，但是，SA濃度較低的SA-CMC@PDMA-2 (「1.電子顯微鏡中的凝膠型態」中例示SA-CMC@PDMA-2的孔徑明顯較SA-CMC@PDMA-1小)，對於BS釋放具有更好的控制效果。
相較於大分子的BS，脂溶性的TR與水溶性的青黴素AM都屬於小分子。根據第5A圖以及第5B圖可以發現，內層凝膠結構的組成變化對小分子內容物的影響不大，然而，降低SA濃度，可以延緩大分子內容物的擴散率，降低釋放率。
3.2.3、外層組成成分對於內容物釋放行為的比較
請參第6A圖以及第6B圖，兩組間雙層凝膠的差異在於，外層聚合物的成分不同 (SA-CMC@PDMA-1組別為PDMA；SA-CMC@PAA-1組別為PAA)。
第6A圖以及第6B圖結果呈現，脂溶性的維他命A酸 (TR) 與水溶性的青黴素 (AM) 在兩組雙層凝膠中的釋放率並無顯著差異，但牛血清蛋白 (BS) 的釋放率，則在外層聚合物的成分由PDMA改為具有較低膨脹率以及較小孔徑的PAA時，BS的釋放率顯著降低。
也就是，相對於選用PDMA，外層凝膠結構的成分選用PAA時，雖然對小分子內容物的影響不大，但可以延緩大分子內容物的擴散率，降低釋放率。
本揭示內容的一些實施方式所提供的雙層凝膠，經由內層凝膠結構以及外層凝膠結構的設計，可以提供內層凝膠結構物理性支撐，避免受到酸鹼度影響結構，並提升擴散阻力，延緩營養成分的釋放。
雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1圖呈現本揭示內容的一些實施方式中的聚(ε-己內酯-共-乙醇酸)和聚(乙二醇)的ABA型三區塊共聚物(ABA type triblock copolymer of poly(ε-caprolactone-co-glycolide) and poly(ethylene glycol；Tri-PCG) 保存在磷酸鹽緩衝生理鹽水中時，隨著濃度與溫度的改變所對應的凝膠狀態變化圖。
第2圖呈現本揭示內容的一些實施方式中的雙層凝膠的電子顯微鏡影像，其中最上排的a至c為SA-CMC@PDMA-1組別，第二排的d至f為SA-CMC@PDMA-3組別，最下排的g至i為SA-CMC@PAA-1組別。
第3A圖呈現不同內層凝膠結構的吸水膨脹特性。
第3B圖呈現具有不同凝膠結構的雙層凝膠的吸水膨脹特性。
第4A圖、第4B圖、第5A圖、第5B圖、第6A圖、以及第6B圖呈現具有不同凝膠結構的雙層凝膠分別在不同pH值中，內容物隨著時間的累積釋放率。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記)
無
國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記)
無
Claims (7)
- 一種雙層凝膠用於培養幹細胞的方法，包含：提供幹細胞、一雙層凝膠以及一營養成分，該雙層凝膠包含：一內層凝膠結構，由一內層聚合物經由一內層交聯物經離子性交聯而得，其中該內層聚合物包含一第一內層聚合物與一第二內層聚合物，該第一內層聚合物為海藻酸鈉，該第二內層聚合物為羧甲基纖維素，該海藻酸鈉與該羧甲基纖維素的重量比為3：2，並且當該內層凝膠結構的重量百分比以100%來計，該羧甲基纖維素的重量百分比大於1%；以及一外層凝膠結構，由一外層單體經由一外層交聯物經共價性交聯聚合而得，其中該外層凝膠結構包覆該內層凝膠結構，其中該營養成分位於該內層凝膠結構內部；混合該幹細胞、該雙層凝膠以及該營養成分，獲得凝膠化培養基；以及將培養液添加至該凝膠化培養基上。
- 如請求項1所述的方法，其中該幹細胞包含胚胎幹細胞、造血幹細胞、乳腺幹細胞、間質幹細胞、內皮幹細胞、神經幹細胞、嗅幹細胞、脂肪幹細胞或其組 合。
- 如請求項1所述的方法，其中，該內層凝膠結構呈多個內層片狀結構，並且該些內層片狀結構彼此相連並且以多個內層孔洞相互間隔；以及該外層凝膠結構呈多個外層片狀結構，並且該些外層片狀結構彼此相連並且以多個外層孔洞相互間隔，其中各該外層孔洞的孔徑小於各該內層孔洞的孔徑。
- 如請求項1所述的方法，其中該內層凝膠結構呈現該第一內層聚合物與該第二內層聚合物的互穿結構。
- 如請求項1所述的方法，其中該內層聚合物以及該內層交聯物之間帶有相反的電性。
- 如請求項1所述的方法，其中該外層單體包含N,N-二甲基丙烯醯胺、丙烯醯胺或其組合。
- 如請求項1所述的方法，其中該外層交聯物包含N,N'-亞甲基雙丙烯醯胺。
Priority Applications (1)
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| TW112126994A TWI831715B (zh) | 2023-07-19 | 2023-07-19 | 雙層凝膠、製造方法以及培養幹細胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW112126994A TWI831715B (zh) | 2023-07-19 | 2023-07-19 | 雙層凝膠、製造方法以及培養幹細胞的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TWI831715B true TWI831715B (zh) | 2024-02-01 |
Family
ID=90824662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW112126994A TWI831715B (zh) | 2023-07-19 | 2023-07-19 | 雙層凝膠、製造方法以及培養幹細胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI831715B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110177870A (zh) * | 2017-01-20 | 2019-08-27 | 新加坡科技研究局 | 热响应性微载体系统及其用途 |
-
2023
- 2023-07-19 TW TW112126994A patent/TWI831715B/zh active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110177870A (zh) * | 2017-01-20 | 2019-08-27 | 新加坡科技研究局 | 热响应性微载体系统及其用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 期刊 Yan Hu et al. A double-layer hydrogel based on alginate-carboxymethyl cellulose and synthetic polymer as sustained drug delivery system. Sci Rep. 11(1). 2021 Apr 28. 9142.; * |
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