TWI651088B - 用於治療癌症的Scalarane二倍半萜類、醫藥組合物及拓樸異構酶II與 Hsp90抑制劑及其用途與製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露一種由海綿動物Carteriospongia sp.萃取出的如式(I)所示的Scalarane二倍半萜類以及如式(II)所示的meroditerpenoid： 其中，R1為-CH3或-C2H5。式(I)及式(II)化合物可用於抑制癌症、作為拓樸異構酶II抑制劑及抗癌醫藥組合物。

Description

用於治療癌症的Scalarane二倍半萜類、醫藥組合物及拓樸異構酶II與Hsp90抑制劑及其用途與製備方法
本發明關於一種二倍半萜類及醫藥組合物，尤其是一種用於治療癌症的Scalarane二倍半萜類、醫藥組合物及拓樸異構酶II抑制劑及其用途與製備方法。
癌症是指生物體細胞不正常增生，這些不正常增生細胞可能侵犯生物體其他部分。有多種造成癌症的原因，例如肥胖、飲食、運動不足、酒精、感染、輻射、環境污染因子、遺傳、病毒感染等。
由於社會及科技的演進，癌症已成為許多國家，尤其是已開發國家，人民的主要死因。各個年齡層的人口均可能罹患癌症。由於DNA損傷是造成癌症的原因之一且會隨著年齡增加而增加，罹癌風險也因此隨年齡增長而升高。
癌症可以經手術切除、化療、放射線治療、免疫治療、單株抗體治療或其他方法治療。治療方式取決於腫瘤位置、惡性程度、發展程度以及病患身體狀態等狀況。
其中，熱休克蛋白質(Hsp)包括一群高度保留的壓力蛋白質，其在癌症組織中過度表現而引人注意。Hsp的過度表現與轉移能力、對化學治療的抗性及較差的預後有關。Hsp依據其分子量而命名，例如Hsp60、Hsp70及Hsp90，其中Hsp90是最佔優勢、含量最多的伴護蛋白質(chaperone protein)，且它對於折疊多肽是必須的，以控制活性、穩定性及蛋白質派送。Hsp90被確認為癌症治療上有希望的藥物標靶，因為它可穩定及活化許多蛋白質，以維持癌症表現型態，且幫助癌細胞克服許多環境壓力。因此，透過致癌基因Hsp90底物的消耗而開發有潛力的Hsp90抑制劑對癌症治療是有益的。第一個Hsp90抑制劑-Tanespimycin(17-AAG)-被發現可鍵結至Hsp90的N端調節區域而可抑制Hsp90的活性，但17-AAG因為其較差的溶解度、受限的生物利用度、無法被接受的肝毒性而無法持續地進行臨床試驗。
另一群蛋白質-拓樸異構酶(Topo)-在細胞存活及複製扮演重要角色而受到關注。拓樸異構酶分為主要兩群：拓樸異構酶I及拓樸異構酶II，其中拓樸異構酶II由共享相近的胺基酸序列(高達70%)的兩個異型體(α、β)組成。Topo IIα對於增生細胞的存活率是必須的且可在DNA鬆弛反應期間辨識DNA超螺旋結構，然而Topo IIβ在細胞階段並非必須。Topo II解開了調節DNA複製、轉錄、染色體分隔以及與腫瘤生成相關過程的拓樸問題。抑制Topo II活性是目前針對包括肺癌、乳癌、淋巴癌、睪丸癌及肉瘤等癌症的治療方法中的一種方法。Topo II活性的抑制作用可由毒物或是抑制劑達成，毒物可干擾拓樸異構酶II-DNA複合物，抑制劑則可抑制催化轉換數(catalytic turnover)。儘管作為抗癌藥物的Topo II毒物是有效的，但它們可啟動染色體斷裂，導致二次的血癌生成作用。
儘管已有上述或未見於本文的治療癌症的技術及研究，科學家們仍致力於尋找新穎及有效的治療癌症的技術、藥物及療法。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研 究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了開發新穎的拓樸異構酶II抑制劑，並將該拓樸異構酶II抑制劑製備為用於治療癌症的醫藥組合物，本發明由海綿動物(Carteriospongia sp.)分離及純化新穎的Scalarane型二倍半萜類(Sesterterpenoid)，其為如下所示的式(I)化合物： 其中，R1為-CH3或-C2H5。當R1為-CH3時，式(I)化合物為12β-(3'β-hydroxybutanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al；當R1為-C2H5時，式(I)化合物為12β-(3'β-hydroxy-pentanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al。
此外，本發明並由Carteriospongia sp.分離及純化被命名為2-tetraprenil-1,4-benzochinone的式(II)化合物：
因此，本發明揭露一種拓樸異構酶II抑制劑，包括如上所示的式(I)化合物。在一個具體實施例中，拓樸異構酶II抑制劑更包括如上所示 的式(II)化合物。
在一個具體實施例中，拓樸異構酶II抑制劑抑制癌細胞的拓樸異構酶II的活性，該癌細胞涉及的癌症包括但不限於血癌、淋巴癌、口腔癌、前列腺癌、大腸癌、乳癌及諸如此類。在一個具體實施例中，血癌的癌細胞包括但不限於人類慢性骨髓性白血病細胞株K562、人類急性淋巴細胞白血病細胞株Molt 4、人類前骨髓性白血病細胞株HL 60及諸如此類；淋巴癌的癌細胞包括但不限於細胞株U937、Sup-T1及諸如此類；口腔癌的癌細胞包括但不限於細胞株Ca9-22、Cal-27及諸如此類；前列腺癌的癌細胞包括但不限於細胞株LNCaP；大腸癌的癌細胞包括但不限於細胞株DLD-1及諸如此類；且乳癌的癌細胞包括但不限於細胞株T-47D及諸如此類。
本發明更揭露一種將前述的拓樸異構酶II抑制劑製備用於治療癌症的醫藥組合物的用途。
本發明更揭露一種前述拓樸異構酶II抑制劑中的式(I)化合物的製備方法，包括：(a)提供海綿動物；(b)以乙酸乙酯萃取海綿動物，以獲得乙酸乙酯萃取物；(c)濃縮乙酸乙酯萃取物，以獲得殘留物；以及(d)層析殘留物，以獲得式(I)化合物。在一個具體實施例中，海綿動物包括但不限於Carteriospongia sp.。
在一個具體實施例中，步驟(a)更包括：(a1)冷凍乾燥海綿動物；以及(a2)切碎海綿動物。在一個具體實施例中，步驟(c)是在減壓下以蒸發方式進行。在一個具體實施例中，步驟(d)更包括：(d1)以正己烷、極性漸增的正己烷-乙酸乙酯混合物及純丙酮對殘留物進行矽膠管柱層析，以獲得複數個分餾物；以及(d2)以正相高效能液相層析純化複數個分餾物至少其中之一，以從被純化的分餾物獲得式(I)化合物。在一個具體實施例中，由被純化的分餾物更獲得上述式(II)化合物。
本發明更揭露一種包括上述式(I)化合物的拓樸異構酶II抑制劑，因可抑制癌細胞的拓樸異構酶II活性而用於抗癌的醫藥組合物。
本文用語「90%甲醇溶液」是指甲醇與水依體積比9：1調和的溶液。本文用語「甲醇溶液」是指甲醇與水依特定體積比調和的溶液，特定體積比並不限於9：1，所屬技術領域中具有通常知識者可理解，其他體積比調和出的甲醇溶液均可應用於本發明且落入申請專利範圍。
本文述及的「正己烷-乙酸乙酯混合物」是以不同體積比例的正己烷與乙酸乙酯調配而成。本文其他混合物、溶液等，若未特別指出，則表示以其成分的體積比例調配而成。
本發明的上述目的及優點在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後對那些所屬技術領域中具有通常知識者將變得更立即地顯而易見。
第1圖為本發明化合物1的1H-1H COSY(─)、HMBC(→)及NOESY()關聯性之示意圖。
第2圖(A)為化合物1至3對Topo II活性影響之電泳膠體示意圖。第1至5道：化合物3(0.08、0.3125、1.25、5及20μg/mL)；第6至10道：化合物1(0.08、0.3125、1.25、5及20μg/mL)；第11至15道：化合物2(0.08、0.3125、1.25、5及20μg/mL)；第16道：作為Topo II毒物(誘導線型DNA)的正控制組依託泊苷(etoposide,500μM)；第17道：質體DNA+Topo II+溶劑控制組(誘導DNA鬆弛作用)；第18道：線型DNA；第19道：負控制組質體DNA(超螺旋DNA)。
第2圖(B)為本發明以海生萜類(化合物1至3)處理誘導Molt 4細胞中γH2AX蛋白質表現之示意圖。以化合物1至3(0、0.0625、0.125及0.25μg/mL)分別處理細胞24小時。以西方點漬法分析蛋白質表現。GAPDH 被使用作為上樣控制組。
第3圖(A)及第3圖(B)為本發明化合物3對活體內人類Molt 4腫瘤異種移植動物模式之(A)腫瘤生長及(B)體重影響之示意圖。以控制組溶劑(DMSO)及化合物3(1.14μg/g)腹膜注射至帶有腫瘤的小鼠33天。在第3圖(A)中，每隔一天測量腫瘤體積，且以平均±標準差表示結果。* p<0.05及** p<0.01表示在與控制組相較具有顯著性差異。在第3圖(B)中，每隔一天測量體重，且以平均±標準差表示結果。控制組小鼠8隻，化合物3實驗組小鼠7隻。
第4圖(A)、第4圖(B)、第4圖(C)、第4圖(D)及第4圖(E)分別為本發明化合物1對Molt 4細胞中(A)ROS生成、(B)ER壓力相關蛋白質、(C)鈣累積、(D)細胞凋亡相關蛋白及(E)彗星拖尾的影響之示意圖。
第5圖(A)為17-AAG對Molt 4細胞的細胞毒殺作用的影響之示意圖。
第5圖(B)為化合物1對Hsp90底物蛋白質表現的影響之示意圖。
本案所提出之發明將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中具有通常知識者可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
萃取及分離：
海綿動物Carteriospongia sp.的樣本是在2013年3月於台灣台東離岸的14公尺深珊瑚礁以水肺潛水方式收集。該海綿動物的保證樣本 寄存於台灣國立海洋生物博物館(樣本編號：2013-03-SP-3)。由台灣高雄國立中山大學進行該海綿動物的分類鑑定。由於海綿動物Carteriospongia sp.可為所屬技術領域中具有通常知識者輕易取得及鑑別，因此並無須依據專利法暨其施行細則的相關規定進行生物材料之寄存。
收集並冷凍乾燥該海綿動物(440g鮮重)。將冷凍乾燥的海綿動物切碎並以乙酸乙酯(EtOAc)徹底地萃取(6×2L)，獲得乙酸乙酯萃取物。在減壓下以蒸發方式濃縮乙酸乙酯萃取物，獲得一殘留物(5g)，再使用正己烷(n-hexane)、極性漸增的正己烷-乙酸乙酯混合物及最終純丙酮對該殘留物進行矽膠管柱層析，獲得8個分餾物：Fr-1(以n-hexane：EtOAc=50：1(v/v)沖提)、Fr-2(以n-hexane：EtOAc=25：1(v/v)沖提)、Fr-3(以n-hexane：EtOAc=10：1(v/v)沖提)、Fr-4(以n-hexane：EtOAc=5：1(v/v)沖提)、Fr-5(以n-hexane：EtOAc=2：1(v/v)沖提)、Fr-6(以n-hexane：EtOAc=1：1(v/v)沖提)、Fr-7(以EtOAc沖提)以及Fr-8(以丙酮沖提)。以正相高效能液相層析(HPLC)及梯度沖提(n-hexane：EtOAc=50：1(v/v)至25：1(v/v))來分離分餾物Fr-2(560.0mg)，得到15個子分餾物2A-2O。以正相HPLC(n-hexane：EtOAc=40：1(v/v))分離子分餾物2I，獲得化合物3(70.0mg)。以矽膠(n-hexane：EtOAc=4：1(v/v)至1：1(v/v))進一步純化分餾物5(320.0mg)，獲得10個子分餾物5A-5J。接著以正相HPLC(n-hexane：EtOAc=3：1(v/v))分離子分餾物5E，獲得化合物2(6.0mg)。以正相HPLC(n-hexane：EtOAc=3：1(v/v))分離子分餾物5G，獲得化合物1(4.1mg)。
化合物1：12β-(3'β-hydroxybutanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al：無色油狀物質；+10.7(c 0.41,CHCl3)；IR(neat)νmax 3448,2963,2931,2875,1718,1666,1374及1272cm-1；13C及1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 523[M+Na]+；HRESIMS m/z 523.3397[M+Na]+(calcd for C31H48O5Na,523.3399)。
化合物2：12β-(3'β-hydroxypentanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al：無色油狀物質；+5.7(c0.50,CHCl3)；IR(neat)νmax 3448,2930,2854,1730,1666,1388及1281cm-1；13C及1H NMR數據，參見表1；ESIMS m/z 537[M+Na]+；HRESIMS m/z 537.3546[M+Na]+(calcd for C32H50O5Na,537.3550)。
(R)-及(S)-MTPA酯類(化合物2r及2s)的製備：
將小量的化合物2(2.5mg)分成兩部分，儲存在二個NMR試管並真空乾燥。將氘代吡啶(0.60mL)及(R)-MTPA-Cl(12μL)加入每支NMR試管。將NMR試管置於室溫進行作用，且每小時以400MHz NMR偵測。三小時後反應完成，獲得1H NMR數據(400MHz，在C5D5N)。獲得化合物2的(S)-MTPA酯類(化合物2s)，且分析其1H NMR數據。類似於化合物2s，在另一實驗中將(S)-MTPA-Cl(12μL)及氘代吡啶(0.60mL)於室溫反應三小時，獲得(R)-MTPA酯類(化合物2r)，且在C5D5N中以400MHz NMR測定1H NMR光譜。(S)-MTPA酯類(化合物2s)：1H NMR(400MHz,C5D5N)：δ 9.928(d,J=3.6Hz,1H,H-25),7.015(s,1H,H-16),5.810(t,J=6.4Hz,1H,H-3'),5.027(dd,J=10.8,4.8Hz,1H,H-12),3.253(s,1H,H-18),2.255(s,3H,H-26),1.134(s,3H,H-23),1.110(t,J=6.0Hz,3H,H-5'),0.882(s,3H,H-21),0.793(s,3H,H-22),0.776(s,3H,H-19),0.743(t,J=7.2Hz,3H,H-25)。(R)-MTPA酯類(化合物2r)：1H NMR(400MHz,C5D5N)：δ 10.018(d,J=4.0Hz,1H,H-25),7.065(s,1H,H-16),5.833(t,J=6.4Hz,1H,H-3'),5.123(dd,J=11.2,4.0Hz,1H,H-12),3.393(s,1H,H-18),2.259(s,3H,H-26), 1.142(s,3H,H-23),1.060(t,J=6.4Hz,3H,H-5’),0.885(s,3H,H-21),0.797(s,3H,H-22),0.780(s,3H,H-19),0.745(t,J=7.2Hz,3H,H-25)。
生物試驗材料：
本發明使用的細胞株是由美國菌種保存中心(ATCC)取得。細胞被培養於37℃及5%CO2濕潤空氣下、添加10%胎牛血清(FCS)、2mM麩醯胺酸及抗生素(100units/mL盤尼西林及100μg/mL鏈黴素)的RPMI1640培養液。抗c-PARP、caspase 8、9、7及3、γH2AX、Bip、Grp 94、p-GSK 3β(Ser9)、p-c-Raf、p70S6K、Hsp 90及70、Rb 2、MDM2、HIF 1、PERK及IRE 1的抗體購自Cell Signaling Technologies(Beverly,MA,USA)。抗XIAP、NFκB(p65)、GADD、CDK 4、HSF 1、ATF 6及β-tubulin的抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)。Hybond ECL轉移膜及ECL西方點漬偵測套組購自Amersham Life Sciences(Amersham,UK)。
Annexin V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試驗：
使用annexin V-FITC/PI(碘化丙啶)染色套組(實創生物科技公司，台灣台北)來定量磷脂醯絲胺酸(PS)的外顯化及膜完整性(Su et al.,Marine Drugs,2013,11(9)：3168-3185.)。簡而言之，將106個細胞培養於35mm直徑培養盤並在收取細胞前以annexin V-FITC(10μg/mL)及PI(20μg/mL)標記細胞。在標記後，以結合緩衝液清洗所有的培養盤並收取細胞。以2×105cells/rmL的濃度將細胞重新懸浮於結合緩衝液，再以流式細胞儀FACS-Calibur(Becton-Dickinson,San Jose,CA,USA)及CellQuest軟體分析。每次測定計數約10,000個細胞。
活性含氧物(ROS)生成作用、鈣累積作用及MMP破壞作用的測定：
分別以JC-1陽離子染劑(5μg/mL)、螢光鈣離子指示劑(Fluo 3,5mM)及螢光素羧基衍生物(carboxy-H2DCFDA,1.0mM)(均購自Molecular Probes and Invitrogen technologies(Carlsbad,CA,USA))偵測MMP破壞作用、鈣累積作用及ROS生成作用(Shih et al.,Marine Drugs,2015,13(5)：3132-3153.)。簡而言之，以特定螢光染劑標記經處理的細胞30分鐘。在標記後，以PBS清洗細胞，並在流式細胞試驗分析之前以1×106cells/mL的濃度將細胞懸浮於PBS。
拓樸異構酶II催化抑制劑及毒物試驗：
本試驗是參照Shih et al.,Marine Drugs,2014,12(5)：3072-3090.及Shih et al.,Marine Drugs,2015,13(5)：3132-3153.所進行。含有50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、200mM麩胺酸鉀、10mM二硫蘇糖醇、50μg/mL牛血清白蛋白(BSA)、1mM ATP、0.3μg pHOT1質體DNA、2單位的人類拓樸異構酶II(Topogen,Columbus,OH,USA)及特定濃度的依託泊苷(etoposide)的標準鬆弛反應混合物(20μL)與化合物1至3一起於37℃培養30分鐘。加入2μL的10%SDS來終止反應，以幫助捕捉切割複合物中的酵素，接著加入2.5μL蛋白酶K(50μg/mL)來消化所結合的蛋白質(培養於37℃、15分鐘)，且最後加入0.1倍體積的樣本填充染劑。經由在0.5×TAE緩衝液、以2 voltage/cm的垂直型2%洋菜膠體電泳來分析DNA產物。以溴化乙錠(EtBr)染色膠體，並使用Eagle Eye II系統(Stratagene,La Jolla,CA,USA)拍攝膠體。定量分析DNA拓樸異構酶II(DNA Topo II)活性。以影像分析儀直接掃描膠體，並計算呈現超螺旋DNA的區域來估計導致50%的Topo II活性抑制(IC50)的化合物之濃度。
偵測DNA雙股斷裂(DSB)的中性慧星試驗：
本試驗是使用CometAssayTM套組(Trevigen,Gaithersburg,MD,USA)、按照中性慧星試驗的製造商手冊來進行。簡而言之，以化合 物1(0.0625μg/mL)於特定時間處理癌細胞(2×105cells/mL)。將細胞與1%低熔點洋菜醣以1：10(v/v)的比例合併，且立即將75μL混合物吸取到CometSlideTM上並置於4℃暗處。以冰冷裂解溶液(Trevigen)淹蓋玻片30到60分鐘。將玻片置於水平電泳裝置並在1x TBE緩衝液(90mM Tris-HCl、90mM硼酸及2mM EDTA(pH 8.0))中以20伏特進行電泳10分鐘。接著將樣本固定於70%酒精並風乾，以1：10,000的SYBR Green I(Trevigen)染色，使可觀察到細胞DNA。使用TriTek彗星影像軟體分析螢光影像，以選圈出每一彗星的「頭部」區域及「尾部」區域，且記錄每一定義的區域的積分螢光值。測量從核的後緣到尾部的前緣之彗星長度。此長度表示DNA損傷的程度。計算是以每重複來平均。結果以三次獨立實驗的平均±標準差表示(* p<0.05)。
免疫螢光分析：
在以化合物處理細胞後，以在50mM HEPES緩衝液(pH 7.3)的4%聚甲醛固定細胞30分鐘，並以在PBS(pH 7.4)的0.2%Trition X-100淹蓋20分鐘。為了避免非專一性的蛋白質結合，在室溫下以在PBS(含有0.05%Trition X-100)(T-PBS)中的5%BSA處理細胞1小時。接著於室溫將細胞與初級抗體Hsp70(1：500)培養2小時，再與二次抗體(Alexa Fluor 586-耦合的山羊抗小鼠IgG(H+L)(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA))(1：1000)培養2小時。以PBS清洗後，在FV1000共焦雷射掃描式顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)觀察細胞。
人類血癌Molt 4細胞異種移植動物模式：
六週大免疫缺陷的無胸腺公小鼠購自台灣台北的國家實驗動物動物研究中心。全部動物都在標準實驗室條件下(溫度24-26℃、12小時-12小時黑暗-明亮循環)照料，且以實驗室飼料及水飼養。將懸浮於0.2mL PBS的Molt 4細胞(1×106個細胞)皮下注射至右脇部，且每日監測腫瘤生長。腫瘤細胞注射後14天將確定有腫瘤生長的小鼠隨機地分為兩組。將化合物3(1.14μg/g)腹膜注射至治療組，而僅注射溶劑至控制組小鼠。每隔一天注射化合物3，持續33天。以二氧化碳犧牲小鼠。使用卡尺每週測量腫瘤大小三次，並根據標準公式「寬度2×長度/2」計算腫瘤體積。
分子模型試驗：
以Autodock 4.2及拉馬克遺傳演算法(Lamarckian Genetic Algorithm)進行分子嵌合(Morris et al.,J.Comput.Chem.,2009,30(16)：2785-2791.)。由蛋白質資料庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)獲得目標巨分子-Hsp90蛋白質(蛋白質資料庫編號：1YET)。去除共結晶的蛋白質受質(包括配體)、水及小分子，且以AutoDoclk Tool 1.5.4介面(ADT)將極性氫及卡爾曼聯合原子電荷(Kallman united atom charges)加入蛋白質，以用於嵌合計算。使用ChemBio3D軟體(11.0版；Cambridge Soft Corp.)以MMFF94力場來最佳化配體。並以ADT將極性氫及Gasteiger電荷加入配體，以用於嵌合研究。以56×56×56Å的尺度以及在間隔為0.375Å的柵格點，將AutoGrid程式計算的柵格箱(grid box)集中於Hsp90活性位置，且其尺寸夠大來允許配體在研究空間自由的移動。所有的嵌合參數被設定為預設值，除了以下參數之外：能量評估的最大數字增加到每次25,000,000下。以ADT分析嵌合結果，並以Accelrys Discovery Studio v3.5客戶軟體(Accelrys Inc,San Diego,CA(2005))示出。
統計：
結果以平均±標準差(SD)表示。每個實驗的比較是使用未配對的學生t-試驗進行，且p值小於0.05被認為是具有統計上顯著性。
實驗結果： 海生萜類(化合物1至3)的化學鑑定：
以矽膠管柱層析對冷凍乾燥的海綿動物樣本的乙酸乙酯萃取物進行分餾，並進一步使用正相HPLC將沖提出的分餾物分離，獲得化合物1至3。新穎化合物1被命名為12β-(3'β-hydroxybutanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al，新穎化合物2被命名為：12β-(3'β-hydroxy-pentanoyloxy)-20,24-dimethyl-24-oxo-scalara-16-en-25-al。已知的化合物3被鑑定為2-tetraprenil-1,4-benzochinone。
化合物1為無色油狀物質。以I-HR-ESI-MS(m/z 523.3397[M+Na]+)及13C NMR數據(表1)確認化合物1的分子式為C31H48O6，意味著具有8度的不飽和度。在3448、1717及1665cm-1觀察到紅外線吸收，意指出現羥基、飽和羰基及α,β-不飽和羰基功能性。由於在13C NMR及無畸變極化轉移增強(distortionless enhancement by polarization transfer,DEPT)光譜數據中的醛羰基碳(δ C 201.1)、α,β-不飽和羰基碳(δ C 198.2)、酯羰基碳(δ C 172.1)及烯烴碳(δ C 142.9,CH；138.4,C)的共振說明了四個雙鍵等效物，表明化合物1的四環骨架。在1H NMR數據中觀察到一個烯烴質子(δ H 7.06,s)及兩個含氧次甲基(δ H 4.86,dd,J=11.0,4.5Hz；4.22,t,J=9.0Hz)的共振。以2D NMR分光分析(尤其是1H-1H化學位移相關光譜(COSY)及異核多鍵相關(HMBC)實驗)說明化合物1的平面結構及所有的1H及13C化學位移(參閱第1圖)，意指一種獨特的scalarin型二倍半萜類結構。化合物1具有在C-12的3-羥基丁醯氧基(3-hydroxybutanoyloxy)、在C-16/C-17的雙鍵、在C-24的酮基及在C-25的醛基。藉由比較化合物1的旋光度(+10.7)及化合物2的旋光度(+5.7)確定了3'R-構型。因此化合物1的結構具有(4S*,5S*,8R*,9R*,10S*,12R*,13S*,14S*,18R*,3'R*)-構型。
基於HR-ESI-MS(在m/z 537.3546[M+Na]+的離子鋒)及13C NMR數據，化合物2分子式為C32H50O5，意指化合物2比化合物1多一個CH2基團。除了化合物1在C-12的3-羥基丁醯氧基(3-hydroxybutanoyloxy)被取代為化合物2的3-羥基戊醯氧基(3-hydroxypentanolyoxy)之外，化合物2的NMR數據(表1)顯示與化合物1接近。再以從H2-29到H3-32的COSY關聯性及從H-12及H2-29到C-28的HMBC關聯性確認化合物2的結構。基於化合物1及2的NMR數據的相似度，化合物1及2均具有一致的相對構型。為了確定在3-羥基戊醯氧基的C-3'構型，以(-)-(R)-MTPA-C1及(+)-(S)-MTPA-Cl分別合成(S)-及(R)-MTPA酯類衍生物2s及2r。△δ-數值表明化合物2的3-羥基戊醯氧基為3'R-構型(結果未示出)。
海生萜類經由DNA損傷、基質金屬蛋白酵素(MMP)異常及半胱天冬酶(caspase)活化作用的細胞凋亡誘導作用：
本發明兩個新穎scalarane二倍半萜類(化合物1及2)以及化合物3(丁平基甲對苯二酚相關的代謝物)的抗增生功效是使用本領域技術人員熟知的MTT試驗來評估。包括血癌細胞株K562、Molt 4及HL60、前列腺癌細胞株LNCaP、大腸癌細胞株DLD-1及乳癌細胞株T-47D等的數株癌細胞株被使用來評估抗增生活性(參見表2)。化合物1對所有血癌細胞株及淋巴癌細胞株U937具有IC50=0.01μg/mL(2.08nM)的最有效細胞毒殺活性。在72小時處理後，化合物1對DLD-1、T-47D、LNCaP、Ca9-22及Cal-27細胞的IC50值分別為2.33、2.19、13.87、0.1及0.56μg/mL。化合物2對血癌細胞株K562、Molt 4及HL 60的IC50值分別為0.35、0.30及0.22μg/mL，化合物3對這些細胞株的IC50值分別為0.70、0.34及0.42μg/mL。由所屬技術領域中具有通常知識者所熟用之MTT試驗法證實Molt 4細胞株是最敏感的細胞株。為了偵測這些海生萜類的細胞毒殺功效是否與粒腺體相關的細胞凋亡有關聯，接 著以arnnexin-V/PI及JC-1染色評估Molts 4細胞中細胞凋亡數量及粒腺體膜電位分佈。在24小時後，化合物1、2及3在Molt 4細胞中細胞凋亡數量及粒腺體膜電位分佈是以劑量依賴方式(0、0.0625、0.125及0.25μg/mL)增加(結果未示出)。結果證實，這些海生萜類的細胞毒殺活性是透過粒腺體異常調控，而導致誘導出細胞凋亡。
為了確認本發明海生萜類誘導的DNA損傷是否參與Topo II活性的抑制作用，使用無細胞DNA切割試驗進行實驗，其使用酵素負調控的超螺旋pHOT1質體DNA。當以依託泊苷(etoposide，一種標準的Topo II毒物)處理超螺旋pHOT1質體DNA時，觀察到線型DNA(第2圖(A)第16道，控制組)。與控制組超螺旋DNA相較且在Topo IIα出現時導致形成超螺旋DNA產物，漸增濃度(0.08、0.312、1.25、5及20μg/mL)的化合物1顯著地抑制12、13、17、20及99%的DNA鬆弛(第2圖(A)第6-10道)。此外，化合物2顯著地抑制12、23、36、90及99%的DNA鬆弛(第2圖(A)第11-15道)，且化合物3顯著地抑制7、13、28、90及98%的DNA鬆弛(第2圖(A)第1-5道)。這些海生萜類抑制Topo II活性，以劑量依賴方式導致了超螺旋DNA鬆弛的抑制作用(第2圖(A))。再者，如無細胞系統所證明的，化合物1、2及3分別以1.98、0.37及0.43μg/mL的IC50值抑制Topo II活性。為了確認化合物1至3的細胞凋亡機制影響了γH2AX(DNA損傷的生物標記物)誘導作用，使用西方點漬分析測定測試γH2AX的活化作用。化合物1及2以劑量依賴方式顯著地增強γH2AX的表現，但在化合物3並未觀察到DNA損傷的活化作用(第2圖(B))。這些結果指出，這些化合物1至3可作為Topo IIα的有效催化抑制劑。
化合物3在活體內人類Molt 4腫瘤異種移植動物模式中抑制腫瘤生長：
化合物1及2在數個癌細胞株中誘導細胞凋亡。另一方面，藉由評估化合物3對於人類血癌細胞Molt 4在異種移植動物模式中腫瘤生長的抗腫瘤活性效果。將1×106個Molt 4細胞皮下接種於免疫缺陷無胸腺母小鼠的右脇部。在注射33天後，Molt 4細胞的腫瘤生長在化合物3(1.14μg/g)腹膜內注射的影響下顯著地被抑制。控制組在第33天的平均腫瘤尺寸為404.63mm3，然而在化合物3處理組的平均腫瘤尺寸為212.10mm3(參閱第3圖(A))。與對照組(p<0.05)相較，在化合物3處理組的腫瘤尺寸顯著地較低，而在小鼠體重並沒有顯著差異(參閱第3圖(B))。這些結果表示，化合物3在活體內異種移植模式中顯示出抗腫瘤效果。
化合物1參與Molt 4細胞中ROS生成、內質網(ER)壓力及DNA損傷的誘導作用之細胞凋亡效果：
氧化壓力是由活性含氧物(ROS)過度表現所證實，且無法由可用的抗氧化物機制平衡。粒腺體為超氧化陰離子(臭氧)的主要產生位置，而本發明化合物1可破壞粒腺體完整性。使用流式細胞分析，以螢光素羧基衍生物(carboxy-H2DCFDA染劑)確定由化合物1誘導的細胞內ROS形成作用。如第4圖(A)所示，與控制組的平均螢光指數(MFI)相較，以化合物1(0.0625μg/mL)處理0.5、1、2及3小時將分別導致ROS含量2.09、1.51、1.06及1.01倍的增加，而呈現ROS生成逐漸增加的趨勢(*** p<0.001)。此外，ROS生成作用可誘導ER壓力朝向與粒腺體相關的細胞凋亡。為了進一步研究是否ER壓力參與了由化合物1誘導的細胞凋亡效果，使用西方點漬分析來確認ER壓力相關蛋白質的表現。收取Molt 4細胞，製備其溶胞產物(lysate)，並且溶胞產物經過SDS-PAGE電泳解析接著西方點漬分析，GAPDH作為上樣控制組。如第4圖(B)所示，化合物1以時間依賴方式促進Bip、Chop、Grp 94的表現量以及ATF6的活化及切割作用，但是抑制PERK 及IRE 1的表現量。再者，使用螢光鈣離子指示劑Fluo 3來評估化合物1在釋放細胞內Ca2+的效果。如第4圖(C)所示，流式細胞分析結果顯示，與控制組的MFI相較，化合物1處理組在不同時間間隔(0.5、1、2、3、6及18小時)分別誘導了細胞內Ca2+累積量的1.03、1.05、1.06、1.37、2.41及1.06倍的增加，表明著ER壓力是受化合物1、接著氧化還原壓力誘導。進一步而言，如第4圖(D)所示，PARP、caspase-8及caspase-9切割作用是以時間依賴方式顯著的增加。在第4圖(D)中，使用西方點漬分析也觀察到caspase-3及caspase-7以及γH2AX的誘導作用。為了確認化合物1誘導了Molt 4細胞中的DNA損傷，使用在中性電泳條件下的慧星試驗。因此，測定化合物1(0.0625μg/mL)在不同時間間隔(0、3、6及9小時)對於核DNA完整性程度的影響。如第4圖(E)所示，化合物1在Molt 4細胞中增加DNA遷移作用的程度。如同在慧星試驗中不正常拖尾大小所表明的，DNA遷移作用是以隨時間增加的雙股斷裂(DSB)誘導作用來表示。
化合物1為Hsp90的有效抑制劑：
粒腺體已知是ROS產生的細胞內關鍵位置，且ROS出現來可導致1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(mPTP)開啟。粒腺體內膜中的抗氧化物-微粒體GST1-可與粒腺體過渡性通透(MPT)調節蛋白質(例如ANT及/或CypD)形成有助於粒腺體調控的細胞死亡的MPT孔。此外，腫瘤細胞的粒腺體恆定作用是受胞器特定的Hsp90伴護蛋白質網路(chaperone network)調節。為了研究Hsp90的抑制作用是否參與了由化合物1誘導的細胞凋亡，以具有結晶結構的Hsp90分子嵌合來洞察化合物1的鍵結模式。相較於第一個Hsp90 N端抑制劑(17-AAG,-6.63Kcal/mol)，化合物1以-10.93Kcal/mol的鍵結能嵌合至Hsp90的N端區域，推測因為化合物1以3.27Å及3.66Å的距離與GLY132及GLY135形成非典型的氫鍵；與胺基酸殘基 LYS112(1.92Å)、PHE138(2.31Å及2.45Å)及ASN106(2.45Å)形成典型氫鍵；與ALA55(3.63及3.69Å)及MET98(3.85及4.96Å)形成斥水鍵結(結果未示出)。根據分子嵌合實驗，化合物1以比17-AAG(10.83μM)更有效的抑制常數9.67nM(>1430倍)抑制Hsp90。為了全然理解化合物1與17-AAG之間在活性上的差異，以MTT試驗進一步測定在Molt 4細胞中的17-AAG抗增生活性。如第5圖(A)所示，以漸增濃度的17-AAG(0、0.4、2及10μM)處理Molt 4細胞24小時抑制了細胞生長，其IC50值為4.2μg/mL(7.2μM)。根據使用Molt 4細胞的MTT結果，化合物1的抗增生活性(0.01μg/mL,19.1nM)比17-AAG高377倍。
Hsp90抑制劑誘導了Hsp70的取決於熱休克因子1(HSF 1)表現量，且HSF 1的基因缺失減小了Hsp90與激酶底物蛋白質的關聯性。Hsp70的誘導作用是Hsp90與N端抑制作用的生物標記物。針對了解Hsp90功能及Hsp70與Hsp90底物表現量之間的關係，以化合物1(0.0625μg/mL)處理Molt 4細胞不同時間間隔。首先，化合物1處理組並未顯著地延遲Hsp90蛋白質表現量。Hsp70表現量以時間依賴方式增加，如同在Hsp90抑制作用後作為熱休克反應(HSR)的標記物，而令人驚訝地在Molt 4細胞的HSF 1蛋白質表現受到化合物1處理組而延遲。而且，如第5圖(B)所示，Hsp90底物蛋白質被抑制，包括p70S6k、NFκB、Raf-1、p-GSK3β、MEK 1及XIAP(促進細胞凋亡蛋白質)、MDM 2及Rb2(致癌基因蛋白質)及CDK4(細胞週期調節蛋白質)、HIF 1及HSF1(轉錄因子)。大多數熱休克蛋白質累積在細胞內位置，其確定了細胞是否正走向死亡或分化。再者，利用共軛焦顯微鏡使用免疫螢光來確認回應化合物1處理組的Hsp70位置。與西方點漬分析結果一致的是，Hsp70位置佔優勢地累積於細胞質液中，且隨時間累積(結果未示出)。
本發明的優點：
本發明由海綿動物Carteriospongia sp.的乙酸乙酯萃取物分離出兩種scalarane二倍半萜類(化合物1及2)及已知的丁平基甲對苯二酚相關的代謝物(化合物3)。所有化合物1至3可用於抗癌、降低癌細胞存活率及拓樸異構酶II催化活性。化合物1導致大量的CA2+釋出，干擾粒腺體膜電位，意指細胞凋亡效果是透過粒腺體異常來調控。由ROS生成作用、ATF6切割作用及Chop表現量，證實了化合物1處理組首先刺激了ROS生成作用，擾亂Bip/IRE1/PERK訊息路徑，且活化與ER壓力有關連的Grp94/ATF6/Chop訊息路徑，且化合物1在人類血癌細胞株Molt 4的細胞毒殺效果與誘導ER壓力有關。由分子嵌合及無細胞系統之實驗，證實了化合物1具有有效的Hsp90及Topo II催化抑制活性。以化合物1處理Mplt 4細胞將會抑制Hsp70的底物蛋白質表現及累積於細胞質液，而且會降低轉錄因子(HSF- 1及HIF 1)表現量。
因此，本發明化合物1至3可用於抑制癌症、作為拓樸異構酶II抑制劑及依據製藥技術方法製備成為抗癌醫藥組合物。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims (9)

  1. 一種拓樸異構酶II抑制劑，包括式(I)化合物：
    Figure TWI651088B_C0001
    其中，R1為-CH3及-C2H5其中之一。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的拓樸異構酶II抑制劑，更包括式(II)化合物：
    Figure TWI651088B_C0002
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的拓樸異構酶II抑制劑，其中該拓樸異構酶II抑制劑抑制癌細胞的拓樸異構酶II的活性，且該癌細胞涉及的癌症係選自由血癌、淋巴癌、口腔癌、前列腺癌、大腸癌、乳癌及其組合所組成的群組其中之一。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的拓樸異構酶II抑制劑，其中該血癌的癌細胞選自由人類慢性骨髓性白血病細胞株K562、人類急性淋巴細胞白血病細胞株Molt 4及人類前骨髓性白血病細胞株HL 60所組成的群組其中之一，該淋巴癌的癌細胞為細胞株U937及Sup-T1其中之一，該口腔癌的癌細胞為細胞株Ca9-22及cal-27其中之一，該前列腺癌的癌細胞為細胞株LNCaP，該大腸癌的癌細胞為細胞株DLD-1，該乳癌的癌細胞為細胞株T-47D。
  5. 一種將申請專利範圍第1項所述的拓樸異構酶II抑制劑製備用於治療癌症的醫藥組合物的用途，其中該癌症是淋巴癌和口腔癌的其中之一。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的用途，其中該拓樸異構酶II抑制劑中的式(I)化合物係以一製備方法製備，該製備方法包括：(a)提供一海綿動物；(b)以乙酸乙酯萃取該海綿動物，以獲得一乙酸乙酯萃取物；(c)濃縮該乙酸乙酯萃取物，以獲得一殘留物；以及(d)層析該殘留物，以獲得該式(I)化合物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該海綿動物為Carteriospongia sp.。
  8. 如申請專利範圍第6項所述的用途，其中該式(I)化合物為一熱休克蛋白質90(Hsp90)抑制劑。
  9. 如申請專利範圍第6項所述的用途，其中步驟(d)更包括：(d1)以正己烷、極性漸增的正己烷-乙酸乙酯混合物及純丙酮對該殘留物進行矽膠管柱層析，以獲得複數個分餾物；以及(d2)以正相高效能液相層析純化該複數個分餾物至少其中之一，以從被純化的分餾物獲得該式(I)化合物。
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