TWI718526B - 經調節泛蛋白化之癌症治療及/或預防 - Google Patents

經調節泛蛋白化之癌症治療及/或預防 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於預防及/或治療癌症之方法，其包含在個體中投與活性BIK (BIKDD)與阻斷BIKDD泛蛋白化路徑之組合。亦提供一種用於預防及/或治療個體之癌症的方法，其包含BIK基因療法繼而投與IRE1α抑制劑的組合治療。

Description

經調節泛蛋白化之癌症治療及/或預防
本發明係關於癌症預防及/或治療領域。特定言之，本發明係關於CRL5ASB11 作為靶向BIK之泛蛋白連接酶，用於泛蛋白化及蛋白酶體降解，以及經由靶向BIK降解路徑以及投與活性BIK之抗癌策略。
細胞死亡之調節對正常細胞生理、組織穩態及發育至關重要。Bcl-2家族決定細胞對細胞凋亡的承諾，且由三個亞組組成：促存活的Bcl-2樣蛋白、多域促凋亡的BAX/BAK蛋白以及促凋亡的BH3-only蛋白。BH3-only蛋白在由Bcl-2家族控制的凋亡路徑的頂點起作用，且藉由兩種不同的機制活化BAX/BAK。在直接活化機制中，某些BH3-only蛋白，諸如BIM及tBID，瞬時結合BAX/BAK以觸發其在線粒體外膜的寡聚化，從而誘導細胞色素C釋放以誘導細胞凋亡。然而，大多數BH3-only蛋白經由間接機制藉由與促存活的Bcl-2蛋白結合而起作用，從而阻止其中和BAX/BAK。
與BH3-only蛋白作為由Bcl-2家族控制的凋亡路徑之支點的功能一致，其表現及活性在各種生理及應激條件下受到嚴格調節。舉例而言，PUMA及NOXA在DNA損傷下由p53轉錄上調，而BIM表現在內質網(endoplasmic reticulum，ER)應激期間由CHOP轉錄誘導。除了在轉錄層面受到調節之外，BH3-only蛋白亦經歷各種轉譯後修飾。舉例而言，BAD及BIM分別由Akt及ERK誘導的磷酸化負調節。泛蛋白介導之蛋白水解為調節BH3-only蛋白豐度的另一種機制，且BIM為經歷此類調節模式的研究最充分的成員。BIM在G1/S期藉由RSK/ERK且在有絲分裂期間藉由APCcdc20 磷酸化後藉由SCF-bTRCP複合物泛蛋白化。此等泛蛋白化路徑之調節可影響癌細胞對抗腫瘤劑之敏感性。
本發明將CRL5ASB11 鑑定為靶向BIK之泛蛋白連接酶，用於泛蛋白化及蛋白酶體降解。在ER應激下，ASB11 藉由IRElα之效應物XBPls轉錄活化。相比之下，DNA損傷誘導之p53下調IRElα以抑制ASB11。因此，BIK泛蛋白化及降解因ER應激而增強且因DNA損傷而降低，從而在兩種應激條件下相反地調節細胞生-死決策。本發明亦顯示，靶向BIK降解路徑以及投與活性BIK可提供有效的抗癌策略。
本發明提供一種用於預防及/或治療癌症之方法，其包含在個體中投與活性BIK (BIKDD)以及阻斷BIKDD泛蛋白化路徑。某些實施例包括使用CRL5ASB11 作為靶向BIK之泛蛋白連接酶，用於泛蛋白化及蛋白酶體降解。在一些實施例中，ASB11增強BIK泛蛋白化；ASB11之耗盡降低BIK泛蛋白化程度；且ASB11之過度表現降低BIK蛋白質含量且增加BIK蛋白質降解。在另一實施例中，ASB11 藉由XBPl轉錄活化。在另一實施例中，XBPl為IRElα之效應物。
在另一實施例中，ASB11 之表現藉由衣黴素(tunicamycin)或鈣泵抑制劑上調。鈣泵抑制劑之某些實施例為毒胡蘿蔔素(thapsigargin)。
在另一實施例中，ER應激可經由XBP1誘導之ASB11上調而促進BIK泛蛋白化及降解。
在另一實施例中，遺傳毒物經由p53起作用，下調IRE1α及ASB11，從而穩定BIK。遺傳毒物之某些實施例包括小紅莓(doxorubicin)及5-氟尿嘧啶。
本發明亦提供一種用於預防及/或治療個體之癌症的方法，其包含BIK基因療法繼之以投與IRE1α抑制劑的組合治療。在一個實施例中，BIK基因療法為遞送BIKDD脂質奈米粒子。BIK脂質奈米粒子之某些實施例包括BIKDD、C-VISA BIKDD:脂質體或SV-BIKDD。IRE1α抑制劑之某些實施例包括7-羥基-4-甲基-2-側氧基-2H-1-苯并哌喃-8-甲醛(4µ8C，IRE1抑制劑I (N-[(2-羥基-1-萘基)亞甲基]-2-噻吩磺醯胺；STF-083010)、3-乙氧基-5,6-二溴柳醛及(R)-2-(3,4-二氯苄基)-N-(4-甲苄基)-2,7-二氮雜螺[4.5]癸烷-7-甲醯胺(GSK2850163)。
在另一實施例中，BIK基因療法係藉由投與BIK脂質奈米粒子以及針對IRE1α之抑制性RNA而進行。針對IRE1α之抑制性RNA之某些實施例包括針對IRE1α之干擾RNA、shRNA、siRNA、核糖核酸酶或反義寡核苷酸。在另一實施例中，針對IRE1α之抑制性RNA用病毒載體遞送。病毒載體之某些實施例為腺病毒載體。
癌症之某些實施例包括神經母細胞瘤；肺癌；膽管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；頭頸部鱗狀細胞癌；鱗狀細胞子宮頸癌；淋巴瘤；鼻咽癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；膽囊癌；攝護腺癌；乳癌；睪丸生殖細胞腫瘤；結腸直腸癌；神經膠質瘤；甲狀腺癌；基底細胞癌；胃腸基質癌；肝母細胞瘤；子宮內膜癌；卵巢癌；胰臟癌；腎細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、慢性白血病、肉瘤、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結腸癌、膀胱癌、肥胖細胞瘤、乳癌、乳腺癌、咽鱗狀細胞癌、睪丸癌、胃腸癌或胃癌或泌尿道上皮癌。
整個文獻意欲作為統一的揭示內容相關聯，且應理解，即使在此文獻的同一個句子或段落或部分中沒有一起找到特徵組合，仍然涵蓋本文所述的特徵的所有組合。以下說明性描述的本發明可以在缺少任何本文未具體揭示之要素或限制的情況下適當地實施。
除非另外指示，否則技術術語係根據其常見含義使用。若給某些術語賦予特定意義，則下文將在使用該等術語之情形下給出術語定義。
除非另外特定陳述，否則單數形式「一(a/an)」及「該」可指複數個物品。
術語「抑制」或「降低」或此等術語之任何變化形式包括可達成所期望結果之任何可量測的降低或完全抑制。術語「促進」或「增加」或此等術語之任何變化形式包括可達成所期望結果之蛋白質或分子的任何可量測的增加或產生。
根據一般熟習此項技術者能夠經由常規實驗容易地確定的術語「有效量」為達成特定作用所必需的量。
術語「預防」或此術語之任何變化形式意謂減緩、停止或逆轉結果的進展。預防可為對結果之進展的任何減緩。
術語「治療(treatment/treating)」涵蓋預防性(亦即防治性)或治療性(亦即洽癒性)及/或緩解性治療。因此，術語「治療」包含對已患上該病狀，尤其是明顯形式的病狀的患者之治療性治療。治療性治療可為對症治療以減輕特定適應症之症狀，或可為病因治療以逆轉或部分逆轉適應症之病狀或停止或減緩疾病之進展。因此，本發明之化合物、組合物及方法可例如用作一段時間內之治療性治療以及慢性療法。
術語「疾病」或「病症」在本文中可互換地使用，且係指對於患病之人或與人接觸者，身體或某些器官之狀態的任何改變、中斷或干擾功能之效能及/或引起症狀，諸如不適、功能障礙、痛苦或甚至死亡。
術語「投與」意謂向個體提供藥劑或組合物。
BIK為BH3-only蛋白之基礎成員。除了BH3域之外，BIK亦在其C端含有跨膜域且主要侷限於ER之膜。BIK經由BAX/BAK依賴性方式促進ER Ca2 +儲存物之釋放。所釋放之Ca2 +經由ER-線粒體接觸位點轉移至線粒體，從而活化發動蛋白(dynamin)相關之GTP酶DRP1，以便粒線體脊重塑及細胞色素C釋放。BIK亦增加ER相關之BAK且破壞Bcl-2與1,4,5三磷酸肌醇受體之間的相互作用，二者均促使Ca2 +從ER釋放。類似於若干其他僅BH3成員，BIK藉由p53及E2F轉錄上調(Real , P . J . 等人 Transcriptional activation of the proapoptotic bik gene by E2F proteins in cancer cells . FEBS Lett 580 , 5905 - 5909 ( 2006 ) )。此外，BIK為不穩定蛋白質且可以藉由蛋白酶體抑制劑穩定(Li , C ., Li , R ., Grandis , J . R . & Johnson , D . E . Bortezomib induces apoptosis via Bim and Bik up - regulation and synergizes with cisplatin in the killing of head and neck squamous cell carcinoma cells . Mol Cancer Ther 7 , 1647 - 1655 ( 2008 ) )。雖然此發現指示BIK係藉由泛蛋白化調節，但是負責此調節之泛蛋白連接酶尚未鑑定。
未摺疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)為一種細胞適應性程式，旨在恢復各種ER應激條件下的ER穩態。UPR藉由摺疊異常之蛋白質在ER內腔中之積累而活化且藉由三種ER膜定位的應激感應蛋白質介導，包括需肌醇酶1 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、活化轉錄因子6 (ATF6)及蛋白激酶RNA樣ER激酶(PERK)。UPR之結果可視ER應激之強度及持續時間而定，為促存活的或促凋亡的。在短暫的且溫和的應激條件下，UPR藉由增加蛋白質摺疊或降解及抑制蛋白質合成而促進細胞存活。在慢性ER應激下，UPR藉由改變一組促凋亡調節劑之表現及/或活性而促進凋亡，促凋亡調節劑包括若干Bcl-2家族蛋白(Rodriguez , D ., Rojas - Rivera , D . & Hetz , C . Integrating stress signals at the endoplasmic reticulum : The BCL - 2 protein family rheostat . Biochim Biophys Acta 1813 , 564 - 574 ( 2011 ) )。然而，UPR是否亦調節Bcl-2家族蛋白以阻止在適應期期間細胞凋亡以及UPR如何從適應期轉變為凋亡期仍未完全瞭解。
在一個態樣中，本發明提供一種用於預防及/或治療癌症之方法，其包含在個體中投與活性BIK (BIKDD)以及阻斷BIKDD泛蛋白化路徑。在一個實施例中，使用CRL5ASB11 作為靶向BIK之泛蛋白連接酶，用於泛蛋白化及蛋白酶體降解。
在一個實施例中，ASB11增強BIK泛蛋白化。在一個實施例中，ASB11之耗盡降低BIK泛蛋白化程度。在一個實施例中，ASB11之過度表現降低BIK蛋白質含量且增加BIK蛋白質降解。
在一個實施例中，ASB11 藉由XBPl轉錄活化。在一個實施例中，XBPl為IRElα之效應物。在一個實施例中，ASB11 之表現藉由衣黴素或鈣泵抑制劑上調。在一個實施例中，鈣泵抑制劑為毒胡蘿蔔素。在一個實施例中，遺傳毒物經由p53起作用，下調IRE1α及ASB11，從而穩定BIK。
在一個實施例中，ER應激可經由XBP1誘導之ASB11上調而促進BIK泛蛋白化及降解。
在一個態樣中，本發明提供一種用於預防及/或治療癌症之方法，其包含BIK基因療法繼之以投與IRE1α抑制劑的組合治療。
在一個實施例中，BIK基因療法為向個體遞送BIKDD脂質奈米粒子。在一個實施例中，BIK脂質奈米粒子為BIKDD、C-VISA BIKDD:脂質體或SV-BIKDD。在一個實施例中，BIK基因療法係藉由投與BIKDD脂質奈米粒子以及針對IRE1α之抑制性RNA (諸如干擾RNA、shRNA、siRNA、時序RNA (temporal RNA，stRNA)、核糖核酸酶及反義寡核苷酸)而進行。在一個實施例中，抑制性RNA用病毒載體遞送。在諸多研究中，病毒載體已成為較佳的遞送方法。相比於替代方案(直接轉染siRNA/質體，或逆轉錄病毒及慢病毒系統)，藉由腺病毒或AAV系統觀察到更大的基因靜默(gene silencing)。
在一個實施例中，IRE1抑制劑為7-羥基-4-甲基-2-側氧基-2H-1-苯并哌喃-8-甲醛(4µ8C，IRE1抑制劑I (N-[(2-羥基-1-萘基)亞甲基]-2-噻吩磺醯胺；STF-083010)、3-乙氧基-5,6-二溴柳醛或(R)-2-(3,4-二氯苄基)-N-(4-甲苄基)-2,7-二氮雜螺[4.5]癸烷-7-甲醯胺(GSK2850163)。
在一個實施例中，該癌症包括(但不限於)由以下組成之群：神經母細胞瘤；肺癌；膽管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；頭頸部鱗狀細胞癌；鱗狀細胞子宮頸癌；淋巴瘤；鼻咽癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；膽囊癌；攝護腺癌；乳癌(breast cancer)；睪丸生殖細胞腫瘤；結腸直腸癌；神經膠質瘤；甲狀腺癌；基底細胞癌；胃腸基質癌；肝母細胞瘤；子宮內膜癌；卵巢癌；胰臟癌；腎細胞癌、卡波西氏肉瘤、慢性白血病、肉瘤、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結腸癌、膀胱癌、肥胖細胞瘤、乳癌(mammary carcinoma)、乳腺癌、咽鱗狀細胞癌、睪丸癌、胃腸癌或胃癌及泌尿道上皮癌。在另一實施例中，癌症為乳癌(breast cancer)。在一個實施例中，癌症為抗藥性癌症。在另一實施例中，癌症為三陰性乳癌(triple-negative breast cancer，TNBC)。
如本文中及本說明書通篇所提及之個體(subject)或個體(individual)包括哺乳動物，諸如鼠，特別是小鼠及大鼠，牛，及靈長類動物，諸如人類。
本文中所述之藥劑或抑制劑可用於醫藥調配物及組合物中。適當地，此類調配物或組合物包含醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、鹽或佐劑。本文中所述之藥劑或抑制劑可與醫藥學上可接受之活性或惰性物質混合來製備醫藥組合物或調配物。用於調配醫藥組合物之組合物及方法視多個準則而定，包括(但不限於)投與途徑、疾病程度或待投與之劑量。
在製備如本文中所揭示之醫藥調配物或組合物時，所選擇本文描述之單獨的或與本發明之靶向部分複合而呈劑量單位形式之口服藥劑或抑制劑可與固體粉末狀成分混合，諸如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、支鏈澱粉、纖維素衍生物、明膠或另一適合成分，以及崩解劑及潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂醯反丁烯二酸鈉及聚乙二醇蠟。隨後將混合物加工成粒劑或壓製成錠劑。
可以用含有本文所述之藥劑或抑制劑在植物油、脂肪或其他適合軟明膠膠囊之媒劑中之混合物的膠囊製備軟明膠膠囊。硬明膠膠囊可含有本文所述之藥劑或抑制劑之顆粒。
口服液體製劑可以製成糖漿、溶液或懸浮液形式。必要時，此類液體製劑可含有著色劑、調味劑、糖精及羧甲基纖維素或其他增稠劑。口服液體製劑亦可以製成乾粉形式，在使用前用使用適合溶劑復原。用於非經腸投與之溶液可以於醫藥學上可接受之溶劑中製成本文所述之藥劑或抑制劑之溶液。此等溶液亦可含有穩定成分及/或緩衝成分且分配至呈安瓿或小瓶形式之單位劑量中。用於非經腸投與之溶液亦可製成乾製劑，在臨用前才使用適合溶劑復原。
本文所述之技術藉由以下實例進一步說明，該等實例絕不應被解釋為進一步限制，本申請案全文所有引用的文獻之內容，包括參考文獻、已頒予之專利、公開專利申請案及同在申請中專利申請案，均已明確地以引用之方式併入。本文所述之技術已依據本發明人所發現或提出之特定實施例說明，以涵括實施本發明之較佳模式。熟習此項技術者應瞭解，根據本發明，可以在不脫離本發明之預期範疇之情況下，在舉例說明之特定實施例中作出許多修改及改變。實例
材料及方法
抗體及試劑
產生ASB11抗血清且由臺灣LTK BioLaboratories Inc.使用肽TDYGANLKRRNAQGKSAL (對應於ASB11之胺基酸248至265)作為抗原來進行親和力純化。此研究中所用之其他抗體描述於補充表1中。環己醯亞胺、小紅莓、5-FU、4μ8C、STF-083010、衣黴素及毒胡蘿蔔素購自Sigma。MG132獲自Calbiochem，而CB-5083來自Cayman Chemical。補充表 1 ：關於此研究中所用抗體之資訊
目標 分析 來源
6xHis WB 631212, Clontech
BIK WB sc-1710；sc-365625, Santa Cruz
經裂解之凋亡蛋白酶-3 WB 9661, Cell Signaling
經裂解之PARP WB 5625, Cell Signaling
Cul1 WB 612040, BD Biosciences
Cul3 WB EPR3196Y, GeneTex
Flag WB, IP F1804, Sigma；GTX115043, GeneTex
GAPBH WB 2251-1, Eptomics；GTX100118, GeneTex
山羊IgG (HRP) WB GTX228416-01；GTX628547-01, GeneTex
HA WB H9658, Sigma
IRE1α WB 3294, Cell Signaling
小鼠IgG (HRP) WB NA931-1ML, GE Healthcare
Myc WB sc-40, Santa Cruz；GTX29106, GeneTex
NFYA WB, IP ab6558, abcam；sc-17753, Santa Cruz
NFYB WB, IP ab6559, abcam；sc-376546, Santa Cruz
NFYC WB, IP ab232909, abcam；H00004802-M01, abnova
NPL4 WB, IP 13489, Cell Signaling
p53 WB sc-126, Santa Cruz
兔IgG IP, ChIP ab171870, abcam
兔IgG (HRP) WB NA934-1ML, GE Healthcare
T7 WB 69522, Novagen
微管蛋白(Tubulin) WB 05-829, EMD Millipore；GTX628802, GeneTex
UFD1 WB, IP 13789, Cell Signaling
V5 WB AB3792, EMD Millipore
VCP WB, IP ab11433, abcam
XBP1s WB, ChIP 619502, BioLegend
細胞培養及轉染
將293T、293FT、H1299、Hs578T、MDA-MB157及MDA-MB468細胞維持在達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中，該培養基補充有10%胎牛血清(FCS)、100單位/毫升青黴素及100 μg/ml鏈黴素。在含有10% FCS、100單位/毫升青黴素及100 μg/ml鏈黴素之RPMI-1640中培養HCT116細胞。使用磷酸鈣方法或脂染胺(Lipofectamine) 3000試劑進行轉染。
質體
所有Cullin DN突變型構築體係藉由定點突變誘發從獲自Hsueh-Chi Sherry Yen之WT構築體產生。將BIK cDNA次選殖至3XFlag-pCMV7.1.2載體或pRK5中，且藉由定點突變誘發產生BIK突變體。XBPls係從源自經衣黴素處理之海拉細胞(HeLa cell)的cDNA進行PCR擴增且選殖至pRK5中。在39個Cul5受質接附子(adaptor)中，針對以下各者之cDNA分別由以下各者提供：SSB2，Soichi Miwa；RAB40A及RAB40C，John H, Brumell；RAB40B，Jorge E. Galan；WSB2，Yue Xiong；CIS，Lu-Hai Wang；SSB1、SSB3及SSB4，Guan Wu；ASB1、ASB6、ASB7及ASB12，Yasuhiko Masuho；以及ASB3、WSB1、PCMTD2及Mufl，Joan Conaway。其他受質接附子從源自293T細胞之mRNA擴增。用於擴增此等cDNA之引子列於補充表2中。將所有受質接附子選殖至pRK5-Flag中。HA-延伸蛋白(Elongin) B及T7-延伸蛋白C由Dong Xie提供，ROC2 cDNA由Yue Xiong提供。His-泛蛋白先前已有描述(Yuan , W . C . 等人 A Cullin3 - KLHL20 Ubiquitin ligase - dependent pathway targets PML to potentiate HIF - 1 signaling and prostate cancer progression . Cancer Cell 20 , 214 - 228 ( 2011 ) )。p53 cDNA獲自Sheau-Yann Shieh且次選殖至pRK5中。CMV-BIKDD及VISA BIKDD如先前所述(Lang , J . Y . 等人 BikDD eliminates breast cancer initiating cells and synergizes with lapatinib for breast cancer treatment . Cancer Cell 20 , 341 - 356 ( 2011 ) )。補充表 2 ：用於 ( 定量 ) PCR 及選殖之引子
  名稱 分析 序列(5'至3')
  ASB11 qPCR F
Figure 02_image001
  R
Figure 02_image003
  ATF6 F
Figure 02_image005
  R
Figure 02_image007
  BIK F
Figure 02_image009
  R
Figure 02_image011
  GAPDH F
Figure 02_image013
  R
Figure 02_image015
  NFYB F
Figure 02_image017
  R
Figure 02_image019
  NFYC F
Figure 02_image021
  R
Figure 02_image023
  p53 F
Figure 02_image025
  R
Figure 02_image027
  PERK F
Figure 02_image029
  R
Figure 02_image031
  XBP1 F
Figure 02_image033
  R
Figure 02_image035
  XBP1s F
Figure 02_image037
  R
Figure 02_image039
  XBP1 (內含子) PCR F
Figure 02_image041
  R
Figure 02_image043
  A (-63 ~+165) ChIP- qPCR F
Figure 02_image045
  R
Figure 02_image047
  B (-304 ~ -86) F
Figure 02_image049
  R
Figure 02_image051
  C (-870 ~ -664) F
Figure 02_image053
  R
Figure 02_image055
  D (-1623 ~ -1474) F
Figure 02_image057
  R
Figure 02_image059
  Flag-ANKRD9 F
Figure 02_image061
  R
Figure 02_image063
  Flag-ASB1 選殖 F
Figure 02_image065
  R
Figure 02_image067
  Flag-ASB3 F
Figure 02_image069
R
Figure 02_image071
  
Flag-ASB4 F
Figure 02_image073
  
R
Figure 02_image075
  
Flag-ASB5 F
Figure 02_image077
  
R
Figure 02_image079
  
Flag-ASB6 F
Figure 02_image081
  
R
Figure 02_image083
  
Flag-ASB7 F
Figure 02_image085
  
R
Figure 02_image087
  
Flag-ASB8 F
Figure 02_image089
  
R
Figure 02_image091
  
Flag-ASB9 F
Figure 02_image093
  
R
Figure 02_image095
  
Flag-ASB10 F
Figure 02_image097
  
R
Figure 02_image099
  
Flag-ASB11 F
Figure 02_image101
  
R
Figure 02_image103
  
Flag-ASB12 F
Figure 02_image105
  
R
Figure 02_image107
  
Flag-ASB13 F
Figure 02_image109
  
R
Figure 02_image111
  
Flag-ASB14 F
Figure 02_image113
  
R
Figure 02_image115
  
Flag-ASB15 F
Figure 02_image117
  
R
Figure 02_image119
  
Flag-ASB16 F
Figure 02_image121
  
R
Figure 02_image123
  
Flag-ASB17 F
Figure 02_image125
  
R
Figure 02_image127
  
Flag-ASB18 F
Figure 02_image129
  
R
Figure 02_image131
  
Flag-CIS F
Figure 02_image133
  
R
Figure 02_image135
  
Flag-Muf1 F
Figure 02_image137
  
R
Figure 02_image139
  
Flag-PCMTD1 F
Figure 02_image141
  
R
Figure 02_image143
  
Flag-PCMTD2 F
Figure 02_image145
  
R
Figure 02_image147
  
FIag-RAB40A F
Figure 02_image149
  
R
Figure 02_image151
  
Flag-RAB40B F
Figure 02_image153
  
R
Figure 02_image155
  
Flag-RAB40C F
Figure 02_image157
  
R
Figure 02_image159
  
Flag-SSB1 F
Figure 02_image161
  
R
Figure 02_image163
  
Flag-SSB2 F
Figure 02_image165
  
R
Figure 02_image167
  
Flag-SSB3 F
Figure 02_image169
  
R
Figure 02_image171
  
Flag-SSB4 F
Figure 02_image173
  
R
Figure 02_image175
  
Flag-SOCS1 F
Figure 02_image177
  
R
Figure 02_image179
  
Flag-SOCS2 F
Figure 02_image181
  
R
Figure 02_image183
  
Flag-SOCS3 F
Figure 02_image185
  
R
Figure 02_image187
  
Flag-SOCS4 F
Figure 02_image189
  
R
Figure 02_image191
  
Flag-SOCS5 F
Figure 02_image193
  
R
Figure 02_image195
  
Flag-SOCS6 F
Figure 02_image197
  
R
Figure 02_image199
  
Flag-SOCS7 F
Figure 02_image201
  
R
Figure 02_image203
  
Flag-TULP4 F
Figure 02_image205
  
R
Figure 02_image207
  
Flag-WSB1 F
Figure 02_image209
  
R
Figure 02_image211
  
Flag-WSB2 F
Figure 02_image213
  
R
Figure 02_image215
  
BIK F
Figure 02_image217
  
R
Figure 02_image219
  
Flag-BCL2 F
Figure 02_image221
  
R
Figure 02_image223
  
3xFlag-BIK F
Figure 02_image225
  
R
Figure 02_image227
  
Myc-ASB11 F
Figure 02_image229
  
R
Figure 02_image231
  
Myc-DNASB11 F
Figure 02_image233
  
R
Figure 02_image235
  
V5-ROC2 F
Figure 02_image237
  
R
Figure 02_image239
  
Flag-ASB11 F
Figure 02_image241
  
R
Figure 02_image243
  
Flag-DNASB11 F
Figure 02_image245
  
R
Figure 02_image247
  
Myc-XBP1(s) F
Figure 02_image249
  
R
Figure 02_image251
  
BIK(115R) F
Figure 02_image253
  
R
Figure 02_image255
  
BIK(160R) F
Figure 02_image257
  
R
Figure 02_image259
  
BIKDD F
Figure 02_image261
  
R
Figure 02_image263
  
pLAS5W-Myc- ASB11 F
Figure 02_image265
  
R
Figure 02_image267
  
ASB11啟動子 1949 F
Figure 02_image269
  
R
Figure 02_image271
  
ASB11啟動子 478 F
Figure 02_image273
  
R
Figure 02_image275
  
ASB11啟動子 478 dNFY F
Figure 02_image277
  
R
Figure 02_image279
  
RNA 干擾
基於慢病毒之構築體獲自臺灣National RNAi Core Facility。shRNA目標序列列於補充表3中。為了產生攜帶shRNA之重組慢病毒，用包裝質體pCMVDR8.91、包膜質體pMD.G及shRNA表現構築體共轉染293FT細胞。為了感染，給病毒儲備液補充8 μg/ml凝聚胺(polybrene)且藉由適當的試劑選擇受感染細胞。補充表 3 ： shRNA 之 靶向序列
基因 純系 目標序列(5'至3')
Cul2 #1
Figure 02_image281
Cul2 #2
Figure 02_image283
Cul5 #1
Figure 02_image285
Cul5 #2
Figure 02_image287
ASB11 #1
Figure 02_image289
ASB11 #2
Figure 02_image291
ATF6 #1
Figure 02_image293
ATF6 #2
Figure 02_image295
BIK #1
Figure 02_image297
NFYB #1
Figure 02_image299
NFYB #2
Figure 02_image301
NFYC #1
Figure 02_image303
NFYC #2
Figure 02_image305
PERK #1
Figure 02_image307
PERK #2
Figure 02_image309
XBP1 #1
Figure 02_image311
XBP1 #2
Figure 02_image313
免疫沈澱及西方墨點法
用含有50 mM Tris (pH 8.0)、0.15 M NaCl、1% NP40、1%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、1 mM PMSF、1 pg/ml抑肽酶(aprotinin)及1 pg/ml抗纖維蛋白溶酶肽(leupeptin)之RIPA溶解緩衝液進行細胞提取。按標準方案進行西方墨點法。為了藉由西方墨點法有效偵測BIK，使用麥黃酮-SDS-PAGE。其他蛋白質之西方墨點分析藉由甘胺酸-SDS-PAGE進行。如先前所述，進行且分析免疫沈澱。簡言之，將細胞溶解產物與初級抗體一起培育隔夜。隨後將純蛋白質組蛋白A/G磁珠(LSKMAGA/G10，EMD Millipore)添加至細胞溶解產物中且培育1.5小時。用RIPA溶解緩衝液洗滌珠粒且藉由西方墨點法分析所結合之蛋白質。
泛蛋白化分析
關於活體外泛蛋白化分析，使用抗Flag M2親和力瓊脂糖凝膠(Sigma)，從經3xFlag-BIK轉染或經Flag-ASB11、Myc-Cul5、V5-Roc2、T7-延伸蛋白C及HA-延伸蛋白B共轉染之293T細胞之溶解產物分開純化基於ASB11之Cul5 E3連接酶複合物及3xFlag-BIK。在含有40 ng酵母E1酶、500 ng E2酶(UbcH5a)、300 ng 3xFlag-BIK及其他組分之20 μl泛蛋白化反應混合物中培育結合在珠粒上之E3連接酶複合物，如先前所描述(Yuan , W . C . 等人 A Cullin3 - KLHL20 Ubiquitin ligase - dependent pathway targets PML to potentiate HIF - 1 signaling and prostate cancer progression . Cancer Cell 20 , 214 - 228 ( 2011 ) )。此分析中所用之E1、E2、His-泛蛋白及其他相關試劑購自R&D Systems。
關於活體內泛蛋白化分析，將細胞用各種構築體及His-泛蛋白轉染且用1 μM MG132處理16小時。在變性條件下，用緩衝液A (6 M胍鹽酸鹽、0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 pH 8.0及10 mM咪唑)溶解細胞，且將溶解產物與Ni-NTA瓊脂糖凝膠一起在4℃下培育2小時。將珠粒用緩衝液A洗滌一次，用緩衝液A/TI (1體積緩衝液A: 3體積緩衝液TI [25 mM Tris-HCl pH 6.8及20 mM咪唑])洗滌兩次，且用緩衝液TI洗滌三次，且隨後在樣品緩衝液中在95℃下培育5分鐘。在所有實驗中，藉由西方墨點分析驗證His-泛蛋白之相等表現。
細胞凋亡分析
如先前所述，分析細胞凋亡。簡言之，將細胞以1×106 個細胞之密度接種在6-cm培養皿中隔夜。隨後在各個時間點將細胞與小紅莓或衣黴素一起培育。收集細胞且藉由細胞死亡ELISA套組(Roche)量測DNA片段化。
mRNA 提取及 RT - qPCR
使用TRIZOL試劑(Invitrogen)從細胞中提取總mRNA，且使用iScriptTM cDNA合成套組(Bio-Rad)將等量RNA反轉錄至cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master套組(Applied Biosystems)進行定量即時PCR。在ABI 7500快速即時PCR系統上進行擴增且使用GAPDH作為內部對照。
螢光素酶報導子分析
將細胞用基於pGL3之報導子構築體、pTK-海腎(renilla)質體以及其他構築體一起共轉染24小時。螢光素酶報導子分析藉由雙重螢光素酶報導子分析系統(Promega)根據製造商之說明書進行。相對啟動子活性表述為螢火蟲螢光素酶活性在以海腎螢光素酶活性標準化後的倍數變化。
ChIP 分析
ChIP分析如先前所述進行。簡言之，將293T細胞以1×107 個細胞之密度接種在10-cm培養皿中隔夜。將細胞用衣黴素處理4小時，且隨後用1%甲醛固定。用XBP1抗體或ChIP級兔IgG (作為對照)進行ChIP。藉由qPCR分析啟動子結合量之增濃。用於ChIP分析之qPCR引子列於補充表2中。
MTT 分析
將MDA-MB157及MDA-MB 468細胞以5×103 個細胞之密度且Hs578T細胞以2×103 個細胞之密度接種在96孔盤中。用BIKDD轉染細胞。次日，將細胞用IRE1α抑制劑或DMSO處理48小時，且隨後用0.4 mg/ml溴化甲基噻唑基二苯基四唑鎓(MTT) (Sigma)處理2小時。將細胞溶解於DMSO中，隨後量測590 nm下之吸光度。使用以下方程式計算組合指數(combination index，CI)：CI= CA /IC50A + CB /IC50B 。CA 及CB 表示用於組合治療之兩種藥劑的濃度。IC50A 及IC50B 為各單一治療之IC50值，其係藉由用各種劑量之各藥劑處理細胞，隨後進行MTT分析而確定的。(CI ＜ 1)指示協同效應，(CI ＞ 1)對應於拮抗效應，且(CI = 1)表示累加效應。
動物實驗
根據動物倫理規範的指導原則維持所有小鼠，且所有動物研究均經過中央研究院(Academia Sinica)實驗動物委員會(Experimental Animal Committee)批准。在五週齡雌性BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl裸小鼠(National Laboratory Animal Center, Taipei, Taiwan)之乳腺脂肪墊中接種2×106 個暫時表現BIKDD或對照載體之Hs578T細胞。七天後，每3天腹膜內投與DMSO或STF-083010 (40 mg/kg)。關於BIKDD基因療法模型，在五週齡雌性BALB/cAnN.Cg-Foxnlnu/CrlNarl裸小鼠(National Laboratory Animal Center, Taipei, Taiwan)之乳腺脂肪墊中接種2×106 個Hs578T細胞。二十八天後，每3至4天腹膜內投與DMSO或STF-083010 (40 mg/kg)。對照載體或VISA-BIKDD (0.75 mg/kg)首先與活體內-jetPEI遞送試劑(PEI；Polyplus Transfection, New York, USA)一起培育15分鐘，且隨後從第28天開始，每7天瘤內注射複合物。關於兩種模型，每3或4天量測腫瘤，且使用以下方程式計算其體積：mm3 =n/6 x 長度(mm) x (寬度(mm))2 。
統計分析
使用針對兩組間之比較的雙尾學生t檢定(two-tailed Student's t test)及針對多組比較之單因子或雙因子變異數分析(ANOVA)與塔基事後檢定來進行統計分析。所有統計分析均在p ＜ 0.05之顯著性水準下進行。實例 1 將 CRL5ASB11 鑑定為 BIK 泛蛋白連接酶
為了鑑定BIK之泛蛋白連接酶，吾人專注於Cullin-RING泛蛋白連接酶(CRL)，其包含最大的泛蛋白連接酶家族(Petroski , M . D . & Deshaies , R . J . Function and regulation of cullin - RING ubiquitin ligases . Nature reviews 6 , 9 - 20 ( 2005 ) )。藉由使用各Cullin之顯性負性(DN)突變體，吾人發現Cul2及Cul5突變體升高BIK蛋白質之表現，而非BIK mRNA (圖1a)。因為Cul2及Cul5之DN突變體由於兩個CRL複合物共用延伸蛋白B/C次單元而為雜亂的，所以吾人進一步使用基因表現減弱方法來驗證Cul2及Cul5之作用。值得注意的是，BIK表現因兩個獨立的Cul5 shRNA而上調且此作用與基因表現減弱效率相關(圖1b)。然而，Cul2基因表現減弱不能升高BIK表現。此等發現支持CRL5對BIK調節之影響。CRL5複合物含有ROC2、Cul5、延伸蛋白B、延伸蛋白C及多種具有SOCS盒(SOCS box)之受質接附子之一(Lydeard , J . R ., Schulman , B . A . & Harper , J . W . Building and remodelling Cullin - RING E3 ubiquitin ligases . EMBO Rep 14 , 1050 - 1061 ( 2013 ) )。為了鑑定負責BIK調節之Cul5受質接附子，吾人使39個Cul5受質接附子中之每一者表現且藉由免疫沈澱測試其與內源性BIK之相互作用。此分析將ANKRD9、ASB11及ASB17鑑定為與BIK相互作用之蛋白質。其中，僅ASB11可以在活體內表現時加強BIK泛蛋白化。類似於BIK，ASB11為ER常駐蛋白26 。免疫沈澱分析證明內源性ASB11與內源性BIK在活體內之相互作用及經純化之ASB11與BIK之間在活體外的直接相互作用(圖1c、d)。此外，ASB11基因表現減弱會削弱BIK與Cul5之活體內相互作用。此等發現與ASB11在將BIK募集至CRL5複合物時之接附子作用一致。類似於其他Cul5受質接附子，ASB11具有用於結合Cul5及延伸蛋白B/C之SOCS盒。吾人發現，SOCS盒缺失消除了ASB11促進BIK泛蛋白化之能力(圖1e)。此外，在293T細胞及H1299細胞中，ASB11耗盡均會降低BIK泛蛋白化程度(圖1f)。在活體外泛蛋白化分析中，容易在補充有完全CRL5ASB11 複合物，包括ROC2、Cul5、延伸蛋白B、延伸蛋白C及ASB11之反應中偵測到BIK泛蛋白化(圖1g)。綜上所述，吾人之結果支持CRL5ASB11 為BIK之直接且生理上相關的泛蛋白連接酶。實例 2 ASB11 促進 BIK 蛋白酶體降解
接著，吾人確定CRL5ASB11 之BIK泛蛋白化結果。ASB11而非其SOCS盒缺失突變體之過度表現可降低BIK蛋白質含量(圖2a)。ASB11之此作用藉由用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞而逆轉(圖2b)。使用環己醯亞胺追蹤分析，吾人發現ASB11過度表現可增加BIK蛋白質降解(圖2c)。在交互組實驗中，293T及H1299細胞中之ASB11基因表現減弱均可升高BIK含量(圖2d)。此外，ASB11耗盡提高BIK蛋白質穩定性(圖2e)。此等發現指示，ASB11介導之BIK泛蛋白化促進其蛋白酶體降解。實例 3 ASB11 為 XBPls 之轉錄目標
BH3-only蛋白通常藉由各種細胞應激信號來調節。吾人研究ASB11介導之BIK泛蛋白化是否可在細胞應激條件下調節。值得注意的是，可抑制糖基化以引起ER應激之衣黴素在多種細胞系統中上調ASB11 mRNA之表現，該等細胞系統包括293T、MDA-MB157及MDA-MB468細胞(圖3a)。藉由另一ER應激子：鈣泵抑制劑毒胡蘿蔔素，觀察到ASB11 mRNA之類似上調(圖3a)。為了剖析ER應激誘導ASB11之分子機制，吾人確定了三個UPR分支中的哪一個負責此作用。藉由耗盡XBP1來阻斷IRE1/XBP1主軸時，大幅遏制了衣黴素誘導之ASB11 mRNA表現，而減弱ATF6或PERK基因表現時則顯示相反作用(圖3b)。回應ER應激，XBP1 mRNA經過IRE1a依賴性非常規剪接，以產生XPB1s ，其蛋白質產物具有轉錄因子功能。因此，吾人開始測試ASB11 是否為XBPls之轉錄目標。XBPls之過度表現大幅增加ASB11 mRNA含量及由ASB11 基因之5'調節區之2 kb區段驅動的螢光素酶報導子之活性(圖3c至e)。由四對引子之染色質免疫沈澱(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析顯示，經衣黴素處理之細胞中之內源性XBPls被特異性募集至ASB11 基因之轉錄起始位點附近的區域(-86至-304) (圖3f)。然而，在此區域中沒有發現真正的XBPls結合基元，諸如UPRE、ERSE、ERSE-II及AGCT核心。吾人改為鑑定‑148至-155之位置中之NF-Y結合基元。因為先前的報導暗示了XBP1對NF-Y結合基元之作用，所以吾人測試其重要性。因此，此基元之缺失消除了XBP1s誘導之ASB11 啟動子活性(圖3g)，表示這兩種轉錄因子在ASB11 轉錄中之合作功能。根據此觀點，免疫沈澱分析證明內源性XBP1s與NF-Y複合物組分中之每一者，NF-YA、NF-YB及NF-YC的相互作用(圖3h)。此外，在經衣黴素處理之細胞中，NF-YB或NF-YC之耗盡不僅消除了ER應激或XBP1x誘導之ASB11 啟動子活性，而且完全阻斷了XBPls與ASB11 啟動子之結合(圖3i至k)。因此，XBPls經由NF-Y募集至ASB11 啟動子且此募集對於在ER應激下活化ASB11 轉錄至關重要。實例 4 ER 應激經由 ASB11 及 p97 / VCP 之作用促進 BIK 降解
與ER應激下升高之ASB11 轉錄一致，衣黴素及毒胡蘿蔔素在多個細胞株中亦升高ASBll蛋白質表現且降低BIK蛋白質含量(圖4a)。衣黴素亦增加內源性BIK之泛蛋白化及轉換(圖4b、c)。為了證實ER應激條件下降低之BIK含量係因為ASB11上調，吾人檢查ASB11基因表現減弱之細胞。實際上，在包括293T、H1299及MDA-MB157細胞在內的多個細胞株中，ASB11基因表現減弱均消除衣黴素誘導之BIK下調(圖4d)。此外，由衣黴素刺激之BIK泛蛋白化及蛋白酶體降解均因ASB11基因表現減弱而發生逆轉(圖4e至f)。與XBP1在ER應激期間在ASB11誘導中之重要作用一致，XBP1基因表現減弱亦阻斷衣黴素誘導之BIK下調及BIK泛蛋白化。吾人之研究因此鑑定ER應激在經由XBP1誘導之ASB11上調來促進BIK泛蛋白化及降解中之作用。
BIK為ER常駐跨膜蛋白。吾人預期，從ER膜提取泛蛋白化之BIK對於後續蛋白酶體降解至關重要。AAA+ ATP酶p97，亦稱為含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein)，負責從細胞器膜分離出大量泛蛋白化之蛋白質以便於其蛋白酶體降解。此外，p97與其輔因子Ufd1-Npl4雜二聚體一起在ER常駐蛋白在ER應激下之降解方面起關鍵作用，該降解為被稱作ER相關降解(ER-associated degradation，ERAD)之過程。因此，吾人確定了p97-Ufd1-Npl4複合物在ER應激誘導之BIK降解中之功能。值得注意的是，投與p97抑制劑CB-5083可消除由ER應激或ASB11過度表現誘導之BIK下調(圖4g)。Ufd1或Npl4耗盡亦阻止ER應激誘導之BIK降解(圖4h、i)。此外，免疫沈澱分析揭示p97與泛蛋白化之BIK的相互作用且此相互作用藉由衣黴素處理而增加(圖4k)。此等發現支持p97-Ufd1-Npl4複合物在控制泛蛋白化之BIK在ER應激條件下之蛋白酶體降解中的作用。 實例5  DNA損傷藉由遏制XBP1/ASB11軸而誘導p53依賴性BIK穩定化。
與ER應激條件形成鮮明對比的是，諸如小紅莓及5-氟尿嘧啶(5-FU)之遺傳毒物降低了p53功能正常HCT116細胞中之ASB11 mRNA含量，但沒有降低其p53缺陷型對應物(圖5a)。類似地，小紅莓下調經p53轉染之H1299細胞中而非親本p53缺陷型H1299細胞中之ASB11 mRNA。與此等發現一致，小紅莓及5-FU以p53依賴性方式下調ASB11蛋白質且上調BIK蛋白質含量(圖5b)。為了確定蛋白質穩定性是否歸因於DNA損傷條件下增加的BIK含量，吾人使用環己醯亞胺追蹤分析評估了BIK蛋白質降解。在p53功能正常HCT116細胞中，BIK蛋白質穩定性在5-FU處理後增加(圖5c，上圖)。然而，在ASB11耗盡之HCT116細胞中，BIK容易穩定且DNA損傷幾乎不誘導BIK穩定性的進一步增加(圖5c，第二圖)。此等發現揭示DNA損傷誘導且p53依賴性ASB11下調，導致BIK穩定。
接下來，吾人試圖弄清楚DNA損傷降低ASB11表現之潛在機制。因為此作用為p53依賴性的，所以吾人測試p53是否調節ASB11 轉錄。與此觀點一致，ASB11 mRNA表現在p53功能正常HCT116細胞中低於其p53缺陷型對應物。此外，H1299細胞中之p53過度表現降低了ASB11 mRNA含量及啟動子活性(補充圖4c、d)。然而，吾人推斷p53可能不直接作用於ASB11 啟動子，因為之前的綜合分析表明p53之轉錄抑制作用主要由間接機制介導。值得注意的是，據報導，p53即使在無應激條件下亦能抑制IRE1/XBP1路徑。一致地，吾人證實小紅莓及5-FU經由p53依賴性方式降低IRE1a含量及XBP1 mRNA剪接(圖5d)。為了提供p53依賴性IRE1/XBP1下調與ASB11下調的因果關係，吾人藉由過度表現來拯救XBP1s含量。實際上，在經小紅莓處理之細胞中，XBP1s過度表現恢復了ASB11 mRNA表現及BIK泛蛋白化(圖5e、f)。綜上所述，此等資料表明，DNA損傷誘導之p53抑制IRE1/XBP1軸，導致ASB11下調及BIK穩定化。 實例6  ER應激及DNA損傷對ASB11依賴性BIK泛蛋白化之相反調節控制生-死細胞命運
已經證明ER應激及DNA損傷相反地調節ASB11 轉錄及BIK蛋白質穩定性，吾人接下來確定此等BIK調節對細胞生-死決策之影響。首先，吾人藉由強制表現ASB11來探討DNA損傷誘導之ASB11下調及BIK穩定對細胞凋亡的影響。重要的是，ASB11而非其SOCS盒缺失突變體之表現減弱經小紅莓處理之細胞中之凋亡性死亡(圖6a)。ASB11過度表現亦減少DNA損傷誘導活性凋亡蛋白酶3及PARP之裂解形式(圖6b)。為了證實ASB11之此等抗細胞凋亡作用係由BIK降解介導的，吾人拯救ASB11過度表現細胞中之BIK表現。實際上，BIK過度表現完全逆轉了ASB11過度表現對DNA損傷誘導之細胞凋亡、凋亡蛋白酶3活化及PARP裂解的抑制作用(圖6c、d)。此等資料支持DNA損傷誘導之ASB11下調及BIK穩定部分地促成了DNA損傷反應之細胞凋亡範例。
相比於DNA損傷，ER應激上調ASB11以誘導BIK不穩定。因此，吾人研究ASB11/BIK軸之此調節是否可以對細胞凋亡起保護作用。實際上，在接受衣黴素後之較早時間點，雖然對照細胞不顯示細胞凋亡誘導的跡象，但ASB11耗盡之細胞在細胞凋亡、凋亡蛋白酶3活化及PARP裂解方面表現出顯著的升高。重要的是，ASB11基因表現減弱之此等作用均被BIK基因表現減弱逆轉(圖6e、f)。此等發現表明，ER應激誘導及ASB11介導之BIK降解起促存活作用，有助於UPR之適應期。為了進一步證實ER應激下ASB11依賴性BIK泛蛋白化對細胞生-死命運之影響，吾人試圖產生BIK之ASB11抗性突變體。BIK含有兩個Lys殘基(亦即，Lys115及Lys160)。用Arg置換兩個殘基(2KR突變體)可完全消除ASB11依賴性BIK泛蛋白化及降解。因此，吾人使293T細胞中之野生型BIK及BIK 2KR突變體表現。值得注意的是，吾人選擇適當劑量的兩個構築體，使得野生型及突變型BIK蛋白質在無應激條件下之表現量類似(圖6g)。相比於野生型BIK，BIK (2KR)之表現不受衣黴素影響，與此蛋白質之ASB11抗性特性一致。因此，相比於表現野生型BIK之細胞，表現BIK (2KR)之細胞中衣黴素誘導之凋亡蛋白酶3活化、PARP裂解及細胞凋亡均增強(圖6h、i)。此等發現支持：ASB11誘導之BIK不穩定可避免細胞發生ER應激誘導之細胞凋亡。 實例7  靶向ASB11依賴性BIK降解路徑可增強BIKDD之抗腫瘤作用
BIKDD，其中Thr33及Ser35殘基經Asp殘基置換以模擬其磷酸化形式，對促存活的Bcl-2家族蛋白質具有較高的親和力且因此代表BIK之活性突變體。因為其強效促凋亡活性，所以已證明BIKDD之腫瘤選擇性表現為若干臨床前模型中之有效的抗腫瘤策略且甚至可以消除腫瘤誘發細胞。然而，BIKDD之不穩定特徵是一種限制。因為BIKDD亦經歷ASB11依賴性及衣黴素誘導之泛蛋白化及降解，所以吾人推斷，靶向此BIKDD降解路徑將增強其穩定性及抗腫瘤功效。抑制ASB11依賴性BIKDD降解之一種方式為投與IRE1α抑制劑。關於癌症類型，吾人出於兩個原因專注於三陰性乳癌(TNBC)。第一，TNBC為具有有限的治療選項之高度侵襲性疾病。第二，BIKDD因為IRE/XBP1軸之頻繁上調而特別容易在TNBC中降解，從而使其穩定化成為重要問題。吾人證明，IRE1α抑制劑STF-083010升高多個TNBC細胞株中之BIKDD含量，該等細胞株包括Hs578T、MDA-MB157及MDA-MB468。因此，STF-083010與BIKDD協同作用於殺傷此等TNBC細胞(圖7a)。經裂解之PARP之含量的增加進一步支持組合治療之增加的細胞凋亡作用(圖7b)。藉由組合投與另一IRE1α抑制劑4u8C亦增強BIKDD對TNBC細胞之殺傷作用。除了利用CMV-BIKDD之外，吾人亦測試IRE1α抑制劑與VISA-BIKDD一起之組合作用，VISA-BIKDD允許BIKDD在乳癌細胞中選擇性表現。重要的是，藉由共投與VISA-BIKDD及STF-083010可觀察到協同殺傷作用(圖7c)。因此，吾人之資料支持組合施加BIKDD及IRE1α抑制劑來治療TNBC之有益作用。
接下來，吾人使用活體內模型評估此類組合治療策略之抗腫瘤活性。為此目的，將表現BIKDD或載體對照之Hs578T細胞正位移植至裸小鼠之乳腺脂肪墊，隨後投與STF-083010 (詳情參見材料及方法)。雖然BIKDD或STF-083010單獨投與可引起腫瘤生長適當減少，但是組合治療極大地抑制腫瘤生長(圖7d)。為了改善治療可行性，吾人採用先前建立的基因療法方案，經由脂質體輔助遞送VISA-BIKDD36 ，且將此基因療法方法與STF-083010投與相組合來治療攜帶源自Hs578T細胞之正位乳房腫瘤之裸小鼠。藉由此模型，吾人再次觀察到藉由組合投與BIKDD及STF-083010達成之抗腫瘤作用的顯著增強，相比於單獨用BIKDD處理而言(圖7e)。重要的是，在任一模型中，小鼠體重無變化，表明沒有毒性。此等發現表明，靶向ASB11依賴性BIK降解路徑可用於增強基於BIKDD之基因療法的抗腫瘤功效。
圖1。Cul5ASB11 靶向BIK進行泛蛋白化。(a、b)經指定Cullin顯性負性(dominant negative，DN)突變體短暫性轉染(a)或經攜帶指定shRNA的慢病毒轉導(b)的293T細胞中內源性BIK表現之西方墨點(Western blot)分析。(c) 293T細胞中內源性ASB11與內源性BIK之間的相互作用之免疫沈澱分析。(d) ASB11與BIK之活體外相互作用。對結合在抗Myc珠粒上之經純化之ASB11進行培育，且BIK分別藉由抗Flag珠粒純化且從抗Flag珠粒溶離。藉由西方墨點法分析所結合之蛋白質。(e)經指定構築體轉染之293T細胞中BIK泛蛋白化之分析。經泛蛋白化之蛋白質在變性條件下被Ni-NTA瓊脂糖下拉且藉由西方墨點法分析。(f)穩定地表現對照或ASB11 shRNA且經指定構築體轉染之293T細胞中BIK泛蛋白化之分析。ASB11 shRNA之基因表現減弱(knockdown)效率顯示於圖2d中。(g) BIK之活體外泛蛋白化分析。將從293T細胞純化之Flag-BIK與從經轉染細胞純化之E1、E2、His-泛蛋白及/或基於ASB11之Cul5複合物一起培育。輸入E3連接酶複合物之完整性顯示在右側。
圖2。ASB11促進BIK蛋白酶體降解。(a)經指定ASB11構築體轉染之293T細胞中內源性BIK之西方墨點分析。(b、c)經ASB11轉染且經指定試劑處理之293T細胞中BIK含量之西方墨點分析。(d)穩定地表現對照或ASB11 shRNA之指定細胞中BIK含量的西方墨點分析。(e)如在(d)中在指定時間點經環己醯亞胺處理之293T衍生物中BIK之西方墨點分析。
圖3。ER應激經由XBP1誘導ASB11 轉錄。(a、b)經衣黴素或毒胡蘿蔔素處理16小時之293T細胞(a)或穩定地表現對照或XBP1 shRNA之293T細胞(b)中ASB11 mRNA含量之RT-qPCR分析。(c)經對照載體或XBP1s轉染之293T細胞中ASB11 mRNA表現之RT-qPCR分析。(d)此研究中所用之ASB11 基因之5'-調節區、螢光素酶報導子(reporter)及ChIP引子之示意性圖示。(e、g)經對照或XBP1s表現構築體以及指定報導子構築體轉染之293T細胞的螢光素酶報導子分析。(f、k)經10 μg/ml衣黴素處理16小時，使用對照IgG或XBP1s抗體進行免疫沈澱及使用指定引子組進行qPCR的293T細胞(f)或293T衍生物(k)中之qChIP分析。(h)經10 μg/ml衣黴素處理4小時之293T細胞中內源性XBP1s與各NF-Y複合物組分之間的相互作用之免疫沈澱分析。(i、j)穩定地表現指定shRNA且經指定構築體轉染或經10 μg/ml衣黴素處理16小時之293T細胞的螢光素酶報導子分析。指定shRNA之基因表現減弱效率顯示在右側。(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)、(i)、(j)及(k)中之數據為平均值±s.d.，n=3。P 值藉由t檢定(a、b右圖、c、e)或單因子變異數分析(1-way ANOVA)與塔基事後檢定(Tukey's post test) (b左圖、f、g、i、j、k)來確定。**P ＜0.01；***P ＜0.001。
圖4。ER應激經由ASB11及p97刺激BIK泛蛋白化及降解。(a)經10 μg/ml衣黴素或200 nM毒胡蘿蔔素處理16小時之293T細胞中BIK及ASB11含量之西方墨點分析。(b)經10 μg/ml衣黴素處理12小時且隨後經50 μg/ml環己醯亞胺處理指定時間段的293T細胞中BIK含量之西方墨點分析。BIK之相對量指示在底部。(c、e)如圖2d (e)中經指定構築體轉染且經衣黴素處理之293T細胞(c)或293T衍生物中內源性(c)或外源性(e) BIK泛蛋白化的分析。(d)如圖2d中經10 μg/ml衣黴素處理16小時之293T衍生物的西方墨點分析。(f)經10 μg/ml衣黴素及MG132共同處理16小時之293T衍生物中BIK含量之西方墨點分析。(g)經衣黴素及10 μM CB-5083共同處理16小時之293T細胞中BIK表現之西方墨點分析。(h、i)穩定地表現指定shRNA且經10 μg/ml衣黴素處理16小時之293T細胞中BIK表現之西方墨點分析。各shRNA之基因表現減弱效率顯示在右側。(j)經10 μg/ml衣黴素處理16小時之293T細胞中p97與泛蛋白化BIK之相互作用的免疫沈澱分析。
圖5。DNA損傷誘導之p53遏制XBP1及ASB11，以穩定BIK。(a)經指定劑量之小紅莓或5-FU處理24小時之指定HCT116細胞中ASB11 mRNA表現之RT-qPCR分析。數據為平均值±s.d.，根據t檢定，*P ＜0.05，***P ＜0.001，n=3。(b)如(a)中處理之指定HCT116細胞中BIK及ASB11表現之西方墨點分析。(c)穩定地表現對照或ASB11 shRNA之HCT116 p53+/+ 細胞經10 μM 5-FU處理24小時，且隨後在指定時間點經環己醯亞胺處理。細胞溶解以進行BIK表現之西方墨點分析且BIK之相對量指示在底部。穩定細胞株中之ASB11及BIK之表現量顯示在下圖。(d)經3 μg/ml小紅莓或10 μM 5-FU處理24小時之指定HCT116細胞中IRE1α表現之西方墨點分析及XBP1 mRNA剪接之RT-qPCR分析。(e)經XBP1s轉染及/或經3 μg/ml小紅莓處理16小時之HCT116細胞中ASB11 及XBPls mRNA表現之RT-qPCR分析。數據為平均值±s.d.，根據t檢定，***P ＜0.001，n=3。(f)經指定構築體轉染及/或經3 μg/ml小紅莓處理16小時之HCT116細胞中BIK泛蛋白化之分析。
圖6。ASB11介導之BIK泛蛋白化之調節在ER應激及DNA損傷下影響細胞生-死決策。(a、b)穩定地表現指定ASB11構築體且經3 μg/ml小紅莓處理24小時之HCT116 p53+/+ 細胞中細胞凋亡之ELISA分析(a)及活性凋亡蛋白酶(caspase) 3及經裂解之PARP之西方墨點分析(b)。(c、d)經ASB11及/或BIK短暫性轉染且經3 μg/ml小紅莓處理24小時之HCT116 p53+/+ 細胞中細胞凋亡之ELISA分析(c)及活性凋亡蛋白酶3及經裂解之PARP之西方墨點分析(d)。(e、f)穩定地表現指定shRNA且經10 μg/ml衣黴素處理12小時之293T細胞中細胞凋亡之ELISA分析(e)及活性凋亡蛋白酶3及經裂解之PARP的西方墨點分析(f)。各種shRNA之基因表現減弱效率顯示在底部。(g)經指定BIK構築體短暫性轉染且經10 μg/ml衣黴素處理24小時之293T細胞中BIK含量之西方墨點分析。顯示未經處理之細胞中BIK及BIK(2KR)之相等表現(藉由調整轉染所用質體之量)。(h、i)使用與(g)中相同的條件轉染且經10 μg/ml衣黴素處理16小時之293T細胞中凋亡細胞之ELISA分析(h)及活性凋亡蛋白酶3及經裂解之PARP的西方墨點分析(i)。(a)、(c)、(e)、(h)中之數據為平均值±s.d.，根據單因子變異數分析與塔基事後檢定，***P ＜0.001，n=3。(b)及(d)中之星號表示非特異性條帶。
圖7。IRE1α抑制劑增強BIKDD之腫瘤殺傷作用(tumor-killing effect)。(a、c)經0.5 mg CMV-BIKDD (a)或VISA-BIKDD (c)轉染且經10或100 μM STF-083010處理48小時之指定TNBC細胞之活力的MTT分析。底部為指定CI值。(b)經CMV-BIKDD轉染且經100 μM STF-083010處理36小時之指定TNBC細胞中經裂解之PARP的西方墨點分析。(d)小鼠原位植入攜帶BIKDD或對照載體之Hs578T細胞且經STF-083010或DMSO處理(參見材料及方法)。在指定的日子量測腫瘤體積且作圖。數據為平均值±s.d.，根據雙因子變異數分析與塔基事後檢定，*P ＜0.05；***P ＜0.001，n=5。在第49天以手術方式移除腫瘤且其大小顯示在右側。(e)在腫瘤細胞植入後第28天開始，小鼠原位植入Hs578T細胞且經VISA-BIKDD脂質奈米粒子以及STF-083010或DMSO處理(參見材料及方法)。在指定的日子量測腫瘤體積且作圖。數據為平均值±s.d.，根據雙因子變異數分析與塔基事後檢定，***P ＜0.001，n=5。在第66天以手術方式移除腫瘤且其大小顯示在右側。

Claims (24)

  1. 一種BIKDD蛋白質的用途，其係用於製備預防及/或治療癌症的藥物，其中該BIKDD蛋白質與抑制ASB11依賴性BIKDD降解之抑制劑併用。
  2. 如請求項1之用途，其中使用CRL5ASB11作為靶向BIK之泛蛋白連接酶，用於泛蛋白化及降解蛋白酶體。
  3. 如請求項1之用途，其中該ASB11增強BIK泛蛋白化。
  4. 如請求項1之用途，其中抑制ASB11會降低BIK泛蛋白化程度。
  5. 如請求項1之用途，其中ASB11之過度表現降低BIK蛋白質含量且增加BIK蛋白質降解。
  6. 如請求項1之用途，其中該ASB11藉由XBP1轉錄活化。
  7. 如請求項6之用途，其中該XBP1為IRE1α之效應物(effector)。
  8. 如請求項1之用途，其中該ASB11之表現藉由衣黴素(tunicamycin)或鈣泵抑制劑上調。
  9. 如請求項8之用途，其中該鈣泵抑制劑為毒胡蘿蔔素(thapsigargin)。
  10. 如請求項1之用途，其中ER應激可經由XBP1誘導之ASB11上調而促進BIK泛蛋白化及降解。
  11. 如請求項1之用途，其中遺傳毒物經由p53起作用，下調IRE1α及ASB11，從而穩定BIK。
  12. 如請求項11之用途，其中該等遺傳毒物為小紅莓(doxorubicin)及5-氟尿嘧啶。
  13. 如請求項1之用途，其中該抑制劑為IRE1α抑制劑。
  14. 一種IRE1α抑制劑的用途，其係用於製備預防及/或治療個體之癌症的藥物，其中該治療包含BIK基因療法繼而投與該藥物之組合療法，其中該BIK基因療法為遞送BIK脂質奈米粒子，且其中該IRE1α抑制劑抑制ASB11依賴性BIK降解。
  15. 如請求項14之用途，其中該BIK脂質奈米粒子為BIKDD蛋白質、C-VISA BIKDD：脂質體或SV-BIKDD。
  16. 如請求項14之用途，其中該IRE1α抑制劑為7-羥基-4-甲基-2-側氧基-2H-1-苯并哌喃-8-甲醛(4μ8C，IRE1抑制劑I(N-[(2-羥基-1-萘基)亞甲基]- 2-噻吩磺醯胺；STF-083010)、3-乙氧基-5,6-二溴柳醛或(R)-2-(3,4-二氯苄基)-N-(4-甲苄基)-2,7-二氮雜螺[4.5]癸烷-7-甲醯胺(GSK2850163)。
  17. 如請求項1或14之用途，其中該癌症為神經母細胞瘤；肺癌；膽管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；頭頸部鱗狀細胞癌；鱗狀細胞子宮頸癌；淋巴瘤；鼻咽癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；膽囊癌；攝護腺癌；乳癌(breast cancer)；睪丸生殖細胞腫瘤；結腸直腸癌；神經膠質瘤；甲狀腺癌；基底細胞癌；胃腸基質癌；肝母細胞瘤；子宮內膜癌；卵巢癌；胰臟癌；腎細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、慢性白血病、肉瘤、直腸癌、喉癌、黑素瘤、結腸癌、膀胱癌、肥胖細胞瘤、乳癌(mammary carcinoma)、乳腺癌、咽鱗狀細胞癌、睪丸癌、胃腸癌或胃癌或泌尿道上皮癌。
  18. 如請求項1或14之用途，其中該癌症為乳癌。
  19. 如請求項1或14之用途，其中該癌症為抗藥性癌症。
  20. 如請求項1或14之用途，其中該癌症為三陰性乳癌(TNBC)。
  21. 如請求項14之用途，其中該BIK基因療法係藉由投與BIK脂質奈米粒子以及針對IRE1α之抑制性RNA之組合來進行。
  22. 如請求項21之用途，其中該針對IRE1α之抑制性RNA為針對IRE1α之 干擾RNA、shRNA、siRNA、核糖核酸酶或反義寡核苷酸。
  23. 如請求項14之用途，其中該針對IRE1α之抑制性RNA係使用病毒載體遞送。
  24. 如請求項23之用途，其中該病毒載體為腺病毒載體。
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