TWI797624B

TWI797624B - 羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法及人參皂甙的萃取方法

Info

Publication number: TWI797624B
Application number: TW110117748A
Authority: TW
Inventors: 林宏殷; 李玫樺; 陳彥澄; 詹姆斯湯瑪斯; 劉開璽; 施媛繽
Original assignee: 國立高雄大學
Priority date: 2021-05-17
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2023-04-01
Also published as: TW202246398A

Abstract

一種羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，用以製造獲得供萃取人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子，以解決人參皂甙難以取得且價格昂貴的問題。該羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法包含：混合羊毛甾醇、數個功能性單體、一磁性顆粒及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將羊毛甾醇及該磁性顆粒包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的羊毛甾醇，以獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子，該羊毛甾醇拓印奈米粒子的表面具有對應羊毛甾醇的數個辨識孔位。

Description

羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法及人參皂甙的萃取方法

本發明係關於一種奈米粒子的製造方法，尤其是一種羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法。本發明另關於一種以該羊毛甾醇拓印奈米粒子萃取人參皂甙的方法。

人參皂甙(ginsenoside)為人參屬(Panax genus)植物中的活性成分，舉例而言，人參皂甙Rb1(具有如第1a圖所示之化學結構式)可以用於改善心血管疾病(cardiovascular disease)，人參皂甙Rg1(具有如第1b圖所示之化學結構式)則具有預防老年癡呆(presbyophrenia)等神經退化性疾病(neurodegenerative disorder)的活性。

然而，由於人參屬植物價格昂貴，加上其中所含有的人參皂甙的含量稀少，使得人參皂甙的價格水漲船高，有鑑於此，若是可以提供一種能夠用於自人參屬植物中萃取出人參皂甙的奈米粒子，確實有助於解決前述的問題。

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，係用以製造獲得供萃取人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子者。

本發明的次一目的是提供一種人參皂甙的萃取方法，係以前述的羊毛甾醇拓印奈米粒子所萃取獲得者。

本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，可以包含：混合羊毛甾醇、數個功能性單體、一磁性顆粒及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將羊毛甾醇及該磁性顆粒包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的羊毛甾醇，以獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子，該羊毛甾醇拓印奈米粒子的表面具有對應羊毛甾醇的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇、該溶劑為水，且該磁性顆粒為四氧化三鐵。

據此，本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，藉由以與人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1具有類似的化學結構式的羊毛甾醇作為該模板化合物，使該人參樣品中的人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，可以吸附於位於該羊毛甾醇拓印奈米粒子表面的辨識孔位，再進一步地可以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子沖提出人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1。因此，該羊毛甾醇拓印奈米粒子可以應用於自該人參樣品中萃取人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，進而可以達成降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取成本之功效。藉由各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，可以使該數個功能性單體能夠聚合形成穩定的結構，並使該羊毛甾醇拓印奈米粒子具有良好的生物相容性，進而避免在將該羊毛甾醇拓印奈米粒子投予該生物體時，使該生物體發生不良的反應；藉由該溶劑為水，可以降低該羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造成本，且藉由該磁性顆粒為四氧化三鐵，可以降低該羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造成本。

本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，各該功能性單體可以為乙烯莫耳百分比為1~50mol%的聚乙烯乙烯醇。如此，該羊毛甾醇拓印奈米粒子具有較佳的拓印效果。

本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，該磁性顆粒的磁化率可以大於±0.1emu/g。如此，可以降低該羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造成本。

本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，該磁性顆粒可以具有超順磁性。如此，可以降低該羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造成本。

本發明的人參皂甙的萃取方法，可以包含：提供一人參樣品；及以前述之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙。

據此，本發明的人參皂甙的萃取方法，藉由使用羊毛甾醇作為該模板化合物所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子，因而能夠以簡單的操作即可以獲得純度較高的人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，有助於降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本，為本發明之功效。

本發明的人參皂甙的萃取方法，其中，該人參樣品可以為一人參癒傷組織的浸泡液，例如為於室溫下浸泡該人參癒傷組織所獲得。如此，藉由於室溫下進行浸泡，可以減少升溫、降溫所需要消耗的能源成本，進而可以降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本。

本發明的人參皂甙的萃取方法，其中，該人參樣品可以為經體積百分濃度為95%的一乙醇水溶液浸泡所獲得。如此，藉由容易取得的乙醇水溶液的選用，可以降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本。

本發明的人參皂甙的萃取方法，其中，以該羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙可以包含：混合該羊毛甾醇拓印奈米粒子及該人參樣品，使該人參樣品中的人參皂甙吸附於該羊毛甾醇拓印奈米粒子的數個辨識孔位；及以磁場分離吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子。如此，可以提升萃取、純化效率，進而可以降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本。

本發明的人參皂甙的萃取方法，其中，以該羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙另包含：於以磁場分離吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子之後，使用一沖提液清洗吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子，以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子沖提出人參皂甙。舉例而言，該沖提液可以為體積百分濃度為5%的一乙醇水溶液。如此，可以提升萃取、純化效率，進而可以降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本。

〔第1a圖〕人參皂甙Rb1的化學結構式。

〔第1b圖〕人參皂甙Rg1的化學結構式。

〔第2圖〕羊毛甾醇的化學結構式。

〔第3圖〕試驗(A)中，各組奈米粒子的羊毛甾醇吸附量。

〔第4圖〕試驗(B)中，各組奈米粒子的羊毛甾醇吸附量。

〔第5圖〕試驗(C)中，各組奈米粒子的平均粒徑。

〔第6圖〕試驗(C)中，各組奈米粒子的比表面積。

〔第7圖〕試驗(C)中，各組奈米粒子的磁場強度。

〔第8圖〕試驗(D)中，人參皂甙標準品的高效液相色譜分析結果。

〔第9a圖〕試驗(E)中，人參皂甙Rg1的等溫吸附結果。

〔第9b圖〕試驗(E)中，人參皂甙Rb1的等溫吸附結果。

〔第10a圖〕試驗(F)中，人參浸泡液的的高效液相色譜分析結果。

〔第10b圖〕試驗(F)中，人參萃取液的的高效液相色譜分析結果。

〔第11a圖〕試驗(G)中，各組待測液的人參皂甙濃度。

〔第11b圖〕試驗(G)中，各組待測液的人參皂甙濃度。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：

本發明之一實施例的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，係藉由使數個功能性單體(functional monomer)及一模板化合物(template compound)共同形成一分子拓印聚合物(molecularly imprinted polymer)，續移除位於該分子拓印聚合物的表面的該模板化合物所獲得。

詳而言之，該數個功能性單體可以進行聚合，並且於進行聚合的同時包覆該模板化合物，以形成該分子拓印聚合物，該分子拓印聚合物的表面會形成數個辨識孔位(recognition site)，各該辨識孔位係對應該模板化合物的立體結構，因而在移除位於該分子拓印聚合物的表面的模板化合物之後所獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子的表面即會具有該辨識孔位。舉例而言，該功能性單體可以為聚乙烯乙烯醇(poly(ethylene-co-vinyl alcohol)，簡稱EVAL)、甲殼素、聚(羥甲基3,4-伸乙基二氧噻吩)(poly(hydroxymethyl 3,4-ethylene dioxythiophene、聚(苯胺-共-甲酸(poly(aniline-co-metanilic acid))、聚苯硫醚(poly(p-phenylene sulfide))及聚噻吩(poly(thiophene))等。於本實施例中，該功能性單體為聚乙烯乙烯醇，其乙烯莫耳百分比介於1~50mol%之間，其能夠形成穩定的結構，且具有良好的生物相容性。

較佳地，可以將該數個功能性單體及該模板化合物加入一溶劑中，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合的同時，包覆該模板化合物，例如可以於0~50℃之溫度下，將包含該數個功能性單體及該模板化合物的混合物加入該溶劑中，並以磁石攪拌1~120分鐘，以利形成該分子拓印聚合物。該溶劑係可以提供一良好的聚合環境，舉例而言，該溶劑可以為水、異丙酮(isopropanol)，或者為包含水及異丙酮的混合溶劑。

又，在形成該分子拓印聚合物後，能夠以一清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以露出位於該分子拓印聚合物表面的辨識孔位，即可以獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子。舉例而言，該清洗溶液可以為丙酮、乙醇、甲醇、水或包含前述溶劑之混合液。

此外，為了有助於該羊毛甾醇拓印奈米粒子的分離純化，較佳可以於使該數個功能性單體在進行聚合的同時也包覆該磁性顆粒，使所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子包含該磁性顆粒(即，混合該數個功能性單體、該模板化合物、該磁性顆粒及該溶劑，即可以使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，同時包覆該磁性顆粒)。該磁性顆粒的飽和磁化率可以大於10±0.1emu/g，例如可以為具有超順磁性(superparamagnetism)的四氧化三鐵(Fe₃O₄)、氧化鐵(FeO)或三氧化二鐵(Fe₂O₃)。舉例而言，係提供一含鐵離子水溶液，該含鐵離子水溶液包含莫耳數比為2：1的三價鐵離子(Fe³⁺)及二價鐵離子(Fe²⁺)，於該含鐵離子水溶液中加入一沉澱劑後，於60~95℃之溫度下，使該三價鐵離子及該二價鐵離子共同沉澱而形成四氧化三鐵；於本實施例中，係以氯化鐵(FeCl₃‧6H₂O)及硫酸亞鐵(FeSO₄‧7H₂O)共同配製形成該含鐵離子水溶液，該沉澱劑為一氫氧化鈉水溶液(NaOH_(aq))或一氫氧化銨水溶液(NH₄OH_(aq))，且該沉澱劑所含的氫氧基(OH^-)與該含鐵離子水溶液的三價鐵離子(Fe³⁺)的莫耳數比為0.5：1~10：1。

將該磁性顆粒(1~1000mg)混合聚乙烯乙烯醇溶液(1~10000μL，溶於二甲基亞碸中，濃度為0.001~25wt%)及該模板化合物(1 ~1000μL)，得一混合溶液，將該混合溶液滴入0~50℃之去離子水中，以磁石攪拌1~120分鐘即可以形成該分子拓印聚合物。

經由上述方法所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子，可以選用羊毛甾醇(lanosterol，其具有如第2圖所示之化學結構式)作為該模板化合物，由於羊毛甾醇與人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1具有類似的化學結構式，因此，以羊毛甾醇作為該模板化合物所形成的羊毛甾醇拓印奈米粒子，即可以應用於萃取人參皂甙Rb1及人參皂甙Rg1。

再且，由於該羊毛甾醇拓印奈米粒子包含該磁性顆粒，在製造獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子，或者以該羊毛甾醇拓印奈米粒子萃取人參皂甙Rb1及/或人參皂甙Rg1之後，可以利用藉由施以外界磁場進行分離純化(例如，可以利用磁石進行吸附，此為本領域具有通常知識者可以理解，恕不贅述)，因此可以容易地分離純化該羊毛甾醇拓印奈米粒子，進而可以獲得一人參皂甙萃取液。

又，本發明之一實施例的人參皂甙的萃取方法，係使用如前所述之羊毛甾醇拓印奈米粒子，換言之，係混合一人參樣品及該羊毛甾醇拓印奈米粒子，使與羊毛甾醇具有類似的化學結構式的人參皂甙，可以吸附於位在該羊毛甾醇拓印奈米粒子表面的辨識孔位。

詳而言之，該人參樣品可以為人參屬植物的根部樣品，亦可以為人參屬植物的癒傷組織(callus)，且該人參屬植物可以為高麗參(Panax ginseng C.A.Mey.，又稱人參、紅參)、西洋參(Panax quinquefolis L.，又稱花旗參)、田七蔘(Panax notoginseng Burkill，又稱三七蔘)、珠子參(Panax bipinnatifidus Seem.，又稱疙瘩七、羽葉三七)、竹節參(Panax japonicas C.A.Mey.，又稱大葉參、日本參)、峨嵋參(Panax vietnamensis Ha & Grushv.，又稱越南參)、狹葉竹節參(Panax wangianus S.C.Sun，又稱狹葉假人參)、薑狀三七(Panax zingiberensis C.Y.Wu & K.M.Feng)、喜馬拉雅參(Panax pseudoginseng Wall.，又稱假人參)、屏邊三七(Panax stipuleanatus H.T.Tsai & K.M.Feng，又稱竹節七)、三葉參(Panax trifolius L.)及金沙參(Panax aureus Sander)等，此為本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，惟於此不加以限制。於本實施例中，係選用高麗參的癒傷組織，工者較佳可以預先將該人參樣品進行乾燥(例如於50℃之溫度下進行乾燥2小時)，得到一人參乾燥物，使該人參乾燥物的含水量可以約為40%；此外，該人參樣品亦可以預先碎成粒徑約為0.01~5mm的粉粒，以增加該人參樣品與該羊毛甾醇拓印奈米粒子之接觸表面積，藉此提升後續萃取之萃取效率。

又，於本實施例中，該人參樣品係為高麗參的癒傷組織的浸泡液。舉例而言，每100克的人參樣品係能夠混合5,000毫升的一乙醇水溶液(乙醇濃度為95%)，在室溫下浸泡一週之後，進行超音波震盪3小時(200W)，上述程序亦可以重複數次，使該人參樣品所富含之活性成分可以完整溶出於該乙醇水溶液，最終進行濃縮而獲得一人參浸泡液(crude extract)，此為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所廣泛應用，在此不加以贅述。

工者可以取250μL的人參浸泡液混合100μL的羊毛甾醇拓印奈米粒子，於室溫下反應30分鐘，使該人參浸泡液中的人參皂甙可以吸附於該羊毛甾醇拓印奈米粒子的數個辨識孔位，再以磁場分離吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子，接著，工者能夠以一沖提液(如，濃度為5%的一乙醇水溶液)清洗該吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子，如此即可以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子沖提出人參皂甙。

為優化本發明之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，遂進行以下試驗：

(A)乙烯莫耳百分比的影響

請參照第1表所示，本試驗係取27mol%、32mol%、38mol%及44mol%等不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇(EVAL)，混合濃度為100μg/mL的羊毛甾醇，及飽和磁化率大於±0.1emu/g，且具有超順磁性的四氧化三鐵(Fe₃O₄)，進而製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP作為第A1組，本試驗另以同樣包含前述不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇(EVAL)及飽和磁化率大於±0.1emu/g，且具有超順磁性的四氧化三鐵(Fe₃O₄)，惟未加入該羊毛甾醇所製造獲得的非羊毛甾醇拓印奈米粒子(magnetic non-imprinted polymer nanoparticles，簡稱MNIP)作為第A0組。

接著，將前述之第A0組的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP及第A1組的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP分別混合一羊毛甾醇溶液(含濃度為100μg/mL的羊毛甾醇)，於室溫下反應30分鐘後，移除該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP及該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP，並以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，量測殘留於該羊毛甾醇溶液中的羊毛甾醇含量，進而換算吸附於該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP或該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP上的羊毛甾醇的量。

詳而言之，固定相(stationary phase)為Kromasil C18管柱(粒徑為5μm，孔徑為100Å，長度及管徑為25cm×4.6mm；購自Sigma-Aldrich)，流動相為乙腈(acetonitrile，ACN)及0.1%磷酸(phosphoric acid，溶於去離子水)的混合液，依第2表所示的梯度分布(gradient profile)進行沖提，流速為1.3mL/分，偵測波長為210nm，偵測溫度為室溫，且羊毛甾醇的滯留時間(retention time)為24.6分。

結果如第3圖所示，該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第A1組)可以特異性地吸附羊毛甾醇，包含27mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的吸附量為683.3±28.6μg/g、包含32mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的吸附量為407.4±8.5μg/g、包含38mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的吸附量為287.6±2.7μg/g，且包含44mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的吸附量為536.9±8.0μg/mg，而該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第A0組)儘管也會非特異性地吸附羊毛甾醇，包含27mol%的聚乙烯乙烯醇的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的吸附量僅為183.3μg/g、包含32mol%的聚乙烯乙烯醇的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的吸附量僅為266.0μg/g、包含38mol%的聚乙烯乙烯醇的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的吸附量僅為254.3μg/g，且包含44mol%的聚乙烯乙烯醇的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的吸附量僅為186.2μg/g，均遠低於羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的羊毛甾醇吸附量。

(B)羊毛甾醇的濃度的影響

接著測試使用不同濃度的羊毛甾醇，在製造獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP時，對所獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的吸附量的影響。

請參照第3表所示，本試驗係將包含乙烯莫耳百分比為27mol%的聚乙烯乙烯醇所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP作為第B1組，包含乙烯莫耳百分比為44mol%的聚乙烯乙烯醇所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP作為第B3組，以及同樣包含前述不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇，惟未加入該羊毛甾醇所製造獲得的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP作為第B0、B2組。

接著，量測各組奈米粒子的羊毛甾醇的吸附量，其結果如第4圖所示，並依(式一)計算包含不同乙烯莫耳百分比的聚乙烯乙烯醇所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的拓印效率α。

請參照第4圖所示，當羊毛甾醇的濃度達100μg/mL以上時，無論是包含27mol%或44mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第B1、B3組)均具有良好的拓印效率(imprinting effectiveness)。其中，包含27mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的拓印效率為3.7(第B1組)，且包含44mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的拓印效率為2.9(第B3組)。

值得注意的是，綜合比較試驗(A)、(B)可以得知，在羊毛甾醇的濃度為100μg/mL時，包含27mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第B1組)具有最佳的拓印效率，且在羊毛甾醇的濃度上升後的拓印效率亦優於包含44mol%的聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第B3組)，故後續所有試驗均以27mol%的聚乙烯乙烯醇進行。

(C)清洗前後的變化

本試驗係如第4表所示，將包含聚乙烯乙烯醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP作為第C1組，以及同樣包含聚乙烯乙烯醇，惟未加入該羊毛甾醇所製造獲得的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP作為第C0組。

詳而言之，混合羊毛甾醇、聚乙烯乙烯醇及該磁性顆粒，以共同形成該分子拓印聚合物(清洗前)之後，以水作為該清洗溶液清洗該分子拓印聚合物，以移除該羊毛甾醇而獲得羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(清洗後)；接著再混合該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP與一再吸附溶液(其中含濃度為100μg/mL的羊毛甾醇)，使該羊毛甾醇可以再次吸附於該羊毛甾醇拓印奈米粒子的表面上的辨識孔位，為便於後續說明，該辨識孔位結合有該羊毛甾醇的羊毛甾醇拓印奈米粒子稱為再吸附粒子(再吸附後)。

請參照第5圖所示，在移除羊毛甾醇之前(清洗前)，第C0、C1組的分子拓印聚合物之平均粒徑(直徑)分別為115.3±7.4nm(第C0組)及116.5±7.5nm(第C1組)。在移除該羊毛甾醇之後(清洗後)，第C0、C1組的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的粒徑比移除前為大，分別為182.5±10.6nm(第C0組)及165.5±10.5nm(第C1組)，其理由可能為親水的羊毛甾醇被移除後，使該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP較為疏水，而產生團聚的現象。又，在再次吸附之後(再吸附後)，第C0、C1組的再吸附粒子的粒徑分別為155.3±9.5nm(第C0組)及131.2±7.9nm(第C1組)，顯示親水的羊毛甾醇可以再次被吸附於該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的表面上的辨識孔位，使其親水性得以提升。

接著以比表面積分析儀(specific surface area and porosimetry analyzer，簡稱BET)測定第C0、C1組的分子拓印聚合物(清洗前)、羊毛甾醇拓印奈米粒子(清洗後)及再吸附粒子(再吸附後)的比表面積(specific surface area)。

請參照第6圖所示，第C0組的分子拓印聚合物、非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP及再吸附粒子的比表面積分別為333.1m²/g(清洗前)、 264.9m²/g(清洗後)及160.3m²/g(再吸附後)，而第C1組的分子拓印聚合物的比表面積雖與第C0組的分子拓印聚合物差異不大(約為264.4m²/g)，其羊毛甾醇拓印奈米粒子的比表面積有明顯提升(約為550m²/g)，而再吸附後的再吸附粒子的比表面積則降低至約200mg²/g。

再且，以超導量子干涉儀(superconducting quantum interference device，簡稱SQUID)測定第C0組的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP及第C1組的分子拓印聚合物(清洗前)、羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(清洗後)及再吸附粒子(再吸附後)的磁滯曲線(hysteresis curve)。

請參照第7圖所示，無論是第C0組的非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP、第C1組的分子拓印聚合物、羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP及再吸附粒子都具有超順磁性，因而均可以利用磁場有效分離。

又，相較於清洗前的第C1組的分子拓印聚合物(清洗前)，第C1組的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(清洗後)具有較大的飽和磁化強度(saturated magnetization)，而在再吸附後的第C1組的再吸附粒子(再吸附後)的飽和磁化強度再次降低。

此外，為證實本案的羊毛甾醇拓印奈米粒子確實可以用於自該人參樣品中獲得該人參皂甙萃取液，遂進行以下試驗：

(D)人參皂甙標準品的分析結果

本試驗係取濃度均為167.0μg/mL的人參皂甙Rc、人參皂甙Rb2、人參皂甙Rg1、人參皂甙Rd、人參皂甙Re及人參皂甙Rb1混合後，以高效液相色譜法進行分析。詳而言之，固定相為Kromasil C18管柱(粒徑為5μm，孔徑為100Å，長度及管徑為25cm×4.6mm；購自Sigma-Aldrich)，流動相為乙腈及0.1%磷酸(溶於去離子水)的混合液，依第5表所示的梯度分布進行沖提，流速為1mL/分，偵測波長為203nm，偵測溫度為35℃。

分析結果如第8圖所示，人參皂甙Rc、人參皂甙Rb2、人參皂甙Rg1、人參皂甙Rd、人參皂甙Re及人參皂甙Rb1分別於6.4、10.7、20.0、40.4、61.0及71.2分鐘處形成波峰。

(E)對人參皂甙的等溫吸附(isothermal adsorption)

本試驗係將該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP作為第E1組，加入包含不同濃度的人參皂甙Rg1的乙醇水溶液(5vol%)中，於25℃下反應10分鐘後，移除該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP，並以高效液相色譜法分析該乙醇水溶液中殘留的人參皂甙Rg1的含量，藉此換算人參皂甙Rg1的吸附量。本試驗另以該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP作為第E0組。

如第9a圖所示，在該乙醇水溶液(5vol%)中，該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第E1組)對人參皂甙Rg1的結合常數(binding constant)為261.0μg/g，且對人參皂甙Rg1的最大容量(maximum capacity)為660.6μg/g；該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第E0組)對人參皂甙Rg1的結合常數則為219.4μg/g，且對人參皂甙Rg1的最大容量分別為521.2μg/g。

另將該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第E1組)或該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第E0組)，加入包含不同濃度的人參皂甙Rb1的乙醇水溶液(5vol%)中，於25℃下反應10分鐘後，移除該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP，並以高效液相色譜法分析該乙醇水溶液中殘留的人參皂甙Rg1的含量，藉此換算人參皂甙Rb1的吸附量。

如第9b圖所示，在該乙醇水溶液(5vol%)中，該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第E1組)對人參皂甙Rb1的結合常數及最大容量分別為216.1μg/g及666.3μg/g，且該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第E0組)對人參皂甙Rb1的結合常數及最大容量分別為163.0μg/g及553.1μg/g。

此外，將該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第E1組)或該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第E0組)，加入包含不同濃度的人參皂甙Rb1的去離子水中，於25℃下反應10分鐘後，移除該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP，並以高效液相色譜法分析該去離子水中殘留的人參皂甙Rg1的含量，藉此換算人參皂甙Rb1的吸附量。

如第9b圖所示，在該去離子水中，該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(第E1組)對人參皂甙Rb1的結合常數及最大容量分別為260.4mg/g及667.4mg/g，且該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP(第E0組)對人參皂甙Rb1的結合常數及最大容量分別為219.3mg/g及522.4mg/g。

(F)人參癒傷組織的誘導及增生

本試驗係取三年生的高麗參(Panax ginseng C.A.Mey.)的新鮮根部樣品(長度約3~6cm；直徑約0.4~0.5cm)，將其切片後作為外植體(explant)，於室溫下，以如第6表所示的MS改良培養基進行避光培養，經培養出的癒傷組織(callus line)一個月繼代培養一次。

(F)羊毛甾醇拓印奈米粒子的萃取效率

本試驗係先將癒傷組織乾燥後，混合濃度為95%的乙醇水溶液(每100克的癒傷組織混合5公斤的乙醇水溶液)，於室溫下浸泡一週，接著進行超音波震盪後，於80℃加熱濃縮1小時，最終去除殘留的乙醇。如此獲得的濃縮液以5,000rpm的轉速離心5分鐘，即可以取得該人參浸泡液(第F1組)。

取250μL的人參浸泡液，混合100μg的羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP，於室溫下反應30分鐘後，以磁場分離該羊毛甾醇拓印奈米粒子 MLIP；接著，加入5vol%的乙醇水溶液(250μL)，以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP上分離人參皂甙而得該人參皂甙萃取液(第F2組)。

接著，以高效液相色譜法分別分析該人參浸泡液及該人參皂甙萃取液，其結果分別如第10a、10b圖所示，該人參浸泡液中，人參皂甙Rc的強度為30.6mv、人參皂甙Rb2的強度為1.4mv、人參皂甙Rg1的強度為41.5mv、人參皂甙Rd的強度為5.6mv、人參皂甙Re的強度為6.1mv，且人參皂甙Rb1的強度為18.9mv；而在經該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的分離純化之後的人參皂甙萃取液中，人參皂甙Rc的強度為20.1mv、人參皂甙Rb2的強度為0mv、人參皂甙Rg1的強度為4.4±0.2mv、人參皂甙Rd的強度為0mv、人參皂甙Re的強度為0mv，且人參皂甙Rb1的強度為2.3±0.1mv，顯示該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP確實能夠用於自該人參樣品中(人參浸泡液)中萃取人參皂甙Rg1及人參皂甙Rb1。

(G)羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP與非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的比較

本試驗係使該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP(100μg)與該人參浸泡液(250μL)反應後，取得該人參皂甙萃取液作為第G1組的待測液，及將其萃遺液(remaining)作為第G2組的待測液；及使該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP與該人參浸泡液反應後，取得該人參皂甙萃取液作為第G3組的待測液，及將其萃遺液作為第G4組的待測液。本試驗另以該人參浸泡液作為第G0組的待測液。接著以高效液相色譜法分別分析第G0~G4組的待測液，並換算其中人參皂甙Rg1及人參皂甙Rb1的濃度。

結果如第11a圖所示，使用該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP所得的人參皂甙萃取液(第G1組)中的人參皂甙Rg1的濃度為4.4±0.2μg/mL，且人參皂甙Rb1的濃度為2.3±0.1μg/mL，與第G0組的人參浸泡液相比可知，其中60%以上的人參皂甙Rg1/人參皂甙Rb1均已被該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP萃取純化出來。反之，使用該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP所得的人參皂甙萃取液(第G3組)中的人參皂甙Rg1的濃度為0.98μg/mL，且人參皂甙Rb1的濃度為0.44μg/mL，換言之，僅有約13%的人參皂甙Rg1/人參皂甙Rb1由於該非羊毛甾醇拓印奈米粒子MNIP的非特異性吸附而被純化出來。

此外，如第11b圖所示，第G0組的人參浸泡液中，人參皂甙Rc的濃度為6.2μg/mL、人參皂甙Rb2的濃度為5.2μg/mL、人參皂甙Rg1的濃度為7.5μg/mL、人參皂甙Rd的濃度為2.6μg/mL、人參皂甙Re的濃度為2.8μg/mL，且人參皂甙Rb1的濃度為3.8μg/mL，且使用該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP所得的第G1組的人參皂甙萃取液中，人參皂甙Rc的濃度為4.6μg/mL、人參皂甙Rb2的濃度為0μg/mL、人參皂甙Rg1的濃度為4.4μg/mL、人參皂甙Rd的濃度為0μg/mL、人參皂甙Re的濃度為0μg/mL，且人參皂甙Rb1的濃度為2.4μg/mL，顯示分別約有75.3%的人參皂甙Rc、0%的人參皂甙Rb2、59.0%的人參皂甙Rg1、0%的人參皂甙Rd、0%的人參皂甙Re及61.9%的的人參皂甙Rb1由於該羊毛甾醇拓印奈米粒子MLIP的特異性吸附而被純化出來。

綜上所述，本發明的羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，藉由以與人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1具有類似的化學結構式的羊毛甾醇作為該模板化合物，使該人參樣品中的人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，可以吸附於位於該羊毛甾醇拓印奈米粒子表面的辨識孔位，再進一步地可以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子沖提出人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1。因此，該羊毛甾醇拓印奈米粒子可以應用於自該人參樣品中萃取人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，進而可以達成降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取成本之功效。

再且，本發明的人參皂甙的萃取方法，藉由使用羊毛甾醇作為該模板化合物所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子，因而能夠以簡單的操作即可以獲得純度較高的人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1，有助於降低人參皂甙Rb1、人參皂甙Rg1的萃取、純化成本，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims

一種羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，包含：混合羊毛甾醇、數個功能性單體、一磁性顆粒及一溶劑，使該數個功能性單體於該溶劑中進行聚合時，將羊毛甾醇及該磁性顆粒包覆其中，共同形成一分子拓印聚合物；及移除位於該分子拓印聚合物的表面的羊毛甾醇，以獲得該羊毛甾醇拓印奈米粒子，該羊毛甾醇拓印奈米粒子的表面具有對應羊毛甾醇的數個辨識孔位；其中，各該功能性單體為聚乙烯乙烯醇、該溶劑為水，且該磁性顆粒為四氧化三鐵。
如請求項1之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，各該功能性單體為乙烯莫耳百分比為5~50mol%的聚乙烯乙烯醇。
如請求項1之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，該磁性顆粒的磁化率大於±0.1emu/g。
如請求項3之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法，其中，該磁性顆粒具有超順磁性。
一種人參皂甙的萃取方法，包含：提供一人參樣品；及以如請求項1~4中任一項之羊毛甾醇拓印奈米粒子的製造方法所製造獲得的羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙。
如請求項5之人參皂甙的萃取方法，其中，該人參樣品為一人參癒傷組織的浸泡液。
如請求項6之人參皂甙的萃取方法，其中，該人參樣品為於室溫下浸泡該人參癒傷組織所獲得。
如請求項7之人參皂甙的萃取方法，其中，該人參樣品為經體積百分濃度為95%的一乙醇水溶液浸泡所獲得。
如請求項5之人參皂甙的萃取方法，其中，以該羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙包含：混合該羊毛甾醇拓印奈米粒子及該人參樣品，使該人參樣品中的人參皂甙吸附於該羊毛甾醇拓印奈米粒子的數個辨識孔位；及以磁場分離吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子。
如請求項9之人參皂甙的萃取方法，其中，以該羊毛甾醇拓印奈米粒子自該人參樣品中萃取出人參皂甙另包含：於以磁場分離吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子之後，使用一沖提液清洗吸附有人參皂甙的羊毛甾醇拓印奈米粒子，以自該羊毛甾醇拓印奈米粒子沖提出人參皂甙。
如請求項10之人參皂甙的萃取方法，其中，該沖提液為體積百分濃度為5%的一乙醇水溶液。