TWI671401B - 以香魚假單孢菌isuwyz01 生產聚羥基烷酯的方法 - Google Patents

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Yu Chi Wang
王瑜琦
Yu Jing Zeng
曾俞靜
Zong Hua Wu
吳宗樺
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I-Shou University
義守大學
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一種生產聚羥基烷酯的方法，包含，提供一香魚假單孢菌ISUWYZ01，其寄存於中華民國食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910835；於25℃、pH 6之條件下，以一氮源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；及於25℃、pH 6之條件下，以一碳源培養基培養經該氮源培養基培養所得之香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；其中，該碳源培養基包含以體積百分比計為0.1~0.3%之食用油。

Description

以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法
本發明係關於一種生產聚羥基烷酯的方法，特別關於一種以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法。
聚羥基烷酯(polyhydroxyalkanoate，簡稱PHA)為藉由微生物的醱酵作用所生成的線性聚酯，聚羥基烷酯不僅可以取代傳統的石化塑膠，更由於其具有良好的生物可降解性(biodegradability)，具有被應用於生醫材料或製藥產業中的發展潛力。因此，具有生產聚羥基烷酯能力的微生物的篩選與開發，確實為一個刻不容緩的課題。
本發明係為了解決上述問題，遂提供一種生產聚羥基烷酯的方法，係利用香魚假單孢菌ISUWYZ01來生產聚羥基烷酯者。
本發明之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，係包含：提供一香魚假單孢菌ISUWYZ01，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910835；於25℃、pH 6之條件下，以一氮源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；及於25℃、pH 6之條件下，以一碳源培養基培養經該氮源培養基培養所得之香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；其中，該碳源培養基包含以體積百分比計為0.1~0.3%之橄欖油。如此，藉由該香魚假單孢菌ISUWYZ01的生物活性， 利用該橄欖油作為碳源，經生物代謝而有效轉換為聚羥基烷酯，並藉由溫度、pH值的調整，與食用油種類的選擇，可以提升聚羥基烷酯的生產效率。
本發明之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，其中，該氮源培養基包含酵母菌萃取物、蛋白腖、肉萃取物、硫酸銨及水，例如每公升之氮源培養基包含1公克之酵母菌萃取物、1公克之蛋白腖、0.5公克之肉萃取物及0.5公克之硫酸銨，其餘的比例為水；該碳源培養基另包含一水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、硫酸銨、二水氯化鈣、檸檬酸及水，例如每公升之碳源培養基包含0.716公克之一水磷酸氫二鈉、0.265公克之磷酸二氫鉀、0.02公克之七水硫酸鎂、0.01公克之硫酸銨、0.1公克之二水氯化鈣及0.5公克之檸檬酸、1~3毫升之橄欖油，其餘的比例為水。如此，藉由該氮源培養基及該碳源培養基的配方調整，可以提升聚羥基烷酯的生產效率。
第1圖：試驗(A)各組的聚羥基烷酯之含量百分比長條圖。
第2圖：試驗(B)各組的聚羥基烷酯之含量百分比長條圖。
第3圖：試驗(C)各組的聚羥基烷酯之含量百分比長條圖。
第4圖：試驗(D)各組的聚羥基烷酯之熱分析儀的分析結果。
第5a圖：試驗(D)第D1組的聚羥基烷酯之核磁共振儀的分析結果。
第5b圖：試驗(D)第D2組的聚羥基烷酯之核磁共振儀的分析結果。
第5c圖：試驗(D)第D3組的聚羥基烷酯之核磁共振儀的分析結果。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，詳細說明如下：本發明所述之香魚假單孢菌(Pseudomonas plecoglossicida)ISUWYZ01係篩選自樹德科技大學校園河流，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910835)，並具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列，該香魚假單孢菌ISUWYZ01係具有生產聚羥基烷酯能力，故可以應用於生產聚羥基烷酯。
大抵而言，工者係可以優先以一氮源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01，續以一碳源培養基培養經該氮源培養基培養所得之香魚假單孢菌ISUWYZ01，該碳源培養基包含一食用油，藉此使該香魚假單孢菌ISUWYZ01可以利用該食用油作為碳源，經生物代謝而轉換為聚羥基烷酯。
工者係能夠於20~30℃、pH 4~8之條件下，以該氮源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；較佳係能夠於25℃、pH 6之條件下震盪培養48小時(180rpm)。又，該氮源培養基可以包含酵母菌萃取物(yeast extract)、蛋白腖(peptone)、肉萃取物(meat extract)、硫酸銨((NH4)2SO4)及水，於本實施例中，每公升之氮源培養基包含1公克之酵母菌萃取物、1公克之蛋白腖、0.5公克之肉萃取物及0.5公克之硫酸銨，其餘的比例為水。
接著，工者可以收集經該氮源培養基培養所得的香魚假單孢菌ISUWYZ01(例如，於4℃下，以4,000rpm之轉速離心20分鐘)，續於20~30℃、pH 4~8之條件下，以該碳源培養基培養經該氮源培養基培養所得之香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；較佳係能夠於25℃、pH 6之條件下震盪培養72小時(180rpm)。又，該碳源培養基中的食用油可以為大豆沙拉油、葡萄籽油或橄欖油；且除前述之食用油外，該碳源培養基 另可以包含一水磷酸氫二鈉(Na2HPO4‧H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、七水硫酸鎂(MgSO4‧7H2O)、硫酸銨、二水氯化鈣(CaCl2‧2H2O)、檸檬酸(citric acid)及水，於本實施例中，每公升之氮源培養基包含1~3毫升之食用油、0.716公克之一水磷酸氫二鈉、0.265公克之磷酸二氫鉀、0.02公克之七水硫酸鎂、0.01公克之硫酸銨、0.1公克之二水氯化鈣及0.5公克之檸檬酸、1~3毫升之食用油，其餘的比例為水。
為證實該香魚假單孢菌ISUWYZ01確實能夠應用於生產聚羥基烷酯，遂選用大豆沙拉油〔台糖大豆沙拉油，批號：030047032〕、葡萄籽油〔愛之味葵花葡萄籽健康油〕及橄欖油〔保榮藥工株式會社，批號：025201〕作為該食用油，並進行以下試驗：
(A)溫度的選擇
本試驗係於收集經該氮源培養基培養所得的香魚假單孢菌ISUWYZ01後，分別於20℃(第A1組)、25℃(第A2組)、30℃(第A3組)之溫度、pH為4之條件下，以含有大豆沙拉油之碳源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01，最終分析所產生的聚羥基烷酯之含量，其結果如第1圖所示，該香魚假單孢菌ISUWYZ01於25℃之溫度下所產生的聚羥基烷酯之含量最高。
(B)食用油的選擇
本試驗係於收集經該氮源培養基培養所得的香魚假單孢菌ISUWYZ01後，於25℃之溫度、pH為4之條件下，以含有大豆沙拉油(第B1組)、葡萄籽油(第B2組)、橄欖油(第B3組)之碳源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01，最終分析所產生的聚羥基烷酯之含量，其結果如第2圖所示，以含有橄欖油之碳源培養基所培養的香魚假單孢菌ISUWYZ01所產生的聚羥基烷酯之含量最高。
(C)pH值的選擇
本試驗係於收集經該氮源培養基培養所得的香魚假單孢菌ISUWYZ01後，於25℃之溫度、pH為(第C1組)、6(第C2組)、7(第C3組)、8(第C4組)之條件下，以含有橄欖油之碳源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01，最終分析所產生的聚羥基烷酯之含量，其結果如第3圖所示，以該碳源培養基的pH值為6的條件下，該香魚假單孢菌ISUWYZ01所產生的聚羥基烷酯之含量最高。
(D)高分子的組成測定
本試驗係於收集經該氮源培養基培養所得的香魚假單孢菌ISUWYZ01後，於25℃、pH為4之條件下，以含有大豆沙拉油之碳源培養基(第D1組)、含有葡萄籽油之碳源培養基(第D2組)、含有橄欖油之碳源培養基(第D3組)分別培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01，以熱分析儀(DSC)分析各組產生的聚羥基烷酯，結果如第4圖所示，另以核磁共振儀(NMR)分析各組產生的聚羥基烷酯，結果如第5a~5c圖所示，各組產生的聚羥基烷酯均為相同的產物(包含聚羥基丁酸酯及其共聚合物)。
綜合上述，本發明之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，係藉由該香魚假單孢菌ISUWYZ01的生物活性，利用該食用油作為碳源，經生物代謝而有效轉換為聚羥基烷酯，並藉由溫度、pH值的調整，與食用油種類的選擇，可以提升聚羥基烷酯的生產效率。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
【生物材料寄存】 國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
中華民國食品工業發展研究所、2018年05月04日、BCRC 910835
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
(無)
<110> 義守大學
<120> 以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法
<130> PK14930
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1050
<212> DNA
<213> Pseudomonas plecoglossicida(香魚假單孢菌)
<400> 1

Claims (5)

  1. 一種以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，係包含：提供一香魚假單孢菌ISUWYZ01，其係寄存於中華民國食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910835；於25℃、pH 6之條件下，以一氮源培養基培養該香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；及於25℃、pH 6之條件下，以一碳源培養基培養經該氮源培養基培養所得之香魚假單孢菌ISUWYZ01 24~96小時；其中，該碳源培養基包含以體積百分比計為0.1~0.3%之橄欖油。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，其中，該氮源培養基包含酵母菌萃取物、蛋白腖、肉萃取物、硫酸銨及水。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，其中，每公升之氮源培養基包含1公克之酵母菌萃取物、1公克之蛋白腖、0.5公克之肉萃取物及0.5公克之硫酸銨，其餘的比例為水。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，其中，該碳源培養基另包含一水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、硫酸銨、二水氯化鈣、檸檬酸及水。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之以香魚假單孢菌ISUWYZ01生產聚羥基烷酯的方法，其中，每公升之碳源培養基包含0.716公克之一水磷酸氫二鈉、0.265公克之磷酸二氫鉀、0.02公克之七水硫酸鎂、0.01公克之硫酸銨、0.1公克之二水氯化鈣及0.5公克之檸檬酸、1~3毫升之橄欖油，其餘的比例為水。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20130288323A1 (en) * 2010-12-01 2013-10-31 University Of Manitoba Microbial production of polyhydroxyalkanoates

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Title
Chen, Bor-Yann, et al. "Feasibility study of polyhydroxyalkanote production for materials recycling using naturally occurring pollutant degraders." Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 43.3 (2012): 455-458.
Chen, Bor-Yann, et al. "Feasibility study of polyhydroxyalkanote production for materials recycling using naturally occurring pollutant degraders." Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers 43.3 (2012): 455-458. 戴君, et al.一株新型高產 PHB 假單胞菌 SCH17 的分離和特徵分析. 2011. 微生物學通報38(5):635-640. Sabarinathan, Devaraj, et al. "Production of polyhydroxybutyrate (PHB) from Pseudomonas plecoglossicida and its application towards cancer detection." Informatics in Medicine Unlocked 11 (2018): 61-67. Available online 4 May 2018 *
Sabarinathan, Devaraj, et al. "Production of polyhydroxybutyrate (PHB) from Pseudomonas plecoglossicida and its application towards cancer detection." Informatics in Medicine Unlocked 11 (2018): 61-67. Available online 4 May 2018
戴君, et al.一株新型高產 PHB 假單胞菌 SCH17 的分離和特徵分析. 2011. 微生物學通報38(5):635-640.

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