TWI798552B - 用於治療腦發炎和損傷並改善功能恢復的小窩蛋白１抗體 - Google Patents

用於治療腦發炎和損傷並改善功能恢復的小窩蛋白１抗體 Download PDF

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Abstract

本揭露係有關用於治療腦發炎和損傷並改善功能恢復的小窩蛋白1抗體。具體地，公開了針對小窩蛋白1的特異性抗體或其抗原結合片段在製備用於在有需要的受試者中治療與小窩蛋白1的腦水準升高有關的神經障礙、症狀或疾病的藥物的用途。還公開了針對小窩蛋白1的特異性抗體或其抗原結合片段在製備用於在有需要的受試者中減少腦發炎、腦組織損傷、腦神經元死亡，以及改善與出血性中風有關的行為預後或功能恢復的藥物的用途。

Description

用於治療腦發炎和損傷並改善功能恢復的小窩蛋白1抗體
本揭露主要關於小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)抗體和治療小窩蛋白1相關疾病的方法。
腦內出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一類由腦組織內或心室內出血所引起的中風。ICH占所有中風的10%至15%，但卻導致較高的死亡率和發病率。在ICH中，從血清和血細胞釋放的成分引起神經元細胞損傷並引發強烈的發炎反應，從而導致循環免疫細胞的浸潤和發炎介質的釋放，導致血腦屏障的破壞、繼發性神經元損傷和腦水腫形成。臨床上已經測試了許多治療方法，但是有效的治療仍然不能令入滿意。
因此，在本領域中需要提供一種減少由ICH所引起的腦損傷的有效方法。
本揭露係關於針對小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)的特異性抗體或其抗原結合片段在製備用於以下目的之藥物的用途：(1)在有此需要的 受試者中治療與小窩蛋白1(Cav-1)的腦水準升高有關的神經障礙、症狀或疾病；(2)在有此需要的受試者中減少腦發炎、腦組織損傷、腦神經元死亡，以及改善與出血性中風有關的行為預後或功能恢復；或(3)在有此需要的受試者中治療出血性中風。
治療藥物可以在神經障礙、症狀或疾病發生之前的30分鐘內、1小時內或2小時內施用於有此需要的受試者。治療藥物可以在所述神經障礙、症狀或疾病發生之後不遲於3小時或不遲於6小時施用於有此需要的受試者。
在另一個具體實施例中，有此需要的受試者處於在30分鐘內，或在1小時內，或在2小時內發生神經障礙、症狀或疾病的風險。
在另一個具體實施例中，有此需要的受試者是在神經障礙、症狀或疾病發生的6小時內，亦即，有此需要的受試者是在神經障礙、症狀或疾病發生之前或之後的6小時內，例如在0.5、1、2、3、4、5或6小時內。
有此需要的受試者可以是在出血性中風發生的1至24小時內或3至24小時內。亦即，有此需要的受試者是在出血性中風發生之後或之前的1至24小時內或3至24小時內。
在一個方面，本揭露係關於一種在有此需要的受試者中治療與小窩蛋白1的腦水準升高有關的神經障礙、症狀或疾病的方法。該方法包括向有此需要的受試者施用包含以下的組合物：
(a)治療有效量的針對Cav-1的特異性抗體或其抗原結合片段；和
(b)藥學上可接受的載體，
以在有此需要的受試者中治療與Cav-1的腦水準增加有關的神經障礙、症狀或疾病。
在一個具體實施例中，神經障礙、症狀或疾病是由腦內出血或出血性中風所引起的。
在另一個具體實施例中，施用步驟在神經障礙、症狀或疾病發生之前的1小時內或2小時內進行。
在另一個具體實施例中，施用步驟在神經障礙、症狀或疾病發生之後不超過或不遲於5小時，或不超過或不遲於6小時進行。
在另一個具體實施例中，施用步驟在神經障礙、症狀或疾病發生之後的3小時內進行。
針對Cav-1的特異性抗體可以是針對小窩蛋白1產生的多株抗體。小窩蛋白1可以是人源的。
在另一個具體實施例中，針對Cav-1的特異性抗體是針對定位在人源的小窩蛋白1的N-末端的肽而產生的多株抗體。
針對Cav-1的特異性抗體可以是單株抗體。它可以是針對人源的Cav-1而特異性產生的單株抗體。
施用步驟可以藉由腦室內(intracerebroventricular，i.c.v.)或靜脈內注射。
在一個具體實施例中，神經障礙、症狀或疾病是選自腦出血、腦損傷、腦發炎、腦水腫、凋亡神經元、半球萎縮和運動缺陷中的至少一種。
在另一方面，本揭露係關於一種用於在有此需要的受試者中減少腦出血、腦組織損傷、腦神經元死亡，以及改善與出血性中風有關的行為預後或功能恢復的方法。該方法包括向有此需要的受試者施用包含以下的組合物：
(a)治療有效量的針對小窩蛋白1的特異性抗體或其抗原結合片段；和
(b)藥學上可接受的載體，
以在有此需要的受試者中減少腦發炎、腦組織損傷、腦神經元死亡，以及改善與出血性中風有關的行為預後或功能恢復。
行為預後可以選自神經病學行為預後和不對稱運動行為預後中的至少一項。
在另一個具體實施例中，行為預後或功能恢復係選自改良神經功能損傷嚴重程度評分(modified neurological severity score，mNSS)和提升軀體搖擺試驗(elevated body swing test，EBST)比中的至少一項。
在另一方面，本揭露係關於一種在有此需要的受試者中治療出血性中風的方法。該方法包括向有此需要的受試者施用包含以下的組合物：
(a)治療有效量的針對小窩蛋白1的特異性抗體或其抗原結合片段；和
(b)藥學上可接受的載體，
以在有此需要的受試者中治療出血性中風。
在另一個具體實施例中，施用步驟在出血性中風發生的1至24小時或3至24小時期間內進行。
進一步地，在另一個具體實施例中，針對Cav-1的特異性抗體是全人單株抗體。
藉由結合以下附圖對具體實施例進行以下描述，這些和其他方面將因而變得顯而易見，但可在不脫離本揭露的新穎概念的精神和範圍下，對其進行變化和修改。
附圖顯示本揭露的一個或多個具體實施例，並且與書面描述一起用於解釋本揭露的原理。在全部附圖中，儘可能使用相同的附圖標記指代具體實施例的相同或相似元件。
圖1顯示了在ICH後，腦組織中的Cav-1誘導和抗Cav-1抗體治療的作用。(A)在ICH後3小時至7天，藉由蛋白質墨點法檢查Cav-1的表現(n=5-6)。(B、D至J)在ICH前1小時，i.c.v.注射抗Cav-1抗體或對照IgG。(B)在ICH後3小時至7天，藉由Cav-1+/Iba-1+細胞的螢光共定位檢測並定量小膠質細胞中Cav-1的表現(n=5)。比例尺=50μm。(C)在野生型(WT)和Cav-1剔除型(KO)腦裂解物中Cav-1的西方墨點分析。(E)用抗兔IgG抗體對腦裂解物中抗Cav-1抗體重鏈水準進行的西方墨點分析。(F)使用抗兔IgG抗體和OX-42抗體(抗CD11-b/c抗體)藉由螢光共定位檢測小膠質細胞中的抗Cav-1抗體。在ICH後1天，藉由ELISA測量(G)IL-6和(H)MIP-2水準(n=6)。在ICH後1天，在注射了對照IgG或1至5μg的抗Cav-1抗體的小鼠中測量(I)mNSS和(J)體重的行為預後。將切片用DAPI染色以顯示所有細胞核。A.U.：任意單位；mNSS：改良神經功能損傷嚴重程度評分。值是平均值±SEM。與假手術(sham)組相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。與ICH IgG組相比，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。
圖2顯示了抗Cav-1抗體治療改善了行為預後並減少了ICH後的腦水腫和神經元死亡。在ICH前1小時，i.c.v.注射抗Cav-1抗體或對照IgG。在ICH後1至28天，測量(A)mNSS和(B)EBST和(C)體重的行為預後(n=8)。(D、E)在ICH後1天和3天，藉由甲酚紫染色檢查損傷量和半球擴大率(n=8)。(F)在ICH後28天，藉由甲酚紫染色分析萎縮率(n=8)。比例尺=2mm。(G)在ICH後1天，藉由血紅蛋白測定評估出血量(n=6)。(H)在ICH後1天和3天，由腦水含量定量腦水腫水準(n=8)。(I)在ICH後1天和3天，藉由西方墨點法檢測剪切型半胱天冬酶3 (cleaved caspase-3)(n=5-6)。(J)在ICH後1天和3天，藉由FJB染色檢查變性的神經元(n=8)。比例尺=100μm。(K)在ICH後1天和3天，藉由TUNEL+/NeuN+細胞的螢光共定位檢測和定量凋亡神經元(n=6)。(L)在ICH後3天，藉由MRI檢測損傷量。將切片用DAPI染色以顯示所有細胞核。Contra：對側；Ipsi：同側；CX：皮質；BG：基底神經節；Cere：小腦。值是平均值±SEM。與假手術或對照組相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。與ICH IgG組相比，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。
圖3顯示了抗Cav-1抗體減少小膠質細胞活化並調節ICH後的小膠質細胞從M1至M2表型的極化。在ICH前1小時i.c.v.注射抗Cav-1抗體或對照IgG。在ICH後1天和3天，藉由Iba-1表現的免疫染色(A)和西方墨點(B)定量小膠質細胞活化(n=8)。(C)在ICH後1天和3天，藉由CD16/32+/Iba-1+細胞的螢光共定位檢測並定量經典活化型(classical-activated)(類M1)小膠質細胞(n=6)。(D、E)在ICH後1天和3天，藉由(D)CD206+/Iba-1+和(E)ARG1+/Iba-1+細胞的螢光共定位檢測替代活化型(alternative-activated)(類M2)小膠質細胞。比例尺=50μm。(F至I)在ICH後3天，藉由ELISA檢查IL-6、MIP-2、IL-4和IL-10水準(n=7-8)。將切片用DAPI染色以顯示所有細胞核。ARG1：精胺酸酶1。值是平均值±SEM。與假手術組相比，**p<0.01和***p<0.001。與ICH IgG組相比，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。
圖4顯示了抗Cav-1抗體治療抑制Cav-1表現並抑制ICH後P38和ERK信號傳導。在ICH前1小時，i.c.v.注射抗Cav-1抗體或對照IgG。在ICH後1天和3天，藉由西方墨點法檢測和定量(A)Cav-1、(B)P38磷酸化、(C)ERK磷酸化和(D)JNK磷酸化水準。值是平均值±SEM。(n=5- 6)。與假手術或對照組相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。與ICH IgG組相比，#p<0.05。
圖5顯示了抗Cav-1抗體治療藉由P38信號路徑減輕了原代小膠質細胞培養物中凝血酶誘導的發炎反應。用凝血酶加1μg/ml的抗Cav-1抗體或對照IgG處理原代小膠質細胞24小時(A、B)或1至3小時(C-I)。(A、B)藉由ELISA確定凝血酶誘導的IL-6和MIP-2表現。(C-I)藉由(C)iNOS和COX-2表現、(D)c-Jun磷酸化、(E)P65磷酸化、(F)Cav-1表現、(G)P38磷酸化、(H)ERK磷酸化和(I)JNJ磷酸化的西方墨點測定凝血酶誘導的小膠質細胞活化(n=3-4)。值是平均值±SEM。與對照組相比，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。與凝血酶IgG組相比，#p<0.05和###p<0.001。
圖6顯示了ICH後，用抗Cav-1抗體的延遲治療減少了腦損傷和神經元死亡，並調節了小膠質細胞從M1至M2表型的極化。在ICH後3小時，藉由尾靜脈靜脈注射抗Cav-1抗體(100μl鹽水中20μg)。在ICH後1天和3天，評估(A)mNSS和(B)EBST和(C)體重的行為預後(n=9)。(D)在ICH後3天，藉由甲酚紫染色評估損傷量和半球擴大率(n=5-6)。比例尺=2mm。在ICH後3天，測定(E)藉由FJB染色評估的神經元變性，和(F)藉由Iba-1免疫染色評估的小膠質細胞活化。(G)在ICH後3天，藉由CD16/32+/Iba-1+細胞的螢光共定位檢測經典活化型(類M1)小膠質細胞(n=5-6)。(H、I)在ICH後1天和3天，藉由(H)CD206+/Iba-1+和(I)ARG1+/Iba-1+細胞的螢光共定位確定替代活化型(類M2)小膠質細胞(n=6)。比例尺=50μm。將切片用DAPI染色以顯示所有細胞核。值是平均值±SEM。與ICH IgG組相比，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。
圖7顯示了延遲的靜脈內抗Cav-1治療調節了浸潤的巨噬細胞的M1/M2極化。在ICH後3小時，藉由尾靜脈靜脈注射抗Cav-1抗體或對照IgG(100μl鹽水中20μg)。(A)在ICH後3天，在注射了IgG的對照小鼠中藉由Cav-1和CCR2的螢光共定位來檢測巨噬細胞中Cav-1的表現。(B)在ICH後3天，藉由CCR2和DAPI染色對浸潤的巨噬細胞進行定量(n=6)。(C)在ICH後3天，藉由CCR2+/CD16/32+細胞的螢光共定位檢測經典活化型(類M1)巨噬細胞(n=6)。(D、E)在ICH後1天和3天，藉由(D)CCR2+/CD206+和(E)CCR2+/ARG1+細胞的螢光共定位來確定替代活化型(類M2)巨噬細胞(n=6)。將切片用DAPI染色以顯示所有細胞核。比例尺=50μm。值是平均值±SEM。與ICH IgG組相比，#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001。(F)提出抗Cav-1抗體治療如何調節ICH後的發炎反應及其在腦保護中的預後模型。
圖8顯示了ICH後Cav-1的表現和抗Cav-1抗體治療的作用。(A、B)在ICH後3小時至7天，藉由Cav-1+/GFAP+細胞的螢光共定位來檢測和定量星形膠質細胞中Cav-1的表現(n=5)。比例尺=50μm。(C)用不同的抗Cav-1抗體在野生型(WT)和Cav-1剔除型(KO)腦裂解物中的Cav-1的西方墨點分析。比例尺=50μm。(D)藉由抗兔IgG抗體和NeuN或GFAP的螢光共定位檢測神經元和星形膠質細胞中的抗Cav-1抗體。比例尺=10μm。(E)在ICH後6小時，藉由ELISA測量IL-6和MIP-2水準(n=6)。(F)在ICH後6小時，藉由血紅蛋白測定評估出血量(n=6)。
圖9顯示了抗Cav-1抗體治療減少了ICH後的中性粒細胞浸潤。在ICH後1天和3天，藉由MPO染色檢測中性粒細胞浸潤。
圖10顯示了抗Cav-1抗體治療降低了凝血酶誘導的亞硝酸鹽、IL-6和MIP-2的產生。BV2細胞用凝血酶加0.1至1μg/ml的抗Cav-1抗體或對 照IgG處理24小時。(A)在亞硝酸鹽產生中抗Cav-1抗體處理的劑量依賴性作用(n=6)。(B、C)藉由ELISA確定凝血酶誘導的IL-6和MIP-2表現(n=6)。
圖11顯示了延遲的抗Cav-1抗體治療減少了ICH後的中性粒細胞浸潤。在ICH後3天，藉由MPO染色檢測中性粒細胞浸潤。
定義
如本文所用，術語「抗體」包括與特異性抗原結合的任何單株抗體、多株抗體、多特異性抗體或雙特異性(二價)抗體。
術語「治療(treating或treatment)」是指將有效量的治療劑施用於具有疾病或具有這種疾病的症狀或易患這種疾病的傾向的有需要的受試者，用以治癒、減輕、緩解、醫治或改善此疾病、其症狀或易患這種疾病的傾向。該受試者可由專業醫護人士根據任何適合的診斷方法的結果來鑑別。
「有效量」是指賦予受治療的受試者治療效果所需的活性化合物的量。如本領域技術人員所認識到的，有效劑量將視施用途徑、賦形劑使用及與其他治療性處理共同使用的可能性而不同。
術語「腦損傷」和「腦組織損傷」是可以互換的。
由美國衛生與公共服務部食品藥品監督管理局(U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration)發佈的「評估成人健康志願者治療的臨床試驗安全起始劑量的行業和審查人員指南(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」公開了「治療有效量」可藉由下式由計算得到：
HED=以mg/kg計的動物劑量×(以kg計的動物重量/以kg計的人類重量)0.33。
小窩蛋白1(N-20)是指sc-894抗體(SANTA CRUZ Biotech,Inc.,CA，美國)，是一種親和純化的兔多株抗體，其是針對定位在人源小窩蛋白1的N端的肽而產生的。
約1至24小時意味著該範圍內的全部十分之一和整數單位量都被具體公開作為本揭露的一部分。因此，包括1、1.1、1.2、1.3、……1.7、1.8、1.9、2、……23.8、23.9和24的單位量作為本揭露的具體實施例。
約3至24小時意味著該範圍內的全部十分之一和整數單位量都被具體公開作為本揭露的一部分。因此，包括3、3.1、3.2、3.3、……3.7、3.8、3.9、4、……23.8、23.9和24的單位量作為本揭露的具體實施例。
「在發生1至24小時視窗內」是指發生之前或之後1至24小時內。
「在發生3至24小時視窗內」是指發生之前或之後3至24小時內。
本揭露關於發現藉由抗Cav-1抗體(Ab)處理來抑制Cav-1在小鼠ICH模型中具有保護作用。抗Cav-1抗體的預先處理或延遲處理減少了ICH後的發炎和腦損傷。
實施例
材料和方法
動物
將成年雄性C57BL/6J小鼠(8至12周齡，體重22至28g)飼養在無特定病原體的環境中，並進行溫度和濕度控制。所有動物程序和實驗方 案均遵循美國國立衛生研究院(US National Institutes of Health)出版的《實驗動物的護理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)》。
實驗性ICH模型
簡而言之，將小鼠用戊巴比妥鈉麻醉並置於立體定位框架中。使頭皮縮回後，使用牙科的鑽-環鋸(dental drill-trephine)在前囪之前0.8mm且中線右側2.5mm處鑽一個1.0mm的鑽孔。為誘導ICH，經由漢密爾頓注射器上的30號針頭，藉由微型輸液泵在10分鐘內以0.05μl/min的速度注射細菌膠原酶(0.5μL鹽水中0.075U；VII-S型，Sigma)，該針頭使用立體定位座標：前囪之前+0.8mm、側向+2.5mm植入右側紋狀體至深度為2.5mm。將針頭再留20分鐘以防止回流。取下針頭後，用牙骨水泥密封開顱顱骨並縫合頭皮。在整個手術過程中，使用加熱墊將小鼠維持在37±0.5℃，並置於溫暖的環境中以進行恢復。假手術小鼠以相同方式接受等體積的生理鹽水。
腦室內和靜脈內注射
簡而言之，將漢密爾頓注射器的30號針頭使用立體定向座標：前囪之前-0.5mm、側向+1.0mm插入側腦室至深度為2.0mm，並以0.25μL/min的速率注入抗體。然後，藉由微型輸液泵注入兔對照IgG(5μg/2.5μL；無疊氮化鈉；I5006，Sigma-Aldrich)或抗Cav1抗體(5μg/2.5μL；無疊氮化鈉；sc-894，Santa Cruz，SC)持續10分鐘。注入後50分鐘取下針頭以防止回流，並在抗體注射後1小時進行ICH程序。對於靜脈內注射，在ICH後3小時，藉由尾靜脈注射100μL鹽水中的20μg抗體。
神經功能缺陷評估試驗
如Wu等人(J.Neuroinflammation 2016,13：62)所述，應用改良神經功能損傷嚴重程度評分(mNSS)，藉由測定運動、感覺、反射和平衡試驗(總計18分)來評估功能缺陷，該文獻藉由引用併入本文。分數越高表示損傷越嚴重。
軀體擺動測量試驗
進行用於評估不對稱運動行為的提升軀體搖擺試驗(EBST)，同時略微進行了修改。將小鼠藉由尾巴垂直懸垂，倒垂離地面約1英寸。記錄擺動行為的頻率和方向，持續30s。當動物的頭從垂直軸向任一側移動大於10度時，計為一次擺動。ICH小鼠的擺動活動顯示出明顯偏向於出血側對側的方向。向左側進行的擺動總數除以擺動總數，即可獲得左偏擺動的百分比。
血紅蛋白測量
定量ICH腦的血紅蛋白含量。終末麻醉後，用0.9%的鹽水對小鼠進行心臟灌注，以清除ICH後的血管內血液。之後，收集小鼠腦的同側和對側半球，並向每個半球中加入PBS緩衝液(300μL)，然後在冰上超音波處理1分鐘，並在4℃下以13,000rpm離心30分鐘。將Drabkin試劑(80μL)添加到20μL等分的上清液中，並在室溫下靜置15min(避光)。然後在540nm的波長下測量光密度，以測定氰化正鐵血紅蛋白的濃度。對於標準曲線，在麻醉的對照小鼠中藉由心臟穿刺收集血液。然後將這種血液的增量體積(0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0μL)添加到300μL來自正常半球樣本的組織裂解物中。
腦水含量測量
測定腦水含量以代表腦水腫。終末麻醉後，在ICH後將小鼠斷頭。立即取出腦，將其分為五個部分，由同側和對側皮質、同側和對側基底神經節以及小腦(用作內部對照)組成。立即稱量腦樣本以獲得濕重，然後在100℃下乾燥24小時以獲得乾重。使用以下公式計算每個樣本的水含量：[(濕重-幹重)/濕重]×100%。
磁共振成像
如前所述，使用3 TMRI系統(TRIO 3T MRI,Siemens MAGNETOM，德國)進行磁共振成像(MRI)。藉由在受傷後第1天和第4天獲得的T2加權圖像測定腦水腫。T2加權成像的參數如下：重複時間/回波時間=3500/75ms，矩陣=125×256，視場=25×43mm，截面厚度=1.0mm。成像平面位於穿過病變部位的中心。在將TBI前後的圖像強度標準化後，高強度區域代表水腫區域。由不知情的操作員使用MRI系統軟體(NUMARIS/4，版本syngo MR B17,Siemens MAGNETOM)的ROI工具手動繪製感興趣的區域(ROI)。藉由累加四個切片測得的水腫面積並乘以切片厚度(1.0mm)，由T2加權圖像測定水腫體積。
用於組織學的組織處理
終末麻醉後，對小鼠先後用PBS和4%多聚甲醛進行心臟灌注。取出腦，在4%多聚甲醛中固定過夜，然後轉移到含有30%蔗糖的PBS中進行冷凍保護。此後，在低溫恆溫器中，在整個損傷區域上將腦切成10μm的冠狀切片。
出血性損傷和半球擴大率分析
使用在20吻-尾(rostral-caudal)水準上用甲酚紫染色的間隔為200μm的冠狀切片定量損傷量、半球萎縮、紋狀體萎縮和半球擴大率。使用Image J軟體1.48版(Image J，美國國立衛生研究院，貝塞斯達(Bethesda)，馬裡蘭州(MD)，USA)對切片進行分析。體積測量是藉由將面積乘以層間距離(200μm)的總和來計算的。藉由以下公式計算半球或紋狀體萎縮：[(對側半球或紋狀體體積-同側半球或紋狀體體積)/對側半球或紋狀體體積]×100%。藉由以下公式計算半球擴大率：[(同側半球體積-對側半球體積)/對側半球體積]×100%。由對所有動物組不知情的兩名實驗者進行了分析。評價者間的可靠性在10%以內。
免疫組織化學
進行了免疫組織化學分析。在淬滅內源性過氧化物酶活性並阻斷非特異性結合後，使切片與一級抗體〔兔抗髓過氧化物酶(MPO，中性粒細胞標誌物；Dako)〕，兔抗離子鈣結合接頭分子(ionized calcium-binding adaptor molecule)1(Iba-1，小膠質細胞/巨噬細胞標誌物；Wako)在4℃下反應過夜。然後將切片與二級抗兔抗體(Santa Cruz)一起反應2小時，使用二胺基聯苯胺作為過氧化物酶基質，根據Vectastain Elite ABC試劑盒(Vector Laboratories)的說明書進行比色檢測。在幾種對照程序中測定染色反應的特異性，包括省略了一級抗體和用非免疫兔血清替代一級抗體。
雙重免疫螢光
為了測定Cav-1的細胞定位，藉由將小鼠抗Cav-1或兔抗Cav-1(Santa Cruz)與小鼠單株CD1 lb/c抗體(OX42，小膠質細胞/巨噬細胞標誌物，GeneTex)、小鼠抗神經元核抗原(NeuN，神經元標誌物；Millipore)、 兔抗Iba-1(Wako)、大鼠抗神經膠質原纖維酸性蛋白(GFAP；星形膠質細胞標誌物；Invitrogen)或CD31(內皮細胞標誌物，BD Biosciences Pharmigen)在4℃下同時反應過夜來進行雙重免疫螢光標記。為了測定不同類型的小膠質細胞活化，藉由將兔抗Iba-1與大鼠抗CD16/32(BD Biosciences)、小鼠抗CD206(Bio Rad)、小鼠抗精胺酸酶1(ARG1，BD Sciences)或CCR2(巨噬細胞標誌物，Novus)在4℃反應過夜來進行免疫染色。然後洗滌切片，用Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594偶聯的二級抗體(Molecular Probes)反應2小時，並在螢光顯微鏡下觀察。
Fluoro-Jade B染色
Fluoro-Jade B(FJB)是一種以高靈敏度和特異性結合變性神經元的多陰離子螢光素衍生物，進行Fluoro-Jade B(FJB)染色。簡而言之，將切片分別在梯度乙醇溶液(100%和70%)和蒸餾水中再水化5分鐘，在0.006%KMnO4中反應30分鐘，在蒸餾水中沖洗2分鐘，在0.001%FJB(Chemicon)溶液中反應30分鐘，並在螢光顯微鏡下於450至490nm下觀察。
TUNEL測定
使用末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)染色來用異硫氰酸螢光素標記凋亡細胞(原位細胞死亡檢測試劑盒(In situ Cell Death Detection Kit)；Roche Molecular Biochemicals)。將切片用含有末端去氧核苷酸轉移酶的TUNEL反應混合物在37℃下染色60分鐘，然後與小鼠抗NeuN一起在4℃反應過夜，並與Alexa Fluor 594偶聯的二級抗體(Molecular Probes)一起反應2小時。於螢光顯微鏡下在激發光下檢測圖像。
FJB、NeuN、Iba-1和MPO染色的定量
在距前囪0.24mm的水準處從出血核心連續三個切片上定量FJB、NeuN、Iba-1和MPO染色。用×200的放大倍數在緊鄰血腫的10至12個非重疊區域中的920×860μm2區域中計數陽性細胞的數量。如果Iba-1陽性的靜息小膠質細胞/巨噬細胞包含具有長的細長突起的相對較小的細胞體(直徑小於7.5μm)，則其被定義為靜息。當與靜息的小膠質細胞相比，細胞體大小增加且具有短而厚的突起和強烈的免疫強度時，小膠質細胞/巨噬細胞被定義為活化的。活化的小膠質細胞/巨噬細胞是根據形態學標準和7.5μm的細胞體直徑截斷值的組合定義的。NeuN陽性細胞、FJB陽性細胞、Iba-1陽性細胞和MPO陽性細胞的總數表示為每個視野的平均數。由對所有動物組不知情的兩名實驗者進行了分析。評價者間的可靠性在10%以內。
定量免疫共定位分析
分析了Cav-1與Iba-1的共定位或者Iba-1與CD16/32、CD206或ARG1的共定位。簡而言之，將合併圖像中的共定位信號轉換為灰階圖，並藉由Image J軟體進行計算。共定位的程度以任意單位表示。
西方墨點分析
在ICH或假手術後，收集來自同側半球的2mm厚的冠狀切片。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠分離等量的蛋白質(對組織樣本，20μL中的35至50μg蛋白，以及對於細胞裂解物，20μL中的20μg蛋白)，轉移至Immobilon-P膜，用在含0.1%Tween-20的PBS中的5%奶封閉，並在4℃下用一級抗體探測過夜。兔抗iNOS和兔抗COX-2來自開曼化學(Cayman Chemical)。兔抗剪切型半胱天冬酶3、兔抗磷酸p38、兔抗總p38、兔抗磷酸胞外信號調節激酶p44/42、兔抗全Erk、兔抗磷酸Jun胺基末端激酶(JNK，Thr183/Tyr185)、兔抗總JNK、兔抗磷酸P65、兔抗磷酸c-Jun和兔抗c-Jun來自細胞信號傳導公司(Cell Signaling)。小鼠抗β-肌動蛋白來自Sigma-Aldrich。然後將膜與辣根過氧化物酶連接的抗兔或抗小鼠二級抗體一起在4℃反應1小時。使用Image J軟體定量蛋白質條帶強度，並將蛋白質信號的相對強度標準化為相應的β-肌動蛋白強度。
酶聯免疫吸附測定和亞硝酸鹽測定(ELISA)
手術後，如西方墨點分析一樣收集腦樣本。使用商購的ELISA試劑盒(R&D Systems)在腦勻漿或細胞裂解物中測量巨噬細胞炎性蛋白2(MIP-2)、白介素(IL)-6、IL-1β、IL-4和IL-10。所有樣本和標準品均按照製造商的說明書一式兩份進行測定。藉由使用Griess試劑測量培養上清液的亞硝酸鹽水準來評估一氧化氮(NO)的產生。
小膠質細胞系培養
在37℃，5%CO2濕潤環境下，將BV2小鼠小膠質細胞在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco/BRL)、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM；Gibco/BRL)中培養。在不存在或存在不同濃度的抗Cav-1抗體(sc-594，Santa Cruz)的情況下，用0.1μg/mL LPS或10U/mL凝血酶刺激BV2小膠質細胞24小時。用不同批次的培養物重複實驗四次。
小鼠原代小膠質細胞培養
小鼠原代小膠質細胞獲自P7產後小鼠腦紋狀體，並在37℃，5%CO2濕潤環境下，在補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS；Gibco)、100U/mL青黴素和100μg/mL鏈黴素的洛斯維.派克紀念研究所培養基(Roswell Park Memorial Institute’s media，RPMI；Gibco/BRL，貝塞斯達，馬裡蘭州，美國)中培養。培養14天後即可使用小膠質細胞，並在不存在或存在抗Cav-1抗體的情況下，用10U/mL凝血酶+100ng/mL IFN-γ刺激24小時。用獨立的培養物重複實驗四到五次。
統計分析
所有資料均以平均值±平均值的標準誤差(SEM)表示。對於多組，使用單因素或雙因素方差分析(ANOVA)，然後進行事後Bonferroni檢驗評估，來確定顯著性差異。Student t檢驗用於檢驗兩組之間的差異。統計學顯著性設定為P<0.05。
結果
在ICH後，小膠質細胞/巨噬細胞中Cav-1蛋白表現增加
藉由西方墨點分析檢查了在ICH後3小時至7天的Cav-1的誘導。ICH在3小時、6小時、1天和3天在出血半球中誘導Cav-1蛋白水準的增加(分別為假手術水準的303%、392%、423%和231%；圖1的A)。該水準在1天達到峰值，然後在3天下降。在ICH後7天，Cav-1蛋白水準略有增加，但與假手術對照水準無明顯差異(假手術水準為178%；P=0.079)。使用雙重免疫螢光染色檢查在ICH後，腦中小膠質細胞/巨噬細胞中的Cav-1表現。在ICH後6小時、1天、3天和7天，小膠質細胞/巨噬細胞中Cav-1被顯著誘導(假手術水準的526%、1425%、1327%和699%)，在1天和3天達到 峰值(圖1的B、C)。進一步檢查了Cav-1與GFAP+細胞的共定位水準，結果顯示，在假手術對照腦中或在ICH後，在星形膠質細胞中很少表現Cav-1蛋白(圖8的A、B)。該資料顯示，Cav-1可能參與了ICH誘導的小膠質細胞/巨噬細胞的活化，並且這種作用可能早在ICH後6小時。
抗Cav-1抗體治療減少腦發炎和腦組織損傷並改善ICH後的長期行為預後
藉由對來自Cav-1基因剔除小鼠的腦樣本進行免疫墨點，驗證了三種商業抗Cav-1抗體的特異性。在這三種測試抗體中，只有sc-894抗體未在Cav-1基因剔除的腦裂解物中檢測到Cav-1蛋白(圖1的D)，另外兩種候選抗體仍在Cav-1基因剔除的腦裂解物中檢測到在約22kDa處的Cav-1免疫反應帶(圖8的C)。因此，選擇sc-894抗體(抗Cav-1抗體)用於以下實驗。在ICH前1小時藉由腦室內(i.c.v.)注射遞送抗Cav-1抗體。i.c.v.注射後長達7天用抗兔IgG抗體進行的抗Cav-1抗體的西方墨點分析顯示在約55kDa處有一個免疫反應帶，對應於腦裂解物中的重鏈(圖1的E)，這表明抗Cav-1抗體可以在大腦中維持7天以上。在i.c.v.注射後1天，在小膠質細胞/巨噬細胞(圖1的F)和神經元中觀察到兔IgG染色，但在星形膠質細胞(圖8的D)中未觀察到。然後，進一步研究了抗Cav-1抗體的抗炎作用。用1、2和5μg/2.5μL Cav1-抗體處理均能夠降低ICH後1天時IL-6(圖1的G)和MIP-2(圖1的H)的細胞激素表現，並且5μg/2.5μL的劑量效果最好。僅5μg/2.5μL的劑量降低了在ICH後1天時的mNSS評分(圖1的I)，並且在不同劑量的抗Cav-1抗體注射後，體重沒有變化(圖1的J)。因此，在後續實驗中使用的劑量為5μg/2.5μL。在ICH後6小時，用5μg/2.5μL抗Cav-1抗體處理也降低了IL-6(圖8的E)和MIP-2(圖8的F)的表現。
由於大多數ICH患者均遺留有運動缺陷，因此進一步評估了長期功能預後。從ICH後1天到28天，用抗Cav-1抗體治療的小鼠顯示出比對照組更好的mNSS和EBST比率(圖2的A、B)，而兩組小鼠的體重變化相似(圖2的C)。為了確定觀察到的功能恢復變化是否反映在腦組織損傷和神經元死亡的減少中，對組織學預後進行了評估。甲酚紫染色顯示，與安慰劑組相比，在第1天和第3天，抗Cav-1抗體治療分別將出血損傷量顯著降低了22%和34%(圖2的D、E)。半球擴大率(腦水腫的指標)在第1天(9.21±0.99%對12.22±0.93%；圖2的D)和第3天(2.53±0.57%對6.12±1.12%；圖2的E)在抗Cav-1抗體治療的小鼠中也顯著小於在安慰劑治療的小鼠中。進一步評估了抗Cav-1抗體治療是否減輕ICH慢性期的腦組織損傷。與急性期的保護作用一致，抗Cav-1抗體治療顯著降低了28天時的半球萎縮率(7.34±0.71%對10.71±0.70%；圖2的F)。然而，抗Cav-1抗體在6小時(圖8的G)或1天(圖2的G)均不影響血腫大小(臨床ICH的主要預後指標)，顯示Cav-1抑制的保護作用與血塊形成無關。
抗Cav-1抗體治療減少ICH後的腦水腫和神經元死亡
與IgG組相比，在ICH後第1天(79.47±0.52%對83.43±1.05%)和第3天(80.56±1.17%對84.84±1.32%)，在抗Cav-1抗體組的同側基底神經節中的腦水含量顯著降低(圖2的H)。在施用抗Cav-1抗體後，與施用IgG相比，中性粒細胞浸潤(血腦屏障破壞和腦水腫的主要結果)在第1天(53.80±2.57對69.76±5.50個細胞/視野)和第3天(62.27±3.57對86.21±3.18個細胞/視野)也都減少(圖9)。
在抗Cav-1抗體治療後，在第1天(IgG水準的46%)和第3天(IgG水準的51%)，剪切型半胱天冬酶3(細胞凋亡的最終效應物)的水準 顯著降低了(圖2的I)。抗Cav-1抗體治療與施用IgG相比，在第1天和第3天都顯著減弱了血腫周圍的變性神經元的數量(FJB+細胞；第1天為38.25±1.44對50.30±2.94個細胞/視野，第3天為43.43±1.24對60.44±1.33個細胞/視野；圖2的J)以及凋亡神經元信號(TUNEL+/NeuN+細胞)(圖2的K)。應用MRI來測定在活體動物中的腦損傷程度，顯示在ICH後第3天時，抗Cav-1抗體治療組與IgG對照相比，病變體積明顯減少(12.63±0.96對17.40±0.95mm3)(圖2的L)。
抗Cav-1抗體治療減少促炎性M1小膠質細胞/巨噬細胞活化並增強ICH後的抗炎性M2小膠質細胞/巨噬細胞回應
在第1天和第3天在血腫周圍觀察活化的小膠質細胞/巨噬細胞(細胞體擴大的Iba-1+細胞)，並且與IgG對照相比，在抗Cav-1抗體治療的小鼠中，活化的小膠質細胞/巨噬細胞的數量在第1天(29.63±0.89對39.64±0.90個細胞/視野)和第3天(38.56±1.70對54.16±2.56個細胞/視野)顯著減少(圖3的A)。抗Cav-1抗體處理後，Iba-1的蛋白質表現也降低(圖3的B)。藉由免疫螢光染色，用經典活化型M1小膠質細胞/巨噬細胞的標誌物(CD16/32)或替代活化型M2小膠質細胞/巨噬細胞的標誌物(CD206，ARG1)確定小膠質細胞表型。在第1天和第3天，雖然在假手術的腦中未觀察到CD16/32+/Iba-1+、CD206+/Iba-1+或ARG1+/Iba-1+細胞，但ICH在血腫周圍區域中誘導了CD16/32+/Iba-1+、CD206+/Iba-1+和ARG1+/Iba-1+細胞的增加(圖3的C至E)。在血腫周圍區域中的CD16/32+/Iba-1+信號在第1天和第3天顯著減少，而CD206+/Iba-1+或ARG1+/Iba-1+信號在ICH後3天在抗Cav-1抗體治療的小鼠中均增加(圖3的C至E)。根據抗Cav-1抗體治療後降低的M1極化和升高的M2表型，用抗Cav-1抗體治療在ICH後3天降低了促炎細胞激素 IL-6和MIP-2的表現(圖3的F至G)，並增加了抗炎細胞激素IL-4和IL-10的表現(圖3的H、I)。這些結果顯示，對Cav-1的抑制降低了ICH誘導的小膠質細胞/巨噬細胞活化，並且將小膠質細胞/巨噬細胞極化從促炎狀態轉變為抗炎狀態。
抗Cav-1抗體治療降低ICH後Cav-1的誘導和MAPK信號的活化
ICH在第1天和第3天都誘導Cav-1蛋白表現以及P38和JNK的磷酸化的增加(圖4的A、B和圖4的D)。增加的ERK磷酸化被延遲至ICH後3天(圖4的C)。抗Cav-1抗體治療在ICH後第3天抑制了Cav-1誘導，但在第1天沒有抑制(圖4的A)。抗Cav-1抗體治療降低了ICH後第1天和第3天時P38的磷酸化，降低了第3天時ERK的磷酸化，但不降低JNK的磷酸化(圖4的B至D)。這些資料顯示，抗Cav-1抗體治療針對ICH的保護機制可能與抑制P38和ERK活化有關。
抗Cav-1抗體治療藉由P38MAPK信號路徑減少小膠質細胞培養物中凝血酶誘導的發炎反應
直接使用BV2小膠質細胞系和原代小鼠小膠質細胞培養確定Cav-1抑制對小膠質細胞的作用。凝血酶是一種在ICH中在凝血期間以高水準釋放的絲胺酸蛋白酶，其用於活化小膠質細胞。結果顯示，用10U/mL凝血酶對BV2小膠質細胞處理24小時誘導亞硝酸鹽的產生顯著增加。以0.01、0.1和1μg/mL劑量的抗Cav-1抗體進行共同處理顯著減少亞硝酸鹽的產生，並且1μg/mL的抗Cav-1抗體提供最高程度的抗炎保護(圖10的A)。因此，後續研究採用1μg/mL的劑量。類似地，在施用1μg/mL的抗Cav-1抗體後，在BV2細胞的條件培養基中的促炎細胞激素IL-6和MIP-2的水準降低(圖10的B、 C)。與對BV2細胞的作用相似，抗Cav-1抗體處理在刺激後24小時降低原代小鼠小膠質細胞的培養基中的細胞激素IL-6和MIP-2的水準(圖5的A、B)。在凝血酶暴露後3小時，在凝血酶刺激的原代小膠質細胞中抗Cav-1抗體處理後，iNOS和COX-2(兩種促炎酶)的蛋白表現顯著減弱(圖5的C)。AP(啟動蛋白)-1和NF-κB是兩個轉錄因子，其誘導許多關於腦發炎基因的表現，並且是MAPK信號傳導的下游效應物。凝血酶刺激後，總c-Jun(AP-1家族的關鍵成員)和p-c-Jun水平均增加(圖5的D)。然而，在暴露後1小時和3小時，凝血酶刺激僅增加p-P65(NF-κB活化的指示劑)，但均不影響總P65水準(圖5的E)。用抗Cav-1抗體處理顯著降低了在刺激後1小時和3小時的凝血酶誘導的P65和c-Jun的磷酸化(圖5的D、E)。抗Cav-1抗體直接降低凝血酶刺激後1小時的Cav-1蛋白表現和P38磷酸化(圖5的F、G)。在凝血酶刺激後1小時或3小時，在IgG處理組和抗Cav-1抗體處理組之間，ERK和JNK的磷酸化沒有差異(圖5的H、I)。這些結果顯示抗Cav-1抗體可藉由抑制P38-MAPK信號路徑抑制促炎性小膠質細胞的活化。
延遲靜脈內抗Cav-1抗體治療減少腦損傷和神經元死亡，並調節小膠質細胞/巨噬細胞的M1/M2極化
藉由靜脈內途徑發生ICH後，將抗Cav-1抗體治療延遲了3小時。在ICH後3小時開始的抗Cav-1抗體治療仍顯著減少了在第3天藉由mNSS評估的總體神經功能缺陷和藉由提升軀體擺動試驗評估的運動不對稱性(圖6的A、B)。在3天的觀察期內，在IgG治療組和抗Cav-1抗體治療組之間，體重變化沒有顯著差異(圖6的C)。延遲的抗Cav-1抗體治療在ICH後第3天時還減少了損傷量和半球擴大率(腦水腫的指標)(圖6的D)，並減弱了血腫周圍區域附近的FJB陽性神經元的數量(圖6的E)和中性粒細胞 浸潤(圖11)。抗Cav-1抗體的延遲治療在第3天時降低了在血腫周圍區域中的小膠質細胞/巨噬細胞活化和CD16/32+/Iba-1+信號，並增加了CD206+/Iba-1+和ARG1+/Iba-1+信號(圖6的F至I)。這些資料顯示對Cav-1的延遲抑制仍然發揮神經保護作用，並且該作用可能是藉由調節小膠質細胞/巨噬細胞的M1/M2極化來介導的。
延遲靜脈內抗Cav-1抗體治療調節浸潤巨噬細胞的M1/M2極化
為了研究靜脈施用抗Cav-1抗體是否減少外周來源的巨噬細胞浸潤，使用CCR2染色來標記巨噬細胞。在ICH後第3天在CCR2+細胞上表現Cav-1蛋白(圖7的A)。經由外周施用的抗Cav-1抗體的延遲治療在第3天在血腫周圍區域中減少了CCR2+細胞的數目(55.15±2.13對47.84±0.59個細胞/視野)(圖7的B)，還減少了CD16/32+/CCR2+信號，增加了CD206+/CCR2+信號和ARG1+/CCR2+信號(圖7的C至E)。這些結果顯示，巨噬細胞的M1/M2極化調節可能與延遲的Cav-1抑制的神經保護作用有關。
本揭露關於藉由在實驗性出血性中風中使用中和抗體來抑制Cav-1的作用。以下發現支持了在ICH中抗Cav-1抗體治療的保護作用：(1)抗Cav-1抗體治療(i.c.v.注射)減少ICH誘導的腦損傷；(2)在ICH後3小時的延遲抗Cav-1抗體治療(i.v.注射)減少ICH誘導的腦損傷；(3)抗Cav-1抗體治療同時抑制ICH誘導的發炎反應和凝血酶誘導的小膠質細胞發炎反應；(4)抗Cav-1抗體治療(i.c.v.或i.v.注射)減少ICH後的小膠質細胞和浸潤的巨噬細胞活化，調節小膠質細胞和浸潤的巨噬細胞極化，以減少經典活化型類M1(促炎性)小膠質細胞/巨噬細胞，並增加替代活化型類M2(抗炎性)小膠質細胞/巨噬細胞。
經由i.c.v.注射的抗Cav-1抗體在遭受ICH的小鼠中降低了小膠質細胞/巨噬細胞活化，並減弱了p38 MAPK活化。抑制Cav-1改善了長期行為預後，減輕腦水腫，減少了腦組織損傷和神經元死亡。Cav-1抑制在小膠質細胞培養物中減弱了凝血酶刺激的P38 MAPK-AP-1/NF-κB信號傳導的活化。當藉由靜脈內施用而使用更臨床相關的治療時間視窗時，抗Cav-1抗體治療仍具有神經保護作用。Cav-1可能是減少由小膠質細胞/巨噬細胞介導的出血後腦發炎反應的潛在候選者。
Iba1+細胞中Cav-1蛋白的增加始於ICH後6小時，而Cav-1抗體(i.c.v.注射)最早在6小時(即募集周圍巨噬細胞之前的一個時間點)就降低了細胞激素的表現。Cav-1抗體在原代小膠質細胞培養物中減少了凝血酶誘導的小膠質細胞活化，顯示Cav-1抑制表現出對小膠質細胞活化的直接作用。在ICH後3小時經由i.v.的抗Cav-1抗體的延遲治療減少了CCR2+巨噬細胞的浸潤，這顯示血液來源的巨噬細胞也是Cav-1介導發炎的靶標。除了抑制經典活化型M1小膠質細胞/巨噬細胞的活化外，抗Cav-1抗體誘導了小膠質細胞/巨噬細胞極化為替代活化型M2表型。該結果暗示Cav-1抑制在抑制小膠質細胞/巨噬細胞介導的發炎反應和調節小膠質細胞/巨噬細胞的極化中扮演重要作用。
Cav-1在腦損傷中的作用一直存在爭議。本揭露發現抑制Cav-1減少了ICH誘導的腦損傷和神經發炎，並在小膠質細胞培養物中減弱了凝血酶誘導的小膠質細胞活化。結果暗示，Cav-1是小膠質細胞/巨噬細胞回應於ICH的有害作用的關鍵因素。
總之，抑制Cav-1改善了ICH後的神經功能恢復，減少了腦組織損失和腦水腫，並限制了神經變性(圖7)。抑制Cav-1還抑制了ICH誘導的促炎性小膠質細胞/巨噬細胞活化。在培養的小膠質細胞中，抑制Cav-1降低 了P38 MAPK-AP1和NF-κB信號傳導的活化。因此，抗Cav-1抗體(例如人單株抗體)可具有作為治療ICH的新策略的潛力。
僅出於說明和描述的目的給出了對本揭露的示例性具體實施例的前述描述，而無意於窮舉本揭露或將本揭露限制為所公開的精確形式。根據以上教導，許多修改和變化是可能的。在本說明書中引用和討論的所有參考文獻均藉由引用以其整體併入本文，其程度與每個參考文獻藉由引用單獨併入的程度相同。

Claims (11)

  1. 一種針對小窩蛋白1(Cav-1)的特異性抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備在有需要的受試者中治療腦內出血或出血性中風的藥物，其中，該藥物是靜脈內注射劑型，且其中，該針對Cav-1的特異性抗體為針對小窩蛋白1產生的多株抗體。
  2. 如請求項1所述的用途，其中，該用於治療的藥物在該腦內出血或出血性中風發生之前的2小時內施用於有需要的受試者。
  3. 如請求項1所述的用途，其中，該用於治療的藥物在該腦內出血或出血性中風發生之後不遲於6小時施用於有需要的受試者。
  4. 如請求項1所述的用途，其中，該小窩蛋白1是人源者。
  5. 如請求項1所述的用途，其中，該針對Cav-1的特異性抗體為針對定位在人源小窩蛋白1的N-末端的肽而產生的多株抗體。
  6. 如請求項1所述的用途，其中，該腦內出血或出血性中風係由小膠質細胞或巨噬細胞所介導。
  7. 如請求項1所述的用途，其中，該治療包括減少選自由腦損傷、腦發炎、腦水腫、凋亡神經元、半球萎縮和運動缺陷所組成群組中的至少一種。
  8. 如請求項1所述的用途，其中，該治療包括改善與出血性中風有關的行為預後或功能恢復。
  9. 如請求項8所述的用途，其中，該行為預後係選自由神經行為預後和不對稱運動行為預後所組成群組中的至少一項。
  10. 如請求項8所述的用途，其中，該行為預後或功能恢復係選自由改良神經功能損傷嚴重程度評分(mNSS)和提升軀體搖擺試驗(EBST)比所組成群組中的至少一項。
  11. 如請求項1所述的用途，其中，該治療藥物在出血性中風發生之前或之後的1至24小時視窗內施用於有需要的受試者。
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