TWI580785B - 區別間質幹細胞的方法 - Google Patents

Description

區別間質幹細胞的方法

本發明係關於一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中區別間質幹細胞(MSCs)的方法。本發明亦關於一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中提高MSC群體之純度的方法。另一方面，本發明係關於一種分離在發炎環境中較具反應性的MSC群體之方法。

間質幹細胞或基質細胞(MSCs)是屬於胚胎中胚層來源之多能性細胞，其具有類纖維母細胞之形態。該等細胞視刺激及培養條件可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經系細胞及肌細胞與其它細胞類型。儘管hMSCs之可塑性及其在組織修復與再生上之角色已廣泛地被研究，近來得到最多的關注者是其免疫調控性質[50-51]。人類間質幹細胞已自各種組織分離出。最常用之MSCs來源為骨髓(bone marrow, BM)。然而，其分離程序為極具侵入性的。為避免侵入性的分離程序，諸如人類臍帶及胎盤之組織由於通常在生產後被丟棄而被視為良好之候選物。先前研究已證實hMSCs可自臍帶或胎盤有效率的分離[49]。

MSCs為包含在間質組織中的更複雜的基質細胞組成之子群體。由於間質幹細胞之異質性及對其具特異性之已知生物標誌之缺乏，定義MSC表型及特徵是一項具挑戰性的任務[52-54]。負責MSCs功能之分子組份（特別是在細胞膜上者）大多數仍屬未知。此外，特異性細胞表面標誌的缺乏使得細胞培養處於可能為其它細胞類型污染的風險中，特別是諸如纖維母細胞之成熟基質細胞，其相對地大量存在於間質組織中[52-54]。在自胎盤源組織分離MSCs之過程中，非MSCs（包括纖維母細胞、胎盤源上皮細胞及胎盤源網狀細胞）常常在體外培養中與MSCs共存。纖維母細胞尤其是污染的主要來源。

纖維母細胞被視為成熟間質細胞，尤其大量存在於結締組織中。因此，該細胞為許多細胞培養系統中最常存在之污染細胞表型。不僅成功地自培養物去除纖維母細胞之技術困難，在相同培養物中區別MSCs與纖維母細胞亦尤為複雜。纖維母細胞及MSCs具有極相似的形態外觀；二者均可良好地增生並具有許多相同之細胞表面標誌[55, 56]。國際細胞治療研討會(International Society of Cellular Therapy, ISCT）目前定義MSC為表現CD73、CD90及CD105之具塑料貼附性之多能性類纖維母細胞之細胞，且不表現造血標誌CD14、CD34及CD45。然而，纖維母細胞亦具有該等性質及標誌。因此，目前由ISCT建議之定義無法區別MSC與一般纖維母細胞。至今，區別MSCs與纖維母細胞之最佳方式係基於此兩種細胞之功能特性之分析；MSCs保留多能性幹細胞性及免疫調控能力，而纖維母細胞在此二功能特性中皆顯得較為受限。

自Friedenstein在辨別MSCs上的開創性成果以來[48]，在尋求穩定且明確地區別離體培養擴增之MSC與纖維母細胞方面，培養衍生方法學、形態學及基因表現特徵並無明顯的差異[57-60]。目前，對於分離MSCs與纖維母細胞不存在公認之標準或單一細胞表面標誌。由於纖維母細胞為常見於源自胎盤之MSC培養物中之污染細胞群體之事實，作為生物標誌以區別MSCs與纖維母細胞之新穎表面蛋白對於確保胎盤源MSCs之初代培養之均一性極為重要。

人類促紅血球生成素產生肝細胞(Eph)受體為組成受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)跨膜蛋白質之最大家族。Eph受體最早發現之功能係其在軸突導向之複雜且精密之機制中的角色[4]。目前已知Eph受體可調控胚胎發育期間之細胞定位及組織模式形成以及諸如癌症及血管併發症之病理症狀中所涉及的廣泛範圍之細胞-細胞間通訊事件[1-5]。此外，該等受體為特化細胞功能之重要調控子，參與在突觸可塑性、胰島素分泌、骨重塑、上皮衡定以及發炎與免疫反應中[1, 2, 6]。其表現於多種細胞類型，諸如：神經元、血管細胞、上皮細胞、炎性細胞、免疫細胞及包括癌症幹細胞之腫瘤細胞[7-10]。

EphA2基因屬於蛋白質－酪胺酸激酶家族之Eph受體亞族。先前研究已指出EphA2在介導發育事件（尤其在神經系統中）之功能[4]。在發育期間，EphA2作用於模式形成之特定方面與其後之數種胎兒組織之發育，包括：血管新生、神經管發育、軸中胚層生成、早期後腦發育、神經分化、細胞遷移調控、經由蝕骨細胞生成及成骨細胞生成調控之骨重塑及在乳腺發育期間乳腺上皮細胞增生及分枝形態形成 [11]。尤其，EphA2在神經系統胚胎發育中之角色 [12]，包括神經元送出軸突以到達正確目標之過程，已被明確定義。

Eph受體在幹細胞生物學中於胚胎發育期間與成人幹細胞棲位中的角色僅於最近才被指出。Eph受體在大多數成人幹細胞棲位中表現。幹細胞位於特化之微環境－棲位(niche)中，其定義為細胞及微環境決定因素之組合，其在特化組織位置內精細安排幹細胞群體(pool)之自我更新及分化。Eph受體及ephrin配體在胚胎形成及組織衡定期間之表現與其在發育期間之幹細胞調控及在成人組織衡定中所涉入者一致[13, 15]。Eph/ephrin系統在幹細胞靜止、自我更新與分化之間之平衡中進行空間－時間調控的功能已被提出[14]。然而，Eph在幹細胞棲位維持中之機制及其在幹細胞調控中之角色尚未完全被了解。EphA2大量表現於胚胎幹細胞[16]。然而，大多數EphA2在幹細胞中之功能研究係專注於神經系統上。EphA2在CNS（包括神經系及膠系前驅細胞）中大量表現[12, 15]。最近的研究證據顯示ephrin-A1可促進EphA2-陽性心臟幹細胞之活動性，進而增強心肌梗塞後之再生及心臟功能[17]。除這些發現外，幹細胞科學中EphA2之表現檔案及功能尚未完全確定。

Eph受體及ephrin配體可調控幹細胞／先驅細胞之自我更新與腫瘤的演化[14]。未轉化幹細胞／先驅細胞與癌細胞之間的高相似度亦係公認的。近年來，已描述各種癌症藏有「癌症幹細胞」區（在癌細胞群體組成中高達25%）的概念[14]。該等細胞被定義為腫瘤增殖細胞(tumor-propagating cells, TPCs)，因其可誘發動物宿主中之腫瘤、自我更新並使擴增的腫瘤細胞體中生成進一部分化之細胞[14]。最近，Eph/ephrin訊號被連結至癌細胞去分化與類幹細胞性質之調控[9, 18, 19]。然而，應注意癌症幹細胞實際上並非如相關技術領域中通常所指之（多能性）「幹細胞」。

Ephs之過度表現連帶特異ephrin配體之調降已在數種癌症中被報告，並與腫瘤侵略性及較高之級數(grade)相連結[19-22]。EphA2之表現在乳癌、卵巢癌與肺癌以及神經膠質瘤與黑色素瘤中升高，且高量之EphA2與低病患存活率相關[20, 23-29]。然而，Eph受體在癌細胞中的角色及其表現係絕對情境相依的。已在某些腫瘤（包括乳癌、大腸直腸癌及急性淋巴性白血病）中觀察到相反的表現模式，其中經由表觀遺傳基因靜默或突變造成之低Eph受體表現與不佳預後相關[30]。在人類腎上腺皮質癌、腺瘤與健康腎上腺皮質組織之陣列轉錄剖析研究中，EphA2在人類腎上腺皮質腫瘤組織中的表現與健康腎上腺皮質組織相較係調降的[31]。因此，儘管某些Ephs及ephrins之表現模式在許多腫瘤形成病例中可作為預後標誌，相反現象也在大量研究報告中被觀察到。Eph/ephrins之表現係極度細胞／腫瘤情境特異性且情境相依的。

最近在神經膠質母細胞瘤(glioblastoma, GBM)上之研究顯示藏有大型TPCs子群體的腫瘤具有上升的EphA2及EphA3表現。EphA2受體在人類神經膠質母細胞瘤癌症幹細胞(glioblastoma cancer stem cells, CSCs)中過度表現，且在此特異性腫瘤類型中EphA2之表現與CSCs之大小與腫瘤引發能力具正相關性[9]。該等Eph受體調控中樞神經系統發育，而其失調之表現及體細胞突變與神經系統腫瘤之生長，演化及轉移相關[32-36]。

另一方面，在GBM、大腸直腸癌、乳癌、前列腺癌及皮膚癌中，配體依賴性的EphA訊號活化具有腫瘤抑制作用[27, 38-43] 亦曾被報導。在大量之GBM研究中，根據報導藉由ephrinA1活化EphA2激酶具有抗增生作用，其可能係經由調降EphA2及FAK活性[27, 38, 44]。EphA2剔除小鼠顯示提高之腫瘤細胞增生及ERK磷酸化[45]。EphA2之配體刺激亦減弱EGF媒介之ERK磷酸化，其與減少之細胞增生及遷移相關[46, 47]。總言之，有趣的是，該等發現支持EphA2/ephrinA1訊號傳遞為抑制腫瘤生長及侵入。ephrin–Eph相互作用之結果在不同情境下顯著分歧。

2012年Vescovi團隊發表之研究論文[9]顯示(1) 在hGBMs中之類幹細胞腫瘤增殖細胞(tumor-propagating cells, TPCs) 高度表現EphA2受體，(2) 高EphA2表現支持TPCs之未分化狀態及自我更新，(3) TPC含量及致腫瘤性在EphA2^[High] hGBM細胞中較EphA2^[Low] hGBM細胞為高。雖有以上提出之所觀察事實，EphA2^[Low] hGBM仍具有明顯之腫瘤引發能力。即使在hGBM中，EphA2是否可代表一真實的TPC標誌仍有爭論，更不用說在不同腫瘤或不同類型之細胞中。換言之，本領域中的技藝人士將不會認可EphA2係為一對TPCs具特異性且通用之標誌，遑論一對多能性幹細胞具特異性且通用之標誌。相同團隊亦提出專利申請主張使用EphA2作為用於識別與分離幹細胞（較佳地為哺乳類幹細胞，更佳地為人類或小鼠幹細胞）之細胞表面標誌[37, EP 2733206 A1]。然而，由於Vescovi之研究完全並僅專注於人類神經膠質母細胞瘤(hGBMs)，以及EphA2^[Low] hGBM仍具有顯著腫瘤引發能力之事實，本領域中的技藝人士將無法認可EphA2作為識別多能性幹細胞之特異性標誌。此外，Vescovi亦未提及如何在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中區別多能性幹細胞。

本發明為非預期性地發現間質幹細胞(MSCs)可基於其特異性表面標誌EphA2之表現量在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中被區別出來。

因此，在一方面，本發明提供一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中區別MSCs的方法，其包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。

另一方面，本發明提供一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中提高MSC群體純度的方法，其包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。

又一方面，本發明提供一種分離在發炎環境中較具反應性之MSC群體之方法，該方法包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。

本發明之方法可用於區別MSCs與選自於由纖維母細胞、胎盤源上皮細胞、胎盤源網狀細胞及其組合所組成之群組之細胞群體。

在本發明之較佳實施例中，該方法係用於區別MSCs與纖維母細胞。

根據本發明，胎盤相關組織可選自於由羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶所組成之群組。

根據本發明，分選步驟可使用本領域已知或待開發之技術進行，例如一基於抗體或一基於核苷酸分離之方法。

在本發明之部分實施例中，源自胎盤相關組織之細胞係培養於一用於MSC之培養基。

根據部分實施例，經分離之MSC群體對TNF-α訊號傳遞或TNF-α-依賴的訊號傳遞較具反應性。

應了解先前之一般描述及以下之詳述兩者皆僅為示例性及解釋性且並不限制本發明。

本發明係基於經由表面標誌EphA2之細胞分選，可在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中區別間質幹細胞(MSCs)此未預期之發現。

一方面，本發明提供一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中區別MSCs的方法，其包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。

另一方面，本發明特色為一種在源自胎盤相關組織之細胞之初代培養中提高MSC群體純度的方法，其包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。

亦證實經EphA2分選之MSCs相較於未分選之MSCs或類MSC細胞在發炎環境中展現卓越反應性。因此，在又一方面，本發明提供一種分離在發炎環境中較具反應性之MSC群體之方法，其包含藉由一EphA2表面標誌分選細胞。在本發明之一具體實施例中，經分離之MSC群體對TNF-α訊號傳遞或TNF-α依賴的訊號傳遞較具反應性。

MSCs具有經各種細胞激素活化後抑制T細胞及B細胞反應之免疫抑制功能。其亦可經TNF-α與IFN-γ之作用誘導以在急性發炎環境之存在下發揮促發炎效應。在發炎關節疾病（例如：類風濕性關節炎）中，骨髓中之MSCs藉由TNF-α依賴的機制遷移至關節並可能對疾病進程負部分責任。MSCs亦被證實在骨關節炎中之關節周圍組織中數量增加，其可能反映關節修復或再生之企圖[6]。已提出在發炎環境中釋放之TNF-α藉由結合至MSCs之TNF-R1並活化MSCs中之NF-κB路徑而賦予MSCs免疫抑制性質，從而使MSCs可發揮免疫調控中之角色[62]。

根據本發明，該等細胞係根據本領域中已知之實驗操作程序，例如，Fukuchi 等人，新鮮地得自、獲得自或收集自胎盤相關組織之實驗操作程序。在部分較佳具體實施例中，源自胎盤相關組織之細胞接著培養於一用於MSC之培養基。用於MSC之標準培養基包含伊格爾氏最低必須培養基(Minimum Essential Medium Eagle)（具不同修改版本）、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)及鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF) [49, 64-68]。

根據本發明，該方法可用於區別MSCs與選自於由纖維母細胞、胎盤源上皮細胞、胎盤源網狀細胞及其組合所組成之群組之細胞群體。較佳地，本發明之方法係用於自源於胎盤相關組織之細胞之初代培養中之纖維母細胞中區別MSCs。

胎盤相關組織可選自於由羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶組成之群組。

在本發明方法之實行中，使一源自胎盤相關組織之細胞之初代培養之培養物接受EphA2之細胞分選。該細胞分選可經由本領域已知或待開發之技術進行，例如：一基於抗體或一基於核苷酸之分離方法。較佳地，該細胞分選係藉由一基於抗體之磁性細胞分選進行。例如，MACS法(MACS^® Technology, Miltenyi Biotec)。此外，該細胞分選可經由一流式細胞分析方法進行，例如：一基於抗體或一基於核苷酸之流式細胞分析。

如本文所用，術語「較具反應性(more responsive)」意指回應於發炎相關訊號傳遞路徑之MSCs細胞之行為（例如：活動性），該訊號傳遞路徑包括但不限於一TNF-α訊號傳遞或一TNF-α-依賴的訊號傳遞。

本發明藉由以下實例進一步說明，其提供作為例示之用而非限制本發明。

實例

實例 1 ：胎盤源間質幹細胞 (MSCs) 及纖維母細胞之免疫表型特性分析

在獲得捐贈者簽署之受試者同意書後，收集足月胎盤(n = 8)。MSCs係得自羊膜(AM)、絨毛膜盤 (CD)、絨毛膜(CM)及臍帶(UC)。得自胎盤的細胞在37 °C、飽和濕度及5% CO₂ 下經培養、擴增並保存在具FBS及bFGF之α-MEM中，且當細胞達80%滿度時繼代培養該等細胞，接著以流動式細胞測量術分析其表型特徵。在接受流式細胞分析之免疫染色過程中，細胞依照廠商指示與抗體共同培養。對應類別之非特異性IgG用作陰性對照組。細胞懸浮液經流式細胞分析儀(BD Biosciences FACSCanto II)和Flowjo 7.6.1軟體分析。

吾人評估CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR及EphA2之表現。所有分離自胎盤各個位置之MSCs之流動式細胞測量術之分析結果為CD73、CD90、CD105、EphA2呈陽性，且CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性。纖維母細胞（人類包皮纖維母細胞，新生兒，PC501A-HFF，SBI）之流動式細胞測量術分析CD73、CD90、CD105呈陽性，對CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性，且EphA2呈陰性或低表現。胎盤源MSCs與纖維母細胞之間之EphA2被注意到具有不同模式：MSCs顯示高百分比之EphA2陽性細胞，而纖維母細胞則顯示為相反。結果顯示於下表 1 。

表 1 ：胎盤源間質幹細胞與纖維母細胞之免疫表型分析（在流動式細胞測量術中陽性細胞之百分比） AM＝羊膜；CD＝絨毛膜盤；CM＝絨毛膜；及UC＝臍帶。陰性混合液包括抗CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR之抗體(人類MSC分析套組，BD Stemflow™，目錄編號562245）。胎盤源間質幹細胞之免疫表型可見於捐贈者#12與捐贈者#17於 P0之樣本。流動式細胞測量術分析顯示MSCs群體在P0為99.3~99.7% CD73陽性，77.8~99.8% CD90陽性，75.9~98.0% CD 105 陽性及45.0~80.7% EphA2陽性。相對地，造血細胞系特異性標誌（諸如：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR）未表現在MSCs中。纖維母細胞之流動式細胞測量術分析顯示該群體係99.3% CD73陽性，97.7% CD90陽性，75.6% CD 105陽性，及18.6% EphA2陽性；造血細胞系特異性標誌（諸如：CD11b、CD19、CD34、CD45及HLA-DR）未表現在纖維母細胞中。

實例 2 ：以 EphA2 分選之胎盤源間質幹細胞 (MSCs) 之免疫表型特性分析

a. 藉由磁性活化細胞分選(magnetic-activated cell sorting, MACS)分選之EphA2-富集之MSCs之流動式細胞測量術分析

MACS方法(MACS^® Technology, Miltenyi Biotec)允許細胞藉由與塗布有抗EphA2表面抗原之抗體之磁性奈米粒子培育來分離。源自胎盤之MSCs之初代培養係根據廠商指示與抗EphA2之螢光接合抗體培育並以R-藻紅蛋白(PE)磁性粒子分選。流動式細胞測量術分析顯示MACS分選之P0 MSCs細胞群體為均質的：在於其100% CD73陽性、97.2~99.5% CD90陽性、96.0~99.9% CD 105陽性以及96.6~100% EphA2陽性之表現上（參見下表 2 ），證實經由抗體接合磁珠之EphA2分選可大幅地提升MSC在P0之純度。富集之EphA2-陽性MSCs群體可在體外擴增中良好地維持於其後之繼代（參見下表 3 ）。

表 2 ：P0之EphA2-分選胎盤源MSCs之免疫表型特性分析 EphA2-分選MSCs之免疫表型特性分析係可見於捐贈者#17之P0之絨毛膜盤(CD)之MSCs。結果顯示EphA2-陽性細胞亦為CD73陽性、CD90陽性及CD105陽性。D＝捐贈者。P＝代數。

表 3 ：在體外擴增期間之EphA2-MACS-富集群體之免疫表型特性分析（流動式細胞測量術之陽性細胞百分比） 在之後擴增之EphA2-分選MSCs之免疫表型特性分析。免疫表型可見於源自捐贈者#17之絨毛膜盤(CD)之MSCs。MSCs於P0係藉由EphA2-抗體接合磁珠分選，且在體外擴增期間在其後之繼代中於經優化之MSCs培養條件中保存。結果顯示細胞表面標誌EphA2之表現在經優化MSCs培養條件下可於其後之繼代中良好地保持。

b. 藉由流動式細胞法細胞分選器(Flow Cytometry Cell Sorter, FCCS)分選EphA2-富集之MSCs之流動式細胞測量術分析

收集源自胎盤之細胞並在P0經由JAZZ細胞分選器(BD, USA)以抗EphA2抗體分選。EphA2-分選之MSCs之流動式細胞測量術分析顯示第2~6代的細胞群體為99.5~100% CD73 & CD90雙陽性，99.6~100% CD105 & CD90雙陽性，99.5~100% EphA2 & CD90雙陽性，99.8~100% CD73 & EphA2雙陽性，99.5~100% CD105 & EphA2雙陽性，及99.7~100% CD73 & CD105 雙陽性（參見下表4）。數據顯示EphA2蛋白在MSCs培養的其後繼代中可持續地表現並保持。

表 4 ： 在體外擴增期間之EphA2-FCCS-富集群體之免疫表型特性分析 在之後擴增中之EphA2-富集之MSCs之免疫表型特性分析。免疫表型可見於源自捐贈者#7之臍帶(UC)之MSCs。MSCs於P0係經由細胞分選器藉由抗EphA2抗體分選，且在體外擴增期間在之後之繼代中保存於經優化之MSCs培養條件中。細胞表面標誌EphA2之表現可在其後之繼代中良好地保持。

實例 3 ： 胎盤源間質幹細胞 (MSCs) 及纖維母細胞中之 EphA2 轉錄物之即時定量 PCR 評估

來自胎盤源細胞（n = 8，包括第1代及第3代，來自胎盤之AM、CD、CM、UC，4個不同部份）及人類包皮纖維母細胞（新生兒，PC501A-HFF，SBI）之64個群體之總RNA係使用Direct-zol少量試劑套組(Direct-zol miniprep Kit；Zymo Research Corporation, CA, USA)分離。互補DNA (cDNA)係以轉錄因子第一股cDNA合成套組(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit；Roche, Basel, Switzerland)合成。接著，以LightCycler480 II (Roche, Basel, Switzerland)使用Roche Universal ProbeLibrary System根據廠商指示進行定量RT-PCR。

吾人藉由即時定量PCR評估EphA2之表現，以比較胎盤源多能性MSCs及纖維母細胞。基因表現在不同細胞群體之內以內生基因甘油醛-3-磷酸酯去氫酶之表現標準化。EphA2轉錄物在MSCs中之表現係以與EphA2在纖維母細胞中之表現相較之富集倍數計算。結果顯示相較於纖維母細胞，EphA2在MSCs中高度表現（圖 1 ）。

實例 4 ： MSCs 與纖維母細胞之混合群體之流動式細胞測量術分析

為證明EphA2可作為分離胎盤源MSC與纖維母細胞之生物標誌，源自捐贈者#23之臍帶(UC)之MSCs與纖維母細胞在微量離心管(Eppendorf tube)中藉由以下比例混合（MSC：纖維母細胞，以細胞數表示）：2x10⁵ :0、2x10⁵ :2x10⁴ 、2x10⁵ : 4x10⁴ 、2x10⁵ : 2x10⁵ 、2x10⁵ : 1x10⁶ 、2x10⁵ : 2x10⁶ 及0: 2x10⁵ 。接著藉由流動式細胞測量術分析每一微量離心管中之EphA2⁺ 群體。結果顯示於圖 2 中，其顯示經由流動式細胞測量術以抗EphA2抗體偵測到的EphA2⁺ 群體之百分比相應於增加之纖維母細胞群體而成比例減少。

實例 5 ：藉由慢病毒轉導剔除 EphA2

為評估EphA2在分離之MSCs群體中之功能，進行藉由慢病毒轉導之shRNA (shEphA2)剔除實驗。每一構築體具有一EGFP報導基因以監測轉導效率。測試四個不同之shRNA序列，每一者具有三個不同之感染倍數(Multiplicity Of Infection, MOI) (2, 5, 10)，且每一實驗條件進行三重複。剔除效率係以qRT-PCR評估。結果顯示於圖 3 中。可達到50%剔除之最佳剔除效率。

實例 6 ：

在此研究中，吾人研究MSCs中之EphA2於體外在回應諸如TNF-α訊號之發炎刺激之角色。吾人著重於EphA2涉及在發炎期間MSCs之遷移之作用[51, 63]。檢驗EphA2 ^high MSCs與EphA2 ^low MSCs在基礎培養條件下或在TNF-α發炎刺激存在下之活動性。

a. EphA2-剔除MSCs之跨室遷移分析

在8μm跨越孔室(trans-well)中30,000個細胞之條件下培養野生型、由sh-隨意序列及由sh-EphA2標靶之MSCs。在下室中添加0.2% FBS及TNF-α以促動MSCs之遷移。六小時後，根據廠商指示藉由CellTiter-Glo®發光試劑偵測活遷移細胞。結果顯示於圖 4A 及4B 。數據顯示EphA2之剔除損害TNF-α訊號回應能力與sh-EphA2 MSCs遷移能力。

b.  EphA2^high MSCs之跨室遷移分析

源自胎盤之細胞之初代培養係與由抗EphA2之抗人類抗體共軛之磁珠培育，且之後係根據廠商指示以陽性選擇分選。流動式細胞測量術分析確認在MACS分選後之EphA2⁺ MSCs及EphA2^- 細胞群體。細胞係以於8μm跨越孔室(trans-well)中30,000個細胞之條件培養。在下室中添加0.2% FBS及TNF-α以活化MSCs遷移。在六小時後，根據廠商手冊經由CellTiter-Glo®發光試劑偵測活遷移細胞。數據顯示TNF-α訊號回應能力及MSCs之遷移在EphA2-富集之群體中係增強的。

如在圖 4A 及4B 中所示，MSCs之遷移明顯受到於基礎培養基添加TNF-α的影響。在以TNF-α刺激MSCs後，以CellTiter-Glo®發光試劑偵測之MSCs之遷移以TNF-α-劑量相依之方式增加（參見圖 4A ）。相對地，EphA2-剔除的MSCs群體或經分選之EphA2^- 細胞則失去細胞活動性。當將發光訊號轉換成相對於在0.2% FBS中遷移野生型MSCs對照組之遷移細胞群體時（以倍數變化表示），EphA2分子在回應TNF-α訊號的MSCs遷移中之作用更為明顯（參見圖 4B ）。

熟悉本技術之人士應了解可對上述之實施例進行改變而不背離其廣泛之發明概念。因此，應了解本發明不受限於所揭示之特定實施例，而是意欲涵蓋在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神與範疇內之修改。

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本發明先前之概述以及以下詳述在配合隨附圖式閱讀時得以更佳地被了解。為說明本發明，在圖式中顯示目前較佳之實施例。

在該等圖式中：

圖 1 顯示EphA2轉錄物之即時聚合酶連鎖反應定量。在胎盤源MSCs中EphA2之轉錄物量係藉由與纖維母細胞中EphA2之表現相較之富集倍數來評估，即藉由將MSCs中之EphA2 mRNA量相對於纖維母細胞中之EphA2量作比較（MSCs／纖維母細胞）。MSCs中EphA2之轉錄物量可見於來自捐贈者#12、#17、#21及#28的樣本。結果顯示在體外，相較於纖維母細胞，EphA2係高度富集於MSCs中。D＝捐贈者。AM＝羊膜；CD＝絨毛膜盤；CM＝絨毛膜；及UC＝臍帶。BS＝胎牛血清。P1＝第一代。P3＝第三代。

圖 2 顯示MSCs及纖維母細胞之混合群體之流動式細胞測量術分析的結果。源自捐贈者#23之臍帶(UC)之MSCs以不同比例與纖維母細胞混合。結果顯示由流動式細胞測量術偵測到之EphA2⁺ 群體之百分比相應於增加之纖維母細胞群體而成比例減少。FB= 纖維母細胞。

圖 3 顯示藉由qPCR評估之EphA2 RNA量。不同個別細胞群體中之總RNA表現量係藉由內生GAPDH表現量進行標準化。「 隨意序列(Scramble)」表示shRNA剔除實驗中隨意序列之對照組。藉由與正常野生型UC源MSC中之EphA2轉錄物表現量比較，qRT-PCR結果確認了sh-EphA2之剔除效率。D＝捐贈者。UC＝臍帶。

圖 4A 及圖 4B 顯示跨室(trans-well)遷移測定及細胞存活率偵測之結果。在圖 4A 中，活遷移細胞由CellTiter-Glo®發光訊號強度呈現。在圖 4B 中，活遷移細胞由與在0.2% FBS中野生型MSC對照組相較之相對比例呈現。

Claims (7)

1. 一種分離在發炎環境中較具反應性之間質幹細胞(MSC)群體之方法，其包含將源自胎盤相關組織之細胞，經初代培養得到MSCs及纖維母細胞；及藉由一EphA2標誌自該等MSCs及纖維母細胞中分離出MSCs。
2. 如請求項1之方法，其中該胎盤相關組織係選自於由羊膜、絨毛膜盤、絨毛膜及臍帶組成之群組。
3. 如請求項1之方法，其中該分離步驟係經由一基於抗體或一基於核苷酸之分離方法進行。
4. 如請求項1之方法，其中該等源自胎盤相關組織之細胞係培養於一用於MSC之培養基。
5. 如請求項1之方法，其中該MSC群體對一TNF-α訊號傳遞或一TNF-α-依賴的訊號傳遞較具反應性。
6. 如請求項3之方法，其中該基於抗體之分離方法係一基於抗體之磁性細胞分選或一基於抗體之流動式細胞測量術。
7. 如請求項3之方法，其中該基於核苷酸分離之方法係一基於核苷酸之流動式細胞測量術。