TWI707133B

TWI707133B - 表面電漿影像化的方法及裝置

Info

Publication number: TWI707133B
Application number: TW108135950A
Authority: TW
Inventors: 魏培坤; 潘明陽; 李光立
Original assignee: 中央研究院
Priority date: 2018-10-04
Filing date: 2019-10-03
Publication date: 2020-10-11
Also published as: EP3861325A1; EP3861325A4; US20220011228A1; TW202035973A; WO2020072809A1

Abstract

本發明係提供一種表面電漿影像化的方法及裝置，其用於生物分子相互作用引起的表面電漿訊號之成像。更具體而言，本發明藉由比較兩段表面電漿頻域內的光強度，提供一種可以將表面電漿模態在頻域上微小的改變成像的方法及裝置。

Description

表面電漿影像化的方法及裝置

本發明係關於表面電漿共振訊號的測量，特別是關於一種將表面電漿模態在頻域上的微小改變加以成像的方法及裝置。

表面電漿感測系統通常用於檢測目標分子，目標生物分子與表面電漿感測器上的受體分子產生交互作用，改變表面折射率，這些改變可以藉由表面電漿共振模態的角度或頻率（波長）量測分析，通常是光強度對應角度上的波谷與光強度對應波長上的波谷位置，藉由即時偵測此訊號，可以將訊號隨時間的變化得到感測圖，並進一步去分析目標分子與受體的親和性。因為此量測方法具有高靈敏度、免標定的特性，表面電漿感測成為在生物檢測領域中熱門的方法之一。

然而隨著生物或藥物領域的發展，對高通量檢測的需求快速升高，例如生物標記探勘、臨床檢測與配體顯示，但高通量表面電漿系統卻發展受阻，因為整合影像系統與角度解析裝置或波長解析裝置是極其困難的。舉例來說，頻域靈敏檢測方法是使用一個寬頻光束照射表面電漿感測器，其反射光或穿透光被稜鏡或光柵分光，並由一維或二維光偵測器解析各頻域的強度，藉由追蹤光譜上的波谷或波峰可以判斷表面電漿訊號響應。角度靈敏檢測方法是使用一個單頻光源，由不同波長入射表面電漿感測器，並由一維或二維光偵測器解析各角度的強度，並藉由追蹤不同角度上光強度的波谷或波峰可以判斷表面電漿訊號響應。這些方法均只能量測表面電漿感測器上單一點的訊號，若需量測多點訊號，必須多增加一個位置掃描裝置，這不僅影響整個表面電漿系統的複雜度，且掃描所花費的時間也延遲了檢測的時間解析度，因此，一個表面電漿影像化的系統與方法相當受到期待。

第一個結合表面電漿感測與成像的系統於1987年由耶特曼（Yeatman）所發明，一個線掃描的聚焦光束被用於激發表面電漿波，藉由量測這些掃描區域的反射光光強度，一個2.5奈米厚的介電質薄膜透過照相機被成像。相隔一年後，羅登郝思樂（Rothenhäusler）演示了一種無需掃描的表面電漿成像顯微術，一個被擴束的雷射光用於激發表面電漿波，並直接由相機成像，折射率的改變會反映在影像中的強度，許多裝置皆是基於此方式實現，例如GWC科技公司的SPRimager®產品，取得美國專利US6,862,094B2的裝置、與取得中國專利CN104730038B的裝置。另一種表面電漿成像的方式是在系統裡加入掃描裝置，賓克伊法軒（Bengt Ivarsson）等人提出一種在表面電漿感測器上量測薄膜的方法（參見US6,493,097B1），兩個偵測器被使用用於偵測不同區域的表面電漿訊號。陸茲霍普（Lutz Hoppe）等人將自製的光罩用於表面電漿系統中（參見US6,570,657B1），入射光經過光罩投射於稜鏡表面電漿感測器上不同位置，用於提供多點表面電漿感測。卡斯登特施辣（Carsten Thirstrup）在US6,738,141B1專利中提出了一個完整的表面電漿成像系統，在此專利中，反射式繞射光學元件被用於產生線型光線，並聚焦至表面電漿感測器上的不同區域，藉此成像表面電漿影像。史蒂芬C.瑋柏（Stephen C. Weibel）提出了一個表面電漿影像裝置（參見US7,576,863B2），利用單頻光源照射表面電漿感測器，並使用雙鏡片掃描光線角度，藉由角度相關的表面電漿訊號來呈現表面電漿影像。除了角度和頻率的方法外，使用相位差方法也能將表面電漿訊號成像，陳顯禎等人在US2003/0219809A1提出了基於馬赫－曾德爾（Mach-Zehnder）干涉術的表面電漿影像裝置，在此專利中，s波被做為參考訊號，p波被用於探測折射率，藉由合併s波與p波，可呈現一個具有空間頻率的影像。

以上既有表面電漿成像技術可分為三類，波長/角度/位置掃描式、單頻光式、與干涉式，其中掃描式因掃描需花費額外時間，導致偵測時間解析度過差，不利於偵測高親和性的分子反應。單頻光式的偵測極限是利用光強度差異作為偵測手段，其偵測極限與角度或波長法相比較差，因為光強度較容易受到多種雜訊干擾，包含熱擾動與振動。干涉法提供了最佳的偵測極限，但光路系統較為複雜，需要非常穩定的光學環境，且偵測動態區間較窄，限縮了能量測的目標分子大小。

本文提出了一種不需色散元件的方法與相關裝置，用於表面電漿成像，此方法基於對比光譜，可用於任何表面電漿感測器上，例如異常穿透型、稜鏡型與局域性表面電漿共振型感測器，感測器在兩段不同光譜波段的影像被用於呈現表面電漿訊號影像，其主要優勢如下：（1）能用於量測異常穿透型、稜鏡型與局域性表面電漿共振型感測器，並提供表面電漿訊號影像；（2）色散元件和掃描機構為非必要裝置，因此，系統複雜度將更簡易，且數據取得的時間解析度也會提高；（3）藉由對比兩段光譜波段的影像，表面電漿訊號具有寬的動態範圍，適合用於生物分子感測；（4）藉由對比兩段光譜波段的影像，光強度雜訊會被減少，因此，偵測極限將被提升；（5）能建立於各成像系統上，像是掃描器、顯微鏡智慧型手機。

本發明係提出一種表面電漿影像化的裝置，其包括一表面電漿共振感測晶片、一成像模組以及一影像處理單元。表面電漿共振感測晶片具有一表面電漿共振波長；成像模組被配置以接收一第一波段電漿共振光束及一第二波段電漿共振光束，而分別對應產生一第一波段表面電漿影像訊號及一第二波段表面電漿影像訊號；影像處理單元與成像模組耦接，並接收第一波段表面電漿影像訊號及第二波段表面電漿影像訊號，藉此產生一表面電漿訊號影像。其中表面電漿共振波長小於第一波段電漿共振光束的最小波長且大於第二波段電漿共振光束的最大波長，第一波段電漿共振光束的最小波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且第二波段電漿共振光束的最大波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內。

在一實施例中，第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束同為反射光束或透射光束。

在一實施例中，表面電漿共振感測晶片的表面電漿共振波長係隨表面環境折射率而變化。

在一實施例中，表面電漿共振感測晶片具有一週期性金屬奈米結構。

在一實施例中，表面電漿共振感測晶片為一穿透型表面電漿共振感測晶片或一反射式表面電漿共振感測晶片。

在一實施例中，表面電漿訊號影像係由影像處理單元以下列公式計算而得：

在一實施例中，表面電漿影像化的裝置更包括：一光源模組，係發出一第一波段入射光束及一第二波段入射光束，表面電漿共振感測晶片被配置以接收第一波段入射光束及第二波段入射光束，而分別對應產生第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束。

在一實施例中，光源模組包括：一第一波段發光單元、一第二波段發光單元以及一切換單元。第一波段發光單元發出第一波段入射光束；第二波段發光單元發出第二波段入射光束；切換單元耦接第一波段發光單元及第二波段發光單元，藉此切換第一波段發光單元及第二波段發光單元。

在一實施例中，表面電漿影像化的裝置更包括：一光譜調變模組，包括一第一波段濾波片及一第二波段濾波片，光譜調變模組接收一寬頻光束而產生一第一波段入射光束及一第二波段入射光束，表面電漿共振感測晶片被配置以接收第一波段入射光束及第二波段入射光束，而分別對應產生第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束。

在一實施例中，光譜調變模組更包括：一切換單元，耦接第一波段濾波片及第二波段濾波片，藉此於寬頻光源至表面電漿共振感測晶片間的入射路徑中，切換單元會切換第一波段濾波片及第二波段濾波片。

在一實施例中，寬頻光束由一白光光源的寬頻光源產生。

在一實施例中，白光光源選自白光LED、鹵素燈、鎢燈、及氙燈所組成的群組。

在一實施例中，成像模組包括一成像單元及一透鏡，透鏡設置於表面電漿共振感測晶片與成像單元之間，第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束係經透鏡而投射於成像單元。

在一實施例中，表面電漿共振感測晶片被配置以接收一寬頻光束而產生一電漿共振光束；表面電漿影像化的裝置更包括：一光譜調變模組，包括一第一波段濾波片及一第二波段濾波片，光譜調變模組被配置以接收電漿共振光束而產生第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束；其中表面電漿共振感測晶片的表面電漿共振波長小於第一波段濾波片的最小截止波長且大於第二波段濾波片的最大截止波長，第一波段濾波片的最小截止波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且第二波段濾波片的最大截止波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內。

在一實施例中，光譜調變模組更包括：一切換單元，耦接第一波段濾波片及第二波段濾波片，藉此於表面電漿共振感測晶片至成像模組間的光路中，切換單元會切換第一波段濾波片及第二波段濾波片。

在一實施例中，光譜調變模組更包括：一分光模組，被配置以接收電漿共振光束而產生一第一分光光束及一第二分光光束，且第一波段濾波片係被配置以接收第一分光光束而產生第一波段電漿共振光束，而第二波段濾波片係被配置以接收第二分光光束而產生第二波段電漿共振光束。

在一實施例中，分光模組包括一分光器，被配置產生第一分光光束及第二分光光束。

在一實施例中，分光模組包括一分光器及一反射器，反射器設置於分光器與第一波段濾波片或第二波段濾波片之間。

在一實施例中，成像模組包括一成像單元及一透鏡，透鏡設置於第一波段濾波片及第二波段濾波片與成像單元之間，第一波段電漿共振光束及第二波段電漿共振光束係經透鏡而投射於成像單元。

在一實施例中，成像模組包括一第一成像次模組以及一第二成像次模組。第一成像次模組包括一第一透鏡及一第一成像單元，第一透鏡設置於第一波段濾波片與第一成像單元之間，第一波段電漿共振光束係經第一透鏡而投射於第一成像單元；第二成像次模組包括一第二透鏡及一第二成像單元，第二透鏡設置於第二波段濾波片與第二成像單元之間，第二波段電漿共振光束係經第二透鏡而投射於第二成像單元。

在一實施例中，電漿共振光束為一反射光束或一透射光束。

本發明亦提出一種表面電漿影像化的方法，包括以下步驟：（1）由一成像模組自一表面電漿共振感測晶片接收一第一波段電漿共振光束及一第二波段電漿共振光束，以分別對應產生一第一波段表面電漿影像訊號及一第二波段表面電漿影像訊號。其中，表面電漿共振感測晶片具有一表面電漿共振波長，而表面電漿共振波長小於第一波段電漿共振光束的最小波長且大於第二波段電漿共振光束的最大波長，第一波段電漿共振光束的最小波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且第二波段電漿共振光束的最大波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米以內。（2）由一影像處理單元接收第一波段表面電漿影像訊號及第二波段表面電漿影像訊號，藉此產生一表面電漿訊號影像。其中，影像處理單元係與成像模組耦接。

在一實施例中，第一波段電漿共振光束的最小波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米內。

在一實施例中，第第二波段電漿共振光束的最大波長與表面電漿共振波長的差異在10奈米內。

本發明提供了一種新的方法與相關裝置用於表面電漿成像。圖1介紹了本發明的方法的工作原理，一個具有表面電漿共振的金屬表面，在其穿透或反射光譜上擁有一個共振波峰或波谷，其波峰或波谷中心位置為λ _SPR（參考圖2）。上述的表面電漿感測器被一道光照射，此光束分別穿透了兩個被設計過穿透波長的色彩濾波片。上述的兩個色彩濾波片將上述的表面電漿感測器穿透波峰分為短波長部分與長波長部分。為判斷二維的表面電漿訊號，光束通過長波段濾波片成像者稱為長波段表面電漿影像（影像A _ij），i、j分別為x與y方向之對應畫素（pixel）。光束通過短波段濾波片成像者稱為短波段表面電漿影像（影像B _ij），經由運算後的影像即為表面電漿訊號影像。經過自定義的計算式：(A _ij-B _ij)/(A _ij+B _ij)，能得到一個自我參考的影像，算式中的A _ij與B _ij中代表在影像像素ij的光強度。此自我參考的計算方式通常用於一個雙感測器或四元位置感測器，用來感測光束位置。如果光線具有的雜訊，此算式可以被計算並簡化：

（1）因為A~B≫dI，所以大大降低雜訊對訊號影響。

本文使用數值方式評估此發明的動態區間。圖3（a）至圖3（d）示範了穿透波峰位置會隨折射率改變而位移的感測過程。圖3（a）顯示了藍位移的表面電漿光譜訊號，它代表了表面電漿感測器偵測到分子離解事件。做為對比；圖3（c）顯示了紅位移的表面電漿光譜訊號，它代表了表面電漿感測器偵測到分子結合事件。對比訊號定義為

。將與波長位移一同比較，因為波長位移法提供極為廣闊的動態區間，是大家所熟知的。圖3（b）和圖3（d）顯示了對比訊號和波長位移的相關曲線，紅位移和藍位移例子都與在-5奈米至+5奈米的波長位移範圍內呈現線性關係。此動態區間相當於折射率範圍-0.0106至+0.0106。換句話說，此方法適合用於大部分的生物分子交互作用。

如圖4A所示，為實現此方法，一個光學架設例包括一照明系統1、兩個窄波段濾波片22、24、感測單元3（包括有表面電漿共振感測晶片）與一單色成像裝置42被示範（如圖4A所示）。上述的感測單元3由流體裝置33與表面電漿感測器35所組成，上述的表面電漿感測器35可能為異常穿透型表面電漿感測器或局域性表面電漿共振型表面電漿感測器。惟本實施例係以表面電漿感測器35可能為異常穿透型表面電漿感測器為例進行說明。亦即，本實施例中雖以異常穿透型表面電漿感測器搭配量測穿透光做為示範，但仍可透過量測反射光達成目的，其架構將如後所述。上述的流體裝置33被用於注入待測物至表面電漿感測器35上。上述的異常穿透型表面電漿感測器35是由黃金覆蓋的奈米溝槽陣列組成。上述的兩個窄波段濾波片22、24皆具有窄頻頻寬（> 40奈米），其中之一帶寬濾波片的長波段邊界接近表面電漿感測器的表面電漿共振波長（λ _{long-boundary}－ λ _SPR≦3~5 nm），另一帶寬濾波片的短波段邊界接近表面電漿感測器的表面電漿共振波長（λ _SPR－ λ _{short-boundary}≦3~5 nm）。一個驅動裝置26被用於切換這些帶寬濾波片的位置。上述的照明系統1為鹵素燈泡、或發光二極體、或具有連續性波段的白光光源。上述的成像模組4為一單色成像裝置42。成像裝置42拍攝的影像中，光束通過長波段濾波片22成像者稱為長波段表面電漿影像，光束通過短波段濾波片24成像者稱為短波段表面電漿影像，經由下式運算後的影像即為表面電漿訊號影像：

圖4B展示圖4A所示架構的其中一種變體。其與圖4A所示架構大致相同，與圖4A所示架構不同之處在於，圖4B中的光譜調變模組2（包含線性偏振板28、及長波段濾波片22與短波段濾波片24）置於表面電漿感測器35與成像裝置（照相機）42之間。

圖5A展示實現本發明的一項替代架構，其與圖4A所示架構大致相同，與圖4A所示架構不同之處在於，在圖5A所示的光學架構中，長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像分別由兩個單色成像裝置（照相機）42、42’所拍攝。為實現此方法，一個50比50的光束分光器（21000，Chroma）被用於分割光束，兩個帶寬濾波片22、24（ET640/20m與ZET660/20x，Chroma）分別被置於兩個成像裝置（照相機）42、42’前。藉由此架構，長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像可以同時被拍攝，且不需要額外的時間來切換兩個帶寬濾波片，因此時間解析度將會提升。

圖5B展示圖5A所示架構的其中一種變體。其與圖5A所示架構大致相同，與圖5A所示架構不同之處在於，圖5B中係採用稜鏡式表面電漿感測器35’來替代原本圖5A中的異常穿透型表面電漿感測器35。

圖6A展示實現本發明的另一項替代架構，其與圖5A所示架構大致相同，與圖5A所示架構不同之處在於，在圖5A所示的實施例裡，長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像分別由同一個成像裝置（照相機）42所拍攝。為實現此方法，一個內建50比50的光束分光器（21000，Chroma）與兩個帶寬濾波片22、24（ET640/20m與ZET660/20x，Chroma）的影像分割裝置5（A12801，Hamamatsu）被用於分割影像，並由同一個成像裝置（照相機）42成像。藉由此架構，長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像可以同時被同一台相機所拍攝在不同畫素區域，且不需要額外的時間來切換兩個帶寬濾波片22、24，因此時間解析度將會提升。

圖6B展示圖6A所示架構的其中一種變體。其與圖6A所示架構大致相同，與圖6A所示架構不同之處在於，圖6B中係採用稜鏡式表面電漿感測器35’來替代原本圖6A中的異常穿透型表面電漿感測器35。

圖7A展示實現此發明用於稜鏡式表面電漿感測器35’的架構，在此實施例中，光源入射稜鏡式表面電漿感測器35’，再藉由其反射光成像於成像裝置（照相機）42上，其光譜調變模組2（包括線性偏振板28、及長波段濾波片22與短波段濾波片24）置於寬頻光源13與稜鏡式表面電漿感測器35’之間。使用光譜調變模組2中的驅動裝置26使光線通過長波段濾波片22、拍攝長波段表面電漿影像；再使用光譜調變模組2中的驅動裝置26使光線通過短波段濾波片24、拍攝短波段表面電漿影像，最後計算出表面電漿訊號影像。

但是，光譜調變模組2（包括線性偏振板28、及長波段濾波片22與短波段濾波片24）不限於置於如圖7A所示的位置，其也可置於表面電漿感測器35與成像裝置（照相機）42之間。如圖7B所示，其為圖7A所示架構的其中一種變體。其與圖7A所示架構大致相同，與圖7A所示架構不同之處在於，圖7B中的光譜調變模組2（包括線性偏振板28、及長波段濾波片22與短波段濾波片24）置於稜鏡式表面電漿感測器35’與成像裝置（照相機）42之間。

此外，本發明亦提供一種表面電漿影像化的置，如圖13所示，包括一光源模組6、一感測單元3（包括有表面電漿共振感測晶片）、一成像模組4、以及一影像處理單元。其架構大致與圖4A所示架構相同，其不同之處在於，在圖13所示的實施例中，係採用具有發出兩個不同波段入射光束的光源模組來代替圖4A的寬頻光源和光譜調變模組2。在圖13所示的光源模組包括有第一波段發光次模組單元61以及第二波段發光次模組單元62。第一波段發光次模組單元61包括第一波段發光單元611、第一透鏡612及第一線性偏振片613。第一波段發光單元611係發出第一波段入射光束，並依序經過第一透鏡612及第一線性偏振片613，而入射至表面電漿感測器（表面電漿共振感測晶片）35。類似地，第二波段發光次模組單元62包括第二波段發光單元621、第二透鏡622及第二線性偏振片623。第二波段發光單元621係發出第二波段入射光束，並依序經過第二透鏡622及第二線性偏振片623，而入射至表面電漿共振感測晶片。惟本實施例係以表面電漿感測器可能為異常穿透型表面電漿感測器為例進行說明。亦即，本實施例中雖以異常穿透型表面電漿感測器搭配量測穿透光做為示範，但仍可透過量測反射光達成目的，其架構將如後所述。上述的流體裝置33被用於注入待測物至表面電漿感測器35上。上述的異常穿透型表面電漿感測器35是由黃金覆蓋的奈米溝槽陣列組成。上述的兩個入射光束（第一波段入射光束及第二波段入射光束）皆具有窄頻頻寬（> 40奈米），其中第二波段入射光束的長波段邊界接近表面電漿感測器的共振波長（λ _{long-boundary}－ λ _SPR≦3~5 nm），第一波段入射光束的短波段邊界接近表面電漿感測器的表面電漿共振波長（λ _SPR－ λ _{short-boundary}≦3~5 nm）。一個驅動裝置26被用於切換第一波段發光次模組單元61與第二波段發光次模組單元62的位置。上述的成像系統為一單色成像裝置42。成像裝置42拍攝的影像中，以長波段光束（第一波段入射光束）成像者稱為長波段表面電漿影像，以短波段光束（第二波段入射光束）成像者稱為短波段表面電漿影像，經由下式運算後的影像即為表面電漿訊號影像：

圖13B展示圖13A所示架構的其中一種變體。其與圖13A所示架構大致相同，與圖13A所示架構不同之處在於，圖13B中係採用稜鏡式表面電漿感測器35’來替代原本圖13A中的異常穿透型表面電漿感測器35。

圖8（a）是基於此發明的其中一種掃描器裝置示意圖與奈米結構電漿子生物晶片影像。圖8（b）及圖8（c）分別是應用於具有窄共振波峰及窄共振波谷的穿透式電漿子晶片的紅、綠、藍三色段分析法解說示意圖。穿透式掃描器的白光LED燈源可以被區分為紅、綠、藍三個色段，而金屬奈米結構的共振波峰或波谷可以被調整並出現在紅綠或者藍綠兩個色段的交疊區。對於共振波峰而言，當波峰因環境的折射率增加而產生紅位移，此移動會造成紅色段穿透光強度（A _R）的增加及綠色段的穿透強度（B _G）的減少。反之，對共振波谷而言，波谷的移動會造成紅色段穿透光的減少及綠色段的穿透強度增加。而共振波峰及共振波谷在紅綠兩色段的自定義計算式可分別表示為

=(A _G-B _R)/(A _G+B _R)及

=(A _R-B _G)/(A _R+B _G)，其可以去除共同的雜訊並增強感測能力。

實驗例一

使用如圖4A、圖4B的裝置，不同光譜影像可以被同一個相機所拍攝，表面電漿訊號影像也可以被計算。在此架構中，一個穩定強度的鹵素燈源被用於產生寬頻光源，兩個帶寬濾波片（ET640/20m與ZET660/20x，Chroma）被鑲於電控旋轉座中，將用於光波切換。金屬覆蓋的奈米溝槽陣列結構被作於表面電漿感測器，此奈米溝槽陣列結構的週期被設計為470奈米，以在水中表面電漿共振的波長為650奈米。此表面電漿感測器置於顯微鏡的觀測物平台上以成像。一個互補式單色金屬氧化物半導體的相機（C11440，Hamamatsu）用於拍攝表面電漿感測器的影像。圖9的上/下排影像分別代表注入高折射率溶液前與後的表面電漿感測器的穿透影像，比較長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像在注入前/後的強度差異，並沒有顯著變化，但表面電漿訊號影像在流道區域能清楚的顯示有明顯訊號。

實驗例二

檢測極限是表面電漿感測器的一項重要指標，在此實施例中，將使用如圖4A、圖4B的裝置測試此本案的偵測極限，並與標準的波長位移分析方法做比較。使用本案裝置與方法的測試中，一種黃金覆蓋奈米溝槽陣列組成的結構被當作表面電漿感測器使用，表面電漿感測器中的奈米溝槽陣列結構的週期被設計為470奈米，此表面電漿感測器置於顯微鏡的觀測物平台上以成像，一個互補式單色金屬氧化物半導體（CMOS）的相機（C11440，Hamamatsu）用於拍攝表面電漿感測器的影像，利用微流道裝置依序通入不同比例、且已知折射率的糖水，藉由分析感測曲線的變化量與穩定度，能得到靈敏度與感測極限。標準的波長位移分析方法是使用單點量測方式，以一個聚焦的光點照射於相同的表面電漿感測器上，及週期被設計為470奈米的奈米溝槽陣列結構，利用微流道裝置依序通入不同比例、已知折射率、與前述本案裝置與方法測試中完全相同的糖水，並由光纖收集穿透光，傳導至光譜儀讀取光譜訊號，並藉由觀測光譜波峰的波長位移量分析靈敏度與偵測極限。靈敏度定義為每單位折射率變化造成的表面電漿訊號變化量，其感測極限定義為該系統能解析的最小折射率變化量。圖10左上圖顯示了標準的波長位移分析裝置與方法量測到的感測曲線，圖10右上圖顯示了本案裝置與方法量測到的感測曲線，兩張圖可明顯見到當量測物的折射率從n ₀= 1.3290依續升高至n ₅= 1.3355時，波長與表面電漿變化訊號也隨之提高；當折射率從n ₅= 1.3355回歸n ₀= 1.3290時，波長與表面電漿變化訊號也回歸基準線，比較兩者訊號可以看出，本案除可以形成表面電漿共振影像外，其由於為自我參考訊號，可以降低雜訊影響，比起一般常用的共振波峰值變化具有較好的訊噪比表現。進一步利用線性回歸方法分析感測曲線，如圖10左下圖，可得出波峰波長與折射率的關係式為

（refractive index unit：折射率單位），其中346.42185即為標準的波長位移分析方法的偵測靈敏度，系統穩定度則可從量測相同折射率糖水其持續時間下的波峰波長訊號分析出。該實施例中，n ₀量測區間分析得到的波峰波長訊號標準差為0.0058奈米。因此，可求得該方法的偵測極限為1.6743 × 10 ^-5RIU；另一方面，表面電漿訊號變化量與折射率的關係式為

，其中10.8558即為本案的偵測靈敏度。該實施例中，n ₀量測區間分析得到的表面電漿訊號標準差為1.12774 × 10 ^-4。因此，可求得該方法的偵測極限為1.0394 × 10 ^-5RIU。此數值充分顯示出本案藉由自我參考訊號雜訊影響，可獲得相較標準的波長位移分析方法更低的檢測極限；更為重要的是，標準的波長位移分析方法只適用於單點量測，本案提出的方法與裝置適用於全視野影像化，可同時分析多點訊號，在量測通量上有明顯助益。

實驗例三

表面電漿訊號隨時間的變化被稱之為感測曲線，它是一個在表面電漿檢測領域中重要的應用，感測曲線可以提供相當多資訊，例如親和能力、標定物與待測物之間的離解和結合速率、目標分子的濃度，與交叉反應分子專一性。圖11介紹一基於此發明，能高通量量測感測曲線的實施例。在此實施例中，長波段表面電漿影像與短波段表面電漿影像依序被記錄，時間序列表面電漿訊號影像也同時被計算出。因為所有的表面電漿訊號影像在全部時間內都被記錄下來，使用者可提取特定區域中的感測圖。如圖11右圖的包括三條感測曲線，標示為exp、ref，和non，分別對應由左圖的區域exp、ref，和non中提取的表面電漿訊號。其中區域exp是位於流道中且在金屬覆蓋的奈米溝槽陣列結構上，所以有表面電漿的訊號。相反的，區域ref不位於奈米溝槽陣列結構上。區域non位於流道外，所以無表面電漿訊號變化。

實驗例四

為進一步確認應用掃描器及紅、綠、藍三色段分析法於電漿子感測晶片的可行性。圖12（a）是使用商用穿透式掃描器及雙層奈米鋁狹縫晶片（圖左方）進行不同比例甘油水的檢測實驗，圖右方為使用掃描器記錄電漿子晶片在不同比例甘油水的穿透影像，甘油水折射率介於1.3290至1.346之間。在此，為了讓結構產生的共振波峰出現在紅綠兩色段，調整雙層奈米鋁狹縫晶片的週期長度至430 nm。

首先將純水滴在晶片上，再以蓋玻片覆蓋其上並記錄晶片穿透影像。隨後，將晶片吹乾並將以不同比例甘油水重複上述步驟，其影像掃描結果如圖12（a）右方所示。圖12（b）是分析影像在紅色、綠色及紅綠兩色段的自定義計算式下，結構在不同折射率的穿透強度。隨著環境折射率的增加，位於波長573 nm的共振波峰產生紅位移，如圖12（d）所示。由於折射率與波峰位置呈現一線性關係，其折射率靈敏度為427 nm/RIU（見圖12（e））。這個數值與理論計算值接近，其折射率靈敏度由週期長度決定，也就是S _λ~ P nm/RIU，RIU為折射率單位。因為隨著折射率的增加，共振波峰移往紅色段，因此結構在紅色段的穿透強度逐漸增加。反之，因為共振波峰隨著折射率的增加，逐漸遠離綠色段，所以結構的綠色段穿透強度逐漸減小。如圖12（c）所示，兩波段的穿透強度改變量與環境折射率呈現線性關係，紅及綠色段對應的斜率分別為201 %/RIU及56 %/RIU。而兩色段的自定義計算式的強度改變量也與環境折射率呈現一線性關係，其強度靈敏度為1241 %/RIU。其靈敏度優於其它兩個單獨色段分析法。因此，這些結果證實應用掃描器及紅、綠、藍三色段分析法於電漿子感測晶片的可行性。

1：照明系統 2：光譜調變模組 3：感測單元 4：成像模組 5：影像分割裝置 6：光源模組 13：寬頻光源 22、24：濾波片 26：驅動裝置 28：線性偏振板 33：流體裝置 35、35’：表面電漿感測器（表面電漿共振感測晶片） 42、42’：成像裝置（照相機） 61：第一波段發光次模組單元 62：第二波段發光次模組單元 611：第一波段發光單元 612：第一透鏡 613：第一線性偏振片 621：第二波段發光單元 622：第二透鏡 623：第二線性偏振片

圖1為表面電漿訊號成像方法示意圖。

圖2為表面電漿訊號成像方法在光譜上的工作原理示意圖，短波長濾波片、長波長濾波片的穿透光譜方別以虛線、實線代表，表面電漿感測器的反射及穿透光譜分別以紅色圓形（反射）與藍色方塊（穿透）線段代表。

圖3為動態區間的理論驗證示意圖。（a）一個表面電漿共振波長藍位移的例子與（b）訊號值對應波長位移量的關係，（c）一個表面電漿共振波長紅位移的例子與（d）訊號值對應波長位移量的關係。

圖4A為本發明的一種表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖4B為本發明的一種表面電漿成像裝置的另一實施例的示意圖。

圖5A為本發明的一種使用異常穿透型表面電漿感測器的雙相機表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖5B為本發明的一種使用稜鏡式表面電漿感測器的雙相機表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖6A為本發明的一種使用異常穿透型表面電漿感測器的單相機表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖6B為本發明的一種使用稜鏡式表面電漿感測器的單相機表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖7A為本發明的一種使用稜鏡式表面電漿感測器的表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖7B為本發明的一種使用稜鏡式表面電漿感測器的表面電漿成像裝置的另一實施例的示意圖。

圖8（a）為本發明的一種掃描器裝置示意圖的一實施例的示意圖與奈米結構電漿子生物晶片影像。圖8（b）及圖8（c）分別為其應用於具有窄共振波峰及窄共振波谷的穿透式電漿子晶片的紅、綠、藍三色段分析法解說示意圖。

圖9為表面電漿訊號影像（上排：通入高折射率溶液前，下排：通入高折射率溶液後）。其中光譜A（spectral-A）影像代表長波段表面電漿影像，光譜B（spectral-B）影像代表長波段表面電漿影像，伽馬（Gamma）影像代表長波段表面電漿訊號影像。

圖10為本發明的方法與裝置的檢測極限與標準波長位移分析方法的比較。（左上圖）使用標準波長位移分析方法測量不同折射率的糖水取得的感測曲線。（右上圖）使用本案的裝置與方法測量不同折射率的糖水取得的感測曲線，其中n ₀= 1.3290，n ₁= 1.3295，n ₂= 1.3300，n ₃= 1.3305，n ₄= 1.3320，n ₅= 1.3355，折射率單位（refractive index unit，RIU）。（左下圖）黑點：使用標準波長位移分析方法測量到的表面電漿訊號變化量。紅線：線性回歸分析。（右下圖）黑點：使用標本案的裝置與方法測量到的表面電漿訊號變化量。紅線：線性回歸分析。

圖11為使用本發明的即時表面電漿訊號顯像技術量測蛋白質與抗原反應的結果。（左圖）在實驗末量測到的表面電漿訊號影像。（右圖）分別從區域exp、ref，和non提取出的感測曲線。

圖12：（a）商用穿透式掃描器及雙層奈米鋁狹縫晶片（圖左方）進行不同比例甘油水的檢測實驗，圖右方為使用掃描器記錄電漿子晶片在不同比例甘油水的穿透影像，甘油水折射率介於1.3290至1.346之間。（b）結構在紅色、綠色及紅綠兩色段的自定義計算式下，環境折射率與穿透強度關係圖。（c）結構在紅色、綠色及紅綠兩色段的自定義計算式下，環境折射率與穿透強度改變量關係圖。（d）週期430 nm雙層奈米鋁狹縫在不同折射率環境下的穿透光譜圖。（e）共振波峰波長與環境折射率關係圖。

圖13A為本發明的一種使用雙光源及稜鏡式表面電漿感測器的表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

圖13B為本發明的一種使用雙光源及異常穿透型表面電漿感測器的表面電漿成像裝置的一實施例的示意圖。

1：照明系統 2：光譜調變模組 3：感測單元 4：成像模組 13：寬頻光源 22、24：濾波片 26：驅動裝置 28：線性偏振板 33：流體裝置 35：表面電漿感測器 42：成像裝置（照相機）

Claims

一種表面電漿影像化的裝置，包括：一表面電漿共振感測晶片，具有一表面電漿共振波長；一成像模組，被配置以接收一第一波段電漿共振光束及一第二波段電漿共振光束，而分別對應產生一第一波段表面電漿影像訊號及一第二波段表面電漿影像訊號；以及一影像處理單元，與該成像模組耦接，並接收該第一波段表面電漿影像訊號及該第二波段表面電漿影像訊號，藉此產生一表面電漿訊號影像；其中該表面電漿共振波長小於該第一波段電漿共振光束的最小波長且大於該第二波段電漿共振光束的最大波長，該第一波段電漿共振光束的最小波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且該第二波段電漿共振光束的最大波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束同為反射光束或透射光束。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該表面電漿共振感測晶片的該表面電漿共振波長係隨表面環境折射率而變化。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該表面電漿共振感測晶片具有一週期性金屬奈米結構。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該表面電漿共振感測晶片為一穿透型表面電漿共振感測晶片或一反射式表面電漿共振感測晶片。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該表面電漿訊號影像係由該影像處理單元以下列公式計算而得：
如申請專利範圍第1項所述的裝置，更包括：一光源模組，係發出一第一波段入射光束及一第二波段入射光束，該表面電漿共振感測晶片被配置以接收該第一波段入射光束及該第二波段入射光束，而分別對應產生該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束。
如申請專利範圍第7項所述的裝置，其中該光源模組包括：一第一波段發光單元，發出該第一波段入射光束；一第二波段發光單元，發出該第二波段入射光束；以及一切換單元，耦接該第一波段發光單元及該第二波段發光單元，藉此切換該第一波段發光單元及該第二波段發光單元。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，更包括：一光譜調變模組，包括一第一波段濾波片及一第二波段濾波片，該光譜調變模組接收一寬頻光束而產生一第一波段入射光束及一第二波段入射光束，該表面電漿共振感測晶片被配置以接收該第一波段入射光束及該第二波段入射光束，而分別對應產生該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束。
如申請專利範圍第9項所述的裝置，其中該光譜調變模組更包括：一切換單元，耦接該第一波段濾波片及該第二波段濾波片，藉此於該寬頻光源至該表面電漿共振感測晶片間的入射路徑中，該切換單元會切換該第一波段濾波片及該第二波段濾波片。
如申請專利範圍第9項所述的裝置，其中該寬頻光束由一白光光源的寬頻光源產生。
如申請專利範圍第11項所述的裝置，其中該白光光源選自白光LED、鹵素燈、鎢燈、及氙燈所組成的群組。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該成像模組包括一成像單元及一透鏡，該透鏡設置於該表面電漿共振感測晶片與該成像單元之間，該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束係經該透鏡而投射於該成像單元。
如申請專利範圍第1項所述的裝置，其中該表面電漿共振感測晶片被配置以接收一寬頻光束而產生一電漿共振光束；該裝置更包括：一光譜調變模組，包括一第一波段濾波片及一第二波段濾波片，該光譜調變模組被配置以接收該電漿共振光束而產生該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束；其中該表面電漿共振感測晶片的該表面電漿共振波長小於該第一波段濾波片的最小截止波長且大於該第二波段濾波片的最大截止波長，該第一波段濾波片的最小截止波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且該第二波段濾波片的最大截止波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內。
如申請專利範圍第14項所述的裝置，其中該光譜調變模組更包括：一切換單元，耦接該第一波段濾波片及該第二波段濾波片，藉此於該表面電漿共振感測晶片至該成像模組間的光路中，該切換單元會切換該第一波段濾波片及該第二波段濾波片。
如申請專利範圍第14項所述的裝置，其中該光譜調變模組更包括：一分光模組，被配置以接收該電漿共振光束而產生一第一分光光束及一第二分光光束，且該第一波段濾波片係被配置以接收該第一分光光束而產生該第一波段電漿共振光束，而該第二波段濾波片係被配置以接收該第二分光光束而產生該第二波段電漿共振光束。
如申請專利範圍第16項所述的裝置，其中該分光模組包括一分光器，被配置產生該第一分光光束及該第二分光光束。
如申請專利範圍第16項所述的裝置，其中該分光模組包括一分光器及一反射器，該反射器設置於該分光器與該第一波段濾波片或該第二波段濾波片之間。
如申請專利範圍第16項所述的裝置，其中該成像模組包括一成像單元及一透鏡，該透鏡設置於該第一波段濾波片及該第二波段濾波片與該成像單元之間，該第一波段電漿共振光束及該第二波段電漿共振光束係經該透鏡而投射於該成像單元。
如申請專利範圍第14項所述的裝置，其中該成像模組包括：一第一成像次模組，包括一第一透鏡及一第一成像單元，該第一透鏡設置於該第一波段濾波片與該第一成像單元之間，該第一波段電漿共振光束係經該第一透鏡而投射於該第一成像單元；以及一第二成像次模組，包括一第二透鏡及一第二成像單元，該第二透鏡設置於該第二波段濾波片與該第二成像單元之間，該第二波段電漿共振光束係經該第二透鏡而投射於該第二成像單元。
如申請專利範圍第14項所述的裝置，其中該電漿共振光束為一反射光束或一透射光束。
一種表面電漿影像化的方法，包括以下步驟：由一成像模組自一表面電漿共振感測晶片接收一第一波段電漿共振光束及一第二波段電漿共振光束，以分別對應產生一第一波段表面電漿影像訊號及一第二波段表面電漿影像訊號；其中該表面電漿共振感測晶片具有一表面電漿共振波長，而該表面電漿共振波長小於該第一波段電漿共振光束的最小波長且大於該第二波段電漿共振光束的最大波長，該第一波段電漿共振光束的最小波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內，且該第二波段電漿共振光束的最大波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米以內；以及由一影像處理單元接收該第一波段表面電漿影像訊號及該第二波段表面電漿影像訊號，藉此產生一表面電漿訊號影像，其中該影像處理單元係與該成像模組耦接。
如申請專利範圍第22項所述的方法，其中該表面電漿訊號影像係由該影像處理單元以下列公式計算而得：
如申請專利範圍第22項所述的方法，其中該第一波段電漿共振光束的最小波長或該第二波段電漿共振光束的最大波長與該表面電漿共振波長的差異在10奈米內。