TWI759783B - 利用gc-ci/ms平台非侵入性同步定量及追蹤體內脂肪酸合成碳源路徑之分析方法 - Google Patents

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黃羽萱
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周奕秀
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Abstract

本發明係提供一種以非侵入性方式同步定量及追蹤體內脂肪酸合成碳源路徑之分析方法，其特徵在於使用化學電離氣相質譜(GC-CI/MS)平台結合不同穩定同位素追蹤配方組合，以達到同步定量脂肪酸並追蹤不同碳源進入脂肪酸碳源路徑的目的。藉由本發明之方法，可有效降低樣品使用量、衍生藥品的使用、分析上機時間及研究人員的人力成本。

Description

利用GC-CI/MS平台非侵入性同步定量及追蹤體內脂肪酸合成碳源路 徑之分析方法
本發明係關於一種非侵入性同步定量體內脂肪酸，並追蹤用以合成脂肪酸之碳源的代謝路徑之分析方法。更特別地，係關於一種以非侵入性模式同步定量並追蹤體內不同碳源進入脂肪酸碳源路徑之方法，其係利用GC-CI/MS氣相質譜平台結合不同穩定同位素追蹤配方，定量並追蹤不同碳源合成各類脂肪酸同位素異構體之分佈。
脂肪酸在人類許多生理和病理過程扮演重要角色，脂肪酸代謝影響細胞長期能量儲存、細胞與細胞間信號傳遞、對維持細胞膜的穩定有其重要性。單元不飽和脂肪酸(mono-unsaturated fatty Acids，MUFA)積累對於壽命扮演重要角色，在無脊椎動物和哺乳動物研究中，特定脂肪分佈剖繪(profiles)的改變被認為可能與壽命相關，研究顯示於飲食補充單元不飽和脂肪酸(MUFA)，例如油酸(oleic)、棕櫚油酸(palmitoleic)及順式異油酸(cis-vaccenic acid)或內源性產生單元不飽和脂肪酸(MUFA)，可以延長秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)壽命和降低心血管疾病及糖尿病，也可以延長其他物種及哺乳類動物的壽命和降低心血管疾病。(PMID： 28379943，Han et al.,Nature 544,185-190,2017)。
脂肪代謝異常會導致肥胖、動脈粥樣硬化和第2型糖尿病等疾病。而在各種不同類型的癌症中，包括前列腺癌、肝癌、肺癌和腦腫瘤，會促進外源乙酸鹽(acetate)的吸收產生乙醯輔酶A(acetyl-coA)進一步增加脂質合成和維持腫瘤生長。疾病會造成脂肪酸代謝的改變，而飲食的介入可以改變特定脂肪酸的分佈、改善疾病造成的發炎反應、降低心血管疾病，探討脂肪酸的代謝可以更了解癌細胞的增生，也可以讓我們更了解飲食介入和保健食品對脂肪酸代謝的影響。
已知先前技術中之脂肪酸分析方法一般係使用電子電離(electron impact,EI)氣相質譜，電子電離被認為是一種硬電離方法，其在電子電離過程中會產生大量碎片，故而降低偵測靈敏度和碳流追蹤的準確性。且由於裂解出各種不同的碎片其中含有標定的碳含量不一，以致其質譜分佈無法偵測完整的脂肪酸結構，而不能準確反映出原本含碳官能基被轉換成脂肪酸產物的實際情況，造成在與自然豐度(nature abundance)結合分析追蹤代謝流時，會產生相當大的誤差，因此無法準確計算出其中原本碳源實際被利用情況，並不適用於脂肪酸碳流追蹤。
再者，目前市面生技業者代為分析送測脂肪酸的收費高昂，單就檢測脂肪酸的定量方法而言即超過台幣一萬元，而且目前市面生技業者皆没有提供追蹤不同碳源對脂肪酸碳源路徑的分析，以致使因研究實驗需求而送測所獲得之結果僅限於相對定量，但若想追蹤代謝路徑則無法符合預期。因此，本發明遂致力於建立一種可同步定量並追蹤不同碳源進入脂肪酸碳源路徑的偵測平台，嘗試以化學電離(chemical ionization,CI)氣相 質譜(GC-CI/MS)結合非侵入性穩定同位素追蹤配方，可以在對動物干擾最小的情況下，保留完整脂肪酸結構而進行脂肪酸定量，並進一步同步追蹤不同碳源對脂肪酸生成的影響。
於是，本發明之一方面係關於一種非侵入性同步定量及追蹤體內脂肪酸合成碳源路徑之分析方法，其特徵在於包含：將一包含同位素標定碳源之同位素追蹤配方組合物餵予目標檢測動物，其中該組合物係維持符合該動物之RDA巨量微量營養素熱量占比及維生素礦物質含量；於一定時間(例如，24小時)後收集該動物之血液檢體並萃取脂肪酸；將所得之萃取液以化學電離(chemical ionization,CI)氣相質譜(GC-CI/MS)系統進行分析，其中該氣相質譜系統係由氣相色譜儀及質譜儀所組成，且脂肪酸分離温度為氣相分離色譜管柱從70-80℃開始加熱，然後以4℃/min的速度升至200-240℃；以及由獲得之的質量同位素異構體分佈定量並追蹤脂肪酸碳源路徑。
於本發明之一具體實施例，所述之同位素追蹤配方組合物包含U-13C葡萄糖(glucose)碳源及/或[1,2-13C]乙酸(acetate)同位素標定碳源。
於本發明之一具體實施例，所述之脂肪酸分離温度為氣相分離色譜管柱從80℃開始加熱，然後以4℃/min的速度升至240℃。
於本發明之一具體實施例，所述之脂肪酸萃取步驟進一步包含將檢體加入100uL氫氧化鈉溶液於100℃下反應15分鐘，接着再加入三氯化硼反應衍生化1小時，之後加入氯化鈉和正己烷，離心後取上清液，使脂肪酸萃取物衍生化更完全。
圖一為脂肪酸標準品的氣相質譜圖譜
圖二為比較棕櫚酸(16：0,palmitic acid)在GC-EI/MS和GC-CI/MS的分析圖譜。
圖三為顯示標定葡萄糖U-13C Glucose，探討追蹤葡萄糖U-13C Glucose作為碳源透過糖解作用進入脂肪酸碳源路徑，●為標定葡萄糖U-13C Glucose之碳源可能流向。
圖四為顯示標定乙酸鹽[1,2-13C]acetate，探討追蹤乙酸鹽[1,2-13C]acetate作為碳源透過乙醯輔酶A羧化酶直接合成脂肪酸代謝路徑，●為標定乙酸鹽[1,2-13C]acetate之碳源流向。
圖五為動物標定葡萄糖U-13C葡萄糖(A)和[1,2-13C]乙酸鹽(B)穩定同位素追蹤配方組合，經本實驗室建立的質量同位素異構體分佈分析後，成功追蹤並量化出小鼠血漿中U-13C葡萄糖和[1,2-13C]乙酸鹽的碳源對脂肪酸代謝的影響(Y軸)，X軸代表各類脂肪酸。Y軸表示同位素標定增豐度(isotopic enrichments)。
圖六為動物標定穩定同位素L-[2,3,3-2H3]絲胺酸(A)和d9膽鹼(B)，追蹤肝臟L-[2,3,3-2H3]絲胺酸(A)和d9膽鹼(B)透過NADPH合成脂肪酸之路徑。Y軸表示同位素標定增豐度(isotopic enrichments)。
動物飼養方法
為了進一步研究動物體內不同碳源對脂肪酸碳源路徑的影響和脂肪酸定量，本發明建立一種非侵入性動物模式，同時定量及追蹤不同碳源對脂肪酸碳源路徑的影響。六週大雌性C57B6鼠，由國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center,NLAC，台北)獲得。為了減少動物實驗因環境因素造成的個體差異，小鼠飼養在20-25℃的特定無病原體和合適濕度條件下。照明以12小時的明暗循環運行。小鼠分為兩個組別，一組標定U-13C葡萄糖當碳源、另一組則用[1,2-13C]乙酸鹽當碳源追蹤不同碳源對脂肪酸代謝路徑的影響。動物在犧牲前會進行糞便收集。
為準確且降低同位素標定之使用成本，並能有效追蹤不同碳源對脂肪酸碳源路徑的影響，本發明研發一種『非侵入性穩定同位素追蹤配方組合』，其足以維持符合嚙齒類動物RDA巨量微量營養素熱量占比及維生素礦物質之含量。經過計算後，本發明之穩定同位素配方組合，可用在活體模式中同步定量和追蹤脂肪酸代謝路徑，已發現本發明之非侵入性穩定同位素追蹤配方組合可減少動物因打針管餵造成的壓力，在不干擾動物正常攝食飲水情況下，穩定追蹤活體模式中脂肪酸代謝路徑並可同步進行定量。於下表一所示，為所例舉一穩定同位素配方組合的組合物內容，包括其中所含有之組成物質及各成分的組成含量。小鼠進行犧牲，收集小鼠的血液檢體，肝及其他動物組織，檢體冰在-80冰箱待上機處理。
Figure 109122295-A0101-12-0006-1
Figure 109122295-A0101-12-0007-2
脂肪酸之萃取及衍生化
取50uL血漿加入100μL C19十九烷酸 脂肪酸內標，之後加入750uL氯仿/甲醇，再加入250uL氯仿和250uL水，混合均勻後離心10分鐘。離心後分層取下清液，並抽乾。為了更有效萃取脂肪酸並使脂肪酸衍生化更完全，將檢體加入100uL NaOH於100℃下反應15分鐘，接着再加入1mL三氯化硼反應1小時，之後加入750uL氯化鈉和200uL正己烷，離心後取上清液待上機進行分析。
GC-CI/MS分析方法
於本實例係建立GC-CI/MS分析平台，結合不同穩定同位素追蹤配方組合，來同步定量及追蹤脂肪酸碳源代謝路徑。於本實例中所使 用之氣相質譜系統，係分別由6890氣相色譜儀及5973質譜儀(Hewlett-Packard Corp.,Palo Alto,CA)所組成。氣相分離色譜管柱使用CP-Sil 88色譜管柱(內徑0.25mm，長100m，塗層厚度0.2μm)透過GCMS方法進行分析。脂肪酸分離温度為，氣相分離色譜管柱從80℃開始加熱，然後以4℃/min的速度升至240℃。
定量並追蹤出不同碳源合成各類脂肪酸同位素異構體分佈
首先於本發明之方法中，已成功建立同時定量並追蹤脂肪酸碳源路徑之氣相質譜分析平台，圖一為脂肪酸標準品的氣相質譜圖譜。本發明之方法，其特徵係使用化學電離以保留完整的脂肪酸結構。圖二為棕櫚酸(16：0,palmitic acid)在以GC-EI/MS和GC-CI/MS方法所得之圖譜比較。由比較結果顯示，GC-EI/MS在離子化過程中產生很多小碎片，由於裂解出各種不同的碎片其中含有標定的碳含量不一，無法準確反映出原本含碳官能基被轉換成脂肪酸產物的實際情況，因此無法準確計算出其中原本碳源實際被利用情況。而反觀本發明之GC-CI/MS分析平台，則可保留完整的脂肪酸結構，因此使用GC-CI/MS可以更準確靈敏地追蹤脂肪酸碳源路徑。
本發明藉由找出同位素代謝動力學，並在動物體內追蹤U-13C葡萄糖和[1,2-13C]乙酸鹽對脂肪酸碳源路徑的影響。動物在未給予同位素標定時所測得之脂肪酸，會符合自然界的同位素分佈；相反，當動物給予穩定同位素標定後，所測得之脂肪酸會比自然界的同位素分佈多，故藉由給予不同穩定同位素，追蹤不同代謝路徑對脂肪酸合成的影響。本發明透過計算，進一步追蹤同位素標定進入各脂肪酸的量。由結果顯示，已成功追蹤葡萄糖透過糖解作用，進入脂肪酸的碳源路徑(參見圖三)，以及乙 酸鹽透過乙醯輔酶A羧化酶，直接合成脂肪酸的代謝路徑(參見圖四)。
因此藉由本發明之方法，可追蹤不同組織來自不同碳源透過追蹤糖解作用，以及乙酸鹽透過乙醯輔酶A羧化酶，進入不同脂肪酸合成及排除的影響。在人類肝癌細胞(human hepatocellular carcinoma)中，乙醯輔酶A合成作用(Acetyl-CoA synthetases)基因(ACSS1,ACSS2(ACSS1/2)基因)的表達量會增加，而促進組蛋白H3乙醯化(histone H3 acetylation)和增加脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)基因的表達(PMID：27357947(Gao,X.,et al.,Nat Commun 7,11960,2016)。疾病會影響各種碳源利用進而改變脂肪酸的代謝，而目前市面生技產業没有提供追蹤脂肪酸的分析方法。
Palmitoleic acid碳源路徑的分析
經由本發明之方法，成功分析動物血漿標定U-13C葡萄糖和[1,2-13C]乙酸鹽對脂肪酸代謝路徑的影響(參見圖五)。在脂肪組織中16：1n-7可以減少發炎反應，以及透過影響AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)和絲裂原活化蛋白激酶信號通路(mitogen-activated protein kinase signaling pathways)，進一步改善肝臟和肌肉的代謝反應。棕櫚油酸(16：1n-7)可以改善肥胖和第二型糖尿病T2DM造成的代謝受損(Talbot,N.A.,et al.,Mol Cell Endocrinol 393,129-142,2014；Chan,K.L.,et al.,J Biol Chem 290,16979-16988,2015)。截至目前，追蹤動物體內不同碳源對棕櫚油酸碳源路徑的分析系統尚未被建立，而參照圖五所示之結果，本發明之方法已能藉由所建立之氣相質譜分析平台，於非侵入性動物模式成功分析、追蹤出標定U-13C葡萄糖和[1,2-13C]乙酸鹽同位素，以追蹤不同碳源對棕櫚油酸代謝路徑的利用，並且同步定量棕櫚油酸的含量。
探討NADPH在脂肪酸合成之角色
先前研究指出，約有40%之NADPH會透過四氫葉酸單碳代謝路徑產生(Fan,J.,et al.,Nature 510,298-302,2014)。絲胺酸和甘胺酸為主要的單碳代謝碳源，單碳代謝主要由絲胺酸透過細胞質和線粒體產生NADPH。由於已在很多實驗組中發現NADPH會受影響，遂欲進一步了解相關代謝的影響，然而，NADPH在非侵入性動物模式對脂肪酸合成之角色尚未被探討。本發明於是進一步建立，以非侵入性方式追蹤L-[2,3,3-2H3]絲胺酸及d9膽鹼透過NADPH進入脂肪酸合成之路徑，進一步了解NADPH在脂肪酸合成之角色。圖六為藉由動物標定穩定同位素L-[2,3,3-2H3]絲胺酸及d9膽鹼，追蹤肝臟L-[2,3,3-2H3]絲胺酸及d9 choline透過NADPH合成脂肪酸路徑。由結果發現，動物肝中會優先利用d9膽鹼而非L-[2,3,3-2H3]絲胺酸的NADPH進入脂肪酸。因此，本發明在不干擾動物正常攝食飲水情況下，利用不同之同位素如U-13C葡萄糖、[1,2-13C]乙酸鹽、及L-[2,3,3-2H3]絲胺酸和d9膽鹼，標定、追蹤脂肪酸碳源利用、並同步定量出各個目標脂肪酸的含量，成功追蹤不同碳源、探討不同的代謝路徑的影響。
本發明之脂肪酸代謝體分析方法與目前市面生技產業之技術比較
於目前市面生技產業中針對代謝體分析服務方法，已知並没有任何檢測方法可提供，同步定量跟測追蹤不同碳源對脂肪酸碳源路徑的影響。以下表二綜合列示，市面生技產業方法和本發明技術平台系統，在使用之分析平台及功能等方面上的比較。
Figure 109122295-A0101-12-0011-3
Figure 109122295-A0101-12-0012-4
Figure 109122295-A0101-12-0013-5
綜合上述，本發明首創結合GC-CI/MS分析平台與非侵入性穩定同位素追蹤配方組合，在不干擾動物正常攝食飲水下，以單一方法同步進行動物脂肪酸定量及追蹤脂肪酸代謝流程，減少實驗耗材、研發人力和時間成本，具有目前脂肪酸定量分析方法無法達到的功效及優點。因此，預期可應用於業界設計合成目標脂肪酸相關的路徑，同時提供產業界目標脂肪酸檢測或代謝體分析，有助產業界合成開發特殊脂肪酸及其組合，進一步提供保健食品素材開發、藥物設計和篩選，或追蹤食品活化物對脂肪酸代謝影響，以協助業界設計組合目標脂肪酸配方，有助於開發新穎或特殊配方組合。

Claims (5)

  1. 一種非侵入性同步定量及追蹤體內脂肪酸合成碳源路徑之分析方法，其特徵在於包含：
    將一包含同位素標定碳源之同位素追蹤配方組合物餵予目標檢測動物，其中該組合物係維持符合該動物之RDA巨量微量營養素熱量占比及維生素礦物質含量；
    於24小時後收集該動物之血液檢體並萃取脂肪酸；
    將所得之萃取液以化學電離(chemical ionization,CI)氣相質譜(GC-CI/MS)系統進行分析，其中該氣相質譜系統係由氣相色譜儀及質譜儀所組成，且脂肪酸分離温度為氣相分離色譜管柱從70-80℃開始加熱，然後以4℃/min的速度升至200-240℃；及
    由獲得之的質量同位素異構體分佈定量並追蹤脂肪酸碳源路徑。
  2. 如請求項1之方法，其中該同位素追蹤配方組合物包含U-13C葡萄糖碳源及/或[1,2-13C]乙酸鹽同位素標定碳源。
  3. 如請求項1之方法，其中該同位素追蹤配方組合物包含L-[2,3,3-2H3]絲胺酸和d9膽鹼。
  4. 如請求項1之方法，其中該脂肪酸分離温度為氣相分離色譜管柱從80℃開始加熱，然後以4℃/min的速度升至240℃。
  5. 如請求項1之方法，其中該脂肪酸萃取步驟進一步包含將脂肪酸衍生化，包含將檢體加入100uL NaOH溶液於100℃下反應15分鐘；之後加 入三氯化硼反應衍生化1小時；及加入氯化鈉和正己烷，離心後取上清液得到萃取液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200538738A (en) * 2004-02-20 2005-12-01 Univ California Molecular flux rates through critical pathways measured by stable isotope labeling in vivo, as biomarkers of drug action and disease activity

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Title
"食品中脂肪酸及反式脂肪酸之檢驗方法," 96年10月19日署授食字第 0961800343 號公告^&rn^ http://www.rootlaw.com.tw/Attach/L-Doc/A040170051034400-1021128-1000-001.pdf^&rn^
"食品中脂肪酸及反式脂肪酸之檢驗方法," 96年10月19日署授食字第 0961800343 號公告^&rn^ http://www.rootlaw.com.tw/Attach/L-Doc/A040170051034400-1021128-1000-001.pdf^&rn^ *
Yvonne Schober, Hans Günther Wahl, Harald Renz, Wolfgang Andreas Nockher, and Carrie J. Adler, "临床研究中红细胞脂肪酸谱的测定：化学电离气相色谱串联质谱仪," Agilent应用简报临床研究, 2018/03/08. https://www.agilent.com/cs/library/applications/5991-8941ZHCN_cellular_FA_GCMS_application.pdf; *

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