TWI825612B - 蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患第二原發癌之用途及第二原發癌預測方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之用途，其中該蛋白標誌物包含：錯配修復蛋白、視網膜母細胞瘤蛋白、週期蛋白依賴型激酶4和週期蛋白依賴型激酶6。本發明透過鎖定上述4種蛋白標誌物，可有效降低檢測標的物蛋白之種類數量，而降低時間和費用成本。本發明另提供一種甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之預測方法，具有精準、方便和高效率之優點，符合病患需求。
Description
本發明係有關於一種蛋白標誌物，尤其是一種用於預測甲狀腺癌病患第二原發癌之蛋白標誌物及使用其之預測方法。
甲狀腺癌為最常見之內分泌相關惡性腫瘤，其中分化型甲狀腺癌佔全部甲狀腺惡性腫瘤之95%以上。雖然分化型甲狀腺癌病患具有高存活率，但其預後狀況高度依腫瘤的分子學及病理學特徵之不同而異。此外，部分甲狀腺癌病患可能發展出第二原發癌，而進一步影響治療成效，並有報導指出在所有甲狀腺癌病患中，18.7%之病患死因為同時具有雙原發癌，故甲狀腺癌病患是否具有或未來可能發展出第二原發癌，將實質影響病患之存活率與治療成效。
鑒於甲狀腺癌病患是否具有或未來可能發展出第二原發癌之原因仍不明瞭，且潛在影響因素眾多，包含基因、治療副作用與環境因素等，而尚無有效的預測方法，故有必要研發精準且方便之預測方法，以預防或早期治療第二原發癌。
為達到上述目的，本發明提供一種蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之用途，包含：自該甲狀腺癌病患分離出一體外樣本，並評估該蛋白標誌物於該體外樣本中之表現情況，其中該蛋白標誌物包含：錯配修復蛋白(Mismatch repair proteins)和細胞週期調節蛋白，且該細胞週期調節蛋白包含視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)、週期蛋白依賴型激酶4(Cyclin-dependent kinases 4，CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)。
本發明透過鎖定上述4種蛋白標誌物，可有效降低檢測標的物蛋白之種類數量，而降低時間和費用成本，並可由自動化切片染色儀器完成，故可精準、方便和高效率地預測甲狀腺癌病患是否具有或將出現第二原發癌，符合病患需求。
雙原發癌(Double primary cancers，DPCs)係指非第一原發癌之移轉癌之第二癌症，並可與第一原發癌發生於相同或不同部位。雙原發癌又稱為雙原發惡性腫瘤(Double primary malignancies)，依兩原發惡性腫瘤確診之時間間隔分為兩類：(一)同時性(synchronous)雙原發惡性腫瘤：第一和第二原發惡性腫瘤係同時確診或二者時間間隔小於6個月；(二)異時性(metachronous)雙原發惡性腫瘤：第一和第二原發惡性腫瘤之確診時間間隔大於或等於6個月。所述確診係指經檢驗證明為第一及/或第二原發惡性腫瘤。
在一實施態樣中，該錯配修復蛋白包含PMS2、MLH1、MSH2、MSH6之任一或其組合。較佳的，該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之表現情況為至少其一不表現。
在一實施態樣中，該視網膜母細胞瘤蛋白為磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylate retinoblastoma protein，pRb)。
在一實施態樣中，該體外樣本為組織切片；較佳的，該體外樣本為腫瘤組織切片；更佳的，該體外樣本為腫瘤組織微陣列切片(Tissue Microarray，TMA)。
在一實施態樣中，以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之腫瘤細胞比例至少其一為零。
在一實施態樣中，以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之腫瘤細胞比例大於或等於10%。
在一實施態樣中，以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之腫瘤細胞比例小於10%。
在一實施態樣中，以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之腫瘤細胞比例小於10%。
較佳的，以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之腫瘤細胞比例至少其一為零；表現該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之腫瘤細胞比例大於或等於10%；表現該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之腫瘤細胞比例小於10%；以及表現該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之腫瘤細胞比例小於10%時，預測該甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌。
在一實施態樣中，該被預測為具有或將出現第二原發癌之甲狀腺癌病患之健康檢查頻率為每年至少一次。較佳的，健康檢查頻率為每半年至少一次。
在一實施態樣中，本發明藉由免疫組織化學法進行染色，以評估該蛋白標誌物之表現情況。
在一實施態樣中，該甲狀腺癌病患具有甲狀腺乳突癌或甲狀腺濾泡癌。甲狀腺乳突癌病患或甲狀腺濾泡癌病患為本發明之參考族群，故應用本發明時，將具有較高之準確性。
在一實施態樣中，該甲狀腺癌病患為亞洲人。亞洲人為本發明之參考族群，故應用本發明時，將具有較高之準確性。
在一實施態樣中，該第二原發癌包含結腸直腸癌、乳房癌、頭頸癌、肺癌、子宮頸癌、軟組織癌、前列腺癌或淋巴瘤。此些第二原發癌種類為本發明之參考族群，故應用本發明時，將具有較高之準確性。
本發明另提供一種甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之預測方法，包含：(一)採樣步驟：從該甲狀腺癌病患分離出一體外樣本；(二)評估步驟：評估該體外樣本之蛋白標誌物之表現情況，其中該蛋白標誌物包含：錯配修復蛋白和細胞週期調節蛋白，且該細胞週期調節蛋白包含視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)，其中該錯配修復蛋白包含PMS2、MLH1、MSH2、MSH6之任一或其組合，以及該視網膜母細胞瘤蛋白為磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylate retinoblastoma protein，pRb)；以及(三)預測步驟：第二原發癌預測概率 = 1/(1 + e
-z) (式1)，其中e
-z為指數函數；z = β0 + β1 x dMMR + β2 x pRb + β3 x CDK4 + β4 x CDK6 (式2)；且β0為-1.087；β1為2.336；β2為4.138,；β3為-1.671；以及β4為-3.578；dMMR、pRb、CDK4和CDK6分別為該錯配修復蛋白、該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)表現情況之給定值，其中：該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白缺失者，給定值為1，該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白充足者，給定值為0；該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；以及該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；以及當該第二原發癌預測概率為大於0.5者，預測該甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌。
本發明之預測方法利於病患評估是否進一步增加健康檢查之項目或提升健康檢查之頻率。
本發明係提供一種甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之預測方法，但進行預測步驟之當下，病患是否具有第二原發癌，或第二原發癌之種類皆尚不可知，而有待其他檢查方法來確認，故本發明所請之預測方法非屬不予專利保護之診斷方法。
在一實施態樣中，該體外樣本為腫瘤組織切片，並以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之腫瘤細胞比例至少其一為零者界定為錯配修復蛋白缺失(Mismatch repair deficient，dMMR)，否則界定為錯配修復蛋白充足(Mismatch repair proficient，MMR-Proficient)；表現該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性；表現該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性；以及表現該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性。
在一實施態樣中，該體外樣本為腫瘤組織微陣列切片。
在一實施態樣中，本發明藉由免疫組織化學法進行染色，以評估該蛋白標誌物之表現情況。
在一實施態樣中，本發明所請預測方法中之甲狀腺癌病患和第二原發癌種類同上述所請用途所示內容。
綜上，本發明透過鎖定上述4種蛋白標誌物，可有效降低檢測標的物蛋白之種類數量，而降低時間和費用成本，並具有高準確性，故可精準、方便和高效率地預測甲狀腺癌病患是否具有或將出現第二原發癌，符合病患需求。
以下提供數種操作方式，以便說明本發明之實施方式；熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本發明所能達成之優點與功效，並且於不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本發明之內容。
實驗1：基因標誌物篩選
(一)檢體
本實驗符合赫爾辛基宣言，並經國泰綜合醫院之科學研究與倫理審查委員會(Institutional review board，IRB)核准執行。本實驗自國泰綜合醫院生物資料庫取得檢體，並經匿名化去連結後，豁免採集人體組織之知情後同意之要求；其中，IRB編號為CGH-P108136(2020年02月28日)，以及生物資料庫編號為HBKEC-20200928-1。
上述檢體係於1995年至2010年間診斷為分化型甲狀腺癌，其臨床資訊，例如：年齡、性別、樣本取得流程、治療方法與追蹤資訊皆從生物資料庫取得。本實驗所有樣本皆為經福馬林固定及石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)之甲狀腺癌樣本。
本實驗從71位甲狀腺癌病患隨機選出67位，其中24位病患為單一甲狀腺癌(Single thyroid cancer)病患，其中13名病患為甲狀腺乳突癌(Papillary thyroid carcinoma)，其餘11名病患為甲狀腺濾泡癌(Follicular thyroid carcinoma)；雙原發(Double primary cancer)甲狀腺癌病患則有43位，其中35名病患之第一原發癌為甲狀腺乳突癌，其餘8名病患之第一原發癌則為甲狀腺濾泡癌。雙原發甲狀腺癌病患之第二原發癌部位、數量及佔所有第二原發癌部位之比例如下：結腸直腸(colorectum)共12位(27.9%)、乳房(breast)共11位(25.6%)、頭頸部(head and neck)共6位(14.0%)、肺(lung)共6位(14.0%)、子宮頸(gynecologic tract)共4位(9.3%)、軟組織(soft tissue)共2位(4.7%)、前列腺(prostate)共1位(2.3%)以及淋巴瘤(lymphoma)共1位(2.3%)。此外，上述67位病患包含12位男性和55位女性，年齡為27歲至82歲，中位數為52歲，其中截至本實驗進行時之最近追蹤資訊，存活之雙原發甲狀腺癌病患已知有29位，存活之單一甲狀腺癌病患已知有9位，因癌症或非癌症因素死亡之雙原發甲狀腺癌病患已知有8位，因癌症或非癌症因素死亡之單一甲狀腺癌病患已知有5位，其餘未知，並如表1所示。
表1：病患性別、年齡、時間間隔和臨床結果
註：1.「時間間隔」係指第一原發癌與第二原發癌確診之時間間隔；2. NA表示不適用。
| 單一甲狀腺癌病患 (共24位) | 雙原發甲狀腺癌病患 (共43位) | ||
| 性別 | 男性 | 3位(12.5%) | 9位(20.9%) |
| 女性 | 21位(87.5%) | 34位(79.1%) | |
| 年齡 | ＜50歲 | 14位(58.3%) | 15位(34.9%) |
| ≧50歲 | 10位(41.7%) | 28位(65.1%) | |
| 時間間隔 | ＜6個月 | NA | 9位(20.9%) |
| ≧6個月 | NA | 34位(79.1%) | |
| 臨床結果 | 存活 | 9位(37.5%) | 29位(67.4%) |
| 死亡 | 5位(20.8%) | 8位(18.6%) | |
| 未知 | 10位(41.7%) | 6位(14.0%) |
(二) 組織微陣列切片(Tissue Microarray，TMA)
藉由病理檢查評估上述經福馬林固定及石蠟包埋之甲狀腺癌樣本之腫瘤組織學特徵以選取出代表區域，並挖取直徑為3毫米之區塊作為核心，以切片後排列組成高密度組織微陣列切片，其中該切片後之每一腫瘤組織樣本之厚度為5微米，並進行免疫組織化學法分析。
(三)免疫組織化學法分析
以卵白素–生物素–免疫過氧化物酶染色技術(avidin–biotin–immunoperoxidase method)處理上述腫瘤組織樣本，並使用組織切片染色儀(BenchMark XT slide stainer，Ventana Medical Systems，美國)，透過自動化免疫組織化學法程式進行脫蠟、抗原修復、初級抗體結合、二級抗體結合和呈色。此外，另採用外部組織樣本作為陽性控制組和陰性控制組，以及設置陰性反應劑控制組，以確保染色結果係偵測與初級抗體結合之抗原而得；其中，本實驗之染色標的物蛋白共13種：週期蛋白D1(cyclin D1)、p21、磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、p16
INk4a、週期蛋白依賴型激酶2(CDK2)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)、週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)、E2F1、Ki-67/MIB-1、MLH1、PMS2、MSH2和MSH6、其初級抗體來源細胞株及供應商如表2所示。所述MLH1、PMS2、MSH2和MSH6係為了觀察樣本是否具有錯配修復蛋白缺失(Mismatch repair deficient，dMMR)而進行免疫組織化學染色。最後，使用玻片掃描器(Aperio Image Scopeslide scanner)掃描，以及Image Scope software (Aperio Technologies，美國)進行分析。
表2：染色標的物蛋白、初級抗體來源細胞株及供應商
| 染色標的物蛋白 | 初級抗體來源細胞株 | 供應商 |
| cyclin D1 | clone SP4-R | Roche Ventana |
| p21 | clone DCS-60.2 | Cell Marque |
| pRb | clone 13A10 | Leica Biosystems |
| p16 INk4a | clone E6H4 | Roche Ventana |
| CDK2 | clone E304 | Abcam |
| CDK4 | clone C-22 | Santa Cruz |
| CDK6 | clone EPR4515 | Abcam |
| E2F1 | clone KH95 | Santa Cruz |
| Ki-67 | clone 30-9 | Roche Ventana |
| MLH1 | clone M1 | Roche Ventana |
| PMS2 | clone EPR3947 | Roche Ventana |
| MSH2 | clone G219-1129 | Roche Ventana |
| MSH6 | clone 44 | Roche Ventana |
(四)免疫組織化學染色結果詮釋
病理學家在不知曉腫瘤組織樣本所對應之臨床資訊下檢查高解像力切片影像，並在腫瘤組織樣本之全部範圍中，逐一評估有表現所述染色標的物蛋白之細胞比例；其中，所述染色標的物蛋白係於細胞核中表現，故係以細胞核有呈色之細胞數量佔全部細胞數量之比例來評估是否超過以下截止值(cut-off value)以進行分類：(1) 週期蛋白D1(cyclin D1)：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於50%者，界定為高表現，否則為低表現；(2) p21：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於50%者，界定為高表現，否則為低表現；(3) 磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；(4) p16
INk4a：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；(5) 週期蛋白依賴型激酶2(CDK2)：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；(6) 週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；(7) 週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；(8) E2F1：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於10%者，界定為陽性，否則為陰性；以及(9) Ki-67：細胞核有呈色之細胞數量比例大於或等於5%者，界定為高增殖指數，否則為低增殖指數。
所述截止值係依照同性質研究而設，包括：(1) Zagouri, F. et al., Protein expression patterns of cell cycle regulators in operable breast cancer,
PLoS ONE2017, 12, e0180489；(2) Myong, N.-H., Cyclin D1 Overexpression, p16 Loss, and pRb Inactivation Play a Key Role in Pulmonary Carcinogenesis and have a Prognostic Implication for the Long-term Survival in Non-small Cell Lung Carcinoma Patients,
Cancer Res. Treat2008, 40, 45–52；(3) Ebihara, Y. et al., Over-expression of E2F-1 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with tumor progression,
Dis. Esophagus2004, 17, 150–154；(4) Kjellman, P. et al., MIB-1 Index in Thyroid Tumors: A Predictor of the Clinical Course in Papillary Thyroid Carcinoma?
Thyroid2003, 13, 371–380；(5) Anwar, F.et al., Retinoblastoma Expression in Thyroid Neoplasms,
Mod. Pathol.2000, 13, 562–569。
有關MLH1、PMS2、MSH2和MSH6之部分，依據微小衛星體的不穩定性(Microsatellite instability，MSI)之定義，錯配修復蛋白缺失係指在腫瘤組織樣本之全部範圍中，細胞核完全未呈色。因此，當MLH1、PMS2、MSH2和MSH6至少其一之染色結果為細胞核完全未呈色者，界定為錯配修復蛋白缺失(Mismatch repair deficient，dMMR)，否則界定為錯配修復蛋白充足(Mismatch repair proficient，MMR-Proficient)。本實驗另以淋巴球和血管内皮细胞作為陽性内部参照。
(四)統計方法
單一甲狀腺癌病患和雙原發甲狀腺癌病患之基本人口統計資料以費雪正確性檢定(Fisher’s exact test)進行比較。13種染色標的物蛋白、單一甲狀腺癌和雙原發癌之狀態採用單變數邏輯迴歸分析(univariate logistic regression analyses)和多變量邏輯迴歸分析後，再以單變數邏輯迴歸分析以腫瘤次種類(tumor subtype)來分層以評估每一染色標的物蛋白與雙原發癌間之關聯性是否在兩種腫瘤次種類中具有一致性。最後，為了觀察在具有顯著性的染色標的物蛋白間是否具有潛在可加性效應(additive effect)，故檢測該具有顯著性的染色標的物蛋白間之交互效應。所有檢測皆為雙尾檢定，並以p值小於0.05為具有統計上之顯著意義。本實驗之數據分析皆採用SPSS 25 (IBM SPSS Inc.，美國)進行，結果如表3至表5所示，並說明如下：
第一，表3顯示染色標的物蛋白、單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態之單變數和多變量邏輯迴歸分析結果。從表3可知，在24位單一甲狀腺癌病患中，僅8位之檢測結果被界定為錯配修復缺陷，佔比約為33%；在43位雙原發甲狀腺癌病患，則高達32位之檢測結果被界定為錯配修復蛋白缺失，佔比約為74.4%，且在多變量邏輯迴歸分析結果中，顯示錯配修復蛋白於單一甲狀腺癌和雙原發癌兩族群之間具有顯著差異。此外，本實驗中最常見之缺失態樣為：MLH1和PMS2同時缺失，共23位；其次為PMS2單一缺失，共13位；最後為MSH2和MSH6同時缺失，共4位。
第二，圖1A例示性顯示在雙原發甲狀腺癌病患中，甲狀腺乳突癌病患之腫瘤組織樣本被界定為錯配修復蛋白缺失，且MLH1和PMS2完全缺失之染色結果；圖1B例示性顯示在雙原發甲狀腺癌病患中，甲狀腺濾泡癌病患之腫瘤組織樣本被界定為錯配修復蛋白充足之染色結果。從圖1A和圖1B之比較可知，圖1A顯示MLH1缺失和PMS2缺失態樣之染色結果，故其細胞核皆未呈色，圖1B顯示MLH1健全和PMS2健全態樣之染色結果，故其細胞核皆呈咖啡色。在MSH2和MSH6之部份，則圖1A和圖1B皆顯示MSH2健全和MSH6健全之態樣，故其細胞核皆呈咖啡色，並據以將所有雙原發甲狀腺癌病患分為錯配修復蛋白缺失組(32位)和錯配修復蛋白充足組(11位)。
第三，從表3可知，在磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之部分，雙原發甲狀腺癌病患被界定為陽性之比例為60.5%，明顯高於單一甲狀腺癌病患的25.0%，且在多變量邏輯迴歸分析結果中，顯示磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)於單一甲狀腺癌和雙原發癌兩族群之間具有顯著差異。在週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之部份，雙原發甲狀腺癌病患被界定為陽性之比例分別20.9%和9.3%，皆各自明顯低於單一甲狀腺癌病患的54.2%和33.3%，且在多變量邏輯迴歸分析結果中，顯示週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)於單一甲狀腺癌和雙原發癌兩族群之間皆具有顯著差異。
圖2A和圖2B分別例示性顯示在雙原發甲狀腺癌病患中，甲狀腺乳突癌病患和甲狀腺濾泡癌病患之腫瘤組織樣本之蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，H&E)染色結果，以及週期蛋白D1(cyclin D1)、p21和週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之免疫組織化學法染色結果；其中，針對週期蛋白D1(cyclin D1)和p21之染色結果中，圖2A和圖2B中之細胞核皆呈咖啡色，顯示週期蛋白D1(cyclin D1)和p21皆高度表現，相較之下，針對週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之染色結果中，圖2A和圖2B中之細胞核皆無呈色，顯示週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)未表現。
第四，圖3例示性顯示雙原發甲狀腺癌病患中之甲狀腺濾泡癌病患之腫瘤組織樣本染色結果，包含針對磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，H&E)染色結果和針對磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)、週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)、MLH1、PMS2、MSH2和MSH6之免疫組織化學法染色結果；其中，在蘇木素-伊紅染色和磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之免疫組織化學染色結果中，皆可發現細胞核呈色比例高，從而被界定為磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)高度表現。
在週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之部份，圖3例示性顯示被界定為陰性之態樣，並可明顯看出細胞核呈色比例極低。在錯配修復蛋白之部份，則例示性顯示MLH1和PMS2缺失之態樣，並可明顯看出MLH1和PMS2之細胞核皆無呈色，而與MSH2和MSH6所示咖啡色明顯不同。
第五，表4顯示染色標的物蛋白與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態以腫瘤次種類來分層」間之關聯性單變數邏輯迴歸分析結果，所述腫瘤次種類為甲狀腺乳突癌和甲狀腺濾泡癌。從表4可知，受限於樣本數，故在每一腫瘤次種類族群中，其結果多數為較不顯著。此外，所有染色標的物蛋白和腫瘤次種類間之交互作用皆為不顯著，顯示腫瘤次種類並不會改變染色標的物蛋白與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態」間之關連性。換句話說，「錯配修復蛋白和細胞週期調節蛋白」與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態」間之關係在甲狀腺乳突癌和甲狀腺濾泡癌之此兩種腫瘤次種類中係屬相似。
第六，本實驗進一步將表3所示單一甲狀腺癌病患和雙原發甲狀腺癌病患族群間，在多變量邏輯迴歸分析結果中具有顯著差異的染色標的物蛋白：錯配修復蛋白(Mismatch repair proteins)、視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)、週期蛋白依賴型激酶4(Cyclin-dependent kinases 4，CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)進一步界定為蛋白標誌物；其中該錯配修復蛋白包含PMS2、MLH1、MSH2和MSH6。
表5顯示蛋白標誌物與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態以其餘蛋白標誌物來分層」間之關聯性單變數邏輯迴歸分析結果。從表5可知，任一蛋白標誌物和其餘蛋白標誌物間之交互作用皆為不顯著，顯示任一蛋白標誌物並不會改變其餘具有顯著差異的染色標的物蛋白(即蛋白標誌物)與「雙原發癌狀態」間之關連性。換句話說，此暗示了在不同蛋白標誌物之間，並無可加性效應。
(五)甲狀腺癌病患出現第二原發癌之預測方法
本實驗之數據分析亦採用SPSS 25 (IBM SPSS Inc.，美國)進行。將蛋白標誌物表現情況之給定值進一步導入至向後消去(Backward elimination)之多變量模型，以獲得具有甲狀腺癌病患出現非甲狀腺癌(亦即第二原發癌)之預測概率，並以蛋白標誌物表現情況之給定值作為在接收器操作特徵曲線分析(Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis)中的解釋變數(Explanatory variable)，以獲得接收器操作特徵曲線(即ROC曲線)，結果如圖4所示，並顯示ROC曲線之曲線下面積為0.95(95%信賴區間，0.90至0.998)，具有極佳的區別力表現，其公式為：第二原發癌預測概率 = 1/(1 + e
-z) (式1)，其中e
-z為指數函數，z為風險分數； z = β0 + β1 x dMMR + β2 x pRb + β3 x CDK4 + β4 x CDK6 (式2)，且β0為-1.087；β1為2.336；β2為4.138,；β3為-1.671；以及β4為-3.578。
所述式2中之dMMR、pRb、CDK4和CDK6分別為錯配修復蛋白、視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)表現情況之給定值，其中：該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白缺失者，給定值為1，該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白充足者，給定值為0；該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；以及該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陰性者，給定值為0。最後，當該第二原發癌預測概率為大於0.5者，預測該甲狀腺癌病患屬具有或未來將出現第二原發癌之高風險群。
本實驗另以71位病患中剩餘之4位甲狀腺癌病患以式1和式2進行預測，其中2位單一甲狀腺癌病患之第二原發癌預測概率分別為0.01和0.06，皆小於0.5；另2位雙原發甲狀腺癌病患之第二原發癌預測概率分別為0.98和0.95，皆大於0.5，顯示本發明之式1和式2確實可準確預測甲狀腺癌病患是否具有或將出現第二原發癌。
最後，以71位甲狀腺癌病患之數據組預測是否具有或將出現第二原發癌之敏感度(Sensitivity)為88.9% (95%信賴區間，75.1至95.8)，以及特異度(Specificity)為69.2% (95%信賴區間，48.1至84.9)，顯示本發明之式1和式2確實可準確預測甲狀腺癌病患是否具有或將出現第二原發癌，而有助於被預測為屬第二原發癌之高風險甲狀腺癌病患增加檢查項目及加強定期檢查，以期當第二原發癌出現時，能即早發現及治療。
無
圖1A和圖1B分別為在雙原發甲狀腺癌病患中，針對甲狀腺乳突癌和甲狀腺濾泡癌之MLH1、PMS2、MSH2和MSH6之免疫組織化學染色照片。
圖2A和圖2B分別為在雙原發甲狀腺癌病患中，針對甲狀腺乳突癌和甲狀腺濾泡癌之蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，H&E)染色照片和針對週期蛋白D1(cyclin D1)、p21和週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之免疫組織化學染色照片。
圖3為針對磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之蘇木素-伊紅(Hematoxylin and eosin，H&E)染色照片和針對磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)、週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)、MLH1、PMS2、MSH2和MSH6之免疫組織化學染色照片。
圖4為接收器操作特徵曲線圖。
無
表3：染色標的物蛋白與單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態以腫瘤次種類來分層之關聯性單變數和多變量邏輯迴歸分析結果
註：所述「CI」係指信賴區間(confidence interval，CI)。
表4：染色標的物蛋白與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態以腫瘤次種類來分層」間之關聯性單變數邏輯迴歸分析結果
表5：染色標的物蛋白與「單一甲狀腺癌和雙原發癌狀態以其餘蛋白標誌物來分層」間之關聯性單變數邏輯迴歸分析結果
| 變數 | 單一甲狀腺癌 | 雙原發癌 | 單變數邏輯迴歸分析 | p值 | 多變量邏輯迴歸分析 | p值 |
| n=24 | n=43 | 粗勝算比(95% CI) | 校正後勝算比(95% CI) | |||
| dMMR | 8 (33.3) | 32 (74.4) | 5.82 (1.95–17.32) | 0.002 | 10.34 (2.17–49.21) | 0.003 |
| cyclin D1 | 13 (54.2) | 36 (83.7) | 4.35 (1.39–13.61) | 0.011 | ||
| p21 | 5 (20.8) | 20 (46.5) | 3.30 (1.04–10.47) | 0.042 | ||
| pRb | 6 (25.0) | 26 (60.5) | 4.59 (1.52–13.89) | 0.007 | 62.71 (4.83–814.22) | 0.002 |
| p16 INk4a | 3 (12.5) | 13 (30.2) | 3.03 (0.77–11.98) | 0.113 | ||
| CDK2 | 3 (12.5) | 19 (44.2) | 5.54 (1.43–21.40) | 0.013 | ||
| CDK4 | 13 (54.2) | 9 (20.9) | 0.22 (0.08–0.67) | 0.007 | 0.19 (0.04–0.99) | 0.049 |
| CDK6 | 8 (33.3) | 4 (9.3) | 0.21 (0.05–0.78) | 0.020 | 0.03 (0.002–0.44) | 0.011 |
| E2F1 | 8 (33.3) | 15 (34.9) | 1.07 (0.37–3.08) | 0.898 | ||
| Ki-67 | 2 (8.3) | 14 (32.6) | 5.31 (1.09–25.83) | 0.039 |
| 變數 | 甲狀腺乳突癌 | 甲狀腺濾泡癌 | 交互作用 p值 | ||||
| 單一甲狀腺癌 n=13 | 雙原發癌 n=35 | 勝算比(95% CI) | 單一甲狀腺癌 n=11 | 雙原發癌 n=8 | 勝算比(95% CI) | ||
| dMMR | 4 (30.8) | 25 (71.4) | 5.62 (1.40–22.53) | 4 (36.4) | 7 (87.5) | 12.25 (1.08–138.99) | 0.586 |
| cyclin D1 | 8 (61.5) | 29 (82.9) | 3.02 (0.73–12.52) | 5 (45.5) | 7 (87.5) | 8.40 (0.76–93.34) | 0.474 |
| p21 | 2 (15.4) | 16 (45.7) | 4.63 (0.89–24.04) | 3 (27.3) | 4 (50.0) | 2.67 (0.39–18.17) | 0.669 |
| pRb | 0 (0.0) | 21 (60.0) | NA | 6 (54.5) | 5 (62.5) | 1.39 (0.22–8.92) | 0.998 |
| p16 INk4a | 2 (15.4) | 13 (37.1) | 3.25 (0.62–17.01) | 1 (9.1) | 0 (0.0) | NA | 1.000 |
| CDK2 | 0 (0.0) | 17 (48.6) | NA | 3 (27.3) | 2 (25.0) | 0.89 (0.11–7.11) | 0.998 |
| CDK4 | 4 (30.8) | 5 (14.3) | 0.38 (0.08–1.70) | 9 (81.8) | 4 (50.0) | 0.22 (0.03–1.75) | 0.689 |
| CDK6 | 0 (0.0) | 2 (5.7) | NA | 8 (72.7) | 2 (25.0) | 0.13 (0.02–0.999) | 0.999 |
| E2F1 | 6 (46.2) | 12 (34.3) | 0.61 (0.17–2.22) | 2 (18.2) | 3 (37.5) | 2.70 (0.33–21.98) | 0.236 |
| Ki-67 | 2 (15.4) | 12 (34.3) | 2.87 (0.55–15.10) | 0 (0.0) | 2 (25.0) | NA | 0.999 |
| 變數 | 錯配修復蛋白缺失(dMMR) | 錯配修復蛋白充足(MMR-Proficient) | 交互作用 p值 | ||||
| 單一甲狀腺癌 n=8 | 雙原發癌 n=32 | 勝算比(95% CI) | 單一甲狀腺癌 n=16 | 雙原發癌 n=11 | 勝算比(95% CI) | ||
| CDK4 | 3 (37.5) | 7 (21.9) | 0.47 (0.09–2.45) | 10 (62.5) | 2 (18.2) | 0.13 (0.02–0.84) | 0.321 |
| CDK6 | 2 (25.0) | 3 (9.4) | 0.31 (0.04–2.28) | 6 (37.5) | 1 (9.1) | 0.17 (0.02–1.65) | 0.688 |
| pRb | 2 (25.0) | 17 (53.1) | 3.40 (0.59–19.46) | 4 (25.0) | 9 (81.8) | 13.50 (2.01–90.69) | 0.295 |
| 變數 | pRb陽性 | pRb陰性 | 交互作用 p值 | ||||
| 單一甲狀腺癌 n=6 | 雙原發癌 n=26 | 勝算比(95% CI) | 單一甲狀腺癌 n=18 | 雙原發癌 n=17 | 勝算比(95% CI) | ||
| dMMR | 2 (33.3) | 17 (65.4) | 3.78 (0.58–24.75) | 6 (33.3) | 15 (88.2) | 15.00 (2.55–88.17) | 0.295 |
| CDK4 | 6 (100.0) | 6 (23.1) | NA | 7 (38.9) | 3 (17.6) | 0.34 (0.07–1.61) | 0.998 |
| CDK6 | 5 (83.3) | 4 (15.4) | 0.04 (0.00–0.40) | 3 (16.7) | 0 (0.0) | NA | 0.999 |
| 變數 | CDK4陽性 | CDK4陰性 | 交互作用 p值 | ||||
| 單一甲狀腺癌 n=13 | 雙原發癌 n=9 | 勝算比(95% CI) | 單一甲狀腺癌 n=11 | 雙原發癌 n=34 | 勝算比(95% CI) | ||
| dMMR | 3 (23.1) | 7 (77.8) | 11.67 (1.53–89.12) | 5 (45.5) | 25 (73.5) | 3.33 (0.81–13.66) | 0.321 |
| pRb | 6 (46.2) | 6 (66.7) | 2.33 (0.40–13.61) | 0 (0.0) | 20 (58.8) | NA | 0.998 |
| CDK6 | 8 (61.5) | 1 (11.1) | 0.08 (0.01–0.83) | 0 (0.0) | 3 (8.8) | NA | 0.999 |
| 變數 | CDK6陽性 | CDK6陰性 | 交互作用 p值 | ||||
| 單一甲狀腺癌 n=8 | 雙原發癌 n=4 | 勝算比(95% CI) | 單一甲狀腺癌 n=16 | 雙原發癌 n=39 | 勝算比(95% CI) | ||
| dMMR | 2 (25.0) | 3 (75.0) | 9.00 (0.56–143.89) | 6 (37.5) | 29 (74.4) | 4.83 (1.40–16.73) | 0.688 |
| pRb | 5 (62.5) | 4 (100.0) | NA | 1 (6.3) | 22 (56.4) | 19.41 (2.33–161.86) | 0.999 |
| CDK4 | 8 (100.0) | 1 (25.0) | NA | 5 (31.3) | 8 (20.5) | 0.57 (0.15–2.11) | 0.999 |
Claims (12)
- 一種蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之用途，包含：自該甲狀腺癌病患分離出一體外樣本，並評估該蛋白標誌物於該體外樣本中之表現情況，其中該蛋白標誌物包含：錯配修復蛋白(Mismatch repair proteins)和細胞週期調節蛋白，且該細胞週期調節蛋白包含視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，Rb)、週期蛋白依賴型激酶4(Cyclin-dependent kinases 4，CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(Cyclin-dependent kinases 6，CDK6)。
- 如請求項1所述之用途，其中該錯配修復蛋白包含PMS2、MLH1、MSH2、MSH6之任一或其組合，以及該視網膜母細胞瘤蛋白為磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylate retinoblastoma protein，pRb)。
- 如請求項2所述之用途，其中該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之表現情況為至少其一不表現。
- 如請求項2所述之用途，其中該體外樣本為腫瘤組織切片，並以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之腫瘤細胞比例至少其一為零；表現該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之腫瘤細胞比例大於或等於10%；表現該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之腫瘤細胞比例小於10%；以及表現該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之腫瘤細胞比例小於10%時，預測該甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌。
- 如請求項4所述之用途，其中該被預測為具有或將出現第二原發癌之甲狀腺癌病患之健康檢查頻率為每年至少一次。
- 如請求項1至5中任一項所述之用途，其藉由免疫組織化學法進行染色，以評估該蛋白標誌物之表現情況。
- 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中該甲狀腺癌病患具有甲狀腺乳突癌或甲狀腺濾泡癌。
- 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中該第二原發癌包含結腸直腸癌、乳房癌、頭頸癌、肺癌、子宮頸癌、軟組織癌、前列腺癌或淋巴瘤。
- 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中該甲狀腺癌病患為亞洲人。
- 一種甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌之預測方法，包含： (一)採樣步驟：從該甲狀腺癌病患分離出一體外樣本； (二)評估步驟：評估該體外樣本之蛋白標誌物之表現情況，其中該蛋白標誌物包含：錯配修復蛋白和細胞週期調節蛋白，且該細胞週期調節蛋白包含視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)、週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)，其中該錯配修復蛋白包含PMS2、MLH1、MSH2、MSH6之任一或其組合，以及該視網膜母細胞瘤蛋白為磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylate retinoblastoma protein，pRb)；以及 (三)預測步驟：第二原發癌預測概率 = 1/(1 + e -z) (式1)，其中e -z為指數函數；z = β0 + β1 x dMMR + β2 x pRb + β3 x CDK4 + β4 x CDK6 (式2)；且β0為-1.087；β1為2.336；β2為4.138,；β3為-1.671；以及β4為-3.578；dMMR、pRb、CDK4和CDK6分別為該錯配修復蛋白、該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)、該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)和該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)表現情況之給定值，其中：該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白缺失者，給定值為1，該錯配修復蛋白之表現情況界定為錯配修復蛋白充足者，給定值為0；該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；以及該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陽性者，給定值為1，該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之表現情況界定為陰性者，給定值為0；以及當該第二原發癌預測概率為大於0.5者，預測該甲狀腺癌病患具有或將出現第二原發癌。
- 如請求項10所述之預測方法，其中在該(二)評估步驟中，該體外樣本為腫瘤組織切片，並以該腫瘤組織切片中之腫瘤細胞總數為基準，表現該PMS2、該MLH1、該MSH2和該MSH6之腫瘤細胞比例至少其一為零者界定為錯配修復蛋白缺失(Mismatch repair deficient，dMMR)，否則界定為錯配修復蛋白充足(Mismatch repair proficient，MMR-Proficient)；表現該磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性；表現該週期蛋白依賴型激酶4(CDK4)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性；以及表現該週期蛋白依賴型激酶6(CDK6)之腫瘤細胞比例大於或等於10%者界定為陽性，否則界定為陰性。
- 如請求項10所述之預測方法，其藉由免疫組織化學法進行染色，以評估該蛋白標誌物之表現情況；該甲狀腺癌病患具有甲狀腺乳突癌或甲狀腺濾泡癌；該第二原發癌包含結腸直腸癌、乳房癌、頭頸癌、肺癌、子宮頸癌、軟組織癌、前列腺癌或淋巴瘤；以及該甲狀腺癌病患為亞洲人。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW111108339A TWI825612B (zh) | 2022-03-08 | 2022-03-08 | 蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患第二原發癌之用途及第二原發癌預測方法 |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202336438A TW202336438A (zh) | 2023-09-16 |
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ID=88927318
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| TW111108339A TWI825612B (zh) | 2022-03-08 | 2022-03-08 | 蛋白標誌物用於預測甲狀腺癌病患第二原發癌之用途及第二原發癌預測方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI825612B (zh) |
-
2022
- 2022-03-08 TW TW111108339A patent/TWI825612B/zh active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 期刊 Kristine S Wong et al, "Clinicopathologic Features of Mismatch Repair-Deficient Anaplastic Thyroid Carcinomas", Thyroid. 2019 May; 29(5): 666-673. thy.2018.0716. Epub 2019 Apr 16_ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TW202336438A (zh) | 2023-09-16 |
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