TWI631953B - 靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途 - Google Patents

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Abstract

本案提供一種用於製備抗癌之醫藥組合物的用途,其係先以濃度為1-5mg/ml之靈芝萃取物投藥一預定時間後,再以濃度為3-10μM之兩性黴素B投藥,透過此分段方式給藥以增進該兩性黴素B的抑癌效力。

Description

靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途
本案係關於一種抗癌醫藥組合物及其醫藥用途,尤指一種靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途。
根據近年來的統計,惡性腫瘤一直都位居國人十大死因之首,其中又以肺癌、肝癌、結腸直腸癌為癌症死亡之前三大癌症。因此,如何有效治療癌症及降低癌症死亡率一直是醫藥界所致力努力的目標。
由於文明快速發展,生活環境中含有許多無形的有害物質,長時間暴露在此種環境中將對身體有所傷害,而經過流行病學及統計學研究,顯示大約有八成的癌症是由外在因素所引起,其中包括生活方式的改變、傳染病造成之感染因素、職業及其環境造成的因素等,而當中又以化學致癌物為最危險因子,化學致癌物一旦經人體吸收進入體內經過代謝活化,將可能導致細胞內基因發生一連串的突變,使細胞失去控制而持續不斷分裂生長,最終導致腫瘤細胞之形成。
也因此,各種針對癌症的治療方法不斷被研發,包含化療、放射性治療、免疫療法、單株抗體療法、及基因療法等,然而其中亦突顯出許多問題,例如化療所產生一連串的副作用,或者病患對藥物產生抗藥性等。
另一方面,癌症治療也開始往天然食物研究,篩選出具有抗癌潛力之功能性食物或營養食物也變成一個重要的方向,在過去研究中,亦有許多中草藥被推 測具有抗癌效果。因此,本發明即在萃取靈芝中的有效成分,並研究其與兩性黴素B之協同作用,以開發更具療效的抗癌醫藥組合物。
本案之目的在於研究靈芝萃取物與兩性黴素B之協同作用,以開發更具療效的抗癌醫藥組合物。
為達上述目的,本案之一較佳實施態樣為提供一種抗癌醫藥組合物,其係包含:一靈芝萃取物,其濃度為1-5mg/ml;以及一兩性黴素B,其濃度為3-10μM,其中,該靈芝萃取物及該兩性黴素B係以分段方式給藥,先以該靈芝萃取物投藥一預定時間後再以該兩性黴素B投藥,以增進該兩性黴素B的抑癌效力。
在一實施例中,該靈芝係為赤芝(Ganoderma lucidum)。
在一實施例中,該靈芝萃取物係以酒精萃取法萃取而得,且萃取自靈芝之子實體。
在一實施例中,該靈芝萃取物包含固醇及三萜類。
在一實施例中,該兩性黴素B之濃度為3-5μM。
在一實施例中,該預定時間為12-48小時,且較佳為24小時。
在一實施例中,該抗癌醫藥組合物係用於治療肝癌。
在一實施例中,該抗癌醫藥組合物係用於治療肺癌。
第1A及1B圖顯示實例1之Hep G2細胞之實驗結果。
第1C及1D圖顯示實例1之Hep 3B細胞之實驗結果。
第1E及1F圖顯示實例1之Hep 5J細胞之實驗結果。
第2A及2B圖顯示實例2之Hep G2細胞之實驗結果。
第2C及2D圖顯示實例2之Hep 3B細胞之實驗結果。
第2E及2F圖顯示實例2之Hep 5J細胞之實驗結果。
第3A圖顯示實例3之A549細胞之實驗結果。
第3B圖顯示實例3之H460細胞之實驗結果。
體現本案特徵與優點的一些典型實施例將在後段的說明中詳細敘述。應理解的是本案能夠在不同的態樣上具有各種的變化,然其皆不脫離本案的範圍,且其中的說明及圖式在本質上係當作說明之用,而非用以限制本案。
根據文獻得知,有些藥用真菌含有豐富的三萜類(triterpenoids)、多醣體(polysaccharides)及固醇(sterols),其對於保護肝臟、促進肝細胞再生、對抗肝癌有相當程度的療效。此外,兩性黴素B(Amphotericin B,簡稱AmB)為一種多烯類抗黴菌藥,藉由與真菌細胞膜上所嵌之麥角固醇(Ergosterol)結合產生孔洞,而造成細胞膜通透性的改變,使得真菌細胞產生裂解而死亡。因此,本發明進一步研究靈芝萃取物及兩性黴素B的協同作用,以致力開發更具療效的抗癌醫藥組合。
本發明主要係檢測靈芝萃取物是否能促進兩性黴素B抑制人類肝癌細胞之效力。本發明係選用赤芝(Ganoderma lucidum)進行酒精萃取,以取得靈芝酒精萃取物(簡稱靈芝酒萃物),其係將赤芝子實體切片打成粉末,取10克加入500ml之99%酒精,再置於迴轉式振盪器(200rpm)持續振盪24小時,再過濾收取濾液,並減壓濃縮至乾燥,秤重後計算回收率,於4℃避光保存。
當然,本發明之靈芝萃取物不限於以酒精萃取所得之萃取物,其他能萃取出靈芝之固醇及三萜類之萃取方法及萃取物皆適用於本發明,例如亦可利用具有不同極性的有機溶劑(如正己烷)來進行萃取,但不以此為限。
以下以實驗進一步說明本發明所開發之醫藥組合物實例。
實例1
本實例係以Hep G2、Hep 3B及Hep 5J等人類肝癌細胞的細胞株來進行實驗,並以96格(well)細胞培養盤進行培養。試驗方法主要分成兩組,一組是先以靈芝酒萃物預處理24小時再以兩性黴素B處理48小時,另一組則是以靈芝酒萃物及兩性黴素B共同處理48小時。
在預處理實驗組中,細胞係先以0、1、2.5及5mg/ml之靈芝酒萃物處理24小時之後,再以0~80μM遞增濃度之兩性黴素B處理48小時,之後進行細胞存活率分析(MTT assay)。在共同處理實驗組中,細胞則係以0、1、2.5及5mg/ml之靈芝酒萃物及0~80μM遞增濃度之兩性黴素B共同處理48小時,之後進行細胞存活率分析(MTT assay)。細胞存活率分析係將MTT染劑(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)加入每一培養格並繼續培養45-60分鐘,之後移除培養液並置換成DMSO(dimethyl sulfoxide),再檢測溶液在550nm之吸光度(optical density,OD)。
第1A及1B圖顯示實例1之Hep G2細胞之實驗結果。第1A圖為預處理實驗組,第1B圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第1A圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml皆能明顯促進兩性黴素B抑制Hep G2生長之能力,使得兩性黴素B在用藥濃度為5μM時即可抑制約75%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。然而由第1B圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml及兩性黴素B皆明顯拮抗兩性黴素B抑制Hep G2生長之能力,且此一拮抗能力與靈芝酒萃物劑量成正比。
第1C及1D圖顯示實例1之Hep 3B細胞之實驗結果。第1C圖為預處理實驗組,第1D圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細 胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第1C圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物2.5及5mg/ml皆能明顯促進兩性黴素B抑制Hep 3B生長之能力,且抑制能力與靈芝酒萃物劑量成正比,其中當靈芝酒萃物濃度為5mg/ml且兩性黴素B濃度為10μM時可抑制約75%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。然而由第1D圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物及兩性黴素B則無明顯效果。
第1E及1F圖顯示實例1之Hep 5J細胞之實驗結果。第1E圖為預處理實驗組,第1F圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第1E圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物5mg/ml能明顯促進兩性黴素B抑制Hep 5J生長之能力,其中當靈芝酒萃物濃度為5mg/ml且兩性黴素B濃度為10μM時可抑制超過85%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果,但靈芝酒萃物1及2.5mg/ml預處理則與兩性黴素B略呈拮抗效果。而由第1F圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml及兩性黴素B皆明顯拮抗兩性黴素B抑制Hep 5J生長之能力,且此一拮抗能力與靈芝酒萃物劑量成正比。
由上述實例1之結果可知,預處理靈芝酒萃物24小時後可明顯促進兩性黴素B對Hep G2、Hep 3B及Hep 5J等三株人類肝癌細胞之抑癌效力,然而此促進作用在共同處理時並不存在,甚至拮抗兩性黴素B之抑癌效力。因此可推論,適當使用靈芝酒萃物,例如以足夠劑量進行預處理,可有效促進兩性黴素B抑制人類肝癌細胞之能力,故可發展為更具療效的抗癌醫藥組合物。
實例2
實例2之實驗方法與實例1相同,僅為不同批次的細胞實驗。
第2A及2B圖顯示實例2之Hep G2細胞之實驗結果。第2A圖為預處理實驗組,第2B圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活 細胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第2A圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml皆能明顯促進兩性黴素B抑制Hep G2生長之能力,且抑制能力與靈芝酒萃物劑量成正比,其中當靈芝酒萃物濃度為5mg/ml且兩性黴素B濃度為4μM時可抑制約80%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。然而由第2B圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml及兩性黴素B反而拮抗兩性黴素B抑制Hep G2生長之能力。
第2C及2D圖顯示實例2之Hep 3B細胞之實驗結果。第2C圖為預處理實驗組,第2D圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第2C圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物1、2.5及5mg/ml皆能明顯促進兩性黴素B抑制Hep 3B生長之能力,且抑制能力與靈芝酒萃物劑量成正比,其中當靈芝酒萃物濃度為5mg/ml且兩性黴素B濃度為5μM時可抑制約75%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。而由第2D圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物及兩性黴素B同樣能明顯促進兩性黴素B抑制Hep 3B生長之能力。
第2E及2F圖顯示實例2之Hep 5J細胞之實驗結果。第2E圖為預處理實驗組,第2F圖為共同處理實驗組,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,四條曲線則分別為靈芝酒萃物濃度為0、1、2.5及5mg/ml之曲線。由第2E圖之圖示結果可知,相較於靈芝酒萃物濃度為0之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物2.5及5mg/ml能明顯促進兩性黴素B抑制Hep 5J生長之能力,其中當靈芝酒萃物濃度為5mg/ml且兩性黴素B濃度為5μM時可抑制約75%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果,但靈芝酒萃物1mg/ml預處理則與兩性黴素B略呈拮抗效果。而由第2F圖之圖示結果可知,共同處理靈芝酒萃物及兩性黴素B反而拮抗兩性黴素B抑制Hep 5J生長之能力。
由上述實例2之結果可知,預處理靈芝酒萃物24小時後可明顯促進兩性黴素B對Hep G2、Hep 3B及Hep 5J等三株人類肝癌細胞之抑癌效力,與實例1之結果近似。
根據本案之實例,預處理靈芝酒萃物可明顯促進兩性黴素B的抑癌效力,其中,靈芝酒萃物的有效濃度為1-5mg/ml,兩性黴素B的有效濃度為3μM以上,但兩性黴素B若劑量過高將產生較嚴重的副作用,因此在臨床上用藥劑量須小心控制,因此,根據實例1及實例2實驗結果,安全且有效濃度約為3-10μM,且較佳為3-5μM。另外,靈芝酒萃物預處理的時間不限於24小時,亦可為12-48小時。
推論預處理靈芝酒萃物可明顯促進兩性黴素B的抑癌效力之原理在於,癌細胞細胞膜中的固醇組成與正常細胞有所不同,其中癌細胞的固醇具有較多的不飽和雙鍵,因此細胞較柔軟易移動與轉多,正常細胞則無此現象。由於本案之靈芝酒萃物含有真菌固醇與三萜類,且其相較於正常細胞的固醇具有更多的雙鍵,在癌細胞快速複製分裂的過程中,容易取代癌細胞上的固醇,且由於雙鍵更多,與兩性黴素B的親和力更大,使得兩性黴素B容易與癌細胞膜上的真菌固醇結合,進而產生孔洞造成細胞膜通透性的改變,因而使癌細胞產生裂解而死亡,故達成標靶治療的功效。由上述機制可知,本發明之抗癌醫藥組合物不限於用來治療肝癌,亦可用來治療其也癌症,例如肺癌及結腸直腸癌等。
以下實例更進一步驗證本發明之抗癌醫藥組合物亦可用來治療其他癌症。
實例3
本實例係以A549及H460等人類肺癌細胞的細胞株來進行實驗,並以96格(well)細胞培養盤進行培養。試驗方法係先以2.5mg/ml之靈芝酒萃物預處理24小時再以兩性黴素B處理48小時。
第3A圖顯示實例3之A549細胞之實驗結果,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,線條Con係未以靈芝酒萃物預處理之曲線,線條GT則 為以2.5mg/ml之靈芝酒萃物預處理之曲線。由第3A圖之圖示結果可知,相較於未以靈芝酒萃物預處理之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物2.5mg/ml可明顯促進兩性黴素B抑制A549細胞生長之能力,使得兩性黴素B在用藥濃度為5μM時即可抑制90%以上之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。
第3B圖顯示實例3之H460細胞之實驗結果,其中橫軸為兩性黴素B濃度,縱軸為存活細胞比例,線條Con係未以靈芝酒萃物預處理之曲線,線條GT則為以2.5mg/ml之靈芝酒萃物預處理之曲線。由第3B圖之圖示結果可知,相較於未以靈芝酒萃物預處理之曲線(亦即僅以兩性黴素B處理),預先處理靈芝酒萃物2.5mg/ml可明顯促進兩性黴素B抑制H460細胞生長之能力,使得兩性黴素B在用藥濃度為5μM時即可抑制約85%之癌細胞生長,顯現相當好的抑癌效果。
綜上所述,本發明提供一種新的抗癌醫藥組合物,其包含靈芝萃取物及兩性黴素B,其中,以靈芝萃取物對癌細胞預處理一段時間後,再加入兩性黴素B,可明顯增進兩性黴素B的抑癌效力。換言之,靈芝萃取物及兩性黴素B係以分段方式給藥,先以靈芝萃取物投藥一預定時間後再以兩性黴素B投藥,以增進兩性黴素B的抑癌效力。由於本發明之抗癌醫藥組合物較佳可抑制75%以上之癌細胞生長,且可降低兩性黴素B的用藥劑量,故本案極具產業價值,爰依法提出申請。
本案得由熟習此技術之人士任施匠思而為諸般修飾,然皆不脫如附申請專利範圍所欲保護者。

Claims (5)

  1. 一種靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途,其中,所述抗癌醫藥套組包括濃度介於1mg/ml至5mg/ml之間的該靈芝酒萃物以及濃度介於3μM至10μM之間的一兩性黴素B;其中,該用途係包括:以濃度為1-5mg/ml的該靈芝酒萃物投藥至人類肝癌細胞或人類肺癌細胞之後,再於24小時內以濃度為3-10μM的該兩性黴素B投藥至人類肝癌細胞或人類肺癌細胞,藉此方式顯著提升該兩性黴素B抑制人類肝癌細胞或人類肺癌細胞生長之能力;其中,所述兩性黴素B抑制人類肝癌細胞或人類肺癌細胞生長之能力係與該靈芝酒萃物的濃度成正比。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途,其中,所述靈芝酒萃物係以酒精萃取法自一赤芝(Ganoderma lucidum)的子實體萃取而得。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途,其中,所述靈芝酒萃物係至少包含固醇及三萜類。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途,其中,所述人類肝癌細胞可為下列任一者:Hep G2、Hep 3B或Hep 5J。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之靈芝酒萃物於製備抗癌醫藥套組的用途,其中,所述人類肺癌細胞可為下列任一者:A549或H460。
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Chen,et al."Pretreatment with an Ethanolic Extract of Taiwanofungus camphoratus (Antrodia camphorata) Enhances the Cytotoxic Effects of Amphotericin B",J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 11255–11263. *
VT Nguyen,et al."Cytotoxic and anti-angiogenic effects of lanostane triterpenoids from Ganoderma lucidum",Phytochemistry Letters 12,June 2015,69–74. *

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