TWI625137B

TWI625137B - Method for preparing nano turmeric granules by co-coating curcumin with cerium oxide and chitosan

Info

Publication number: TWI625137B
Application number: TW105110268A
Authority: TW
Inventors: Rui-Lin Gong; ke-liang Zhang; zheng-sheng Zhang; xiang-ping Guo
Original assignee: Gong rui lin
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2018-06-01
Also published as: TW201733570A

Abstract

本發明係提供一種利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒(NACU)之製法，其作法係以醋酸水溶液配製幾丁聚醣溶液，並以醋酸鈉水溶液配製矽酸鈉溶液；接著，以預定重量百分比，依序加入矽酸鈉溶液、薑黃素植物油溶液和幾丁聚醣溶液，加以均質；經透析至少一預定期間後，高速離心去除上層液，沉澱物以二次水沖散清洗，且重複數次離心及沖散步驟；接著，放入超低溫冷凍櫃，並接著進行冷凍乾燥，即製成NACU；經對倉鼠之實驗結果顯示，不僅能有效解決薑黃素易氧化且易因紫外線照射而分解之問題，尚能修復倉鼠因順鉑誘導而受損之生殖能力。

Description

利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒之製法

本發明係關於薑黃顆粒，尤指一種利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒之製法，以期不僅能有效解決薑黃素易氧化且易因紫外線照射而分解之問題，且能有效提升動物對薑黃素之利用率，進而發揮薑黃素對動物生殖能力受損之修復效果。

近年來，奈米材料(Nanomaterials)在不同產業的應用，已受到世界各國普遍地重視，其中，由於二氧化矽顆粒(amorphous silica)的製造過程並不複雜，且成本低廉，使得二氧化矽顆粒得以被廣泛地應用於生物應用科學的研究中，且早已被添加至許多市售的營養補充食品、保養用品(如：玻尿酸)或動物飼料中。然而，根據研究及實驗報告顯示，當以乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，簡稱LDH)及細胞存活率分析(MTT assay)兩種方法對二氧化矽顆粒進行細胞毒性檢驗時，意即，將許多組正常的纖維組織母細胞(如：肺細胞、皮膚的纖維組織母細胞)及腫瘤細胞(如：結腸、胃及肺的腫瘤細胞)，分別與由低至高劑量(dose)的二氧化矽顆粒共同放置於一培養皿中，觀察各該細胞(包括正常的纖維組織母細胞及腫瘤細胞)之後續發展，不僅於LDH之檢測方式發現高劑量下的二氧化矽顆粒將導致所有受測細胞之細胞膜受損外，以MTT檢測方式進行細胞增殖檢測時，亦發現所有受測細胞於高劑量下所表現出的增殖速度是減緩的，而受測細胞於低劑量下所表現出的增殖速度則尚屬正常。由此可知，人類或動物服用低量的二氧化矽雖對於體內細胞無害，但若人們或動物持續服用更多含有二氧化矽的營養補充食品時，則人體或動物體內所累積的高劑量二氧化矽顆粒，仍有可能對人體或動物體內不同器官之細胞(如：肺、肝等)產生有害之毒素(toxicity)，而這些累積於不同器官內之毒素，將逐漸地使體內不同器官之細胞成長減緩，或傷害體內不同器官細胞之細胞膜，最後，導致器官損壞，此外，前述二檢驗方式皆發現纖維組織母細胞與腫瘤細胞於接觸二氧化矽顆粒時，纖維組織母細胞較腫瘤細胞更容易受損。

有鑒於此，發明人曾開發設計出一種「由二氧化矽與幾丁聚醣所複合而成之材料及其製法」，且已獲准發明專利權在案(即台灣第3447338號發明專利權)，期藉由二氧化矽與幾丁聚醣所複合而成之奈米顆粒，能大幅降低二氧化矽之毒素及其對動物體內細胞所產生之負面影響。

按，薑黃素(curcumin)是薑黃(turmeric)的主要功效成分，為一低分子量多酚類化合物，其化學特性在1910年被首次公開，近三十年來，也有數百篇相關文獻指出，薑黃素在抗氧化、抗發炎及癌症相關運用上的潛力，且清楚指出，薑黃素不僅能抑制動物體內肝臟的微粒體、紅血球細胞膜及大腦的脂質過氧化運動，且由餵食薑黃素的糖尿病鼠體實驗亦發現，薑黃素能改善糖尿病鼠體內非酵素性抗氧化能力，進而降低脂質過氧化情形；另，許多不同之研究及實驗亦發現，薑黃素能阻斷花生四烯酸之代謝，進而減少發炎介質prostaglandins、leukotrienes、thromboxanes及NO、TNF-α及IL-12之生成；此外，雖然於2003年有研究及提及，以薑黃素體外處理的精蟲(sperm)，其活動力有下降的趨勢，然而，在後續的許多動物實驗結果中則發現，飲食中添加薑黃素並不會影響老化，且能有效促進幼鼠之生殖功能。

雖然，薑黃素有諸多優良之功效，但在臨床數據中卻顯示，其生物利用率極低，且為相當不安定的化合物，容易氧化或受到紫外線照射而分解，造成應用上的瓶頸。有鑒於此，如何利用二氧化矽(silica)與幾丁聚醣(Chitosan)所複合而成之奈米顆粒(nanoparticles)，提供一種高效率的載體(highly effective carrier)，用以包覆薑黃素，以有效解決薑黃素易氧化且易因紫外線照射而分解之問題，且有效提升動物對薑黃素之利用率，進而發揮薑黃素對動物生殖能力受損之修復效果，使其能成為一種價格普及的保健食品，即成為本發明在此欲解決之一重要課題。

發明人經過長久努力研究與實驗，終於開發設計出本發明之一種「利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒之製法」，期藉由本發明的提出，令薑黃素能被有效利用，且增強薑黃素成份對修復動物生殖能力損傷之效果，使其成為一種價格普及的保健食品，以對社會大眾的身體保健有所貢獻。

本發明之一目的，係提供一種利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒(Nanocurcumin，以下簡稱NACU)之製法，係以0.1±0.05M(莫耳濃度)之醋酸水溶液配製0.82±0.5%(w/w)之幾丁聚醣溶液，並以0.1±0.05M之醋酸鈉水溶液配製0.82±0.5%(w/w)之矽酸鈉溶液，再用醋酸分別調整上述溶液之pH值為4.6±1.5；接著，以10±1：1 ±0.5：1±0.5之重量比，依序加入矽酸鈉溶液、薑黃素植物油溶液和幾丁聚醣溶液，並以均質機加以均質成混合溶液；經透析至少15小時後，以高速離心去除上層液，沉澱物以二次水沖散清洗，且重複數次離心及沖散之步驟；最後，放入超低溫冷凍櫃冰凍，並接著進行冷凍乾燥，即能獲得幾丁聚醣與二氧化矽共同包覆薑黃素所形成之NACU。

本發明之另一目的，係該植物油為橄欖油。

經過對倉鼠之實驗結果顯示，NACU不僅能有效解決薑黃素易氧化且易因紫外線照射而分解之問題，對於該等倉鼠已因順鉑(Cisplatin，以下簡稱CP)之誘導而受損之生殖能力亦有明顯之修復效果，且適當濃度之NACU尚能有效增加倉鼠精子之濃度、活動力，減少形態異常精子之比例，並顯著降低倉鼠精子中活性氧類(Reactiveoxygen species，以下簡稱ROS)物質的生成量及血漿、睪丸和精子內脂質過氧化終產物(Malondialdehyde，以下簡稱MDA)的含量，因此，證實了NACU確能顯著提升動物對薑黃素之利用率，以發揮薑黃素所具備之前述諸多效果。

為便貴審查委員能對本發明之目的、技術特徵及其功效，做更進一步之認識與瞭解，茲舉實施例配合圖式，詳細說明如下：

〔習知〕

無

〔本發明〕

100~105‧‧‧步驟

第1圖係本發明之流程示意圖；第2圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠體重影響之實驗數據圖；第3圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠精子中ROS含量影響之實驗數據圖；第4圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠內超氧陰離子濃度影響之實驗數據圖；第5圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠精子中NO釋放影響之實驗數據圖；第6圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠精子形成量影響之實驗數據圖；及第7圖係本發明之NACU對CP誘導倉鼠血漿形成量影響之實驗數據圖。

按，順鉑(CP)是一個含鉑的抗癌藥物，許多研究顯示，男性癌症病患若是接受CP等抗癌劑的治療，該等抗癌劑會直接或間接誘發過量活性氧類(ROS)物質的產生，ROS是生物有氧代謝過程中的一種副產品，包括氧離子、過氧化物和含氧自由基等，這些粒子相當微小，且由於存在未配對的自由電子，而十分活躍，因此，過高的活性氧水平不僅會對細胞和基因結構造成損壞，亦會對睪丸及精子造成傷害，進而降低動物之生殖能力。

有鑒於此，發明人乃思及，將已因CP誘導而生殖能力受損之倉鼠，作為動物實驗之對象，以驗證本發明利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素所製成之奈米薑黃顆粒(NACU)，是否能有效解決薑黃素易氧化且易因紫外線照射而分解之問題？且是否對於該等倉鼠已受損之生殖能力能發揮明顯之修復效果。請參閱第1圖所示，本發明利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成NACU之製法，主要包括下列步驟：(100)以0.1±0.05M之醋酸水溶液與幾丁聚醣配製成0.82±0.5%(w/w)之幾丁聚醣醋酸水溶液，M係莫耳濃度，代表1公升溶液中所含溶質莫耳數，單位為莫耳/升；w/w則代表重量百分比；(101)以0.1±0.05M之醋酸鈉水溶液配製成0.82±0.5%(w/w)之矽酸鈉溶液；(102)再以醋酸調整上述溶液至pH值分別為4.6±1.5；(103)接著，以10±1：1±0.5：1±0.5之重量比，依序加入矽酸鈉溶液、薑黃素植物油溶液和幾丁聚醣溶液，並以均質機加以均質成一混合溶液，以使水相(W)之幾丁聚醣與矽酸鈉能包覆油相(O)之薑黃素，進而形成包覆薑黃素之二氧化矽幾丁聚醣複合奈米顆粒。其中，薑黃素植物油溶液中薑黃素與植物油之配製比為15±5%(w/w)，該植物油係以橄欖油為最佳；(104)經透析至少15小時後，以高速離心12000±2000 x g，去除上層液，沉澱物以二次水沖散清洗，重複前述離心及沖散之步驟數次；(105)最後，將沉澱物放入超低溫冷凍櫃，並接著進行冷凍乾燥，即能獲得本發明之幾丁聚醣與二氧化矽共同包覆薑黃素所形成之奈米薑黃顆粒(NACU)。

本發明進行動物實驗時所使用之倉鼠，係購自國家動物中心，為4週齡之雄性倉鼠，屬於Syrian hamster品系；飼養環境之相對溼度維持在60%，室溫25±2℃，光照時間為6：00-18：00之12小時光照循環，且每2天更換墊料一次；在餵食方面，首先，以一般飼料馴養1週，飼料係購自台灣雍立貿易股份公司，其成分包含粗蛋白(Crude protein)23.0%、粗脂肪(Crude fat)4.5%、粗纖維(Crude fiber)6.0%、灰粉(Ash)8.0%、礦物質(Added minerals)2.5%及碳水化合物(Carbohydrate)56%；俟倉鼠適應飲食與環境後，將實驗動物分成下列六組，每組四隻：(1)控制組：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射生理食鹽水，且連續六天，對每隻倉鼠管餵植物油(如：橄欖油…等)；(2)CP組：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射一單位劑量之順鉑(CP)；(3)正控制組：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射一單位劑量CP，且連續六天，對每隻倉鼠管餵褐藻萃取物(Fucoxanthin，簡稱FX)：(4)實驗組1x NACU：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射一單位劑量CP，且連續六天，對每隻倉鼠管餵一單位劑量(含0.2g/kg/day)之NACU；(5)實驗組2x NACU：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射一單位劑量CP，且連續六天，對每隻倉鼠管餵二單位劑量之NACU；及(6)實驗組5x NACU：以腹腔注射，對每隻倉鼠注射一單位劑量CP，且連續六天，對每隻倉鼠管餵五單位劑量之NACU。

全部組別在第七天進行犧牲，且取其精子、血液與臟器，進行下列相關指標之生化分析：(1)精子品質之評估：取出副睪後，將副睪放入含有8ml Roswell Park Memorial Institute(RPMI)培養基的燒杯中，以解剖剪刀剪三刀(不要剪斷副睪)後，在搖擺器上搖晃10分鐘，再以190 x g離心5分鐘，於37℃，5% CO2的培養箱中培養30分鐘，收集上層活動力較好的精子進行實驗，計算精子總數、活動力和異常數之比例；(2)精子內ROS含量之測定：將各組的精子濃度調整至2×106sperm/mL，吸取1mL，再加入dichlorodihydrofluorescein diacetate(簡稱DCFH-DA)進行染色並使最終濃度為20μM。精子與DCFH-DA於 37℃反應30分鐘後，以760 xg離心5分鐘去除上清液，精子以PBS清洗1次，再加入1mL PBS加以懸浮，在流式細胞儀上以cell quest轉體進行分析，收取10,000個精子作為檢品，讀取被水解成2',7'-dichlorofluorescein(DCF)所激發之螢光；(3)精子中O2-之NBT還原能力：把各組間的精子數目調成1×106cells/ml，加入0.3ml nitro blue tetrazolium(簡稱NBT)溶液，在37℃中共同培養45分鐘，以500 xg離心10分鐘，並用磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate buffered saline，簡稱為PBS)清洗1次，離心去除上清液，加入200μl二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)溶解細胞內的紫色結晶，置於超音波振盪機振盪1分鐘，吸出100μl於96wells中，以ELISA reader測量630nm吸光值；(4)精子NO釋放量測定：取精子離心後之上清液100μl，在室溫下加入Griess試劑50μl sulfanilamide(SUL)和50μl N-1-napthyl-ethylenediamine dihydrochloride(NED)混合後，避光靜置30分鐘，以ELISA reader測其570nm吸光值，以0.1M nitrite連續稀釋作為標準品檢驗量線；及(5)脂質過氧化程度之測定：將精子數目調成1×106sperms/ml並取1ml；另取0.5ml的血漿置入試管中；再取0.5g的睪丸組織，於15ml的離心管中加入4.5ml 1.15%的氯化鉀(KCl)，加以均質並取出1ml；在上述三種樣品中分別加入2倍體積的反應試劑，混合均勻後以100℃水浴15分鐘，取出流水冷卻，加入2ml之n-butanol劇烈混合均勻；接著，以1500 xg離心10分鐘，取上層液，以分光光度計測量532nm的吸光值；以PBS所測得的吸光值為blank，並與標準品對照換算，即可得到精子中MDA的濃度。

前述分析結果值係以平均值±標準誤差表示，利用Duncan’s multiple range test檢定組間之差異，並設定p<0.05時，表示有顯著性差異，其中，在下表一中各數值右上方顯示之a、b、c及d等符號，或本發明圖式上顯示之a、b、c及d等符號，係用以表示其在統計上的差異性，意即，符號相同者係代表其在統計上不具顯著性差異，符號不同者係代表其在統計上具有顯著性差異。動物實驗結果顯示，請參閱第2圖所示，單獨注射CP的CP組別平均體重下降最多；注射CP並餵食不同劑量NACU的組別，均能有效減緩體重下降的幅度，甚至，與控制組無異；相關研究亦指出單次給予高達5,000mg/kg B.W.的薑黃素，並不會造成倉鼠急性毒性。表一顯示器官重量變化情形，其中，在肝(Liver)、腎(Kidney)重量上，CP組相較控制組降低18%與16%，NACU實驗組則能顯著避免CP所造成之肝及腎臟重量下降的問題，進而達到與控制組無異或超過控制組的情形，據此，推測NACU應能避免CP對肝、腎造成的損傷，然而，仍需以組織切片做進一步的觀察，以資確認；在睪丸(Testes)和副睪(Epididymides)的重量變化上亦有上述類似的結果，正控制組(FX)與不同劑量之NACU實驗組均能避免CP所造成重量下降的情形。

至於，NACU對精子特性的影響，請參閱下表二所示，CP組倉鼠副睪中精子數目及具活動力精子所占比例顯著降低，與控制組相比分別降低42%及45%，而1倍和2倍劑量的NACU實驗組顯然能提升精子功能，效果甚至超越正控制組；然而，在5倍劑量下之NACU實驗組則無法達到上述效果，其精子活動力反而較CP組低，表示劑量過多的NACU對精子可能造成不當的影響。另，CP組精子形態不正常所占的比例比控制組高出2倍，而不同劑量NACU實驗組均能顯著降低精子形態不正常所占的比例，此亦說明了，適當濃度劑量之NACU確實能提升精子的活動力(motility)和濃度(rate)，因此，適當的濃度應該是NACU抗氧化性是否能有效發揮的關鍵因素。

請參閱第3圖所示，為NACU對抗癌劑CP誘導倉鼠精子中ROS含量之影響，實驗結果顯示，CP組精子中ROS含量明顯高於控制組，不同劑量NACU之實驗組則可顯著降低螢光值位移，且用量越高位移越明顯，顯見NACU確實能藉由其優異的抗氧化效果，降低精子內ROS的含量，進而減少氧化壓力對精子所造成的傷害。請參閱第4圖所示，為NACU對倉鼠精子內O2-生成之影響，實驗結果顯示，隨著NACU劑量的增加，超氧陰離子濃度有降低的趨勢，且用量在0.4g/kg/day時，效果已經與正控制組相仿，並與CP組有顯著的差異，顯示NACU確實可減少精子粒線體中一連串氧化還原反應的起始因子，進而防止精子功能的喪失。請參閱第5圖所示，為NACU對精子NO釋放之影響，實驗結果顯示，CP組與控制組相比，會大大增加精子釋放NO的情形，而正控制組(FX)和NACU實驗組則皆能有效降低NO的產生，其效果均能達到精子未受CP刺激的程度，據此，應能證明，NACU確實能降低因CP所造成過多NO的產生，並修復因此所造成的精子損傷。請參閱第6及7圖所示，為NACU對精子及MDA血漿生成量之影響，實驗結果顯示，CP組的MDA濃度為控制組的2.57倍，NACU實驗組與正控制組(FX)則能顯著降低精子中MDA的濃度，1倍劑量NACU之實驗組能使精子中MDA濃度下降46%，在2倍及5倍劑量下，實驗組則分別下降61%和64%，其下降幅度顯然與劑量具有依存關係；正控制組(FX)則下降62.6%；在血漿脂質過氧化方面，CP組血漿中MDA濃度為控制組的3.2倍，NACU實驗組與正控制組(FX)皆能顯著降低血漿中MDA濃度，且五倍劑量的NACU實驗組效果最好，其下降幅度同樣與劑量多寡有依存關係；睪丸中MDA的實驗結果也極為類似(datd not shown)；綜上所述，各劑量NACU的實驗組均有降低精子、血漿和睪丸中因CP所誘導產生的MDA，且其效果與正控制組相當，在五倍劑量的使用下效果更好，顯示脂質過氧化的情形可因NACU 而顯著改善。

據上所述，本發明利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素所製成之奈米薑黃顆粒(NACU)顯然能充份發揮薑黃素本身所具備之抗氧化活性，進而能藉由其抗氧化活性，修復倉鼠因順鉑誘導所造成的精子氧化壓力損傷，因此，藉由本發明之製法，將薑黃素製成NACU，使其成為普羅大眾所接受之一種價格普及的保健食品，應能作為日後預防或改善男性不孕症的潛在保健品，進而發揮其對大眾身體之保健功能。

按，以上所述，僅為本發明最佳之一具體實施例，惟本發明之技術特徵並不侷限於此，任何熟悉該項技藝者在本發明領域內，可輕易思及之變化或修飾，皆可涵蓋在以下本案之專利範圍。

Claims

一種利用二氧化矽及幾丁聚醣共同包覆薑黃素製成奈米薑黃顆粒之製法，包括：以醋酸水溶液配製幾丁聚醣溶液；以醋酸鈉水溶液配製矽酸鈉溶液；及將幾丁聚醣溶液、矽酸鈉溶液及薑黃素植物油溶液加入一均質機，予以均質成一混合溶液；使幾丁聚醣分子與矽酸鈉在該混合溶液中聚合成二氧化矽-幾丁聚醣的奈米粒子，且與薑黃素進行複合，將薑黃素包覆其中，進而在該混合溶液中，形成薑黃素的奈米粒子。
如請求項1所述之製法，其中，醋酸水溶液之莫耳濃度為0.1±0.05M，醋酸水溶液與幾丁聚醣溶液之重量配製比為0.82±0.5%(w/w)，且其pH值為4.6±1.5。
如請求項2所述之製法，其中，醋酸鈉水溶液之莫耳濃度為0.1±0.05M，醋酸鈉水溶液與矽酸鈉溶液之重量配製比為0.82±0.5%(w/w)，且其pH值為4.6±1.5。
如請求項3所述之製法，其中，矽酸鈉溶液、薑黃素植物油溶液和幾丁聚醣溶液之重量比為10±1：1±0.5：1±0.5。
如請求項4所述之製法，其中，該混合溶液中水相之幾丁聚醣與矽酸鈉能包覆油相之薑黃素，進而形成包覆薑黃素之二氧化矽幾丁聚醣複合奈米顆粒。
如請求項5所述之製法，其中，該薑黃素植物油溶液中薑黃素與植物油之重量配製比為15±5%(w/w)。
如請求項1、2、3、4、5或6所述之製法，其中，該植物油係橄欖油。
如請求項7所述之製法，尚包括對均質混合溶液進行透析至少15小時，以高速離心12000±2000 x g，去除上層液後，再對沉澱物以二次水沖散清洗。
如請求項8所述之製法，在完成離心及沖散之步驟後，尚包括將該沉澱物放入超低溫冷凍櫃，並接著進行冷凍乾燥，以獲得幾丁聚醣與二氧化矽共同包覆薑黃素所形成之奈米薑黃顆粒。