TWI812228B - 新穎微小桿菌yl-01及其還原六價鉻之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種新穎微小桿菌YL-01及其還原六價鉻之用途，其中，該新穎微小桿菌YL-01寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2021年11月29日，寄存編號為BCRC911083；對於六價鉻有高度耐受性，可於含有1500ppm六價鉻的培養基中正常生長，並具有高效還原能力，達到60µM/小時，因此，該新穎微小桿菌YL-01係能夠用於處理高濃度之六價鉻污染或是含有六價鉻之污染物。
Description
本發明係有關於新穎微生物及其用途，特別係指一種新穎微小桿菌YL-01及其還原六價鉻之用途。
按，金屬鉻係依據其化學價之不同而有不同之應用，具體來說，化學價為零價之鉻係被用於製造鋼鐵；三價鉻係為人體不可缺少之營養素，會被用於作為顏料或染劑使用；六價鉻亦被用於作為材料處理或保存之化合物，例如顏料或染劑中之色素；而其中，又以六價鉻具有毒性，意即當生物體直接或間接地接觸到環境中高濃度之鉻時，會對於個體健康造成不良影響舉例來說，吸入高濃度之六價鉻會造成呼吸問題，嚴重者甚至會罹患肺癌；飲食中若含有六價鉻，則會造成腸胃疼痛、潰瘍或貧血。
含有鉻之產品於製造過程或是被丟棄於環境中時，會釋放出鉻至空氣、土壤、水等環境中。以台灣來說，電鍍工廠所排放出之廢水中係含有大量六價鉻，因此，為能去除或降低廢水中六價鉻之濃度，目前多數工廠會選擇以化學沉澱、離子交換、超薄膜過濾、電解法等方式進行廢水處理，不過，以上述方式進行含有六價鉻之廢水處理的費用高昂，並且於處理過程中仍會產生其他有害廢棄物。
據此可知，目前仍缺少一種能夠有效率且具經濟價值之清除環境中六價鉻污染之方法。
本發明之主要目的係在於提供一種新穎微小桿菌YL-01及其還原六價鉻之用途，具體來說，本發明所揭新穎微小桿菌YL-01係能存活於含有六價鉻之環境中，並且將六價鉻還原為三價鉻，因此，該新穎微小桿菌YL-01係能夠用於處理污染物中之六價鉻，使所得到之終產物中之六價鉻含量符合或低於環境法規之規定，以有效達到處理含鉻污染物且不會再次對環境造成二次污染之功效。
緣是，為能達成上述目的，本發明係提供一種新穎微小桿菌YL-01，其係寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2021年11月29日，寄存編號為BCRC911083，並且，該新穎微小桿菌YL-01，係能夠透過細胞膜結合還原酶，將一污染物中之六價鉻還原成三價鉻。
於本發明之一實施例係提供一種組合物，其係包含有一有效量之新穎微小桿菌YL-01，用以添加至一污染物中，以處理該污染物中之六價鉻。
其中，該組合物中係更包含有一發酵培養基，用以提供該新穎微小桿菌YL-01生長繁殖所需元素或物質，例如LB培養基。
本發明之另一實施例中係提供一種含六價鉻污染物之處理方法，其主要係將一有效量之新穎微小桿菌YL-01或含有該有效量之新穎微小桿菌YL-01的組合物與一污染物共同培養一預定時間，使該新穎微小桿菌YL-01產出之鉻酸鹽還原酶將該污染物內之六價鉻還原成三價鉻。
具體來說，於本發明又一實施例中，該含六價鉻污染物之處理方法係包含有下列步驟：
步驟a：收集該污染物，其中，該污染物得為液體或土壤，並且，該污染物中之六價鉻濃度以0 ppm且小於等於1500 ppm者為佳。
步驟b：取該新穎微小桿菌YL-01與一發酵培養基，添加至該污染物內，進行發酵培養一預定時間；
步驟c：產出一終產物，其內六價鉻含量係符合法規規定或是幾近為零。
其中，該步驟c之該發酵培養之時間係得依據該污染物中之六價鉻含量、提供之菌量、污染物之體積等因素而變化，如以該污染物中之六價鉻含量為1500ppm之高標時，該發酵培養之時間係為96小時。
為能增加處理終產物之便利性，於本發明之次一實施例中所揭含六價鉻污染物之處理方法，其更包含有一步驟d，位於該步驟c之後，而該步驟d係透過酸鹼中和反應調整終產物之酸鹼值，並且使其內三價鉻形成固態沈澱物。
本發明係揭露一種新穎微小桿菌YL-01（Exiguobacterium sp.YL-01）及其還原六價鉻之用途，其中，該新穎微小桿菌YL-01係為自彰化河川土壤所分離出者，經全基因體解序及比對後，確認為未曾發現的新穎菌株，如圖1所示，16S rRNA基因序列為SEQ ID No.:1，並寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2021年11月29日，寄存編號為BCRC911083。
該微小桿菌YL-01對於六價鉻有高度耐受性，可於含有1500ppm六價鉻的培養基中正常生長，並具有高效還原能力，達到60µM/小時，因此，該微小桿菌YL-01係能夠用於處理高濃度之六價鉻污染或是含有六價鉻之污染物。
更進一步來說，本發明所揭新穎微小桿菌YL-01之分離程序如下：
A. 取1g來自彰化之土壤樣本，加入去離子水100ml，均勻攪拌後，以10倍系列稀釋塗抹於一固態耐鉻LB培養基上，於30℃培養72小時，獲得可培養的菌落，其中，金固態耐鉻LB培養基每100 ml含有胰蛋白腖1克、酵母提取物0.5克、氯化鈉1克、瓊脂1.5克，並其內含有濃度為1500 ppm之六價鉻Cr(VI)。
B. 通過畫盤於該固態耐鉻LB培養基上於30℃下培養72小時，篩選且分離出具鉻耐受性之細菌菌株，經鑑定比對後，確認其為本發明所揭新穎微小桿菌YL-01。
其中，鑑定比對之說明如下：
將所分離出具鉻耐受性之細菌菌株進行總量DNA提取，再由此總量DNA中擴增16S rRNA基因，使用16S rRNA之27F（SEQ ID No.:2，5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）與1492R（SEQ ID No.:3，5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）引子對進行聚合酶鏈反應，將所擴增出的16S rRNA片段進行核酸定序。鑑定結果根據試驗標的引子再配合NCBI中之16S ribosomal RNA sequences（Bacteria and Archaea）資料庫比對計算，進行16SRNA基因序列數據的分析，得到具鉻耐受性之細菌菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID No.:1所示。使用MEGA第11版軟體進行多序列比對分析(multiple sequence alignment)，並以此結果進行親緣關係程序構建，鑑定的菌株的系統發生樹結果如圖2所示，而後再進行全基因組定序比較，如圖1所示。
該微小桿菌YL-01係能夠透過細胞膜結合還原酶將具有流動性與毒性高的六價鉻[Cr(VI)]還原為相對毒性低、溶解度與流動性較低的三價鉻[Cr(III)]。詳言之，該微小桿菌YL-01係可產生鉻酸鹽還原酶，參與氧化還原之電子傳遞鏈，以鉻酸鹽為終端電子的受體，而這些鉻酸鹽還原酶利用NAD(P)H作為電子供體以將六價鉻還原為三價鉻作為最終產物。基此，本發明所揭微小桿菌YL-01係能夠用於以微生物修復方法改善鉻廢水，並且使處理後之終產物中幾乎不含有六價鉻或是已經符合法規規定標準，亦即相較於傳統化學除污法之終產物中仍會含有六價鉻來說，以本發明所揭微小桿菌YL-01處理含六價鉻之污染物係能夠有效地降低終產物對環境所造成之二次污染。
於本發明之一實施例中所揭以微小桿菌YL-01處理污染物之方法，係將待處理之污染水導入發酵槽內，其中，待處理之污染水含有高濃度（至少300ppm）之六價鉻；再加入該微小桿菌YL-01，以LB培養基或其他具供微小桿菌YL-01生長繁殖之培養基進行培養，於培養96小時內可將待處理之污染物內的六價鉻還原成三價鉻；而後以氫氧化鈉將培養液之酸鹼值調整為約8.5之弱鹼性，使待處理之污染物內的三價鉻形成沈澱物：氫氧化鉻（Cr(OH)
3），以利於回收。
其中，加入本發明所揭該微小桿菌YL-01後，得於每24小時測定一次OD600mn，以確認該微小桿菌YL-01之生長濃度及還原六價鉻之情形。
於本發明之另一實施例中所揭以微小桿菌YL-01處理污染物之方法，其係將含有該微小桿菌YL-01之LB培養液直接施用於待處理之污染土壤，使該微小桿菌YL-01直接還原污染土壤中之六價鉻；或是以水淋洗待處理之污染土壤，收集淋洗液，再以上述實施例中所揭處理污染水之方式，將含有微小桿菌YL-01 之LB培養基加入淋洗液中進行培養，使微小桿菌YL-01還原淋洗液中之六價鉻。
於本發明之實施例中，所使用之含有該微小桿菌YL-01之LB培養液係以下列方式所製備：1％對數期（log-phase）培養的菌液(約10
6CFU/ml)接種到上述LB培養基。
本發明所稱「含有六價鉻之污染物」或是「污染物」，係為受六價鉻所污染之水、液體或土壤且為本發明所屬技術領域且具通常知識者所通認達污染之濃度、或是依據法規或主管機關所明訂之標準，例如稻田的土壤汙染管制標準為總鉻濃度不大於250 mg/kg；美國FDA規定瓶裝水內鉻的濃度不可超過0.1 mg/L等。
本發明所稱「發酵培養基」，係指可供微小桿菌YL-01生長繁殖之培養基，其內含有生長必要之營養物質或/及原料，例如本發明實施例中所使用之LB培養基。
以下，為能說明本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實驗例並搭配圖式作詳細說明如後。
實例一：分析微小桿菌YL-01之鉻耐受性
將1％對數期培養的本發明所揭含有該微小桿菌YL-01分別接種於含有不同濃度之六價鉻（500、1000、1500、2000、3000、4000ppm）的不含瓊脂之上述LB液態培養基中（pH7.0）中，並在30℃，150 rpm之條件下培養120小時，培養期間內，每24小時測量一次OD600nm觀察其生長狀況。並且檢測之存活率，結果如圖3所示。
由圖3之結果可知，本發明所揭微小桿菌YL-01可存活於六價鉻濃度最高為1500ppm之培養基中，意即本發明所揭微小桿菌YL-01對於六價鉻之耐受性為1500ppm。
實例二：檢測微小桿菌YL-01之鉻還原能力
分別將1％對數期培養的本發明所揭含有該微小桿菌YL-01接種至含有不同濃度之六價鉻（300、500、1000、1500ppm）的LB培養基中，（pH7.0）中，並在30℃，150 rpm之條件下培養168小時，並於培養期間，每24小時檢測一次OD600nm，觀察發明所揭含有該微小桿菌YL-01之生長濃度且計算培養基中六價鉻還原成三價鉻之還原率，結果如圖4所示。
由圖4之結果可知，本發明所揭微小桿菌YL-01確實具有還原廢水或是污染物中六價鉻之能力，並且，於污染物中六價鉻濃度為1500ppm以下時具有還原能力，其中，當污染物中六價鉻濃度越低時，本發明所揭微小桿菌YL-01之還原六價鉻之效率越佳，意即得於較短時間達到較高之還原率。
實例三：電鍍廢水還原六價鉻試驗
從電鍍廠商取得電鍍廢水並稀釋成為500 PPM之待處理液，加入LB培養基並接種1％對數期培養的本發明所揭微小桿菌YL-01菌液到待處理液中，在37℃，150rpm培養96小時。每24小時測量一次OD540nm，以觀察本發明所揭微小桿菌YL-01還原六價鉻之狀況，結果如圖5所示。
由圖5之結果可知，本發明所揭微小桿菌YL-01係能於電鍍廢水中還原其內所含六價鉻，於培養24小時開始具有良好還原率，並於培養至96小時的時候還原率最佳。
無
圖1係為本發明所揭微小桿菌YL-01與已知微小桿菌之全基因體比較之結果。
圖2以系統發生樹分析本發明所揭微小桿菌YL-01與其他以知之相關桿菌間的親緣關係。
圖3係為本發明所揭微小桿菌 YL-01於含有不同濃度六價鉻之培養基中之生長曲線。
圖4係為分析本發明所揭微小桿菌 YL-01於對於不同濃度六價鉻之還原率的結果。
圖5係為分析本發明所揭微小桿菌 YL-01處理電鍍廢水中六價鉻的情形。
新穎微小桿菌YL-01，新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2021年11月29日，寄存編號為BCRC911083
<110> 國立中興大學
<120> 新穎微小桿菌YL-01及其還原六價鉻之用途
<130> HJ28-002
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1496
<212> DNA
<213> Exiguobacterium sp.
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ArtificialSequence
<220>
<223> 合成
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成
<400> 3
Claims (10)
- 一種新穎微小桿菌YL-01(Exiguobacterium sp.YL-01)，寄存於新竹食品工業發展研究所，寄存日期為2021年11月29日，寄存編號為BCRC911083。
- 一種如請求項1所述新穎微小桿菌YL-01之用途，其係用於還原一污染物中之六價鉻。
- 一種組合物，其係包含一有效量之如請求項1所述新穎微小桿菌YL-01。
- 如請求項3所述組合物，其更包含有一發酵培養基。
- 一種含六價鉻污染物之處理方法，其係以一有效量之如請求項1所述新穎微小桿菌YL-01處理一污染物一預定時間，使該新穎微小桿菌YL-01係將該污染物內之六價鉻還原成三價鉻。
- 如請求項5所述含六價鉻污染物之處理方法，其中，該污染物係為六價鉻之濃度係大於0ppm且小於等於1500ppm。
- 如請求項5所述含六價鉻污染物之處理方法，其係包含下列步驟：步驟a：收集該污染物；步驟b：取該新穎微小桿菌YL-01與一發酵培養基，加入該污染物，進行發酵培養一預定時間；步驟c：產出一終產物，其中，該終產物之六價鉻含量幾乎為零。
- 如請求項7所述含六價鉻污染物之處理方法，其更包含有一步驟d，位於該步驟c之後：該步驟d：使該終產物中之三價鉻經化學反應而形成固態沈澱物。
- 如請求項7所述含六價鉻污染物之處理方法，其中，該步驟c中之該預定時間約為96小時。
- 如請求項5所述含六價鉻污染物之處理方法，其中，該污染物中六價鉻之濃度係大於0 ppm且小於等於1500 ppm。
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| CN109647875A (zh) * | 2017-10-11 | 2019-04-19 | 庄正 | 纤维微菌gtm1在铬污染土壤修复中的应用 |
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-
2022
- 2022-05-18 TW TW111118589A patent/TWI812228B/zh active
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 Benedict C. Okeke. Bioremoval of hexavalent chromium from water by a salt tolerant bacterium, Exiguobacterium sp. GS1. J Ind Microbiol Biotechnol. 35(12). 2008 Dec. 1571–1579.; * |
| 期刊 Sasmita Das et al. Reduction of hexavalent chromium by Exiguobacterium mexicanum isolated from chromite mines soil. Chemosphere. 282. Epub 2021 Jun 8. 131135. * |
Also Published As
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|---|---|
| TW202346568A (zh) | 2023-12-01 |
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