TWI737219B

TWI737219B - 低分子量幾丁聚醣之用途

Info

Publication number: TWI737219B
Application number: TW109108834A
Authority: TW
Inventors: 鄭嘉雄
Original assignee: 臺北醫學大學
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2021-08-21
Also published as: TW202136320A

Abstract

本揭示提供一種破壞一細胞之細胞膜之方法，其包含以低分子量幾丁聚醣與該細胞接觸，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。本揭示亦提供一種萃取一細胞中蛋白質之方法、一種均質化一細胞之方法及一種破壞一細胞之細胞膜之套組。

Description

低分子量幾丁聚醣之用途

本揭示係關於一種多醣聚合物之用途，具體而言，係關於一種低分子量幾丁聚醣之用途。

隨者生物科技的進步與演進，自生物體之組織或自培養之細胞內萃取蛋白質，乃成為生物科技領域中基本且常用的技術手段之一。自組織或細胞內萃取蛋白質時，首要步驟須將組織或細胞打破以萃取蛋白質。

現有技術將組織或細胞破碎之方法包括機械法及非機械法，其中，機械法包括高壓均質破碎法(homogenization)、高速攪拌珠研磨破碎法(fine grinding)及超音波破碎法(ultrasonication)等；而非機械法包括滲透壓衝擊破碎法(osmotic shock)、凍融破碎法(freezing and thawing)、酵素裂解法(enzyme lysis)、透過酸、鹼、表面活性劑和有機溶劑處理之化學處理法(chemical treatment)及洗滌劑破裂法(detergent)。然而，利用高壓均質破碎法、高速攪拌珠研磨破碎法、超音波破碎法洗滌劑破裂法、化學處理法及洗滌劑破裂法來破碎組織或細胞會破壞蛋白質的活性。此外，倘若使用酵素裂解法打破大量的組織或細胞，將提高萃取蛋白質之成本。再者，利用滲透壓衝擊破碎法及凍融破碎法會耗費漫長的時間來萃取組織或細胞內的蛋白質。

有鑑於此，發展出低成本且不會破壞蛋白質活性之快速萃取生物體之組織或細胞內蛋白質之方法係本領域亟待解決之問題。

因此，本揭示提供一種於活體外破壞一細胞之細胞膜之方法，其包含以低分子量幾丁聚醣與該細胞接觸，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。

本揭示提供一種萃取一細胞中蛋白質之方法，其包含前述之方法。

本揭示另提供一種均質化一細胞之方法，其包含前述之方法。

本揭示又提供一種破壞一細胞之細胞膜之套組，其包含低分子量幾丁聚醣，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。

本揭示再提供一種低分子量幾丁聚醣之用途，其係用以製備破壞一細胞之細胞膜之藥物，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。

除非另外指出，否則如本揭示所用之以下術語應解釋為具有以下含義。

範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。

必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

除非本文另有說明，否則說明書及所附申請專利範圍中所使用之術語「或」包括「及/或」之含義。

本揭示提供一種於活體外破壞一細胞之細胞膜之方法，其包含以低分子量幾丁聚醣與該細胞接觸，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。

本揭示所言之「幾丁聚醣」係指一線性多醣，其中胺基葡萄糖之脫乙醯單位與N-乙醯葡糖胺之乙醯單位隨機分布，並彼此透過β-（1-4）糖苷鍵聚合而成。根據本揭示之幾丁聚醣可包含或不包含修飾。根據本揭示之修飾包含但不限於醯化、羧基化、羥基化、烷化、酯化、醛亞胺化、疊氮化、成鹽、水解、螯合、氧化、氯化、枝接或交聯。

根據本揭示之低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。於本揭示之一較佳具體實施例中，該低分子量幾丁聚醣之分子量上限值可為約60 kDa、約55 kDa、約50 kDa、約45 kDa、約40 kDa、約35 kDa、約30 kDa、約25 kDa、約20 kDa或約15 kDa；該低分子量幾丁聚醣之分子量下限值可為約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約25 kDa、約30 kDa、約35 kDa、約40 kDa、約45 kDa、約50 kDa或約55 kDa。更佳地，該低分子量幾丁聚醣之分子量範圍自約10 kD至約60 kDa之間、自約10 kD至約50 kDa之間、自約10 kD至約40 kDa之間、自約10 kD至約30 kDa之間、自約20 kD至約30 kDa之間或自約10 kD至約20 kDa之間。尤佳地，該低分子量幾丁聚醣之分子量可為約12.9 kDa、約13.6 kDa、約13.9 kDa、約15 kDa、約18.5 kDa、約25 kDa、約24 kDa、約29 kDa或約33 kDa。

另一方面，根據本揭示之幾丁聚醣可為源自天然或人工合成。於本揭示之一較佳具體實施中，該低分子量幾丁聚醣係為降解高分子量幾丁聚醣而得。根據本揭示之降解包含但不限於酸降解法、酵素降解法、氧化還原降解法或物理性降解法。

於本揭示之一具體實施例中，酸降解法包括，但不限於透過氯化氫、硝酸、硫酸、磷酸、甲酸、以酸、乳酸或其任意組合，以降解高分子量幾丁聚醣。

於本揭示之一具體實施例中，酵素降解法包括，但不限於透過幾丁質酶、溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶、木瓜酵素、鳳梨酵素、纖維素分解酶或其任意組合，以降解高分子量幾丁聚醣。

於本揭示之一具體實施例中，氧化還原降解法包括，但不限於透過過氧化氫、次氯酸鈉、亞硝酸鹽或其任意組合，以降解高分子量幾丁聚醣。

於本揭示之一具體實施例中，物理性降解法，包括，但不限於微波、超音波、放射線或是其任意組合，以降解高分子量幾丁聚醣。

於本揭示之一較佳具體實施例中，該低分子量幾丁聚醣係去乙醯化低分子量幾丁聚醣。

根據本揭示之細胞係源自一生物，該細胞可位於一生物體內，亦可獨立或半獨立於一生物體外，例如存在於適當培養液中之細胞培養物或存在於經分離組織中之細胞。於本揭示之一具體實施例中，該細胞係源自一動物，根據本揭示之動物包含脊椎動物及無脊椎動物。於本揭示之一具體實施例中，脊椎動物較佳為哺乳動物。根據本揭示之動物包含但不限於人類、非人類靈長類動物、齧齒動物、天竺鼠、兔、綿羊、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、雞、鴨、鵝、魚或蜆。

於本揭示之一較佳具體實施例中，該方法另包含與陰離子生物聚合物(anionic biopolymer)結合再與該細胞接觸。根據本揭示之該陰離子生物聚合物包含但不限於γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、海藻酸鹽(alginate)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、果膠(pectin)、紅藻膠(carrageenan)、醣肝素(heparin)或其任意組合。

本揭示提供一種萃取一細胞中蛋白質之方法，其包含前述之方法。雖不願為理論所限制，但咸信因該低分子量幾丁聚醣可破壞細胞膜，因此細胞中之蛋白質可自細胞膜內釋放，俾利於進一步之蛋白質萃取。

本揭示另提供一種均質化一細胞之方法，其包含前述之方法。雖不願為理論所限制，但咸信因該低分子量幾丁聚醣可破壞細胞膜，因此細胞中之成分或胞器可自細胞膜內釋放，俾利於細胞之均質化及進一步之各物質萃取。

本揭示透過低分子量幾丁聚醣破壞生物體之細胞膜的機制，達到在短時間內快速萃取生物體之組織或細胞的蛋白質之目的。此外，由於低分子量幾丁聚醣並非界面活性劑，低分子量幾丁聚醣係溫和地破壞生物體之細胞膜，且生物體之組織或細胞的物質或蛋白質能夠在短時間內被萃取出來，因此，本揭示亦能夠達到減低各物質或蛋白質活性被破壞之目的。具有低成本、快速萃取且不會破壞物質活性。

本揭示又提供一種破壞一細胞之細胞膜之套組，其包含低分子量幾丁聚醣，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10 kDa至約60 kDa。低分子量幾丁聚醣價格便宜且容易製得，因此，低分子量幾丁聚醣能夠方便包裝為用於製備破壞細胞膜或進一步萃取生物體之組織或細胞之蛋白質的套組內的製劑。具有低成本、快速萃取且不會破壞物質活性，以及方便包裝之功效。

於本揭示之一較佳具體例中，該套組另包含陰離子生物聚合物，以控制其作用。其中該陰離子生物聚合物係選自γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、聚丙烯酸、果膠、紅藻膠、醣肝素或其任意組合。

於本揭示之一較佳具體實施例中，該藥物另包含陰離子生物聚合物，以控制其作用，其中該陰離子生物聚合物係選自γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、聚丙烯酸、果膠、紅藻膠、醣肝素或其任意組合。

以下係藉由特定的具體實施例說明本揭示之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本揭示之其他優點與功效。然而，本揭示中所揭示之例示性實施例僅出於說明之目的，不應被視為限制本揭示之範圍。換言之，本揭示也可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同的觀點與應用，在不悖離本揭示之精神下進行各種修飾與變更。製備例1：製備幾丁聚醣(CS)溶液

將約85%去乙醯化之分子量為60 kDa的幾丁聚醣粉末(購自日本東京甲陽化學株式會社)溶解於去離子蒸餾水(ddH ₂O)中，以配製濃度為0.7% (w/v)幾丁聚醣水溶液。將0.02% (w/v)亞硝酸鈉溶液與0.7%幾丁聚醣水溶液以1：10之比例混合，以形成混合物，並震盪10分鐘。利用氫氧化鈉溶液調整混合物之pH值為pH 10後，利用去離子蒸餾水作為透析液，進行透析3天。最後，利用氯化氫溶液將混合物中和為pH 5.0，以製得幾丁聚醣溶液，並儲存於4℃。製備例2：製備低分子量之幾丁聚醣(LMWCS)溶液

如圖1所示，將100 µl溶菌酶(濃度為4,000 Unit/ml)加入製備例1所製得之幾丁聚醣溶液，於25℃水浴下進行水解反應3、6、12、18和24小時後，將水解產物置於80℃水浴中加熱6小時，使溶菌酶失活，以分別製得分子量為18.5 kDa、15 kDa、13.9 kDa、13.6 kDa 以及12.9 kDa之低分子量的幾丁聚醣。製備例3：製備低分子量之幾丁聚醣奈米顆粒(LMWCS NPs)混合溶液(LMWCS NPsM)

將500毫升製備例2所製得之低分子量的幾丁聚醣與0.001克γ-聚乙二醇海藻酸鹽(γ-polyethylene glycol-alginate, γ-PGA，購自台灣味丹)混合並溶解於去離子蒸餾水中，以配製濃度為50% (w/v)之LMWCS NPs混合溶液，其中，LMWCS NPs混合溶液包含LMWCS NPs、游離的LMWCS和游離的γ-PGA。實施例1：檢測CS溶液與LMWCS溶液對於斑馬魚之毒性

將CS溶液與LMWCS溶液分別以10 ppm、50 ppm及100 ppm的濃度處理斑馬魚苗，並以蒸餾水作為對照組，於處理後24小時觀察斑馬魚苗的卵黃之完整度，倘若斑馬魚苗的卵黃破裂，則判斷CS溶液與LMWCS溶液對於斑馬魚苗具有毒性。如圖2所示，處理CS溶液後並不會造成斑馬魚苗死亡，然而，處理10 ppm、50 ppm及100 ppm濃度的LMWCS溶液後，斑馬魚苗的存活率分別降至約83.3%、6.7%及0%。結果顯示，CS溶液對於斑馬魚苗不具毒性，然而，LMWCS溶液則會造成斑馬魚苗死亡。實施例2：檢測LMWCS NPs混合溶液(LMWCS NPsM)及經純化的低分子量之幾丁聚醣奈米顆粒(LMWCS NPs)對於斑馬魚之毒性

將濃度為10 ppm、50 ppm及100 ppm的LMWCS NPs混合溶液處理斑馬魚苗，並以蒸餾水作為對照組，於處理後18小時、24小時、48小時及72小時觀察LMWCs NPs混合溶液對於斑馬魚苗的毒性。如圖3A所示，處理10 ppm濃度的LMWCS NPs混合溶液後，斑馬魚苗的存活率降至70%，而處理50 ppm及100 ppm濃度的LMWCS NPs混合溶液後，斑馬魚苗的存活率則為0%。結果顯示，LMWCS NPs混合溶液對於斑馬魚苗的毒性呈劑量依賴性。

為了確認LMWCS NPs混合溶液中的何種組成物提供斑馬魚苗的毒性，進一步從LMWCS NPs混合溶液中分離出LMWCS NPs。將濃度為100 ppm的LMWCS NPs混合溶液(LMWCS NPsM)以10,000 rpm轉速進行離心10分鐘，以獲得包含游離的LMWCS和游離的γ-PGA之上清液，及幾丁聚醣奈米顆粒(LMWCS NPs)之沉澱物。將濃度為100 ppm的LMWCS NPs混合溶液(LMWCS NPsM)、分離出的LMWCS NPs與上清液及濃度為20 ppm的γ-PGA處理斑馬魚苗，並以蒸餾水作為對照組，於處理後18小時、24小時、48小時及72小時觀察LMWCS NPs混合溶液、LMWCS NPs、上清液及γ-PGA對於斑馬魚苗的毒性。如圖3B所示，利用20 ppm的γ-PGA處理斑馬魚苗72小時後，斑馬魚苗的存活率為100%；利用50 ppm的LMWCS NPs混合溶液處理斑馬魚苗18小時後，斑馬魚苗的存活率為0%；利用上清液處理斑馬魚苗18小時後，斑馬魚苗的存活率降為10%；而利用LMWCS NPs處理斑馬魚苗24小時及48小時，斑馬魚苗的存活率為100 %，然而，處理72小時後，斑馬魚苗的存活率略降為約80%。結果顯示，γ-PGA對於斑馬魚係沒有毒性的，由此顯見，存在於上清液內游離的LMWCS係提供斑馬魚苗之毒性的主要成分。實施例3：檢測LMWCS溶液對於斑馬魚肝細胞(zebrafish liver cell)之細胞毒性及對於細胞膜之影響

利用3-(4, -二甲基噻唑 (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)分析法，檢測不同濃度之LMWCS溶液對於斑馬魚肝細胞之細胞毒性。將斑馬魚肝細胞接種於48孔培養盤內(濃度為每孔含有105個斑馬魚肝細胞)隔夜後，於各孔中分別加入含有濃度為0.5 ppm、1 ppm、5 ppm及10 ppm之LMWCS溶液的E3緩衝液或加入作為對照組之E3緩衝液，於室溫下處理20分鐘後，移除E3緩衝液，並利用PBS緩衝液沖洗細胞3次。於28℃下，利用包含10% FBS且溶解於LDF培養液之濃度為50 µg/mL的MTT處理細胞2小時，之後移除培養液，再以200 µl DMSO溶解沉澱物。最後，利用微孔盤光譜分析儀(購自美國Bio-Tech公司)讀取波長為570 nm之吸光值。如圖4A所示，處理5 ppm濃度的LMWCS溶液後，斑馬魚肝細胞的存活率降至約55%，而處理10 ppm濃度的LMWCS溶液後，斑馬魚苗的存活率則降至約50%。結果顯示，LMWCS溶液對於斑馬魚肝細胞會造成毒性，並引起細胞死亡。

為了觀察LMWCS溶液造成斑馬魚肝細胞死亡之原因是否由於細胞膜破裂所引起，利用台酚藍(trypan blue)將細胞進行染色，並觀察細胞的顏色，另以掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)觀察細胞的完整度。將斑馬魚肝細胞接種於12孔培養盤內(濃度為每孔含有105個斑馬魚肝細胞)隔夜後，於各孔中分別加入含有濃度為5 ppm、10 ppm、50 ppm及100 ppm之LMWCS溶液的E3緩衝液，於室溫下處理20分鐘後，移除E3緩衝液，並利用PBS緩衝液沖洗細胞3次。利用0.5%台酚藍將細胞進行染色5分鐘後，以OLYMPUS IX70-FLA倒立式螢光顯微鏡(購自日本東京OLYMPUS公司)結合SPOT系統(購自美國密西根州Diagnostic Instrument製造商)擷取影像。圖4B顯示，以PBS緩衝溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，斑馬魚肝細胞並未被台酚藍染成藍色；而圖4C至圖4F所示，隨著處理LMWCS溶液之濃度的增加，斑馬魚肝細胞經台酚藍後所呈現的顏色(藍色)會越深。此外，利用掃描電子顯微鏡觀察經E3溶液或經100 ppm之LMWCS溶液處理之斑馬魚肝細胞之細胞膜的影像圖。圖4G顯示，經E3溶液處理之斑馬魚肝細胞r具有完整的細胞膜；然而，如圖4H所示，經100 ppm之LMWCS溶液處理之斑馬魚肝細胞的細胞膜不完整，且具有許多的穿孔。結果顯示，LMWCS溶液會引起斑馬魚肝細胞之細胞膜大量穿孔，進而造成斑馬魚肝細胞死亡。實施例4：檢測LMWCS溶液對於斑馬魚成魚之毒性

為了觀察LMWCS溶液對於斑馬魚成魚之影響，利用移動分析觀察斑馬魚成魚之行為，並藉由組織化學染色(histochemistry stain)觀察斑馬魚成魚之鰓、表皮層、小腸及肌肉組織的狀態。利用濃度為100 ppm之LMWCS溶液或作為對照組之水，於室溫下處理並觀察斑馬魚成魚1個小時，透過數位監控紀錄器記錄斑馬魚成魚在卵黃破裂前的移動行為，以及利用TopScan Lite軟體(購自美國維吉尼亞州Clever公司)進行行為軌跡之分析。如圖5A和圖5B所示，斑馬魚成魚經LMWCS溶液處理後至死亡前，會出現焦慮不安及缺氧行為。

將經LMWCS溶液處理後的斑馬魚成魚以4%三聚甲醛處理1天後，利用100%甲醇進行脫水，以得到斑馬魚成魚樣本。將斑馬魚成魚樣本包埋於石臘內，並切片後，利用蘇木精-伊紅進行染色。如圖5C至圖5F所示，斑馬魚成魚經LMWCS溶液處理後，斑馬魚成魚之鰓、表皮層、小腸及肌肉組織皆會被分解。結果顯示，LMWCS溶液亦會破壞斑馬魚成魚之組織，且鰓受到破壞係造成斑馬魚成魚死亡之主要原因。實施例5：利用LMWCS溶液萃取斑馬魚成魚之總蛋白質

利用濃度為100 ppm之LMWCS溶液，於室溫下處理15隻或30隻斑馬魚成魚1個小時後，分別可得到濃度約34 μg/mg及約48 μg/mg之總蛋白質。結果顯示，透過LMWCS溶液破壞斑馬魚肝細胞的細胞膜之機制，藉由LMWCS溶液處理斑馬魚成魚後，能夠在1小時有效地萃取出斑馬魚成魚的總蛋白質。實施例6：檢測LMWCS溶液對於人類PC9肺癌細胞之細胞毒性

為了分析LMWCS溶液造成哺乳動物細胞膜的破裂，以LMWCS溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，再利用台酚藍(trypan blue)將進行細胞染色，並觀察細胞的顏色變化。將人類PC9肺癌細胞接種於12孔培養盤內(濃度為每孔含有105個斑馬魚肝細胞)隔夜後，於各孔中分別加入含有濃度為10 ppm、50 ppm、100 ppm及200 ppm之LMWCS溶液的E3緩衝液或加入作為對照組之E3緩衝液，於室溫下處理20分鐘後，移除E3緩衝液，並利用PBS緩衝液沖洗細胞3次。利用0.5%台酚藍將細胞進行染色5分鐘後，以OLYMPUS IX70-FLA倒立式螢光顯微鏡(購自日本東京OLYMPUS公司)結合SPOT系統(購自美國密西根州Diagnostic Instrument製造商)擷取影像。圖7A顯示，以E3緩衝溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，人類PC9肺癌細胞並未被台酚藍染成藍色；而圖7B至圖7E所示，隨著處理LMWCS溶液之濃度的增加，人類PC9肺癌細胞經台酚藍後所呈現的顏色(藍色)會越深。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。本發明所屬技術領域中具通常知識者對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1顯示，利用溶菌酶處理幾丁聚醣溶液3、6、12、18和24小時後，得到分子量分別為18.5 kDa、15 kDa、13.9 kDa、13.6 kDa 以及12.9 kDa之低分子量的幾丁聚醣。

圖2顯示，以濃度為10 ppm、50 ppm及100 ppm的CS溶液與LMWCS溶液處理斑馬魚苗24小時後，斑馬魚苗之存活率曲線圖。

圖3A顯示，以濃度為10 ppm、50 ppm及100 ppm的LMWCS NPs混合溶液(LMWCS NPsM)處理斑馬魚苗18小時、24小時、48小時及72小時後，斑馬魚苗存活率之曲線圖。

圖3B顯示，以濃度為10 ppm的LMWCS NPs混合溶液(LMWCS NPsM)、LMWCS NPs、上清液及濃度為20 ppm的γ-PGA處理斑馬魚苗處理斑馬魚苗18小時、24小時、48小時及72小時後，斑馬魚苗存活率之曲線圖。

圖4A顯示，LMWCS在PBS及E3緩衝溶液中處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，以(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (MTT)測定細胞的存活率。

圖4B顯示，以E3緩衝溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖4C顯示，以5 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖4D顯示，以10 ppm之LMWCS溶液或PBS緩衝處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖4E顯示，以濃度為50 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖4F顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖4G顯示，以PBS緩衝溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用掃描電子顯微鏡觀察斑馬魚肝細胞之細胞膜的影像圖。

圖4H顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚肝細胞20分鐘後，利用掃描電子顯微鏡觀察斑馬魚肝細胞之細胞膜的影像圖。

圖5A顯示，以水持續處理斑馬魚成魚20分鐘，利用移動分析(locomotion assay)觀察斑馬魚成魚之行為。

圖5B顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液持續處理斑馬魚成魚20分鐘，利用移動分析(locomotion assay)觀察斑馬魚成魚之行為。

圖5C顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚成魚20分鐘後，利用蘇木精-伊紅進行染色之鰓組織細胞之影像圖。

圖5D顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚成魚20分鐘後，利用蘇木精-伊紅進行染色之表皮層細胞之影像圖。

圖5E顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚成魚20分鐘後，利用蘇木精-伊紅進行染色之小腸細胞之影像圖。

圖5F顯示，以濃度為100 ppm之LMWCS溶液處理斑馬魚成魚20分鐘後，利用蘇木精-伊紅進行染色之肌肉組織細胞之影像圖。

圖6顯示，以濃度為2000 ppm之LMWCS溶液處理15隻或30隻斑馬魚成魚1小時後，所萃取之蛋白質之濃度柱狀圖。

圖7A顯示，以E3緩衝液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖7B顯示，以10 ppm之LMWCS溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖7C顯示，以50 ppm之LMWCS溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖7D顯示，以100 ppm之LMWCS溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

圖7E顯示，以200 ppm之LMWCS溶液處理人類PC9肺癌細胞20分鐘後，利用0.5%台酚藍將細胞進行染色之細胞影像圖。

Claims

一種於活體外破壞細胞之細胞膜之方法，其包含以低分子量幾丁聚醣與該細胞接觸，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10kDa至約60kDa，其中該細胞係源自動物。
如請求項1之方法，其另包含以陰離子生物聚合物控制低分子量幾丁聚醣與該細胞接觸之步驟。
如請求項2之方法，其中該陰離子生物聚合物係選自γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、聚丙烯酸、果膠、紅藻膠、醣肝素或其任意組合。
一種萃取細胞中蛋白質之方法，其包含如請求項1至3任何一項之方法，其中該細胞係源自動物。
一種均質化細胞之方法，其包含如請求項1至3任何一項之方法，其中該細胞係源自動物。
一種破壞細胞之細胞膜之套組，其包含低分子量幾丁聚醣，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10kDa至約60kDa，其中該細胞係源自動物。
如請求項6之套組，其另包含陰離子生物聚合物，以控制其作用，其中該陰離子生物聚合物係選自γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、聚丙烯酸、果膠、紅藻膠、醣肝素或其任意組合。
一種低分子量幾丁聚醣之用途，其係用以製備破壞細胞之細胞膜之藥物，其中該低分子量幾丁聚醣之分子量係自約10kDa至約60kDa，其中該細胞係源自動物。
如請求項8之用途，其中該藥物另包含陰離子生物聚合物，以控制其作用，其中該陰離子生物聚合物係選自γ-聚乙二醇海藻酸鹽、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、聚丙烯酸、果膠、紅藻膠、醣肝素或其任意組合。