TWI724046B - 以抗ｃｄ３８抗體與生存素抑制劑於血紅素惡性腫瘤之組合治療 - Google Patents

Abstract

本發明係關於以抗CD38抗體與生存素(survivin)抑制劑於血紅素惡性腫瘤之組合治療。

Description

以抗CD38抗體與生存素抑制劑於血紅素惡性腫瘤之組合治療 【相關申請案之交互參照】

本申請案主張於2016年6月22日申請的美國專利申請案第15/189,577號及於2016年6月22日申請的國際專利申請案第PCT/US16/38702號之利益，其全文內容係以引用方式併入本文中。

本發明係關於用於血紅素惡性腫瘤之組合治療。

多發性骨髓瘤(MM)是一種B細胞惡性腫瘤，其特徵為骨髓中分泌型漿細胞以低增生率和延長的壽命潛伏聚積。疾病最終攻擊骨骼與骨髓，而導致遍及骨骼系統的多發性腫瘤與病變。大約所有癌症的1%，以及所有血液惡性腫瘤的略多於10%，可歸因於MM。在診斷時中位數年齡係約61歲的老化人口中，MM之發生率會增加。

目前可用於MM的治療包括化學治療方案、幹細胞移植、THALOMID®(沙利度胺(thalidomide))、REVLIMID®(來那度胺(lenalidomide))、POMALYST®(泊馬度胺(pomalidomide))、VELCADE®(硼替佐米(bortezomib))、KYPROLIS®(卡非佐米(carfilzomib))、FARADYK®(帕比司他(panobinostat))、AREDIA® (裴米卓耐特(pamidronate))、及ZOMETA®(唑來磷酸(zoledronic acid))。目前的治療計畫包括諸如長春新鹼(vincristine)、BCNU、黴法蘭(melphalan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿黴素(adriamycin)、及強體松(prednisone)或迪皮質醇(dexamethasone)等化學治療劑之組合，其給出只有約5%之完全緩解率，且自診斷時以來的中位數存活期係大約36至48個月。最近的進展係使用高劑量化學治療，接著進行自體骨髓或周邊血液單核細胞移植，如此已增加完全緩解率與緩解持續時間。儘管如此，整體存活期僅有稍微延長，且尚未獲得痊癒的證據。最終，即使是在單獨使用干擾素α(IFN-α)或在其與類固醇組合的維持治療下，所有MM病患皆會復發。

可用於MM的藥物治療方案之療效因細胞增生率低且在病患中高達90%會發展出抗藥性而受限。染色體易位、致癌基因突變、失調的訊息傳遞路徑(諸如抗細胞凋亡及存活路徑等)、及骨髓微環境(bone marrow niche)已顯示與促成MM中的抗藥性有關(有關綜述，參見Abdi等人，Oncotarget 4：2186-2207,2013)。骨髓(BM)微環境意味著惡性漿細胞的增生、存活、分化、遷移、及抗藥性(Manier等人，J Biomed Biotechnol 2012；線上發表於2012年10月3日，doi：_10.1155/_2012/_157496)。

CD38是一種第二型跨膜醣蛋白，對用於各種血紅素惡性腫瘤之抗體治療來說，此係引人注目的標靶，包括多發性骨髓瘤。抗CD38抗體已描述於例如國際專利公開號WO2008/037257、國際專利公開號WO2008/047242、及國際專利公開號WO2007/042309中， 彼等對於多發性骨髓瘤以及其他血紅素惡性腫瘤之療效正在臨床設定中加以評估。

本發明提供一種治療患有CD38陽性血液惡性腫瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體及生存素(survivin)抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療CD38陽性血液惡性腫瘤的時間。

圖1A. 骨髓基質細胞(BMSC)媒介針對多發性骨髓瘤(MM)細胞殺滅的保護作用，該細胞殺滅由以MM細胞系中抗CD38抗體(達拉單抗(daratumumab))誘導之ADCC所致。螢光素酶轉導的CD38⁺ UM9 MM細胞於健康供體BMSC(HD-BMSC)存在或不存在的條件下經過培養16小時，然後經過與系列濃度之達拉單抗及HD-PBMC(PBMC：MM細胞比係30：1)培育。經過4小時後，藉由生物發光成像(BLI)來測定MM細胞生存力。在相對於沒有達拉單抗的細胞生存力下，計算ADCC百分比(%)。誤差條表示三次重複測量的平均值標準誤差(SEM)。資料代表3項獨立的實驗。用非成對t檢定來檢定有或沒有BMSC的培養物之間的差異，*=p<0.05。

圖1B. 骨髓基質細胞(BMSC)媒介針對多發性骨髓瘤(MM)細胞殺滅的保護作用，該細胞殺滅由以MM細胞系中抗CD38抗體(達拉單抗(daratumumab))誘導之ADCC所致。螢光素酶轉導的 CD38⁺ RPMI8226 MM細胞在HD-BMSC存在或不存在的條件下經過培養16小時，然後經過與系列濃度之達拉單抗及HD-PBMC(PBMC：MM細胞比係30：1)培育。經過4小時後，藉由BLI來測定MM細胞生存力。在相對於沒有達拉單抗的細胞生存力下，計算ADCC(%)。誤差條表示三次重複測量的SEM。資料代表3項獨立的實驗。用非成對t檢定來檢定有或沒有BMSC的培養物之間的差異，*=p<0.05。

圖2A. BMSC媒介針對MM細胞殺滅的保護作用，該殺滅殺傷係由以初代MM病患樣本中抗CD38抗體(達拉單抗)誘導之ADCC所致。自MM病患1獲得的完全骨髓穿刺物於自體骨髓基質細胞存在(白色條)或不存在(黑色條)的條件下經過培養，然後以指定濃度之達拉單抗處理。穿刺物中存在的自體細胞係經用於作為效應細胞。由於BM-MNC已含有作為效應細胞之NK細胞，因此未加入額外效應細胞。經過24小時後，以流動式細胞測量術測定培養物中的CD138⁺ MM細胞之生存力。誤差條表示三次重複測量的SEM。用非成對t檢定來檢定有或沒有BMSC的培養物之間差異。*=p<0.05。上圖：病患#1；下圖：病患#2。BMSC：骨髓基質細胞。ADCC：抗體依賴性細胞毒性。

圖2B. BMSC媒介針對MM細胞殺滅的保護作用，該殺滅殺傷係由以初代MM病患樣本中抗CD38抗體(達拉單抗)誘導之ADCC所致。自MM病患2獲得的完全骨髓穿刺物於自體骨髓基質細胞存在(白色條)或不存在(黑色條)的條件下經過培養， 然後以指定濃度之達拉單抗處理。穿刺物中存在的自體細胞係經用於作為效應細胞。由於BM-MNC已含有作為效應細胞之NK細胞，因此未加入額外效應細胞。經過24小時後，以流動式細胞測量術測定培養物中的CD138⁺ MM細胞之生存力。誤差條表示三次重複測量的SEM。用非成對t檢定來檢定有或沒有BMSC的培養物之間差異。*=p<0.05。上圖：病患#1；下圖：病患#2。BMSC：骨髓基質細胞。ADCC：抗體依賴性細胞毒性。

圖3. YM155不會誘導NK細胞裂解。HD-PBMC與病患骨髓單核細胞(BMMNC)在具有指定濃度之YM155下培育24小時。使用流動式細胞測量術測定生存CD3^- CD56⁺ NK細胞的數量，且使用未經處理的樣本作為陰性對照來計算裂解百分比。

圖4A. 達拉單抗與YM155之組合對於由基質細胞存在下ADCC所致的MM細胞殺滅，提供協同效應。螢光素酶轉導的RPMI8226 MM細胞在HD-BMSC存在或不存在的條件下經過培養。以指定濃度加入達拉單抗及YM155。以40：1之PBMC：MM比，在所有孔中加入HD-PBMC作為NK細胞的來源以誘導ADCC。經過4小時後，藉由BLI來測定RPMI8226細胞存活情形。在相對於未接受任何處理的RPMI8226細胞之存活情形下，計算裂解(%)。在YM155與達拉單抗組合的情況下，自單獨經達拉單抗與單獨經YM155處理的效果推導出預期的裂解值，在此假定累積效應會是相加的，而不是協同的。用成對t檢定來測定已預 期與已觀察的結果之間的統計上差異，***=P<0.005，*=P<0.05。DARA：達拉單抗。

圖4B. 達拉單抗與YM155之組合對於在基質細胞存在下之ADCC所致的初代MM細胞殺滅提供協同效應。MM病患1的完全BM穿刺物於自體MM-BMSC存在或不存在下經過培養。以指定濃度加入達拉單抗及YM155。由於BM-MNC含有足夠NK細胞(在兩者情況下，大約在30：1之NK：MM細胞比)，因此未加入額外效應細胞。經過24小時後，生存CD138⁺ MM細胞在各自條件下經由流動式細胞測量術計數。在相對於經以相同條件培養但未接受任何處理的BM-MNC中MM細胞之存活情形下，計算裂解(%)。用成對t檢定來測定預期與觀察的結果之間的統計上差異。*=P<0.05。

圖4C. 達拉單抗與YM155之組合對於在基質細胞存在下之ADCC所致的初代MM細胞殺滅提供協同效應。MM病患2的完全BM穿刺物於自體MM-BMSC存在或不存在下經過培養。以指定濃度加入達拉單抗及YM155。由於BM-MNC含有足夠NK細胞(在兩者情況下，大約在30：1之NK：MM細胞比)，因此未加入額外效應細胞。經過24小時後，生存CD138⁺ MM細胞在各自條件下經由流動式細胞測量術計數。在相對於經以相同條件培養但未接受任何處理的BM-MNC中MM細胞之存活情形下，計算裂解(%)。用成對t檢定來測定預期與觀察的結果之間的統計上差異。*=P<0.05。

圖4D. 達拉單抗與YM155之組合對於在基質細胞存在下之ADCC所致的初代MM細胞殺滅提供協同效應。來自四名MM病患的骨髓單核細胞(BM-MNC)含有CD138⁺ MM細胞(病患1至4分別為45%、5.5%、10.2%、21.6%)於自體MM-BMSC存在或不存在下經過培養。加入了達拉單抗(1ng/ml)及適當之次最大濃度的YM155(病患1至4分別為125、62、75、及50ng/ml)。由於BM-MNC含有足夠NK細胞(分別係7.9%、7.9%、10.3%、及9.5%)，因此未加入額外效應細胞。經過24小時後，生存CD138⁺ MM細胞在各自條件下經由流動式細胞測量術計數。在相對於經以相同條件培養但未接受任何處理的BM-MNC中MM細胞之存活情形下，計算裂解(%)。用成對t檢定來測定預期與觀察的結果之間的統計上差異。*=P<0.05。ns：不顯著。DARA：達拉單抗。

圖5. 達拉單抗與YM155組合治療的抗腫瘤效應。在植入UM9細胞的RAG2^-/-γc^-/-小鼠中，對每個治療群組進行腫瘤負荷之分析。經人類MSC包覆且載有螢光素酶轉導的MM細胞系UM9之複合支架係經皮下植入於RAG2^-/-γc^-/-小鼠背部(每隻小鼠4個支架)。在植入十天後，藉由BLI可視化並定量生長中的腫瘤。然後，不同群組的小鼠(n=4)係依指定經媒劑對照治療(對照)，或者經達拉單抗、YM155、或達拉單抗加上YM155治療。用皮下輸液泵，以1mg/kg/d YM155之速率，持續輸送YM155(或其媒劑，PBS)十天。每隻小鼠(包括對照組中的小鼠)接受T細胞 淨除(T-cell depleted)之HD-PBMC(5×10⁶個細胞)作為人類NK細胞的來源以誘導ADCC。每週藉由BLI監測小鼠。結果以每個支架中的平均腫瘤負荷表示。誤差條代表SEM。使用曼-惠特尼U檢定(Mann-Whitney U-test)，計算經達拉單抗治療的小鼠與經達拉單抗加上YM155治療的小鼠之間的統計上差異。*** P<0.001。

「CD38」係指人類CD38蛋白(同義字：ADP核糖基環化酶1、cADPr水解酶1、環ADP核糖水解酶1)。人類CD38具有如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。眾所周知的是，CD38是一種II型單次跨膜蛋白，其具有代表胞質域的胺基酸殘基1-21、代表跨膜域的胺基酸殘基22-42、及代表CD38之胞外域的殘基43-300。

本文中所用之用語「抗體(antibody)」為廣義上的用意且包括免疫球蛋白分子，其包括單株抗體(包括鼠類、人類、人類調適(human-adapted)、人化及嵌合單株抗體)、抗體片段、雙特異性或多特異性抗體、二聚體、四聚體或多聚體抗體、及單鏈抗體。

免疫球蛋白可分為五大類，即IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，其視重鏈恆定域(constant domain)胺基酸序列而定。IgA與IgG進一步細分為同型(isotype)IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可分派為兩種截然不同類型(即kappa(κ)及lambda(λ))之一者，視其恆定域的胺基酸序列而定。

用語「抗體片段(antibody fragment)」係指免疫球蛋白分子的一個部分，其保留重鏈及/或輕鏈抗原結合部位，諸如重鏈互補決定區(HCDR)1、2及3、輕鏈互補決定區(LCDR)1、2及3、重鏈可變區(VH)、或輕鏈可變區(VL)。抗體片段包括Fab片段，即由VL、VH、CL及CHI域所組成之單價片段；F(ab)₂片段，即二價片段，包含在絞鏈區域(hinge region)藉由二硫橋連結的兩個Fab片段；Fd片段，由VH及CHI域所組成；Fv片段，由抗體單臂的VL及VH域所組成；域抗體(dAb)片段(Ward等人，Nature 341：544-546,1989)，其係由VH域所組成。VH及VL域可經工程改造並經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域會進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之單鏈抗體建構體所表現之情況下則會進行分子間配對，以形成單價抗原結合部位，諸如單鏈Fv(scFv)或雙價抗體(diabody)；例如描述於下列中者：國際專利公開號WO1998/44001、WO1988/01649、WO1994/13804、及WO1992/01047。這些抗體片段係使用所屬技術領域中具有通常知識者所知悉的習知技術而獲得，且該些片段係經篩選具有如全長抗體相同方式之效用。

用語「經單離之抗體(isolated antibody)」係指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體或抗體片段(如，特異性結合CD38的經單離之抗體實質上不含特異性結合人類CD38以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合CD38的經單離之抗體可能會與其他抗原有交叉反應，諸如人類CD38的異種同源物，諸如食蟹猴(Macaca fascicularis)CD38。此外，經單離之抗體可實質上不含其他細胞材料和/或化學物。

抗體可變區係由被三個「抗原結合部位(antigen binding site)」中斷的「架構(framework)」區所組成。該等抗原結合部位係使用各種用語定義：(i)互補決定區(CDR)(三個在VH(HCDR1,HCDR2,HCDR3)，且三個在VL(LCDR1,LCDR2,LCDR3))係基於序列變異性(Wu and Kabat J Exp Med 132：211-50,1970；Kabat et al Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)「超變異區(hypervariable region)」、「HVR」、或「HV」(三個在VH(H1,H2,H3)且三個在VL(L1,L2,L3))係指如Chothia及Lesk所定義般在結構上係超變異(hypervariable)之抗體可變域中的區域(Chothia and Lesk,Mol Biol 196：901-17,1987)。其他用語包括「IMGT-CDR」(Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003)及「特異性決定殘基用途(Specificity Determining Residue Usage)」(SDRU)(Almagro Mol Recognit 17：132-43,2004)。國際免疫遺傳學(International ImMunoGeneTics,IMGT)資料庫(http：//www_imgt_org)提供了標準化編號及抗原結合部位的定義。CDR、HV及IMGT描繪之間的對應性係描述於Lefranc等人，Dev Comparat Immunol 27：55-77,2003。

本文中所用之「Chothia殘基(Chothia residue)」為依據Al-Lazikani所編號的VL及VH殘基(Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273：927-48,1997)。

「架構(framwork)」或「架構序列(framwork sequence)」為可變區中被定義為抗原結合部位以外的其餘序列。因為抗原結合部位可用如上所述之各種用語來定義，架構之確切胺基酸序列取決於如何定義抗原結合部位。

「人化抗體(humanized antibody)」係指抗原結合部位係衍生自非人類物種且可變區架構係衍生自人類免疫球蛋白序列的抗體。人化抗體可在架構區中包括取代，所以該架構可能不是所表現人類免疫球蛋白或生殖系基因序列的確切複本。

「人類抗體(human antibody)」係指具有重鏈及輕鏈可變區的抗體，其中架構及抗原結合部位兩者皆衍生自人源序列。若該抗體含有恆定區，則該恆定區亦衍生自人源序列。

如果該抗體的可變區係得自使用人類生殖系免疫球蛋白或重排(rearranged)免疫球蛋白基因的系統，則人類抗體包含「衍生自(derived from)」人源序列的重或輕鏈可變區。該等系統包括經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫(gene library)、及基因轉殖非人類動物(諸如帶有人類免疫球蛋白基因位點的小鼠)，如本文中所述。「人類抗體」在與人類生殖系或重排免疫球蛋白序列比較時可能含有胺基酸差異，此係由於例如天然發生之體細胞突變或在架構或抗原結合部位中刻意引入取代所致。一般而言，「人類抗體」係在胺基酸序列 上與由人類生殖系或重排免疫球蛋白基因所編碼的胺基酸序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。在一些情況下，「人類抗體」可能含有自人類架構序列分析導出的共有架構序列，例如Knappik等人所述(J Mol Biol 296：57-86,2000)，或合併至經展示在噬菌體上的人類免疫球蛋白基因庫的合成HCDR3，例如Shi等人(J Mol Biol 397：385-96,2010)及國際專利公開號WO2009/085462中所述。抗原結合部位衍生自非人類物種的抗體不包括在「人類抗體」的定義中。

經單離之人化抗體可為合成的。人類抗體若衍生自人類免疫球蛋白序列，則可使用諸如合併有合成CDR之噬菌體呈現(phage display)及/或合併有合成架構的系統來產生，或者可在體外(in vitro)進行突變誘發以改良抗體性質，從而得到在體內(in vivo)人類抗體生殖系貯庫(repertoire)內不會天然存在的抗體。

「重組抗體(recombinant antibody)」包括所有藉由重組手段製備、表現、創建或單離之抗體，諸如自經過人類免疫球蛋白基因之基因轉殖或染色體轉殖的動物(如小鼠)或由其製備的融合瘤(下面有進一步的描述)單離之抗體，自經轉形(transform)以表現抗體之宿主細胞單離之抗體，自重組的組合抗體庫單離之抗體，及藉由任何涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的其他手段製備、表現、創建、或單離之抗體，或在體外使用Fab臂交換所產生的抗體。

「單株抗體(monoclonal antibody)」係指由單一分子組成之抗體分子的製劑。單株抗體組成物對特定表位展示出單一結合特異性及親和力，或者在雙特異性單株抗體的情況下，對兩個不同的表位有雙結合特異性。因此，「單株抗體」係指在各重鏈與各輕鏈中具有單一胺基酸組成之抗體群，除了可能的習知變化，諸如自抗體重鏈移除C端離胺酸。在抗體群內，單株抗體可具有異質性醣基化。單株抗體可係單特異性或多特異性，或者係單價、二價或多價。雙特異性抗體係包括在用語單株抗體內。

「表位(epitope)」係指與抗體特異性結合的抗原部分。表位通常由分子部分(諸如胺基酸或多醣側鏈)之化學活性(諸如極性、非極性或疏水性)表面分群(grouping)所組成，並且可具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。表位可包含形成構形空間單元之鄰接(contiguous)及/或不鄰接(discontiguous)胺基酸。關於不鄰接表位，來自抗原線性序列之相異部分的胺基酸會透過蛋白質分子的摺疊而在3維空間中緊密靠近。

「變體(variant)」係指藉由一或多個修飾(例如取代、插入、或缺失)而不同於參考多肽或參考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

「組合(in combination with)」意指二或更多種治療劑可一起以混合物形式投予至對象、可同時以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。

「治療/處理(treat)」或「治療/處理(treatment)」係指治療性處理與疾病預防性或防治性措施，其中目標是要防治或減緩(減輕)非所欲的生理變化或病症，諸如腫瘤或腫瘤細胞的發展或擴散。有益或所欲之臨床成果包括緩解症狀、降低疾病程度、使疾病進入穩定化(即不惡化)狀態、延緩或減慢疾病進程、改善或緩和疾病狀態、及緩解(無論部分或完全)，無論可檢測或不可檢測，以及在相較於未接受治療的預期存活期下可延長存活期。該等有治療需要的包括該等已具有狀況或病症的，以及該等易患有狀況或病症的，或者該等要防治狀況或病症的。

「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療成果所需之劑量及時間量的有效量。治療有效量可依不同因素而異，諸如對象之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在對象中誘發所欲反應的能力。可減小或減輕與抗性之相關性的有效治療劑或治療劑組合的例示性指標包括例如病患幸福感的提高、腫瘤負荷的減少、腫瘤生長的減緩或停止、及/或癌細胞未轉移至身體的其他位置。

「協同(synergy)」、「協同作用(synergism)」或「協同的(synergistic)」意指組合的效果比預期的相加效應更多。

「抑制生長(inhibit growth)」(如提及細胞(諸如腫瘤細胞)時)係指當與治療劑或治療劑或藥物的組合接觸時，在體外或體內的細胞生長相較於在所屬技術領域中具有通常知識者習知的適當控制條件下生長的相同細胞的生長有可測量的減少。在體外或體內的 細胞生長的抑制可為至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、或100%。細胞生長之抑制可藉由各種機制發生，例如藉由ADCC、細胞凋亡、壞死、或者經由細胞增生之抑制。

「對象(subject)」包括任何人類或非人類動物(nonhuman animal)。「非人類動物」包括所有脊椎動物，如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。用語「對象」與「病患(patient)」在本文中可互換使用。

本文中所用之「生存素(survivin)」係指具有SEQ ID NO：22中所示之胺基酸序列的生存素蛋白。生存素係細胞凋亡抑制劑(inhibitor of apoptosis,IAP)家族中之成員。生存素係雙功能蛋白，可作為細胞凋亡抑制劑與細胞週期調節劑。生存素過度表現已在人類惡性腫瘤中觀察到，且其與預後不良、腫瘤復發、及治療抗性呈正相關(Liu等人，Cancer Biol.Ther.,7：1053-1060,2008；Mita等人，Clin Cancer Res.,14：5000-5005,2008)。

SEQ ID NO：22

「生存素抑制劑(survivin inhibitor)」係指抑制(inhibit)、拮抗、減少、或壓制(suppress)生存素活性之分子；如，對細胞中生存素的抗細胞凋亡活性進行抑制的分子。生存素抑制劑可抑制生存素約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、或100%之抗細胞凋亡活性。生存素抑制劑可係小分子、胜肽、疫苗、多核苷酸、DNA、或RNA分子。

本發明係至少部分基於以下發現：存在於BM微環境中的骨髓基質細胞(BMSC)至少部分藉由調升生存素而保護MM細胞防止抗體誘導ADCC，以及生存素抑制劑改善MM細胞之抗體媒介ADCC並終止由BMSC誘導之ADCC抗性。BMSC已顯示可經由細胞附著媒介免疫抗性保護MM細胞免於細胞毒性T淋巴球(CTL)依賴性裂解，且生存素已發現會在裂解抗性MM細胞中經過調升(de Haart等人，Clin Cance Res 19：5591-5601,2013)。

本發明提供一種治療患有CD38陽性血液惡性腫瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療CD38陽性血液惡性腫瘤的時間。

本發明亦提供一種抑制對象中多發性骨髓瘤細胞生長或增生之方法，其包含將抗CD38抗體及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以抑制多發性骨髓瘤細胞生長或增生的時間。

「CD38陽性血液惡性腫瘤(CD38-positive hematological malignancy)」係指一種血液惡性腫瘤，其特徵為存在表現CD38的腫瘤細胞，其包括白血病、淋巴瘤、及骨髓瘤。例示性 的此類CD38陽性血液惡性腫瘤係前體B細胞淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤與B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、急性前骨髓細胞性白血病、急性淋巴母細胞性白血病與成熟B細胞腫瘤，諸如B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)/小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、B細胞急性淋巴球性白血病、B細胞前淋巴球性白血病、淋巴球漿細胞性淋巴瘤、被套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)(包括低級別、中級別、及高級別FL)、皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤(MALT型、結型、及脾型)、髮樣細胞白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、伯奇氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma,BL)、漿細胞瘤、多發性骨髓瘤(MM)、漿細胞白血病、移植後淋巴增生性病症、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、漿細胞白血病、及退行性大細胞淋巴瘤(ALCL)。

CD38係表現於各種惡性血液疾病，其包括多發性骨髓瘤、白血病、及淋巴瘤，諸如B細胞慢性淋巴球性白血病、T細胞與B細胞急性淋巴球性白血病、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、原發性全身性類澱粉沉積症、被套細胞淋巴瘤、前淋巴球性/骨髓細胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、濾泡性淋巴瘤、伯奇氏淋巴瘤、大顆粒淋巴球性(LGL)白血病、NK細胞白血病、及漿細胞白血病。CD38之表現已描述於不同來源的上皮/內皮細胞，其包括前列腺中的腺體上皮、胰臟中的胰島細胞、腺體的導管上皮(包括腮腺、支氣管上皮細胞、睾丸與卵巢中的細胞、及結腸直腸腺癌中的腫瘤上皮)。其他可涉及CD38表現的疾病包括：如，肺部的支氣管上皮癌、 乳癌(自乳房之導管與小葉中上皮內襯的惡性增生演變而來)、自β細胞演變而來之胰臟瘤(胰島瘤)、自腸道上皮演變而來之腫瘤(如腺癌與鱗狀細胞癌)、前列腺癌、及睾丸和卵巢癌中的生殖細胞瘤。在中樞神經系統中，神經母細胞瘤表現CD38。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係多發性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、伯奇氏淋巴瘤(BL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、急性骨髓性白血病(AML)、或慢性淋巴球性白血病(CLL)。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係MM。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係ALL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係NHL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係DLBCL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係BL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係FL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係MCL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係AML。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係CLL。

在一些實施例中，CD38陽性血液惡性腫瘤係漿細胞疾病。

在一些實施例中，漿細胞疾病係輕鏈類澱粉沉積症(AL)、多發性骨髓瘤(MM)、或瓦登斯特隆巨球蛋白血症。

在一些實施例中，漿細胞疾病係AL。

在一些實施例中，漿細胞疾病係MM。

在一些實施例中，漿細胞疾病係瓦登斯特隆巨球蛋白血症。

B細胞非霍奇金氏淋巴瘤之實例係淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性滲出性淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、縱膈大B細胞淋巴瘤、重鏈疾病(包括γ、μ、及α疾病)、經由具免疫抑制劑之治療誘導的淋巴瘤(諸如經環孢靈素(cyclosporine)誘導之淋巴瘤及經胺甲喋呤(methotrexate)誘導之淋巴瘤)。

在一實施例中，涉及表現CD38之細胞的病症係霍奇金氏淋巴瘤。

其他涉及表現CD38之細胞的病症實例包括衍生自T細胞與NK細胞的惡性腫瘤，該等惡性腫瘤包括成熟T細胞與NK細胞腫瘤，該等腫瘤包括T細胞前淋巴球性白血病、T細胞大顆粒淋巴球性白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T細胞白血病/淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤(鼻型)、78腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾性T細胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤、胚母NK細胞淋巴瘤、蕈狀肉芽腫/Sezary症候群、原發性皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生性病症(原發性皮膚退行性大細胞淋巴瘤(C-ALCL)、淋巴瘤樣丘疹病、臨界病 變)、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤非特指型、及退行性大細胞淋巴瘤。

衍生自骨髓細胞的惡性腫瘤之實例包括急性骨髓性白血病(包括急性前骨髓細胞性白血病)、及慢性骨髓增生性疾病(包括慢性骨髓性白血病)。

任何抗CD38抗體均可用於本發明方法中。抗CD38抗體之可變區可自現有的抗CD38抗體獲得且使用標準方法經可選地克隆成為全長抗體。可使用的例示性抗體可變區結合CD38已描述於例如國際專利公開號WO05/103083、WO06/125640、WO07/042309、WO08/047242、WO12/092612、WO06/099875、及WO11/154453A1中。

可使用的例示性抗CD38抗體係DARZALEX^TM(達拉單抗)。DARZALEX^TM(達拉單抗)包含分別如SEQ ID NO：4與5所示之重鏈可變區(VH)與輕鏈可變區(VL)胺基酸序列、分別如SEQ ID NO：6、7、及8所示之重鏈互補決定區(HCDR)1、HCDR2、及HCDR3胺基酸序列、及分別如SEQ ID NO：9、10、及11所示之輕鏈互補決定區(LCDR)1、LCDR2、及LCDR3胺基酸序列，且屬於IgG1/κ亞型。DARZALEX^TM(達拉單抗)的重鏈胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：12，且輕鏈胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO：13。

SEQ ID NO：1

SEQ ID NO：2 SKRNIQFSCKNIYR

SEQ ID NO：3 EKVQTLEAWVIHGG

SEQ ID NO：4

SEQ ID NO：5

SEQ ID NO：6 SFAMS

SEQ ID NO：7 AISGSGGGTYYADSVKG

SEQ ID NO：8 DKILWFGEPVFDY

SEQ ID NO：9 RASQSVSSYLA

SEQ ID NO：10 DASNRAT

SEQ ID NO：11 QQRSNWPPTF

SEQ ID NO：12

SEQ ID NO：13

另一種可使用的例示性抗CD38抗體係mAb003，其包含分別係SEQ ID NO：14及15的VH及VL序列，並已描述於美國專利第7,829,693號中。

SEQ ID NO：14

SEQ ID NO：15

另一種可使用的例示性抗CD38抗體係mAb024，其包含分別係SEQ ID NO：16及17的VH及VL序列，並已描述於美國專利第7,829,693號中。

SEQ ID NO：16

SEQ ID NO：17

另一種可使用的例示性抗CD38抗體係MOR-202(MOR-03087)，其包含分別係SEQ ID NO：18及19的VH及VL序列，並已描述於美國專利第8,088,896號中。

SEQ ID NO：18

SEQ ID NO：19

另一種可使用的例示性抗CD38抗體係伊沙妥昔單抗(isatuximab)，其包含分別係SEQ ID NO：20及21的VH及VL序列，並已描述於美國專利第8,153,765號中。伊沙妥昔單抗的VH及VL可以IgG1/κ表示。

SEQ ID NO：20

SEQ ID NO：21

在本發明方法中使用的抗CD38抗體亦可重新(de novo)選自例如噬菌體呈現庫，其中該噬菌體係經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分，諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區(Knappik等人，J Mol Biol 296：57-86,2000；Krebs等人，J Immunol Meth 254：67-84,2001；Vaughan等人，Nature Biotechnology 14：309-314,1996；Sheets等人，PITAS(USA)95：6157-6162,1998；Hoogenboom and Winter,J Mol Biol 227：381,1991；Marks等人，J Mol Biol 222：581,1991)。CD38結合可變域可例如自噬菌體呈現庫(表現抗體重鏈及輕鏈可變區)單離為具有噬菌體pIX外殼蛋白的融合蛋白，如Shi等人，(2010)J.Mol.Biol.397：385-96及國際專利公開號WO09/085462中所述。抗體庫可經過篩選以結合至人類CD38細胞外域，而且所得之陽性殖株可經進一步表徵，Fab從殖株裂解物(lysate)單離出來，其後經克隆為全長抗體。此種用於單離人類抗體之噬菌體呈現法已於本領域中建立。參見例如：美國專利第5,223,409 號；美國專利第5,403,484號；及美國專利第5,571,698號、美國專利第5,427,908號、美國專利第5,580,717號、美國專利第5,969,108號、美國專利第6,172,197號、美國專利第5,885,793號；美國專利第6,521,404號；美國專利第6,544,731號；美國專利第6,555,313號；美國專利第6,582,915號及美國專利第6,593,081號。

本發明亦提供一種治療患有CD38陽性血液惡性腫瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體(該抗CD38抗體與包含SEQ ID NO：4之VL及SEQ ID NO：5之VL的抗體競爭結合CD38)及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療CD38陽性血液惡性腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有多發性骨髓瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體(該抗CD38抗體與包含SEQ ID NO：4之VH及SEQ ID NO：5之VL的抗體競爭結合CD38)及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療多發性骨髓瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有CD38陽性血液惡性腫瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體(該抗CD38抗體結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區)及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療CD38陽性血液惡性腫瘤的時間。

本發明亦提供一種治療患有多發性骨髓瘤的對象之方法，其包含將抗CD38抗體(該抗CD38抗體結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)之SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及 EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區)及生存素抑制劑投予至該所需對象達一段足以治療多發性骨髓瘤的時間。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、及8之HCDR1、HCDR2、及HCDR2。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含分別係SEQ ID NO：9、10、及11之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含分別係SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及LCDR3。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含含與SEQ ID NO：4具有95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的VL及含與SEQ ID NO：5具有95%、96%、97%、98%、99%、或100%同一性之胺基酸序列的VL。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含SEQ ID NO：4的VH及SEQ ID NO：5的VL。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含SEQ ID NO：14的VH及SEQ ID NO：15的VL。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含SEQ ID NO：16的VH及SEQ ID NO：17的VL。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含SEQ ID NO：18的VH及SEQ ID NO：19的VL。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含SEQ ID NO：20的VH及SEQ ID NO：21的VL。

可使用習知的體外方法來評估抗體與參考抗體(例如具有VH係SEQ ID NO：4及VL係SEQ ID NO：5的DARZALEX^TM(達拉單抗))對CD38的競爭結合。在一例示性方法中，可將重組表現CD38的CHO細胞與未標記的參考抗體於4℃下培養15分鐘，然後與過量的螢光標記測試抗體於4℃下培育45分鐘。於PBS/BSA中清洗後，可藉由流動式細胞測量術(flow cytometry)使用標準方法來測量螢光。在另一例示性方法中，人類CD38的細胞外部分係經包覆在ELISA盤的表面上。可將過量的未標記參考抗體加入約15分鐘，且隨後可加入生物素化測試抗體。在PBS/Tween中清洗後，可使用共軛辣根過氧化酶(horseradish peroxidase(HRP))的鏈親和素(streptavidin)來檢測該測試生物素化抗體的結合並使用標準方法來檢測信號。在該等競爭性試驗(competition assay)中，顯而易見的是參考抗體可經標記，且測試抗體可未經標記。當參考抗體抑制測試抗體的結合，或者測試抗體抑制參考抗體的結合達至少80%、85%、90%、95%或100%時，該測試抗體會與參考抗體競爭。該測試抗體的表位可進一步藉由例如胜肽圖譜技術(peptide mapping)或氫/氘保護試驗使用已知方法來定義，或者藉由晶體結構測定來定義。

當抗CD38抗體結合SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3中的至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12、13、或14個殘基時，該抗體會結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR (SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。在一些實施例中，抗CD38抗體結合人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少一個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少一個胺基酸。在一些實施例中，抗CD38抗體結合人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少兩個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少兩個胺基酸。在一些實施例中，抗CD38抗體結合人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區中至少三個胺基酸及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區中至少三個胺基酸。

一種結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區的例示性抗體係DARZALEX^TM(達拉單抗)。

結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區的抗體可例如藉由以下方式產生：使用標準方法且如本文中所述以具有SEQ ID NO：2及3所示之胺基酸序列的胜肽免疫小鼠，且使用例如ELISA或突變誘發研究以表徵用於結合至胜肽的所得抗體。

抗體的Fc部份可媒介抗體的效應功能(effector function)，諸如抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、或補體依賴性細胞毒性(CDC)，如下文所詳述 者。此類功能可藉由Fc效應域(effector domain)與具有吞噬或裂解活性的免疫細胞上Fc受體的結合來媒介，或藉由Fc效應域與補體系統成分的結合來媒介。一般而言，由與Fc結合的細胞或補體成分所媒介的效應會導致目標細胞(如CD38表現細胞)的抑制或損耗(depletion)。人類IgG同型IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4在效應功能上顯示出差別能力。ADCC可由IgG1及IgG3媒介，ADCP可由IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4媒介，及CDC可由IgG1及IgG3媒介。

在一些實施例中，抗CD38抗體係屬於IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4同型。

在一些實施例中，抗CD38抗體係屬於IgG1同型。

在一些實施例中，抗CD38抗體係屬於IgG2同型。

在一些實施例中，抗CD38抗體係屬於IgG3同型。

在一些實施例中，抗CD38抗體係屬於IgG4同型。

在一些實施例中，抗CD38抗體藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、或細胞凋亡誘導CD38表現細胞的殺滅。

在一些實施例中，抗CD38抗體藉由ADCC誘導CD38表現細胞的殺滅。

在一些實施例中，抗CD38抗體藉由ADCP誘導CD38表現細胞的殺滅。

在一些實施例中，抗CD38抗體藉由CDC誘導CD38表現細胞的殺滅。

在一些實施例中，抗CD38抗體藉由細胞凋亡誘導CD38表現細胞的殺滅。

「抗體依賴性細胞毒性」、「抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性」、或「ADCC」是一種誘導細胞死亡的機制，其取決於抗體包覆的目標細胞與具有裂解活性的效應細胞(諸如自然殺手細胞、單核球、巨噬細胞、及嗜中性球)之間經由效應細胞上表現的Fcγ受體(FcγR)的相互作用。例如，NK細胞表現FcγRIIIa，而單核球表現FcγRI、FcγRII、及FcγRIIIa。抗體包覆的目標細胞(諸如CD38表現MM細胞)的死亡會發生是由於效應細胞分泌膜孔形成蛋白(membrane pore-forming protein)及蛋白酶的活性。為了評估抗CD38抗體的ADCC活性，可將該抗體加入至CD38表現細胞與免疫效應細胞的組合，該免疫效應細胞可被抗原抗體複合物活化而導致目標細胞的細胞裂解。細胞裂解可透過從裂解細胞中釋放的標記(如放射性基質、螢光染料、或天然的細胞內蛋白)來檢測。用於該等試驗之例示性效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。表現CD38的多發性骨髓瘤細胞系或初代MM細胞可用於做為目標細胞。在一例示性試驗中，將經工程改造以表現螢光素酶的MM細胞系與抗CD38抗體培育。以40：1之目標：效應細胞比，加入新鮮單離的PBMC效應細胞。在加入PBMC後4小時，加入螢光素酶，在20分鐘內使用光度計(SpectraMax,Molecular Devices)測定所得自存活MM細胞發射的 生物發光信號，且可使用下式計算MM細胞的ADCC百分比：ADCC(%)=1-(PBMC不存在下的平均生物發光信號/PBMC存在下的平均生物發光信號)×100%。抗CD38抗體「在體外誘導ADCC」，其中在諸如上述一者之體外試驗中的ADCC(%)係至少約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、或100%。

「補體依賴性細胞毒性(complement-dependent cytotoxicity)」或「CDC」係指一種誘導細胞死亡的機制，其中與目標結合的抗體的Fc效應域結合並活化補體成分C1q，其轉而再活化補體級聯反應而導致目標細胞死亡。補體的活化亦可導致補體成分沉積在該目標細胞表面上，藉由結合白血球上的補體受體(如CR3)而促進ADCC。在一例示性試驗中，可使用衍生自10%混合人類血清的抗CD38抗體與補體以0.3-10μg/ml之濃度將自患有B細胞惡性腫瘤的病患單離之初代BM-MNC細胞加以處理1小時，且可藉由流動式細胞測量術測定初代CD138⁺ MM細胞的存活情形，其使用以下文獻中所述之技術：van der Veer等人，Haematologica 96：284-290,2011；van der Veer等人，Blood Cancer J 1(10)：e41,2011。如本文中所述，可在相對於同型對照之下，測定MM細胞裂解之百分比。在本發明之方法中使用的抗CD38抗體可誘導CDC達約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%。

「抗體依賴性細胞吞噬作用」(「ADCP」)係指一種透過吞噬細胞(諸如巨噬細胞或樹突細胞)內化(internalization)以消滅抗體包覆的目標細胞的機制。ADCP可藉由使用衍生自單核球的巨噬細胞作為效應細胞以及使用道迪(Daudi)細胞(ATCC^® CCL-213^TM)或表現CD38的B細胞白血病或淋巴瘤腫瘤細胞作為目標細胞來評估，該等目標細胞係經工程改造以表現GFP或其他標記分子。效應：目標細胞比可係例如4：1。可將效應細胞與目標細胞在存在或不存在抗CD38抗體的情況下一起培養4小時。培育後，使用細胞剝離液(accutase)將細胞分離。巨噬細胞可用偶接螢光標記的抗CD11b及抗CD14抗體來鑑定，且吞噬作用百分比可根據在該等CD11⁺CD14⁺巨噬細胞中的GFP螢光百分比使用標準方法測定。在本發明之方法中使用的抗CD38抗體可誘導ADCP達約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%。

由抗CD38抗體誘發之ADCC可藉由抗體Fc中之某些取代而增強。例示性取代係例如在胺基酸位置256,290,298,312,356,330,333,334,360,378或430處之取代(殘基編號依據EU索引)，如美國專利第6,737,056號中所述。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含抗體Fc中的胺基酸取代。

在一些實施例中，抗CD38抗體包含抗體Fc中在胺基酸位置256,290,298,312,356,330,333,334,360,378或430的取代(殘基編號依據EU索引)。

由抗CD38抗體誘發之ADCC亦可藉由讓抗體寡醣成分進行工程改造而增強。人類IgG1或IgG3係在Asn297處經N-醣基化並且大部分聚醣係呈雙觸角(biantennary)G0、G0F、G1、G1F、G2、或G2F的形式。由未經工程改造之CHO細胞所生產之抗體典型具有約至少85%之聚醣海藻糖(glycan fucose)含量。自附接至Fc區之雙觸角複合型寡醣移除核心海藻糖經由改善FcγRIIIa結合且不改變抗原結合或CDC活性來增強抗體之ADCC。此類經修飾的抗體可使用已報導會導致成功表現相對高量去海藻糖基化(defucosylated)抗體(帶有雙觸角複合型之Fc寡醣)的不同方法來達成，諸如控制培養滲透壓(Konno等人，Cytotechnology 64(：249-65,2012)、應用變異體CHO株Lec13作為宿主細胞系(Shields等人，J Biol Chem 277：26733-26740,2002)、應用變異體CHO株EB66作為宿主細胞系(Olivier等人，MAbs；2(4),2010；紙本發行前之電子發行版本；PMID：20562582)、應用大鼠融合瘤細胞系YB2/0作為宿主細胞系(Shinkawa等人，J Biol Chem 278：3466-3473,2003)、引入專門針對α1,6-岩藻糖基轉移酶(1,6-fucosyltrasferase,FUT8)基因之短小干擾RNA(Mori等人，Biotechnol Bioeng88：901-908,2004)、或共表現β-1,4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III)及高基氏α-甘露糖苷酶II(Golgi α-mannosidase II)或基夫鹼 (kifunensine)(一種強效α-甘露糖苷酶I抑制劑)(Ferrara等人，J Biol Chem281：5032-5036,2006,Ferrara等人，Biotechnol Bioeng 93：851-861,2006；Xhou等人，Biotechnol Bioeng 99：652-65,2008)。

在一些實施例中，抗CD38抗體具有雙觸角聚醣結構，其海藻糖含量介於約0%至約15%之間，例如15%、14%、13%、12%、11%10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。

在一些實施例中，抗CD38抗體具有雙觸角聚醣結構，其海藻糖含量係約50%、40%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%、11%10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或0%。

Fc中的取代及減少的海藻糖含量可增強該抗CD38抗體的ADCC活性。

「海藻糖含量(Fucose content)」意指Asn297處糖鏈中海藻糖單醣的量。海藻糖的相對量係含海藻糖的結構相對於所有醣類結構的百分比。這些可藉由多種方法來定性及定量，例如：1)使用經N-醣苷酶F(N-glycosidase F)處理過的樣本(如複合、雜合及寡與高甘露糖(oligo-and high-mannose)結構)的MALDI-TOF，如在國際專利公開號WO2008/0775462中所述；2)酶促釋放Asn297聚醣，隨後衍生化並藉由HPLC(UPLC)以螢光檢測及/或HPLC-MS(UPLC-MS)來檢測/定量；3)天然或還原mAb的完整蛋白質分析，將Asn297聚醣以Endo S或其他會在第一與第二GlcNAc單醣之間切割而留下連接至 第一GlcNAc的海藻糖的酵素處理或不經處理；4)藉由酵素分解法(enzymatic digestion)(如胰蛋白酶或內肽酶Lys-C)將抗體分解成構成分(constituent)胜肽，隨後藉由HPLC-MS(UPLC-MS)分離、檢測、及定量；5)藉由以肽-N-糖苷酶F(PNGase F)在Asn 297處進行特異性酵素去醣基化(specific enzymatic deglycosylation)以將抗體寡醣自抗體蛋白質分離。如此釋放出的寡醣可用螢光團標記，藉由各種互補的技術分離和鑑定，該等技術允許：藉由基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜術比較實驗質量與理論質量以精細定性聚醣結構、藉由離子交換HPLC(GlycoSep C)測定唾液酸化(sialylation)程度、藉由正相HPLC(GlycoSep N)根據親水性標準(hydrophilicity criteria)分離及定量寡醣形式、及藉由高效毛細管電泳-雷射誘導螢光(HPCE-LIF)分離及定量寡醣。

本申請案中使用之「低海藻糖(Low fucose)」或「低海藻糖含量(low fucose content)」係指抗體的海藻糖含量係約0%至約15%。

本文中所用之「正常海藻糖(Normal fucose)」或「正常海藻糖含量(normal fucose content)」係指抗體的海藻糖含量約超過50%，一般而言約超過80%或超過85%。

與包含SEQ ID NO：12之重鏈及SEQ ID NO：13之輕鏈的抗體實質上同一的抗體可在本發明之方法中使用。本文中所用之「實質上同一(Substantially identical)」意指所比較的兩個抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列係同一或具有「無實質差異(insubstantial differences)」。無實質差異係在抗體重鏈或輕鏈中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12、13、14、或15個不會對抗體性能造成不利影響的胺基酸取代。同一性百分比可例如藉由使用Vector NTI v.9.0.0(Invitrogen,Carlsbad,CA)之AlignX模組的預設設定進行成對比對來測定。本發明的蛋白質序列可被用作查詢序列(query sequence)來執行針對公開或專利資料庫的檢索以(例如)鑑定相關序列。用來執行該等檢索之例示性程式係XBLAST或BLASTP程式(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)，或使用預設設定的GenomeQuest^TM(GenomeQuest,Westborough,MA)套件。可在本發明方法中使用之抗CD38抗體上進行的例示性取代係例如以具有相似電荷、疏水性、或立體化學特徵的胺基酸進行的保守型取代(conservative substitution)。亦可進行保守型取代以改良抗體性質(例如穩定性或親和力)，或改良抗體的效應功能。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11，例如可在抗CD38抗體的重鏈或輕鏈中進行12、13、14、或15個胺基酸取代。此外，該重鏈或輕鏈中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennan等人，Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67,1998；Sasaki等人，Adv Biophys 35：1-24,1998)。所欲之胺基酸取代可在此等取代係所欲時由所屬領域中具有通常知識者決定。胺基酸取代可例如藉由PCR突變誘發(美國專利第4,683,195號)來進行。變異體庫可使用習知方法來產生，例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK密碼子)，其編碼11種胺基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、 Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)，然後篩選變異體庫以找出具有所欲性質之變異體。所產生的變異體可使用本文所述之方法測試彼等與CD38的結合及彼等誘導ADCC的能力。

「保守性修飾(conservative modification)」係指對含有胺基酸序列之抗體不會顯著影響或改變其結合特徵的胺基酸修飾。保守性修飾包括胺基酸取代、加成及刪除。保守型取代係其中胺基酸經具有相似側鏈之胺基酸殘基取代的取代。具有相似側鏈之胺基酸殘基的家族已有明確界定，且包括具有以下者之胺基酸：酸性側鏈(如天冬胺酸、麩胺酸)、鹼性側鏈(如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、非極性側鏈(如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、不帶電極性側鏈(如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、色胺酸)、芳族側鏈(如苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸、酪胺酸)、脂族側鏈(如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸)、醯胺(如天冬醯胺酸、麩醯胺酸)、β分支側鏈(如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、及含硫側鏈(半胱胺酸、甲硫胺酸)。此外，多肽中的任何天然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前已針對丙胺酸掃描式突變誘發(alanine scanning mutagenesis)所描述者(MacLennan等人，(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643：55-67；Sasaki等人，(1988)Adv Biophys 35：1-24)。本發明對於抗體的胺基酸取代可藉由例如PCR突變誘發的已知方法進行(美國專利第4,683,195號)。替代地，可產生變異體庫，例如使用隨機(NNK)或非隨機密碼子(例如DVK密碼子)，其編碼11種胺基酸 (Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)。所得抗體變異體可使用本文中所述之試驗來測試其特性。

在一些實施例中，抗CD38抗體可以一範圍之親和力(K_D)結合人類CD38。在一實施例中，抗CD38抗體結合至CD38的K_D等於或小於約1×10^-8M，例如5×10^-9M、1×10^-9M、5×10^-10M、1×10^-10M、5×10^-11M、1×10^-11M、5×10^-12M、1×10^-12M、5×10^-13M、1×10^-13M、5×10^-14M、1×10^-14M、或5×10^-15M、或其中的任何範圍或值，如由所屬領域中具有通常知識者所實施的表面電漿共振或Kinexa法所測定。一例示性親和力係等於或小於1×10^-8M。另一例示性親和力係等於或小於1×10^-9M。

KinExA儀器設備、ELISA或所屬技術領域中具有通常知識者已知的競爭結合試驗。特定抗體/CD38交互作用所測量而得的親和力可能會因在不同條件(如，滲透性、pH值)下測量而發生改變。因此，親和力和其他結合參數(如K_D、K_on、K_off)之測量一般而言是以標準化條件及標準化緩衝液進行，諸如本文中所述之緩衝液。所屬領域中具有通常知識者會理解到，在典型檢測極限內，親和力測量(例如使用Biacore 3000或ProteOn進行)的內部誤差(測量為標準差，SD)一般可在測量結果的5至33%內。因此，在K_D的內容脈絡中，用語「約」反映了試驗中的一般標準差。例如，1×10^-9M之K_D的一般SD係多至±0.33×10^-9M。

在一些實施例中，抗CD38抗體係雙特異性抗體。現有的抗CD38抗體的VL及/或VH區或如本文所述重新鑑定之VL及VH 區可被工程改造進雙特異性全長抗體。該等雙特異性抗體可藉由調節抗體Fc中的CH3相互作用來製造以形成雙特異性抗體，其係使用例如那些在以下文獻中所述之技術：美國專利第7,695,936號；國際專利公開號WO04/111233；美國專利公開號US2010/0015133；美國專利公開號US2007/0287170；國際專利公開號WO2008/119353；美國專利公開號US2009/0182127；美國專利公開號US2010/0286374；美國專利公開號US2011/0123532；國際專利公開號WO2011/131746；國際專利公開號WO2011/143545；或美國專利公開號US2012/0149876。

例如，本發明之雙特異性抗體可在無細胞環境中體外產生，此係藉由在兩個單特異性同二聚體抗體之CH3區中引入非對稱突變，且在還原條件中(以讓雙硫鍵異構化)以兩個親體單特異性同二聚體抗體形成該雙特異性異二聚體抗體，其係根據描述於國際專利Publ.No.WO2011/131746之方法。在該等方法中，第一單特異性二價抗體(如，抗CD38抗體)及第二單特異性雙價抗體係經工程改造以在CH3域具有某些促進異二聚體穩定性之取代；該等抗體係在足以讓絞鏈區中之半胱胺酸進行雙硫鍵異構化的還原條件下一起培育；從而藉由Fab臂交換來產生該雙特異性抗體。培育條件可最佳地被回復為非還原性(non-reducing)。可使用之例示性還原劑係2-巰基乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、二硫赤蘚醇(dithioerythritol,DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸及β-巰基乙醇，還原劑較佳係選自由下列所組成之群組：2-巰基 乙胺、二硫蘇糖醇及參(2-羧乙基)膦。例如，可使用在至少20℃之溫度且有至少25mM之2-MEA存在下或於至少0.5mM之二硫蘇糖醇存在且在5至8之pH下(例如在7.0之pH下或在7.4之pH下)培育至少90min。

可在該雙特異性抗體之第一重鏈中及在第二重鏈中使用的例示性CH3突變係K409R及/或F405L。

可合併本發明之抗體之VL及/或VH區的其他雙特異性結構係例如雙可變域免疫球蛋白(Dual Variable Domain Immunoglobulin,DVD)(國際專利公開號WO2009/134776)、或包括各種二聚化域以連接具有不同特異性之兩個抗體臂的結構，諸如白胺酸拉鍊(leucine zipper)或膠原蛋白二聚化域(國際專利公開號WO2012/022811、美國專利第5,932,448號；美國專利第6,833,441號)。DVD為全長抗體，其包含具有結構VH1-連接子-VH2-CH之重鏈及具有結構VL1-連接子-VL2-CL之輕鏈；連接子係可選用的。

在一些實施例中，抗CD38抗體係與毒素共軛。共軛方法及合適的毒素為習知。

在一些實施例中，患有MM的對象在CD16的位置158係苯丙胺酸同型合子(homozygous)(FcγRIIIa-158F/F基因型)或在CD16的位置158係纈胺酸與苯丙胺酸異型合子(heterozygous)(FcγRIIIa-158F/V基因型)。CD16也被稱為Fcγ受體IIIa(FcγRIIIa)或低親和力免疫球蛋白γFc區受體III-A異型體。在FcγRIIIa蛋白殘基位置158的纈胺酸/苯丙胺酸(V/F)多形性已被顯示出會影響 FcγRIIIa對人類IgG的親和力。具FcγRIIIa-158F/F或FcγRIIIa-158F/V多形性的受體當與FcγRIIIa-158V/V相比時顯示出減少的Fc接合並因此有減少的ADCC。人類N-連結寡醣上海藻糖的低量或缺乏會增強抗體誘導ADCC的能力，其係由於抗體與人類FcγRIIIa(CD16)結合的提昇(Shields等人，J Biol Chem 277：26733-40,2002)。可使用常規方法來分析病患的FcγRIIIa多形性。

在一些實施例中，生存素抑制劑係小分子。

在一些實施例中，生存素抑制劑係多核苷酸。

生存素抑制劑可藉由任何機制抑制生存素誘導的細胞凋亡，諸如抑制生存素基因轉錄或蛋白表現、抑制生存素蛋白二聚化、增強去穩定化、或誘導生存素降解等。

一種例示性生存素小分子抑制劑係YM155。YM155結合至生存素促進劑並抑制其轉錄。其他例示性生存素小分子抑制劑係例如美國專利第6,608,108號所述的正二氫癒創酸(nordihydroguaiaretic acid)衍生物、及美國專利公開號US2012/0122910所述的分子。其他生存素多核苷酸抑制劑已描述於例如美國專利第6,838,283號、國際專利公開號WO01/057059、WO09/114476、及WO09/044793。多核苷酸抑制劑包括微RNA(miRNA)、小干擾RNA(siRNA)、等位基因特異性寡核甘酸(ASO)、及其他所屬技術領域中已知的多核苷酸抑制劑。

投予/醫藥組成物

在本發明的方法中，抗CD38抗體可以合適的醫藥組成物提供，該組成物包含抗CD38抗體及醫藥上可接受之載劑。該載劑可為與該抗CD38抗體一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此等媒劑可為液體，諸如水及油，包括來自石油、動物、蔬菜、或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、及類似者。例如，可使用0.4%鹽水及0.3%甘胺酸。這些溶液係無菌且通常不含顆粒物質。彼等可藉由習用、習知的滅菌技術(如過濾)來滅菌。該等組成物可含有如用以接近生理條件所需之醫藥上可接受的輔助物質，諸如pH調整及緩衝劑、穩定、增稠、潤滑、及著色劑等。在此類醫藥配方中本發明分子或抗體之濃度可有廣泛變化，即從以重量計小於約0.5%，通常達以重量計至少約1%至多達以重量計15或20%，並且將主要根據所需劑量、流體體積、黏度等，依據所選擇之特定投予模式來選擇。合適的媒劑及調配物(包括其他的人類蛋白質，如人類血清白蛋白)，例如係經描述於如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,21^st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092中，請特別參見pp.958-989。

本發明方法中的抗CD38抗體之投予模式可為任何合適之途徑，諸如非經腸道(parenteral)投予，如皮內、肌肉內、腹膜內(intraperitoneal)、靜脈內或皮下、肺臟、經黏膜(口腔、鼻腔、陰道內、直腸)、或技藝人士所理解以及在所屬技術領域中習知之其他手段。

本發明方法中的抗CD38抗體可經由任何合適的途徑來投予至病患，例如非經腸道(藉由靜脈(IV)輸液或高劑量注射(bolus injection))、肌肉內或皮下或腹膜內。可給予IV輸液超過例如15,30,60,90,120,180,or 240分鐘，或是從1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11或12小時起。

給予患有CD38陽性血液惡性腫瘤的病患之劑量係足以減輕或至少部分遏止所要治療之疾病(「治療有效量」)並且有時可為0.005mg至約100mg/kg，如約0.05mg至約30mg/kg或約5mg至約25mg/kg、或約4mg/kg、約8mg/kg、約16mg/kg、或約24mg/kg，或者例如約1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,9或10mg/kg，但可甚至更高，例如約15、16、17、18、19、20、21,22,23,24,25,30,40,50,60,70,80,90、或100mg/kg。

亦可給予固定單位劑量，如50、100、200、500、或1000mg，或者劑量可基於病患之表面積，如500、400、300、250、200、或100mg/m²。通常可投予介於1與8次之間的劑量(如1,2,3,4,5,6,7 or 8)以治療MM，但是可給予9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20或更多次的劑量。

本發明方法中之抗CD38抗體，其投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、一個月、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。例如，本發明方法中之抗CD38抗體可 在8mg/kg或在16mg/kg下以每週間隔投予持續8週，接著在8mg/kg或在16mg/kg下每兩週投予持續另外16週，接著在8mg/kg或在16mg/kg下每四週投予，其係藉由靜脈輸液。

抗CD38抗體可在本發明方法中藉由維持治療來投予，諸如(舉例而言)一週一次持續6個月或更長的期間。

例如，本發明方法中之抗CD38抗體可以約0.1-100mg/kg的量作為日劑量，諸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,40,45,50,60、70、80、90、或100mg/kg，每日提供、於開始治療後的第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,or 40天中之至少一天提供、或者替代地，於開始治療後的第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19、或20週中之至少一週提供、或彼等之任何組合，並使用每24、12、8、6、4、或2小時之單次或分次劑量、或彼等之任何組合。

本發明方法中之抗CD38抗體亦可預防性投予以減少發展癌症之風險、延緩癌症進展事件之開始發生、及/或當癌症處於緩解時減少復發之風險。這可能在已知存在有腫瘤但因其他生物因素而很難定位腫瘤的病患中特別有用。

本發明方法中之抗CD38抗體可凍乾貯存，並在使用前於合適的載劑中重構。此技術已顯示對於習用蛋白質製劑為有效者並且可使用習知之凍乾及重構技術。

在本發明的方法中，抗CD38抗體係在與生存素抑制劑的組合下經投予。

在本發明的方法中，抗CD38抗體係在與生存素抑制劑YM155的組合下經投予。

根據如國際專利公開號WO01/60803及WO2004/092160中所揭示之生產過程，可輕易獲得在本發明方法中使用的YM155。

YM155可經口服或非經腸道、或靜脈投予。在此方面，用於靜脈投予的注射製劑包括該等含有無菌水或非水溶液、懸浮液、及乳液者。水溶劑包括例如注射用蒸餾水及生理食鹽水。非水溶劑包括例如丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)、醇(諸如乙醇)、聚山梨醇酯80、及其類似物。此類組成物可含有進一步張力調節劑、防腐劑、潤濕劑、乳化劑、分散劑、穩定劑、及助溶劑。這些可加以滅菌，例如藉由通過濾菌器過濾、混合滅菌器、或輻射。替代地，可製備無菌固體組成物，並在即將使用前溶解或懸浮該組成物於無菌水或注射用無菌溶劑中。

在靜脈投予中，YM155可例如以0.1-20mg/m²/天，諸如以1-10mg/m²/天，經一天一次或分成複數次劑量、或者持續藉由輸液投予(連續滴注)。YM155可以3-10mg/m²/天經持續輸注4天至 20天的期間，例如4天至14天、或5天、7天、10天、或14天，以及或者持續7天。當進一步持續投予時，可在上述用藥期終止後，採用用藥週期，其包含一段為期1天至2個月、7天至21天、或14天之藥物假期(drug holiday)。替代地，YM155可以3-8mg/m²/天之劑量藉由輸液持續投予7天，接著有14天的藥物假期；視條件而定，以此週期作為一個週期而重複進行。在考量抗癌劑種類、病患狀態、年齡、性別等之下，可以根據個別情況適當地判定投予頻率、劑量、輸液時間、用藥週期、及其類似者。

在本發明的方法中，可於任何合宜的時間範圍內投予抗CD38抗體與生存素抑制劑之組合。例如，可於同日向病患投予抗CD38抗體與生存素抑制劑。然而，亦可於交替的日、或交替的週或月、等等投予抗CD38抗體與生存素抑制劑。在一些方法中，可以足夠接近的時間投予抗CD38抗體與生存素抑制劑，使得彼等以可檢測水平同時存在(如在血清中)於經治療的病患中。在一些方法中，用抗CD38抗體的係由在一段時間內若干次劑量所組成，在其後或其前係用由若干次劑量所組成之生存素抑制劑的療程。在抗CD38抗體與生存素抑制劑之投予之間，可使用1、2、或數天或數週的恢復期。

抗CD38抗體在與生存素抑制劑之組合下，可與任何形式的放射治療(包括體外放射(external beam radiation)，強度調控放射治療(IMRT)、及任何形式的放射手術(包括加馬刀(Gamma Knife)、射波刀(Cyberknife)、直線加速器(Linac)、及間質放射(如植入的放射性種粒、GliaSite氣球)))、及/或與手術一起施用。

皮下投予醫藥組成物，其包含與CD38特異性結合的抗體及玻尿酸酶

抗CD38抗體可以醫藥組成物之形式經皮下投予，該組成物包含抗CD38抗體及玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物中抗CD38抗體之濃度可係約20mg/ml。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,200mg至1,800mg之間的抗CD38抗體。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,200mg的抗CD38抗體。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的抗CD38抗體。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,800mg的抗CD38抗體。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約30,000U至45,000U之間的玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,200mg的抗CD38抗體及約30,000U的玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,800mg的抗CD38抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的抗CD38抗體及約30,000U的玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物可包含約1,600mg的抗CD38抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

經皮下投予之醫藥組成物可包含玻尿酸酶rHuPH20，其具有SEQ ID NO：23之胺基酸序列。

rHuPH20係一種重組玻尿酸酶(HYLENEX®重組體)，並已描述於國際專利公開號WO2004/078140中。

玻尿酸酶係將玻尿酸降解的酵素(EC 3.2.1.35)，且減低細胞外基質中玻尿酸的黏度，藉此增加組織穿透性。

SEQ ID NO：23

包含抗CD38抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物的投予可在一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、兩週、三週、四週、五週、六週、七週、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、或更久之後重覆進行。重覆治療過程亦為可能者，如為慢性投予。重覆投予可在相同劑量或在不同劑量下。例如，包含抗CD38抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物的投予可每週一次持續八週，接著兩週一次持續16週，接著四週一次。要投予的醫藥組成物可包含約1,200mg的抗CD38抗體及約30,000U的玻尿酸酶，其中在醫藥組成物中與CD38特異性結合的抗體濃度係約20mg/ml。要投予的醫藥組成物可包含約1,800mg的抗CD38抗體及約45,000U的玻尿酸酶。要投予的醫藥組成物可包含約1,600mg的抗CD38抗體及約30,000U的玻尿酸酶。要投予的醫藥組成物可包含約1,600mg的抗CD38抗體及約45,000U的玻尿酸酶。

包含抗CD38抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物可經皮下投予至腹部區域。

包含抗CD38抗體及玻尿酸酶之醫藥組成物可以約80ml、90ml、100ml、110ml、或120ml之總量投予。

投予時，可將20mg/ml之抗CD38抗體(於25mM醋酸鈉、60mM氯化鈉、140mM D-甘露醇、0.04%聚山梨醇酯20，pH 5.5)與rHuPH20(1.0mg/mL(75-150kU/mL)，於10mM L-組胺酸、130mM NaCl、10mM L-甲硫胺酸、0.02%聚山梨醇酯80，pH 6.5)混合，然後將該混合物投予至對象。

雖然已用一般術語描述了本發明，本發明之實施例將進一步揭露於下列實例中，但其不應被解釋為限制權利要求的範圍。

材料和方法 細胞與細胞培養 骨髓單核細胞(BM-MNC)與周邊血液單核細胞(PBMC)

使用根據赫爾辛基宣言(declaration of Helsinki)而由(institutional medical ethical committee)同意之規程與程序，收集來自MM病患或健康個體的BM穿刺物，以及來自健康個體的PB。健康供體(Healthy Donor,HD)的PBMC與BM-MNC係藉由Ficoll-Hypaque密度梯度離心分別自PB樣本或BM穿刺物單離。PBMC係在ADCC實驗中直接用作效應細胞；BM-MNC經冷凍保存，直到使用為止。

多發性骨髓瘤(MM)細胞系

螢光素酶(Luc)轉導的人類MM細胞系RPMI-8226與UM9係維持於RPMI1640(Invitrogen)中，其係添加有10%胎牛血清(FBS；Integro BV)及抗生素(青黴素/鏈黴素；Life Technologies)，並在37℃下於含有5%CO₂之加濕氣氛中。

骨髓基質細胞(BMSC)

藉由塑膠黏附(plastic adherence)，自健康個體的BM-MNC(hBMSC)或MM病患的BM-MNC(pBMSC)單離並培養黏附基質 細胞。在具有5%血小板裂解物、肝素、及抗生素的Optimem(Invitrogen)中培養細胞。hBMSC於實驗中使用直到第六代為止，而pBMSC係在第一或二代後使用。

試劑

YM155(雪邦特洛尼姆溴化物(Sepantronium Bromide)；4,9-二氫-1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4,9-二側氧基-3-(2-吡嗪甲基)-1H-萘基[2,3-d]咪唑溴化物；CAS 781661-94-7)(Selleck Chemicals)係以1mM的濃度溶解在二甲亞碸(DMSO)中，且經過分裝以貯存直到使用為止。將YM155稀釋在培養基中，以達到每項實驗所指定的濃度。

對於多發性骨髓瘤細胞系之基於區間特異性生物發光之抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性(ADCC)(「基於區間特異性BLI之細胞毒性試驗」)

將hBMSC以1×10⁴細胞/孔之密度播種在白色不透明平底96孔盤(Costar)中，其在100μl的培養基中。經過六小時的黏附期 間後，將螢光素酶轉導的MM細胞系以1×10⁴細胞/孔之密度加入BMSC包覆或未包覆的孔中。在測試YM155的實驗中，將YM155以指定濃度與MM細胞一起加入。16至20小時後，以指定濃度加入達拉單抗，然後在室溫下放置15分鐘。然後，以指定效應目標比，加入自健康個體新鮮單離的PBMC作為效應細胞。在加入PBMC後4小時，加入125μg/ml甲蟲螢光素(Promega)，在20分鐘內使用光度計(SpectraMax,Molecular Devices)測定自存活MM細胞發射的生物發光信號。使用下式計算MM細胞的存活百分比：存活(%)=(PBMC不存在下的平均生物發光信號/PBMC存在下的平均生物發光信號)×100%。在這些試驗中，MM細胞的存活係直接反映出ADCC媒介的裂解且與典型鉻釋放試驗正相關，如McMillin等人，Nat Med 16：483-489,2010所述。

在多發性骨髓瘤BM-MNC中基於FACS之ADCC試驗

在基於FACS之ADCC試驗中，使用來自MM病患的冷凍BM-MNC，其具有15-35%之CD138⁺MM細胞。將細胞解凍並於10%HS在RPMI中培養。16-20h後，藉由台盼藍排斥法(trypan blue exclusion)將BM-MNC計數，並以4×10⁴細胞/孔播種在96圓底盤中。如每個實驗所指示，將達拉單抗及/或YM155加入孔中。24小時後，使用螢光共軛抗CD138、抗CD38、抗CD56、及抗CD38抗體將細胞染色，且如先前所述(Groen等人，Blood 120：e9-e16,2012)，藉由FACS測定BM-MNC中初代CD138⁺MM細胞的存活情形。使用 下式推導出MM細胞的裂解百分比：裂解細胞(%)=1-(經處理孔中之存活CD138⁺細胞的計數/對照孔中之存活CD138⁺細胞數的計數)x 100%。

流動式細胞測量術

為了測定MM細胞上CD38的表現水平，MM細胞係經單獨或與BMSC一同培養，然後與CD38螢光共軛抗體培育。以CD105作為BMSC的標記，另外將細胞染色。藉由FACS測定CD105陰性細胞上的CD38表現，如所述(de Haart等人，Clin Cancer Res 19：5591-601,2013)。

體內腫瘤標靶實驗

將由三個經HD-BMSC包覆之2至3mm兩相磷酸鈣顆粒所組成的複合支架，在體外裝載Luc⁺ MM細胞系UM9(1×10⁶細胞/支架)，然後皮下植入RAG2^-/-γc^-/-小鼠，如先前所述(Groen等人，B1ood 120：e9-e16,2012)。在植入後十天，具有在支架中生長之腫瘤的小鼠經媒劑對照、達拉單抗+PBS、或達拉單抗+YM155治療。每隻小鼠(包括對照組)另外接受T細胞淨除HD-PBMC(5×10⁶個細胞)作為人類NK細胞的來源以誘導ADCC。使用皮下輸液泵(Alzet 1007D)以1mg/kg/d持續輸送藥物，以投予PBS與經稀釋於PBS中的YM155。10天後將泵移除。進行BLI，如先前所述(Spaapen等人， Clin Cancer Res 16：5481-88,2010；Rozemuller等人，Haematologica 93：1049-57,2008)。

顆粒酶B酵素連結免疫吸附試驗法(ELISA)

根據製造商的指示，使用市售ELISA套組(Pelipair,Sanquin,Amsterdam,NL)以測定無細胞上清液中的顆粒酶B(GzB)含量。

實例1. 骨髓基質細胞賦予防止多發性骨髓瘤細胞發生抗體依賴性細胞毒性的保護作用

由於骨髓(BM)的基質細胞之微環境保護MM細胞防止發生CTL與NK媒介的細胞毒性，曾評估過是否會發生防止達拉單抗誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的類似保護作用。

在基於區間特異性BLI之細胞毒性試驗中，以系列濃度之達拉單抗在作為效應細胞的HD-PBMC存在或不存在下，測試藉由健康供體BMSC防止兩種CD38⁺螢光素酶轉導的MM細胞系(UM9與RPMI)發生ADCC誘導的情形。在BMSC不存在下，達拉單抗在兩者MM細胞系中以劑量依賴性方式媒介ADCC。在BMSC存在下，兩者細胞系對於達拉單抗誘導ADCC的敏感度較低。圖1A表示BMSC對於UM9細胞中達拉單抗誘導ADCC的效應，且圖1B表示BMSC對於RPMI-8226細胞中達拉單抗誘導ADCC的效應。

使用如上所述之方法，在基於FACS的ADCC試驗中，亦評估BMSC保護初代MM細胞免於達拉單抗誘導ADCC的能力。在試驗中，將含有至少15%之CD138⁺惡性漿細胞及足夠數量之自體效應NK細胞的BM-MNC與達拉單抗培育以誘導ADCC。BM-MNC在單獨或與自體BMSC共同培養下經過測試，以評估BMSC的效應。在經過培養24小時後，進行基於FACS的生存力試驗，以測定CD138⁺存活細胞並計算裂解情形。在經過測試的兩者供體中，在自體MM-BMSC存在下，初代MM細胞發生的ADCC誘導效果較低(圖2A及圖2B)，即表示腫瘤微環境的基質細胞誘導了對達拉單抗治療的抗性。

實例2. CD38調降或NK細胞壓制未造成BMSC誘導壓制ADCC的作用

評估CD38表面表現與NK細胞活化的可能變化，以了解BMSC媒介防止ADCC之保護作用的機制。

在健康供體BMSC存在或不存在下，培養MM細胞系UM9與RPMI-8226。MM細胞與BMSC的共同培養並未調降任一者MM細胞系的CD38表現水平(資料未顯示)。

由於已知BMSC可生產數種免疫抑制因子，諸如IDO、TGF-β、或PGE-2，由BMSC防止ADCC的保護作用可能歸因於壓制NK細胞活化的作用，如此會減少彼等在免疫突觸中去顆粒並釋放顆粒酶B及穿孔素以殺滅其目標的能力。為此，使用達拉單抗媒 介的顆粒酶B排放作為NK細胞活性的標記，測定藉由達拉單抗造成BMSC對於NK細胞活化的效應。在BMSC存在下，上清液通常有較高的顆粒酶B水平(資料未顯示)。因此，BMSC媒介防止ADCC的保護作用可能不是歸因於NK細胞壓制。

實例3. 生存素抑制劑終止BMSC媒介防止ADCC的保護作用，並提供與達拉單抗之ADCC媒介殺滅多發性骨髓瘤細胞的協同作用

BMSC已顯示可藉由調升MM細胞中的生存素，以保護MM細胞防止CTL裂解。藉由使用YM155(生存素的小分子抑制劑)評估生存素調控，其係由達拉單抗誘導BMSC媒介防止ADCC的保護作用之可能機制。

首先評估YM155對於NK細胞生存力的效應。MM病患的BM-MNC在不同劑量的YM155存在下持續24小時培養。藉由FACS測定MM細胞(CD138⁺細胞)與NK細胞(CD3^-CD138^-CD56⁺細胞)的生存力。當YM155劑量已顯示對MM細胞具有一些毒性時，NK細胞並不受影響(圖3)。

使用顯示對NK細胞不具毒性的YM155濃度，在RPMI-8226細胞中且在兩個MM病患樣本中，評估達拉單抗、YM155、或達拉單抗與YM155之組合所帶來的效應。

在試驗中，使用達拉單抗與YM155時，對於RPMI-8226細胞係分別以0.3μg/ml與1nM之濃度，且對於MM病患樣本係分別以1μg/ml與120nM之濃度。使用健康供體PBMC作為效應 細胞，對於RPMI-8226細胞係以40：1之效應：目標細胞比，且對於MM病患樣本係以30：1之效應：目標細胞比。

在RPMI-8226細胞中，在BMSC不存在下，單獨使用達拉單抗或單獨使用YM155誘導了約20%細胞裂解。在BMSC存在下，達拉單抗誘導了約10%細胞裂解，而YM155則不具效應。達拉單抗與YM155之組合提供了協同效應，在BMSC不存在下誘導約50%細胞裂解，且在BMSC存在下誘導約45%細胞裂解(圖4A)。達拉單抗與YM155之組合在BMSC中的協同效應係約5倍。同樣地，達拉單抗與YM155之組合使用120nM YM155時提供了在MM病患樣本1中的協同效應(圖4B)，使用較低量之YM155(64nM)時提供了在MM病患樣本2中的中等協同效應(圖4C)，且提供在衍生自4名病患的MM細胞之組合樣本中的協同效應(圖4D)。因此，YM155在MM細胞與細胞系中終止BMSC對達拉單抗媒介ADCC的保護效應。

因此，生存素調升對於ADCC媒介殺滅MM細胞的壓制作用而言可係重要機制，其可藉由藥理上調控生存素而避免。

實例4. 達拉單抗與YM155組合治療的體內抗腫瘤效應

在RAG2^-/-gc^-/-小鼠(其中MM腫瘤係在人化類似BM微環境中生長，該微環境係藉由皮下植入經人類BMSC包覆的陶瓷支架創建)的臨床前異體移植模型中，測試達拉單抗與YM155之組合在體內的相關性。經人類MSC包覆且載有螢光素酶轉導的MM細胞 系UM9之複合支架係經皮下植入於RAG2^-/-γc^-/-小鼠背部(每隻小鼠4個支架)。在植入十天後，藉由BLI可視化並定量生長中的腫瘤。然後，不同群組的小鼠(n=4)係經媒劑對照治療(對照)，或者經達拉單抗、YM155、或達拉單抗加上YM155治療。用皮下輸液泵，以1mg/kg/d YM155之速率，持續輸送YM155或其媒劑(PBS)十天。每隻小鼠(包括對照組)接受T細胞淨除HD-PBMC(5×10⁶個細胞)作為人類NK細胞的來源以誘導ADCC。每週藉由BLI監測小鼠。圖5顯示每個群組的相對腫瘤生長情形。使用曼-惠特尼U檢定(Mann-Whitney U-test)，計算經達拉單抗治療的小鼠與經達拉單抗加上YM155治療的小鼠之間的統計上差異。達拉單抗對腫瘤生長具有邊際效應。使用YM155時的抗MM效應更加明顯，其進一步展現與達拉單抗的強大協同作用，以達到顯著改善的抗MM效應。此等結果暗示可從達拉單抗與生存素抑制劑YM155之組合預期臨床效益。

所呈現的結果顯示，以小分子YM155壓制生存素之水平不僅改善了BMSC不存在下的達拉單抗媒介ADCC，更重要的是終止了由BMSC誘導的ADCC抗性。達拉單抗加上YM155的結果亦顯示了BMSC不存在下增強的抗腫瘤效應，其暗示了YM155-達拉單抗組合治療的潛在效益，即使MM細胞不與BMSC直接接觸時(諸如漿細胞白血病)也是如此。此外，在BMSC存在下ADCC的顯著改善(即MM細胞裂解有高達四倍的改善)，其暗示組合達拉單抗治療與YM155對於位於BM中的MM細胞 可達成更大的效益。亦顯示的是，YM155治療不會對NK細胞功能或生存力帶來負面干擾，其係考量此組合治療之臨床應用的前提。

達拉單抗與YM155組合之療效係在多發性骨髓瘤中顯示，然而可推斷出組合治療亦可對其他表現CD38的血液腫瘤有益，尤其是主要位於BM中的血液腫瘤。就此而言，由於AML細胞不僅表現高水平之CD38，而且表現高水平之生存素(其係不良臨床成果的預測因子)，因此AML是明顯的候選者。由於BM中的CLL細胞具有高度生存素表現，且在一些病患中表現CD38，另一種用於組合治療的潛在候選者可能是CLL。在非霍奇金氏淋巴瘤中約50%具有高度CD38與生存素表現，這使得此疾病在評估YM155-達拉單抗組合的療效上亦有相關。總之，達拉單抗與YM155的組合可廣泛地適用於範圍寬廣的血液腫瘤。

<110> 美商健生生物科技公司 Janssen Biotech,Inc.

<120> 以抗CD38抗體與生存素抑制劑於血紅素惡性腫瘤之組合治療 COMBINATION THERAPIES FOR HEME MALIGNANCIES WITH ANTI-CD38 ANTIBODIES AND SURVIVIN INHIBITORS

<140> 105134915

<141> 2016-10-28

<150> US62/319036

<151> 2016-04-06

<150> US15/189577

<151> 2016-06-22

<150> PCT/US16/38702

<151> 2016-06-22

<160> 23

<170>PPatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體VH

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體VL

<400> 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體HCDR1

<400> 6

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體HCDR2

<400> 7

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb HCDR3

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體LCDR1

<400> 9

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體LCDR2

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體LCDR3

<400> 11

<210> 12

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體HC

<400> 12

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體LC

<400> 13

<210> 14

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 003 VH

<400> 14

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 003 VL

<400> 15

<210> 16

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 024 Vh

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mAb 024 VL

<400> 17

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOR202VH

<400> 18

<210> 19

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOR202VL

<400> 19

<210> 20

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊沙妥昔單抗(Isatuximab)VH

<400> 20

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 伊沙妥昔單抗(Isatuximab)VL

<400> 21

<210> 22

<211> 142

<212> PRT

<213> 智人(HOMO SAPIENS)

<400> 22

<210> 23

<211> 509

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

Claims (15)

1. 一種抗CD38抗體用於製造治療患有CD38陽性血液惡性腫瘤的對象的醫藥品之用途，其中該抗CD38抗體係屬於IgG1同型且包含分別係SEQ ID NO：6、7及8的重鏈互補決定區(HCDR)1、HCDR2及HCDR3胺基酸序列，以及分別係SEQ ID NO：9、10及11的輕鏈互補決定區(LCDR)1、LCDR2及LCDR3胺基酸序列，其中該抗CD38抗體係與生存素(survivin)抑制劑組合投予，且其中該生存素抑制劑為YM155。
2. 如請求項1所述之用途，其中該CD38陽性血液惡性腫瘤係多發性骨髓瘤(MM)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、伯奇氏淋巴瘤(BL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、被套細胞淋巴瘤(MCL)、急性骨髓性白血病(AML)或慢性淋巴球性白血病(CLL)。
3. 如請求項1所述之用途，其中該CD38陽性血液惡性腫瘤係漿細胞疾病。
4. 如請求項3所述之用途，其中該漿細胞疾病係輕鏈類澱粉沉積症(AL)、多發性骨髓瘤(MM)、或瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)。
5. 如請求項4所述之用途，其中該漿細胞疾病係MM。
6. 如請求項1至5中任一項所述之用途，其中該抗CD38抗體與包含SEQ ID NO：4之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：5之輕鏈可變區 (VL)的抗體競爭結合CD38。
7. 如請求項6所述之用途，其中該抗CD38抗體結合至人類CD38(SEQ ID NO：1)的SKRNIQFSCKNIYR(SEQ ID NO：2)區及EKVQTLEAWVIHGG(SEQ ID NO：3)區。
8. 如請求項1所述之用途，其中該抗CD38抗體包含含與SEQ ID NO：4具有95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的重鏈可變區(VH)及含與SEQ ID NO：5具有95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL)。
9. 如請求項8所述之用途，其中該抗CD38抗體包含SEQ ID NO：4的VH及SEQ ID NO：5的VL。
10. 如請求項1-4及9中任一項所述之用途，其中該抗CD38抗體藉由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)或細胞凋亡誘導CD38陽性細胞的殺滅。
11. 如請求項1-4及9中任一項所述之用途，其中該抗CD38抗體包含SEQ ID NO：12的重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：13的輕鏈胺基酸序列。
12. 如請求項1所述之用途，其中該抗CD38抗體及該生存素抑制劑係同時投予。
13. 如請求項1所述之用途，其中該抗CD38抗體及該生存素抑制劑係依序或分開投予。
14. 如請求項12或13所述之用途，其中該抗CD38抗體係經靜脈內投予。
15. 如請求項12或13所述之用途，其中該抗CD38抗體係以醫藥組成物經皮下投予，該醫藥組成物包含該抗CD38抗體及玻尿酸酶。

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