TWI745616B - 放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物及其生產方法 - Google Patents

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Abstract

一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物及其生產方法，係將一長效型標靶性胜肽藥物溶解於溶液中，於高溫下標誌放射性同位素，其標誌後之放射線胜肽藥物，其用量減少、標誌效率提升，且無須再經過濾純化，可縮短製備過程並減少人員暴露；其放射性長效型靶向性胜肽藥物，可提升腫瘤專一性結合量，並降低正常組織非專一蓄積，因此可應用於腫瘤與核醫領域，此種藥物可供腫瘤或腫瘤轉移之診斷與治療，並達到精準治療的功效。

Description

放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物及其生產方法
本發明是有關放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物及其生產方法，尤指一種可減少用量並提升標誌效率，且可縮短製備過程、降低生產成本之靶向性胜肽藥物及生產方法。
據世界衛生組織(WHO)發佈的《全球癌症報告2014》指出，全球癌症病例增長快速，將由2012年的1400萬人，逐年遞增至2025年的1900萬人，到2035年，將達到2400萬人，即23年時間內增加七成以上。
標靶性胜肽藥物的開發已是近十年來的趨勢，腫瘤細胞生長至1-2mm，因其新生血管而得以遷移與生長，而整合素作為影響細胞附著、遷移、生長和分化，在發炎與腫瘤內皮細胞，血管新生皆有高度表現，其中αvβ3或αvβ5在乳腺癌血管生成中亦發揮重要作用。
因此以RGD胜肽(Arg-Gly-Asp peptide)當作整合素(integrin-ligand)交互作用抑制劑，環形RGD胜肽可優先結合整合素αvβ3，作為腫瘤細胞靶向探針。當其胜肽藥物標誌長半化期與短半化期的放射線同位素，藉由分子影像可供作腫瘤的診斷與治療劑。
由於整聯蛋白家族的成員在細胞活化、遷移、增殖、存活和分化的調節中具有重要作用，已發現整聯蛋白αvβ3在破骨細胞和侵襲性腫瘤 (如：晚期膠質母細胞瘤，乳腺和前列腺腫瘤、惡性黑素瘤和卵巢癌)中可高度表達；使用放射性標記的RGD-肽對整聯蛋白αvβ3表現，如：F-18標記的RGD的臨床試驗也已經開始用於非侵入性的乳腺癌檢測和分期。含有RGD多肽，並以標記放射性核種(如：I-131、In-111、Tc-99m、Ga-68、F-18等)，使腫瘤部位得以顯像(如：一些F-18-半乳糖RGD、F-18-RGD-K5、Ga-68-NOTA-RGD、Ga-68-NOTA-(RGD)2、F-18-(RGD)2和F-18-Alfatide)。目前臨床藥物RGD藥物開發多以RGD或c(RGDfV)，c(RGDfK)為主，且多為診斷型藥劑。
然而，胜肽藥物因水溶性好、於實際應用時會產生於腫瘤的蓄積量不如蛋白藥物高，以及快速被體內代謝等問題，在商品化的過程中，仍需克服放射線造影時T/M比率高低、腫瘤蓄積量隨時間遞減，與小分子胜肽藥物快速體內排除等缺失；在WO2016209795A1與CN104650217A等二專利案中，NIH揭露了以修飾的伊文思藍(modified Evans Blue,EB)做為所開發RGD相關藥物之技術，但其於應用時，亦難以有效克服放射線經儲存與運送衰變的問題。
有鑑於習見之標靶性胜肽藥物於應用時有上述缺點，發明人乃針對該些缺點研究改進之道，終於有本發明產生。
本發明之主要目的在於提供一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物DOTA-EB-cRGDfK(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N'''-tetraacetic acid,DOTA)，其係以腫瘤高專一性及辨識血管新生之環狀RGD胜肽藥物cRGDfK為主體，開發長效型標靶性核醫藥物，應用於全身移轉之整合素αvβ3表現腫瘤(如：乳癌等)診斷與治療；主要作用機制及設計如下：
(1)環狀(cyclic)RGD衍生物：環狀胜肽cRGDfK與新生血管及部分腫瘤上高度表現之整合素αvβ3可高度專一結合。
(2)於環狀RGD接上可與血液中白蛋白(albμmin)高親合之分子，可延長該胜肽藥物於體內之循環時間，最終達到提升腫瘤專一性結合量並降低正常組織非專一蓄積之目標。
(3)鍵結金屬螯合劑(DOTA)並可進行放射線同位素如(In-111、Lu-177、Ga-68)標誌。
上述放射胜肽藥物優勢與應用(以乳癌為例)，可精準評估腫瘤於體內分布情形及大小，主要針對手術、超音波、斷層掃描等方法無法準確診斷之全身轉移性乳癌，減少誤診機率。
本發明之另一目的在於提供一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物，其設計上係以套組方式搭配產製，以供完成標誌標誌長效型靶向性胜肽藥物，整體操作上極為便利，且使其可安定保存運送，不受放射線半化其影響，經Radio-HPLC與ITLC測試，其標誌效率可大於90%，且不需用經過管柱純化。
本發明之又一目的在於提供一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物，其可結合分子影像醫學技術，，且開發成本較目前臨床試驗中之放射RGD藥物低，可合理抑低進口藥價。
S11:將該溶液瓶中之酸性溶液注入該凍晶瓶中
S12:以酸性溶液潤濕該吸附管柱，並將該吸附管柱置於該凍晶瓶上
S13:將68GaCl3或111InCl3或177LuCl3注入該吸附管柱，並使純化後之放射性溶液流入該凍晶瓶中
S14:混和均勻後加熱，經過濾裝置過濾後即得初產物
S15:經標誌效率檢驗後，即得最終產物
第1圖係本發明之DOTA-EB-cRGDfK結構圖。
第2圖係本發明之DOTA-EB-cRGDfK的標誌效果分析圖(一)。
第3圖係本發明之DOTA-EB-cRGDfK的標誌效果分析圖(二)。
第4圖係本發明之111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤動物模式藥物動力學分佈圖。
第5圖係本發明之111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤藥物器官分佈統計圖。
第6圖係本發明之111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤藥物生物分佈統計圖。
第7圖係本發明之111In-DOTA-EB-cRGDfK套組的使用方法流程圖。
請參第1圖所示，可知本發明之DOTA-EB-cRGDfK結構係如下所示：
Figure 107131698-A0305-02-0006-3
而上述放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK之製備，係以DOTA-EB-cRGDfK胜肽30μg(含20μg/μL溶於DMSO溶液)，加入放射線同位素溶液(含111In或68Ga或177Lu)，1M NaOAc溶液補至300μL，混和均勻後，其溶液pH值為6~7。將溶液置入95℃熱反應器中震盪反應15分鐘，待冷卻後，取1μL進行ITLC分析，其標誌效率大於90%，取上述溶液20-30μCi，進行Radio-HPLC分析，其主訊號出現滯留時間為7分鐘。
請參第2圖所示，其係本發明上述之放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK的標誌效果(濃度與pH值)分析圖，以及第3圖所示，其係本發明上述之 放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK的標誌效果，及其活度與濃度統計表，可知該放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK經條件測試結果顯示：
(1)DOTA-EB-cRGDfK含量為40~60μg，In111活度6mCi，在pH4.5-6，於95℃下反應10-20分鐘，標誌效率皆>90%。
(2)DOTA-EB-cRGDfK含量為40~60μg，In111活度6-13mCi，在pH6，於95℃下反應15分鐘，標誌效率皆>90%。
請參第4圖所示，可知本發明上述之111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤動物模式藥物動力學試驗中，該111In-DOTA-EB-cRGDfK經由尾靜脈給予，於不同時間點採血進行藥物動力學分析。結果得知藥物半衰期(T1/2)為77.9小時、清除率(clearance,CL)為0.426g/h及曲線下面積(area under curve,AUC)為242h*%ID/g。
請參第5、6圖所示，可知本發明上述之111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤藥物生物分佈試驗中，該111In-DOTA-EB-cRGDfK經由尾靜脈給予，於不同時間點犧牲動物採樣組織/器官，進行輻射劑量計讀並換算成生物體分布數據(%ID/g)。結果顯示該111In-DOTA-EB-cRGDfK於U-87 MG腫瘤具有明顯蓄積現象(最高約占25%ID/g)，並至少持續到96小時。
本發明之上述放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK於實際應用時，可將其製備為DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶，以利於長時間儲存及運送，且可增進使用上的便利性；其DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶的製備方式如下：首先，取4-5μL DOTA-EB-cRGDfK/DMSO溶液(濃度20μg/μL)加入3M醋酸鈉(NaOAc)溶液333μL；再加入注射水至1000μL，pH值為7；於-25℃進行冷凍乾燥96hr；再灌入氮氣約1分鐘，並以塑膠軟塞與鋁蓋將瓶蓋密封。
在實際應用時，可將該DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶搭配一溶液 瓶、一過濾裝置及一吸附裝置組成一適用於In111與Ga68之放射性標誌DOTA-EB-cRGDfK的套組結構；其中該溶液瓶含量為3mL pH3之鹽酸或醋酸，以供作為調劑與調整pH值用。
該DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶之成份包括：(1)含量為60-120μg，以100μg為較佳之DOTA-EB-cRGDfK胜肽；(2)含量為4-10μL之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide DMSO)；(3)含量為80-100mg之醋酸鈉(Sodium acetate)。
該吸附裝置具有一吸附管柱，其成分有二層，上層為強陰離子交換樹脂，其組成為Dowex1x8-200，100-200mesh，8%交聯，用量為0.5g~2g；下層為二氧化鈦顆粒，大小為75-300μm，用量為零或為0.1g~1g，其組成為金紅石(rutile)：銳鈦礦(anatase)，以Biorad柱(731-1550)管柱填充。
該過濾裝置係為0.22μm之PVDF(poly vinylidene fluoride，PVDF)濾膜。
請參第7圖所示，可知本發明上述之111In-DOTA-EB-cRGDfK或68Ga-DOTA-EB-cRGDfK或177Lu-DOTA-EB-cRGDfK套組具有下列使用步驟：
(1)「將該溶液瓶中之酸性溶液注入該凍晶瓶中」S11步驟：係取出該溶液瓶中之pH3酸性溶液1-2mL，將其注入該DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶中。
(2)「以酸性溶液潤濕該吸附管柱，並將該吸附管柱置於該凍晶瓶上」S12步驟：取0.1MHCl潤濕該吸附劑管柱，再將該吸附管柱置於該凍晶瓶之上。
(3)「將68GaCl3或111InCl3或177LuCl3注入該吸附管柱，並使純化後之放射性溶液流入該凍晶瓶中」S13步驟：係將68GaCl3或111InCl3或177LuCl3注入該吸附管柱，其溶液活度為3-12mCi，體積為10-200μL，使其純化後之放射性溶液流 入該凍晶瓶中。
(4)「混和均勻後加熱，經過濾裝置過濾後即得初產物」S14步驟：係將該放射性溶液混和均勻後，加熱至85~95℃(以95℃較佳)，反應時間為10~30分鐘(以15分鐘較佳)，再經該過濾裝置過濾後，即可得到初產物。
(5)「經標誌效率檢驗後，即得最終產物」S15步驟：係使該初產物經过Radio-TLC標誌效率檢驗後，即得111In-DOTA-EB-cRGDfK或68Ga-DOTA-EB-cRGDfK或177Lu-DOTA-EB-cRGDfK等最終產物。 上述DOTA-EB-cRGDfK凍晶瓶，進行In-111標誌試驗，最終以ITLC與Radio-HPLC進行標誌效率與放化純度檢驗，得其111In-DOTA-EB-cRGDfK標誌效率與放化純度皆大於90%，其凍晶瓶於-25℃維持1個月仍可達到放化純度與標誌效率大於90%。
本發明上述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物，其具有以下優點：
(1)增加藥物專一於腫瘤處蓄積量，降低非腫瘤處組織藥物蓄積量。
(2)改善胜肽藥物快速排除速率的缺點。
(3)鹽類成分用量少，可減少體內負擔。
(4)可供使用於診斷與治療。
(5)製備過程短，不需要過濾，減少人員暴露。
(6)可適用於放射線核種(如In-111，Ga-68，Lu-177)。
此外，利用其藥物與血液中白蛋白結合之特性，可延長該胜肽藥物於體內循環時間，達到提升腫瘤專一性結合量，並降低正常組織非專一蓄積，以符合精準醫療之發展趨勢。
在實際應用上，未來可進一步開發177Lu/90Y-DOTA-EB- cRGDfK，達成先篩選的個人化醫學目的，其優勢為精準評估乳癌於體內分布情形及腫瘤大小，主要針對手術、超音波、斷層掃描等方法無法準確診斷之全身轉移性Integrin αvβ3表現腫瘤，增加準確性。
綜合以上所述，本發明放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物及其生產方法確可達成減少用量、提升標誌效率，且可縮短製備過程、降低生產成本之功效，實為一具新穎性及進步性之發明，爰依法提出申請發明專利；惟上述說明之內容，僅為本發明之較佳實施例說明，舉凡依本發明之技術手段與範疇所延伸之變化、修飾、改變或等效置換者，亦皆應落入本發明之專利申請範圍內。

Claims (7)

  1. 一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組，包括：一溶液瓶，瓶內容置有pH3之酸性溶液；一凍晶瓶，瓶內容置有胜肽藥物DOTA-EB-cRGDfK(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N",N'''-tetraacetic acid,DOTA)；一過濾裝置與吸附裝置；可與放射性同位素68GaCl3或111InCl3或177LuCl3作用，形成放射性標記的長效型靶向性胜肽藥物，其中該吸附裝置係為一具有二層之Bio-Rad柱吸附管柱，該吸附管柱上層為強陰離子交換樹脂，其組成為Dowex1x8-200，100-200mesh，8%交聯，該吸附管柱下層為二氧化鈦顆粒，大小為75-300μm，其組成為金紅石(rutile)銳鈦礦(anatase)，以Bio-Rad柱吸附管柱填充。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組，其中該溶液瓶內之酸性溶液為選自鹽酸、醋酸及檸檬酸其中之一。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組，其中該過濾裝置係為0.22μm之聚偏二氟乙烯PVDF之濾膜。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組，其中該凍晶瓶依其混合後單次劑量之主要成份包括：(1)含量為60-120μg之DOTA-EB-cRGDfK胜肽；(2)含量為2-10μL之二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide DMSO)；(3)含量為80-100mg之醋酸鈉(Sodium acetate)。
  5. 一種放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組使用方法，包括下列步驟： (1)自一含有鹽酸或醋酸之酸性溶液瓶中取出該溶液瓶中之pH3酸性溶液1-2mL，將其注入含有單次劑量放射性標記的長效型靶向性胜肽藥物DOTA-EB-cRGDfK之凍晶瓶中；(2)取0.1NHCl潤濕一吸附裝置之吸附管柱，將該吸附管柱置於該凍晶瓶之上其中該吸附裝置係為一具有二層之Bio-Rad柱吸附管柱，該吸附管柱上層為強陰離子交換樹脂，其組成為Dowex1x8-200，100-200mesh，8%交聯，該吸附管柱下層為二氧化鈦顆粒，大小為75-300μm，其組成為金紅石(rutile)銳鈦礦(anatase)，以Bio-Rad柱吸附管柱填充；(3)將放射線溶液68GaCl3或111InCl3或177LuCl3注入該吸附管柱，其純化後溶液流入該凍晶瓶中；(4)混和均勻後，於反應器上加熱至85~95℃，時間為10~30分鐘，再經過濾裝置加以過濾，即得初產物；(5)經Radio-TLC標誌效率檢驗後，即得放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之最終產物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組使用方法，其中該放射線溶液係111InCl3、68GaCl3、或177LuCl3，其溶液溶液活度為3-12mCi，體積為10-200μL。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物之套組使用方法，其中該放射線標誌長效型靶向性胜肽藥物係DOTA-EB-cRGDfK，其最終產物為111In-DOTA-EB-cRGDfK或68Ga-DOTA-EB-cRGDfK或177Lu-DOTA-EB-cRGDfK。
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Title
Lopez-Rodriguez V, et al. "Preparation and preclinical evaluation of (66)Ga-DOTA-E(c(RGDfK))2 as a potential theranostic radiopharmaceutical.", Nucl Med Biol. 2015 Feb;42(2):109-114 *
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