TWI763214B - 牡丹皮萃取物的製備方法及其預防或治療發炎性疾病之用途 - Google Patents

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Abstract

一種組合物用於製備預防或治療一個體罹患一發炎性疾病之一醫藥組合物的用途，其中該組合物係由一牡丹皮萃取物及其活性成分所組成，其中該組合物可抑制由腫瘤壞死因子-α和干擾素調節因子3/7路徑所調控影響的發炎反應。

Description

牡丹皮萃取物的製備方法及其預防或治療發炎性疾病之用途
本領域係為一種牡丹皮萃取物製備方法及其用該製品製備預防或治療發炎性疾病之組合物之用途。
牡丹皮(Moutan Radicis Cortex)是一種收載於《臺灣中藥典》的傳統中藥，來源為毛茛科(Ranunculaceae)芍藥屬(Paeonia)植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)乾燥根皮(root cortex)，由於其抗炎作用，傳統用於治療發炎性疾病。在許多發炎性疾病都已有其應用，包括感染性疾病、自體發炎性疾病、自體免疫疾病、癌症、神經退化性疾病、憂鬱症及其他因大量發炎性細胞細胞因子產生而導致嚴重免疫反應所引起之疾病。
中藥牡丹皮(Paeonia suffruticosa Andrews)在中藥之藥效歸類屬於清熱涼血，是中醫常用的抗發炎藥物。可以用於治療癌症、過敏、糖尿病、心血管疾病，及神經性退化疾病。牡丹皮目前共鑑定出有119種單一化合物。然而，哪些成分是牡丹皮中最有效的免疫調節物質，且其作用機制為何，仍未明確。牡丹皮目前發現7大類共119種成分，成分類別包括單萜(monoterpenes)、單萜苷(monoterpene glycosides)、類黃酮(flavonoids)、 鞣質(tannins)、三萜(triterpenoids)、酚類(phenols)及其它，其中單萜苷與酚類化合物為牡丹皮之主要成分，而丹皮酚(paeonol；2’-hydroxy-4’-methoxyacetophenone)、芍藥苷(paeoniflorin)、1,2,3,4,6-penta-O-galloyol-β-D-glucose(PGG)、没食子酸甲酯(methyl gallate；methyl 3,4,5-trihydroxybenzoate)、沒食子酸(gallic acid；3,4,5-trihydroxybenzoic acid)為目前普遍認為對生物具有多種藥理作用的成分。然而，因為其牡丹皮水萃取方式之多糖成分會引發腸道不適之副作用，難以長期或大量使用。
發炎性腸道疾病，又稱炎性腸病(Inflammatory bowel diseases，IBD)是胃腸道的炎性疾病，以越來越高的速率影響全世界數以百萬計的個體。IBD兩種主要疾病是克隆氏症(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)，其病因是腸道的急性和慢性炎症。發炎性腸道疾病好發於20至40歲間之成人，目前對於其真正致病機轉仍不明確，目前認為與腸道內細菌、環境因子及遺傳因子有關，但許多研究指向應該和自體免疫機轉有關，而導致腸道廣泛性持續發生發炎反應，其常見的臨床表現為常見的臨床表現為腹痛、腹瀉、血便、體重減輕、發燒等。
目前針對發炎性腸道疾病的藥物治療目的在抑制急性發炎，降低發炎造成的腸道破壞，包括傳統治療藥物，如：5-氨基水楊酸鹽，主要用來控制輕度至中度的發炎、類固醇藥物為短期用藥，用於抑制免疫系統，可有效控制急性發病、免疫抑制劑則用於上述兩者無法有效控制病情且可以降低對類固醇的依賴；另外一類藥物則為生物製劑，如：抗腫瘤壞死因子製劑(anti-TNF-α)，主要為針對不同方面的免疫反應進行治療，但是現行所有藥物都會受到原發性和繼發性反應喪失的阻礙並具有許多禁忌症和不良反 應。因此，必須使用不同的策略開發新型IBD藥物。
人類腸道炎症涉及對病原體相關分子模式的先天反應，所述分子模式例如肽聚醣和脂磷壁酸存在於細菌細胞壁中。這些分子模式可以激活宿主細胞上的識別受體Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)並誘導產生一連串的訊息傳導，如同源自病毒基因組的雙鏈RNA的激活，從而刺激活化RIG-1(retinoic acid inducible gene I)或MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)。這些配體激活核轉錄因子-kappa B(NF-κB)途徑和/或激活干擾素調節因子3/7(interferon regulatory factors 3/7，IRF3/7)，它們協同刺激各種細胞因子的轉錄，例如干擾素α/β(IFN-α/β)、介白素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可抵抗感染。除了它們的抗感染作用外，在炎性疾病中，尤其是在IBD中發現這些促炎細胞因子的高度表現。
為了開發和鑑定牡丹皮中重要的免疫調節成分，首先，本發明建立一體外模式(in vitro)的具有抗發炎生物活性的藥物篩選平台來篩選可以激活或抑制先天免疫細胞中免疫反應的重要化合物，進一步透過此系統的篩選可以找出最具有藥理活性的成分組合物。此一篩選機制，不但可快速找出牡丹皮抑制發炎反應的最佳萃取物並且藉由分離引發發炎反應之不純物也可以去除牡丹皮本身或製造過程引發發炎反應之多糖物質，而達到消除牡丹皮所導致腸胃不適及發炎反應之副作用，可讓病人長期或大量使用。
因此，根據本發明之一方面，本發明提供一種萃取物用於製備預防或治療一個體罹患發炎性疾病之組合物的用途，其中該組合物係由一 去除牡丹皮粗多糖之醇類萃取物及其活性成分所組成。
根據本發明之另一方面，其中該組合物係為一醫藥組合物或一食品組合物。
本文所用之術語「預防」係指遲延罹患疾病個體之症狀發作或減少疾病出現，「治療」表示緩解或改善感病個體之症狀。
本文所用之術語「個體」表示動物，尤其哺乳動物。在一較佳實施例中，術語「個體」表示「人類」。
本文所用之術語「有效劑量」係指活性成分單獨或與其他藥物組合使用以顯示具有的作用，進而達到預防或治療一個體罹患一發炎性疾病的作用。
根據本發明之一方面，其中該醫藥組合物進一步包括一醫藥上可接受之載體、佐藥或賦形劑；於本發明的另一實施例中，該牡丹皮萃取物可用於製備一食品組合物，該食品組合物係選自由食物、飲料、保健食品和膳食補充物所組成之群組。
在一實施例中，其中該活性成分係選自於沒食子醯氧化芍藥苷(Galloyloxypaeoniflorin)、氧化芍藥苷(Oxypaeoniflorin)、牡丹皮苷C(Mudanpioside C)、牡丹皮苷E(Mudanpioside E)、牡丹皮苷I(Mudanpioside I)、牡丹皮苷J(Mudanpioside J)、丹皮酚苷B(Paeoniside B)、牡丹苷D(Suffruticoside D)、右旋兒茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-Catechin-7-O-β-D-glucopyranoside)、鳶尾酚酮2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Iriflophenone 2-O-β-D-glucopyranoside)、熊果酸(Ursolic acid)、30-降常春藤皂苷元(30-Norhederagenin)以及常春藤皂苷元(Hederagenin)或前述至少一種以上的 化合物所構成之群組。
本發明之牡丹皮萃取物之製備流程，如圖1所示，其中該牡丹皮萃取物係由以下步驟所製備：(a)取得一牡丹皮藥材，以第一溶劑進行萃取產生一牡丹皮藥渣和第一萃取物，其中該第一溶劑為醇類；(b)將牡丹皮藥渣以第二溶劑進行超音波震盪並同時加熱萃取以產生第二溶劑萃取溶液，取部分該第二萃取溶液加入第三溶劑以產生第二萃取物，將部份該第二萃取液去除第二溶劑，產生第三萃取物，其中該第二溶劑為水，該第三溶劑為醇類；(c)將該第一萃取物以第四溶劑進行萃取產生第四萃取物和第一水相，其中該第四溶劑為烷類；(d)將該第一水相以第五溶劑進行萃取產生第五萃取物和第二水相，其中該第五溶劑為酯類；(e)將該第二水相以第六溶劑進行萃取產生第六萃取物和第三水相，其中該第六溶劑為正丁醇；以及(f)第三水相乾燥後，即得第七萃取物。
在一實施例中，其中第一溶劑為具有1至2個碳原子的醇類；在一較佳實施例中，其中該醇類選自於甲醇和乙醇；在一更佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在一實施例中，其中第一溶劑為70至100體積百分比之甲醇和乙醇溶液，在另一實施例中，第一溶劑為70體積百分比之甲醇和乙醇溶液。
在一較佳實施例中，其中第一溶劑為70體積百分比之甲醇水溶液。
在一較佳實施例中，其中第四溶劑為正己烷。
在一較佳實施例中，其中第五溶劑為乙酸乙酯。
在本發明之一方面，本發明提供一種萃取物用於製備預防或治 療一個體罹患一發炎性疾病之組合物的用途，其中該組合物係由一去除牡丹皮粗多糖之醇類萃取物及其活性成分所組成。
在一實施例中，其中該醇類為具有1至4個碳原子的醇類。在另一實施例中，其中該醇類選自於甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。在一較佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在另一實施例中，其中該醇類的濃度為70至100體積百分比。在一較佳實施例中，其中該醇類的濃度為70體積百分比。
本發明提供一種組合物用於製備預防或治療一個體罹患一發炎性疾病之用途，其中該組合物係由一牡丹皮萃取物及其活性成分所組成，其中該牡丹皮萃取物由以下步驟所製備：(a)取一牡丹皮藥材，以一含有一醇類的溶液進行萃取產生一牡丹皮藥渣和一萃取物；(b)將該萃取物以一含有一烷類的溶液進行萃取產生一有機層和一水相層，其中該有機層含有一牡丹皮萃取物；以及(c)去除步驟(b)中的該有機層中的有機溶劑得到該牡丹皮萃取物。
在一實施例中，其中上述步驟(a)的該醇類為一具有1至4個碳原子的一醇類；在一較佳實施例中，其中該醇類選自於甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；在一更佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在一實施例中，其中上述步驟(a)的該醇類為一具有1至4個碳原子的一醇類；在一較佳實施例中，其中該醇類選自於甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；在一更佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在另一實施例中，其中上述步驟(a)該醇類的溶液為70至100體積百分比之甲醇水溶液，在一較佳實施例中，該醇類的溶液為70體積百 分比之醇類水溶液。
在另一實施例中，其中上述步驟(b)該烷類為正己烷。
本發明提供一種組合物用於製備預防或治療一個體罹患一發炎性疾病之用途，其中該組合物係由一牡丹皮萃取物及其活性成分所組成，在另一實施例中，其中該牡丹皮萃取物由以下步驟所製備：(a)取一牡丹皮藥材，以一含有一醇類溶液進行萃取產生一牡丹皮藥渣和一萃取物；(b)將該萃取物以一含有一烷類溶液進行萃取產生一第一有機層和一第一水相層；(c)將步驟(b)中的該第一水相層以一含有一酯類溶液進行萃取產生一第二有機層和一第二水相層；以及(d)去除步驟(c)中的該第二有機層之有機溶劑得到該牡丹皮萃取物。
在一實施例中，其中上述步驟(a)的該醇類為一具有1至4個碳原子的一醇類；在一較佳實施例中，其中該醇類選自於甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；在一更佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在一實施例中，其中上述步驟(a)的該醇類為一具有1至4個碳原子的一醇類；在一較佳實施例中，其中該醇類選自於甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；在一更佳實施例中，其中該醇類為甲醇。
在另一實施例中，其中上述步驟(a)的該醇類的溶液為70至100體積百分比之甲醇水溶液，在一較佳實施例中，該醇類的溶液為70體積百分比之醇類水溶液。
在另一實施例中，其中上述步驟(b)該烷類為正己烷。
在另一實施例中，其中上述步驟(c)該酯類為乙酸乙酯。
根據本發明之另一方面，本發明提供一種萃取物用於製備預防或 治療一個體罹患一發炎性疾病之組合物的用途，其中該組合物係由一去除牡丹皮粗多糖之醇類萃取物及其活性成分所組成，其中該發炎性疾病為一大量表現干擾素α/β、介白素-1β、介白素-6、腫瘤壞死因子-α或上述至少一種以上所组成之免疫細胞發炎反應。在一實施例中，其中該組合物可抑制由腫瘤壞死因子-α和干擾素調節因子3/7路徑所調控影響的發炎反應。
在一實施例中，其中該發炎性疾病為病毒感染引發之發炎疾病和細菌感染引發之發炎疾病。在一較佳實施例中，其中該發炎性疾病為病毒感染引發之發炎疾病。
在一實施例中，其中該發炎性疾病為發炎性腸道疾病、自體免疫疾病或自體發炎疾病。在一較佳實施例中，其中該發炎性疾病為發炎性腸道疾病。
圖1為本發明之牡丹皮萃取物之製備流程圖。
圖2為牡丹皮第五萃取物(MDP-5)進行液相層析質譜分析鑑定的得到的主要化合物的化學結構。
圖3為牡丹皮萃取物對NF-κB驅動子在免疫細胞之冷光表現量，其中圖3A-圖3E依序為MDP-1至MDP-7的處理結果。
圖4為牡丹皮萃取物對ISRE驅動子在免疫細胞之冷光表現量，其中A-E依序為MDP-1至MDP-7的處理結果。
圖5為牡丹皮萃取物對免疫細胞存活率的影響，其中圖5A-圖5E依序為MDP-1至MDP-7的處理結果。
圖6為芍藥苷(Paeoniflorin)對抑制免疫活性的測試，圖6A為芍藥苷的化學結構示意圖，圖6B為NF-κB驅動子在免疫細胞之冷光表現量，圖6C為以ISRE驅動子在免疫細胞之冷光表現量，圖6D為免疫細胞存活率。
圖7為以ELISA測定牡丹皮第五萃取物(MDP-5)對初代巨噬細胞生成發炎細胞因子腫瘤壞死因子-α(圖7A)及介白素-6(圖7B)之量。
圖8為牡丹第四萃取物(MDP-4)抑制免疫活性的測試。其中圖8A為MDP-4抑制ISRE驅動子在水疱性口炎病毒感染後的免疫細胞之冷光表現，圖8B為不同濃度的MDP-4處理下免疫細胞存活率。
圖9為牡丹皮萃取物抑制模擬病毒RNA(poly(I：C))所引發之免疫發炎反應路徑。
圖10為牡丹皮第五萃取物(MDP-5)治療小鼠在腸道發炎性疾病，其中圖10A為小鼠給予牡丹皮萃取物後的腸道發炎模式之疾病嚴重度，圖10B為小鼠在給予牡丹皮萃取物後腸道發炎模式之體重變化。
以下實施例並非為限制本發明的範圍，僅為做為實施本發明之上述和其他目的、特徵和優點更能明顯易懂。
實施例一：牡丹皮萃取物之製備及有效成分之質譜分析
此實施例係利用圖1之方法製造牡丹皮萃取物，其中該牡丹皮萃取物係由以下步驟所製備：(a)取得一牡丹皮藥材，以第一溶劑進行萃取產生一牡丹皮藥渣和第一萃取物，其中該第一溶劑為醇類；(b)將牡丹皮藥渣以第二溶劑進行超音波震盪並同時加熱萃取以產生第二溶劑萃取溶 液，取部分該第二萃取溶液加入第三溶劑以產生第二萃取物，將部份該第二萃取液去除第二溶劑，產生第三萃取物；(c)將該第一萃取物以第四溶劑進行萃取產生第四萃取物和第一水相，其中該第四溶劑為烷類；(c)將該第一水相以第五溶劑進行萃取產生第五萃取物和第二水相；(d)將該第二水相以第六溶劑進行萃取產生第六萃取物和第三水相，其中該第六溶劑為正丁醇；以及(e)第三水相乾燥後，即得第七萃取物。
本發明之本發明之牡丹皮萃取物之製備流程，如圖1所示，其中該牡丹皮第四萃取物(MDP-4)係由以下步驟所製備：(a)取得一牡丹皮藥材，以第一溶劑進行萃取產生一牡丹皮藥渣和第一萃取物，其中該第一溶劑為醇類；以及(b)將該第一萃取物以第四溶劑進行萃取產生第四萃取物和第一水相，其中該第四溶劑為烷類。
本發明之牡丹皮萃取之製備流程，如圖1所示，其中本發明之牡丹皮第五萃取物(MDP-5)係由以下步驟所製備：(a)取得一牡丹皮藥材，以第一溶劑進行萃取產生一牡丹皮藥渣和第一萃取物，其中該第一溶劑為醇類；(b)將該第一萃取物以第四溶劑進行萃取產生第一有機相和第一水相，其中該第四溶劑為烷類；(c)將該第一水相以第五溶劑進行萃取產生第五萃取物(MDP-5)。
本實施例係利用圖1之方法製造牡丹皮萃取物。首先，將牡丹皮藥材料以70%之甲醇水溶液進行重複四次的萃取，得到一牡丹皮藥渣以及一牡丹皮粗萃濾液，其中將上述的該牡丹皮藥渣(MDP residue)以超音波震盪、加熱並以乙醇進行萃取得一粗多醣(MDP-1)和一粗水萃物(MDP-2)。另外，將上述該牡丹皮粗萃濾液中的甲醇除去後得到一牡丹皮粗萃物(MDP- 3)。接著，將該牡丹皮粗萃取物(MDP-3)以不同極性的溶劑進行萃取。首先，以正己烷水溶液進行重複三次萃取以獲得一正己烷有機層以及一水相層，其中該正己烷有機層包含一正己烷萃取物(MDP-4)，將所得到的該水相層進一步以乙酸乙酯水溶液進行重複五次萃取，獲得一乙酸乙酯有機層以及一水相層，其中該乙酸乙酯有機層包含一乙酸乙酯萃取物(MDP-5)，接著將該水相層以丁醇水溶液進行重複五次萃取，獲得一丁醇有機層以及一水相層，其中該丁醇有機層包含一丁醇萃取物(MDP-6)，其中該水相層包含牡丹皮最後之萃取物(MDP-7)。
將上述實施例所分離出之牡丹皮第五萃取物(MDP-5)進一步透過液相層析質譜分析進行鑑定，鑑定結果見表一之列表。
表一、牡丹皮第五萃取物中的化合物
Figure 109146619-A0101-12-0011-1
Figure 109146619-A0101-12-0012-2
透過液相層析質譜分析鑑定出第五萃取物主要含有沒食子醯氧化芍藥苷(Galloyloxypaeoniflorin)、氧化芍藥苷(Oxypaeoniflorin)、牡丹皮苷C(Mudanpioside C)、牡丹皮苷E(Mudanpioside E)、牡丹皮苷I(Mudanpioside I)、牡丹皮苷J(Mudanpioside J)、丹皮酚苷B(Paeoniside B)、牡丹苷D(Suffruticoside D)、右旋兒茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-Catechin-7-O-β-D-glucopyranoside)、鳶尾酚酮2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Iriflophenone 2-O-β-D-glucopyranoside)、熊果酸(Ursolic acid)、30-降常春藤皂苷元(30-Norhederagenin)以及常春藤皂苷元(Hederagenin)等成分(圖2)。
實施例二：牡丹皮萃取物對抗發炎活性及細胞毒性之篩選方法
牡丹皮萃取物抗發炎之篩選平台
當免疫細胞接受受體促效劑(agonist)或以病毒單/雙股DNA及RNA刺激細胞內受體之作用下，可以激活下游路徑，包括Toll-like receptor(TLR)1/2、TLR3、TLR4、TLR7、STING(cGAS-cGAMP-STING路徑)及MAVS(MDA5/RIG-I-Mitochondrial antiviral-signaling protein pathway)路徑。這些受體促效劑可激活NF-κB途徑，和/或激活干擾素調節因子(IRF)3/7，它們可協同刺激各種細胞因子的轉錄，包括干擾素α/β(IFN-α/β)、介白素-1β、介白素-6和腫瘤壞死因子-α。因此，本發明以發炎反應中的干擾素下游調控基因群(Interferon-stimulated Genes)，這裡使用的例子為干擾素活化反應元件(Interferon-Sensitive Response Element，ISRE)以及核轉錄因子-kappa B(NF-κB)驅動子啟動之報告基因，做為檢測本發明牡丹皮萃取物具有抗發炎生物活性的藥物篩選平台。
首先，將ISRE驅動子之冷光報告基因構建體及NF-κB驅動子之冷光報告基因構建體，分別穩定表達於單核球細胞(THP-1 cells)，從而能夠通過不同的促效劑驗證炎症反應，其中NF-κB會被TLR2促效劑Pam3CSK4刺激而活化，而IRF則會被RIG-I/MDA5刺激(透過轉染poly(I：C)來激活)。申言之，以1.0×105/mL之THP-1細胞密度種植於96孔盤之每孔中，然後在37℃之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時，在加入上述兩種促效劑0.1μg/mlPam3CSK4(InvivoGen，USA)或0.05μg/ml poly(I：C)/LyoVecTM(InvivoGen，USA)刺激2小時後，測量細胞報告基因轉錄及轉譯後產生之冷光蛋白，上述所得冷光蛋白表現可藉由其活性量，利用冷光儀測得，結果顯示出在未處理牡丹皮萃取物的組別中(MDP濃度為0μg/ml)，其NF-κB和IRF表現增強各約 10倍(圖3)及20倍(圖4)。接著，細胞以不同劑量的各牡丹皮萃取物錢處理(MDP1至MDP7)6小時，在給予各個促效劑後測定其冷光表現量，結果顯示出以抑制NF-κB路徑，MDP-5的半數最大抑制濃度(IC50)約為50μg/ml(圖3)，而以抑制IRF路徑，MDP-5的IC50抑制濃度更低於50μg/ml(圖4)，以報告基因篩選出來各個萃取液的抑制濃度，低濃度即有抑制效果之萃取液即為有效萃取液。結果顯示出牡丹皮萃取物MDP1至MDP5皆能具有不同程度的抑制IRF路徑的表現的作用，特別是MDP-4和MDP-5抑制IRF路徑的表現更為明顯。相反地，MDP-1為含有牡丹粗多糖的萃取物反而會促進NF-κB和IRF路徑的表現(圖3A和圖4A)。
細胞存活率分析(MTT assay)
將THP-1之細胞，以1.0×105/mL之細胞密度的種植於96孔盤之每孔中，以37℃之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時。之後，將實施例一中不同劑量的各牡丹皮萃取物添加於上述細胞中進行培養72小時。培養72小時之後，每孔加入10μL之3-(4，5-二甲基唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide；MTT四氮唑；5mg/mL,Sigma Co.,USA)，於37℃作用4小時後，移除上清液，再加入100μL之二甲亞碸(dimethyl sulfoxide；DMSO,Sigma Co.,USA)溶解MTT甲臢(MTT formazan；MTT四氮唑被還原後之產物)，震盪10分鐘後，測量其於波長570nm的吸光值以計算細胞存活率(cell viability)，結果顯示出在不同濃度的各種牡丹皮萃取物的處理下均沒有發生細胞死亡的現象(圖5)。
芍藥苷(Paeoniflorin)為一般認為之牡丹皮萃取物具有生物活性成分之一，然而圖6結果顯示出單一芍藥苷化合物不具備抑制免疫活性的功 能，而透過本發明的所揭露的牡丹皮萃取物則具有抑制免疫活性的功能，特別是除去牡丹皮萃取物中粗多糖的成分。
實施例三：牡丹皮萃取物可抑制抗發炎細胞因子的生成
透過實施例二以NF-κB和IRF訊號通路篩選出具有抑制免疫細胞產生發炎細胞因子的活性的牡丹皮萃取物。接著，將MDP-5作用於小鼠初代培養之骨髓分化之巨噬細胞(primary bone-marrow derived macrophages；BMDMs)並以其抑制激活之NF-κB/IRF訊號通路能力來評量其抑制發炎之活性。首先，以1.0×105/mL細胞密度將BMDMs種植於96孔盤之每孔中，在37℃之5%二氧化碳濃度下培養至少24小時，接著將培養好的BMDMs細胞以不同劑量的MDP-5預處理6小時，然後加入TLR4促效劑0.1μg/ml脂多醣(Lipopolysaccharides，LPS；InvivoGen，USA)進行活化免疫反應，最後以酵素結合免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA，eBioscience，USA)，測量下游細胞發炎細胞因子介白素-6和腫瘤壞死因子-α的量來評量其發炎抑製作用，結果顯示出MDP-5可有效抑制LPS引發BMDMs產生發炎細胞因子介白素-6和腫瘤壞死因子-α(圖7)。
實施例四：牡丹皮萃取物具有抑制病毒感染所引發的免疫反應
以免疫細胞受到病毒感染做為測試牡丹皮萃取物抗發炎作用的疾病模式，在此實施例中以水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)作為測試的病毒。實驗結果顯示出牡丹皮萃取物處理組別(MDP-4)具有劑量依賴性的抑制病毒引水疱性口炎發之干擾素發炎反應(圖8A)，進一步確認了MDP4在低濃度可有效抑制病毒引發之干擾素免疫反應且不具細胞毒性(圖8B)。
為了釐清牡丹皮萃取物抑制病毒所引發之免疫發炎反應的分子機制，因此，利用西方墨點法去偵測與病毒感染所引起的免疫反應的相關分子的表現量。圖9結果顯示出牡丹皮萃取物，包括了MDP-4和MDP-5皆能有效抑制由模擬病毒感染的poly(I：C)引起的免疫反應路徑，包括了：pTBK1、pIRF3以及p-IKKε的表現(圖9)。
實施例五：牡丹皮萃取物抗發炎之動物模式
葡聚醣硫酸鈉(Dextran sodium sulfate；DSS)誘發的結腸炎模型
將相同年齡、性別和體重相近的C57BL/6N小鼠飼養在無病原體的環境中並且以8-12週齡的小鼠進行實驗。將含有3%DSS(分子量36,000-50,000；MP Biomedicals,Santa Ana,CA,USA)的飲用水供給小鼠飲用5天，接著換回普通飲用水供給小鼠飲用9天，即可誘發DSS引起的結腸炎。在藥物治療實驗中，將小鼠隨機分為對照組與治療組。在治療組中，與加入含有3%DSS飲用水的當天同時每天餵食MDP-5(20mg/kg)，而對照組則餵食PBS。從DSS誘導的腸炎的當天開始(第0天)每天監測體重和糞便樣品以確定基線臨床評分，其臨床評分以糞便和出血分數平均做為臨床分數，其中以下方式確定糞便評分：0=形成良好的顆粒，1=未粘附於肛門的半糞便，2=粘附於肛門的半糞便，3=粘附於肛門的液體糞便肛門。而測定出血分數則使用Hemoccult SENSA(Beckman Coulter)測試進行判定，其分數判定如下：0=不帶血，1=陽性，2=糞便中可見的血液痕跡，3=直腸出血。
以葡聚醣硫酸鈉(Dextran sodium sulfate；DSS)誘導的小鼠腸炎模型結中驗證牡丹皮萃物在治療腸道發炎疾病及其他發炎疾病之可行性。以牡丹皮萃取物中的MDP-5作為可有效減少腸炎模型中的發炎反應的代表 萃取物，結果顯示出在實驗的第1天到第5天於小鼠的飲用水中添加3%DSS，讓小鼠自由飲用，到第6天則改為一般飲用水讓小鼠飲用並記錄每日所飲用的量。治療組小鼠每日口服MDP-5溶於PBS中，對照組小鼠口服PBS，結果顯示出治療組別其臨床發炎表徵明顯降低且體重升高(圖10)，顯示牡丹皮萃取物可有效治療小鼠腸道發炎。

Claims (6)

  1. 一種製備一牡丹皮萃取物之流程，包含以下步驟：(a)取得一牡丹皮藥材，以第一溶劑進行萃取產生一牡丹皮藥渣和第一萃取物，其中該第一溶劑為甲醇或乙醇；(b)將牡丹皮藥渣以第二溶劑進行超音波震盪並同時加熱萃取以產生第二溶劑萃取溶液，取部分該第二溶劑萃取溶液加入第三溶劑以產生第二萃取物，將部份該第二溶劑萃取溶液去除第二溶劑，產生第三萃取物，其中該第二溶劑為水，第三溶劑為甲醇或乙醇；(c)將該第一萃取物以第四溶劑進行萃取產生第四萃取物和第一水相，其中該第四溶劑為正己烷；(d)將該第一水相以第五溶劑進行萃取產生第五萃取物和第二水相，其中該第五溶劑為乙酸乙酯；(e)將該第二水相以第六溶劑進行萃取產生第六萃取物和第三水相，其中該第六溶劑為正丁醇；以及(f)第三水相乾燥後，即得第七萃取物。
  2. 一種牡丹皮萃取物用於製備預防或治療一個體罹患發炎性疾病之組合物的用途，其中該組合物係由一去除牡丹皮粗多糖之醇類萃取物及其活性成分所組成；其中該牡丹皮萃取物係由以下步驟所製備：(a)取一牡丹皮藥材，以一含有甲醇或乙醇溶液進行萃取產生一牡丹皮藥渣和一萃取物；(b)將該萃取物以一含有正己烷的溶液進行萃取產生一有機層和一水相 層，其中該有機層含有一牡丹皮萃取物；以及(c)去除步驟(b)中的該有機層中的有機溶劑得到該牡丹皮萃取物；以及該牡丹皮萃取物係由以下步驟所製備：(a)取一牡丹皮藥材，以一含有甲醇或乙醇溶液進行萃取產生一牡丹皮藥渣和一萃取物；(b)將該萃取物以一含有正己烷溶液進行萃取產生一第一有機層和一第一水相層；(c)將步驟(b)中的該第一水相層以一含有乙酸乙酯溶液進行萃取產生一第二有機層和一第二水相層；以及(d)去除步驟(c)中的該第二有機層之有機溶劑得到該牡丹皮萃取物。
  3. 根據申請專利範圍2所述之用途，其中該活性成分包含沒食子醯氧化芍藥苷(Galloyloxypaeoniflorin)、氧化芍藥苷(Oxypaeoniflorin)、牡丹皮苷C(Mudanpioside C)、牡丹皮苷E(Mudanpioside E)、牡丹皮苷I(Mudanpioside I)、牡丹皮苷J(Mudanpioside J)、丹皮酚苷B(Paeoniside B)、牡丹苷D(Suffruticoside D)、右旋兒茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-Catechin-7-O-β-D-glucopyranoside)、鳶尾酚酮2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Iriflophenone 2-O-β-D-glucopyranoside)、熊果酸(Ursolic acid)、30-降常春藤皂苷元(30-Norhederagenin)以及常春藤皂苷元(Hederagenin)化合物所構成之群組。
  4. 根據申請專利範圍2所述之用途，其中該發炎性疾病為一大量表現干擾素α/β、介白素-1β、介白素-6、腫瘤壞死因子-α或上述至 少一種以上所组成之免疫細胞發炎反應。
  5. 根據申請專利範圍2所述之用途，其中該發炎性疾病為病毒感染引發之發炎疾病和細菌感染引發之發炎疾病。
  6. 根據申請專利範圍2所述之用途，其中該發炎性疾病為發炎性腸道疾病、自體免疫疾病或自體發炎疾病。
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