TWI571265B - Ｎ－（４－異丙基苯基）－５－胺基異吲哚啉之用途 - Google Patents

Description

N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉之用途

本發明係關於N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉之新穎用途，係用以診斷阿茲海默氏症及定量腦內類澱粉蛋白。

阿茲海默氏症是屬於漸進性造成認知功能的缺乏或障礙，其中早期階段的特徵為近期所發生的事件的記憶障礙，是一種漸進式且不可回復的神經退化性疾病，在醫療水準進步的時代下，隨著老年人口年齡的提高，也導致將來需要花費更多的經濟和社會成本於治療或照顧阿茲海默氏症病患。現今的醫療診斷技術，常利用神經心理學的評量方式進行評估作業，包含針對阿茲海默氏症患者之記憶力、語言功能、認知、專注力，和個人行為部分進行評估的臨床測量，此類之診斷方式欠缺針對疾病的敏感性與專一性，當依據評量檢測出罹患阿茲海默氏症時，通常病患腦部神經病變已發生至嚴重階段，對於病患的治療有限，因此透過核醫藥物搭配正子斷層造影可以提供生理功能的資訊，並以核子醫學影像方式呈現疾病的病理狀態。

阿茲海默氏症是屬於漸進性認知功能缺乏與障礙，因此記憶與執行功能的障礙幾乎是早期診斷的要點。然而，阿茲海默氏症的大腦病理變化早在病人出現認知功能衰退、或行為變化的一、二十年就已經存在，其病理特徵為彌漫性Aβ蛋白(澱粉樣蛋白，β-amyloid)之退化性神經斑塊(Seline plaque，SPs)與過度磷酸化之tau蛋白(hyperphosphorylated tau protein)導致的神經纖維糾結(Neurofibrillary tangles，NFTs)(Kung MP et al.,2004；Kulkarni PV et al, 2005)，糾結和斑塊會阻斷神經彼此溝通和傳遞訊息的功能。其中，斑塊產生的原因，已知是因為體內澱粉樣蛋白前驅蛋白(amyloid precursor protein)酶無法適當作用，導致β-切割酶(β-secretase)和γ-切割酶(γ-secretase)改變APP分解代謝反應，使乙型類澱粉蛋白(beta amyloid)生產過剩(Routtenberg A et al,1997)。此種蛋白質很容易聚集形成沈澱物，可能為造成神經退化及神經傳導物質分泌減少的開端。

類澱粉斑塊(amyloid)形成在阿茲海默氏症發展中算是非常早期的病灶，在認知障礙、記憶困難、FDG正子造影及MRI影像觀察到症狀前便已發生，亦比腦脊髓液tau蛋白產生早且顯著。

由於阿茲海默症最確定的診斷為腦部解剖觀察病理特徵，因此病人活著的時候需透過一些分子診斷技術判斷是否罹患阿茲海默氏症，2011年美國國家老年研究院(NIA)與阿茲海默氏症協會(AA)聯合發表新的診斷標準與建議，將生物標記(biomarker)列入診斷標準的參考，第一類包括腦部乙型類澱粉蛋白沉積(Aβ protein deposition)增加、腦脊髓液中Aβ42蛋白含量下降及類澱粉正子攝影(PET amyloid imaging)陽性反應。第二類為神經細胞持續退化受損，包括腦脊髓液中tau及磷酸化tau(p-tau)蛋白含量增加、F-18 FDG正子攝影在腦部顳頂葉位置訊號減弱及核磁共振影像分析顯示腦部顳葉與內側頂葉的特別萎縮(引用自台大醫院健康電子報2013年12月73期)。隨著核醫影像技術越來越精良，若是阿茲海默氏症可提供早期診斷，將可在病情發展早期給予治療，並提高治療藥物臨床試驗的效率，而即早發現除能給予家屬心理準備，給予適當的照護，同時減少病患不適感以增進生活品質，因此開發阿茲海默氏症新藥仍是科學家努力不懈的議題。

乙型類澱粉蛋白在腦中不正常的堆積被認為是導致病人記憶力喪失的主因，也因此開發中的治療藥物不少以此為標的，希望能抑制不正常蛋白的產生或減少不正常的堆積。然而，阿茲海默氏症藥物的開發面臨一個瓶頸，即患有阿茲海默氏症的病人在臨床症狀出現後才被診斷為阿茲海默氏症，此時病人的 大腦已經累積太多不可回復的傷害，因此發展早期診斷工具，不管是研究乙型類澱粉蛋白在阿茲海默氏症中所扮演的腳色或是檢測阿茲海默氏症症狀發展的層面上都有其必要性與急迫性。

在過去PET結合F-18 FDG(2-去氧-2-[氟-18]-D-葡萄糖，2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose)提供患者體內、非侵入性的方式探討腦部葡萄醣代謝的相關研究已超過25年(Nakamura S et al.,2001)。在利用PET/F-18 FDG的研究發現阿茲海默氏症病患在病徵所在位置的F-18 FDG代謝有明顯減少的臨床徵狀，F-18 FDG吸收量的減少甚至先於認知功能的障礙，且與癡呆症的嚴重程度有正相關性。儘管F-18 FDG提供了一些代謝功能的解釋原因，但這些原因仍無法表示腦部病變的專一性位置(Lee CW et al.,2003)或是對於AD患者而言均不屬於特異性功能測試(Ye L et al.,2006)。

近幾年來，核醫藥物及正子斷層造影的發展顯著，與乙型類澱粉蛋白具高度親和力的C-11 PiB(Pittsburgh Compound B)造影劑應用於乙型類澱粉蛋白專一性的偵測，亦可以利用影像對於乙型類澱粉蛋白的沉積程度進行定量，不過C-11的半衰期只有20分鐘，生產的藥劑不利於轉送至其他醫院使用，侷限於具有迴旋加速器的單位，較不適合商業化，因此，為尋求更穩定與專一性的造影劑，F-18標誌的PiB(Flutemetamol，GE Healthcare)、F-18-AV-45(Florbetapir，AVID-RP/Lilly)和F-18-AV-1(Florbetaben，Piramal)紛紛進行臨床試驗。F-18的半衰期達110分鐘，能量高、靈敏度好且能夠進行運送。除此之外，目前發展中的失智症造影劑還有Azd4694(Navidea)，這些造影劑均有一些缺點，例如一些子區域(sub-region)無法偵測，專一性仍待檢驗且臨床診斷尚未有一致性的判讀標準，再加上，牽涉到專利，國內若要進行臨床試驗需上述單位許可，透過廠商購買，長期下來權利金相當驚人，致使造影成本昂貴，無法變成常規性的檢測，若國內能自行研發，較符合成本效益並有利於提升病患照護品質。

鑒於上述，本發明利用電腦模擬篩選方式及生物體外結合能力分析，驗證化合物與類澱粉蛋白結合能力，而篩選出N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲 哚啉對於退化性神經斑塊(Seline plaque，SPs)與神經纖維糾結(Neurofibrillary tangles，NFTs)具有專一性，故而可用於體內檢測阿茲海默氏症，因而完成本發明。

本發明係有關一種下式(1)所示之N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉之用途，其係用以診斷阿茲海默氏症及定量腦內類澱粉蛋白。

本發明之N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉為已知化合物，可見於下述網站：zinc.docking.gov且可自市面上購得，故而其合成方法將不再贅述。

本發明人等對N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉(以下簡稱”本發明化合物”)能進行生物體外分析，發現該化合物可與乙型類澱粉蛋白染色劑硫黃素T(Thioflavin T，ThT)共同競爭結合位置，故而驗證本發明化合物與類澱粉蛋白之結合能力。

再者，本發明之化合物由於分子量小於500且已知其脂溶性>2並且為電中性，故而具備穿透血腦障壁進入腦部之條件(分子量小、電中性、脂溶性高較易通過血腦障壁)，極適合用以診斷阿茲海默氏症及定量腦內類澱粉蛋白。

尤其，本發明之化合物由於具備穿透血腦障壁進入腦部之條件，而且具有與類澱粉蛋白之結合能力，因此當進一步標記適當的放射性同位素時，推定能應用於阿茲海默氏症的診斷及腦內類澱粉蛋白之定量。

可用以標記本發明化合物之放射性同位素只要為具有放射性之同位素即可，並未特別限制，惟若舉例，則可為例如C-11或F-18等。

圖1顯示實施例中進行之本發明化合物與類澱粉蛋白螢光染劑ThT對Aβ40之螢光結合競爭結果。

本發明中之N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉(以下有時稱為”本發明化合物”)可與乙型類澱粉蛋白結合係透過分子對接分析、結合模式模擬及生物體外結合分析等而篩選出者。現將詳述該等篩選方法。

基於結構的藥物設計技術在藥物研發中扮演非常重要的角色，在藥物分子產生藥效過程中，藥物分子與標靶須充分接近，採取合適的位向，透過適當的構型調整，交互作用以得到一穩定之複合物。基於結構的藥物設計主要採用分子對接技術。分子對接(molecular docking)是分子模擬重要方法之一，係依據配體與受體作用之「鎖鑰原理」(lock and key principle)，模擬彼此間的交互作用，此分子識別的過程，包括了氫鍵作用、靜電作用、疏水作用及凡德瓦爾力作用。通過電腦模擬計算，預測兩者間結合模式與親和力，從而進行虛擬之藥物篩選。分子對接之兩大重點為分子間之空間與能量互補，其中空間辨識是分子間幾何配對，以尋找配體與受體間最佳交互作用模式，能量辨識則作為結合穩定性評估。分子對接被廣泛運用從小分子數據庫中搜尋與受體有較好親和力之小分子，再進行後續藥理測試，從中篩選出具潛力之先導化合物。

篩選藥物之軟體係使用Discovery Studio 3.0(Accelrys Inc.,USA)，利用分子對接CDOCKER模組模擬小分子化合物與乙型類澱粉蛋白受體之結合位向，CDOCKER係採用CHARMm力場的對接技術，及受體固定構型但配體構型為彈性可改變的模式，來評估最穩定的結合位向。本發明化合物係藉由如下之篩選條件而篩選出：(1)分子對接分析；(2)結合位向分析。於篩選出本發明化合物後再進行生物體外結合分析以驗證其與乙型類澱粉蛋白受體之結合能力。

本發明中篩選方式，由於係利用電腦軟體進行，故而於此不再贅述。

用以分析本發明化合物與乙型類澱粉蛋白受體之結合能力之方法，將以 下述實施例進行說明。但所例舉之實施例僅用以說明本發明，而不用以限制本發明之範圍。

[實施例]

生物體外分析

與Aβ40之螢光結合競爭作用：利用2μM Aβ40、1μM類澱粉蛋白螢光染劑ThT與作為競爭化合物的分別為0.47nM、0.94nM、4.7nM、9.4nM、47nM、94nM、470nM、940nM、4700nM及9400nM濃度之標準化合物(PiB及BTA-1)及本發明化合物進行與類澱粉蛋白之競爭結合抑制試驗，於室溫反應2小時，以Anthos Zenyth 3100利用激發波長485nm進行激發而放射出波長535nm之螢光。其中將不添加本發明化合物與ThT競爭與類澱粉蛋白結合位置的情況下之ThT結合率設作1，並以PiB及BTA-1作為正對照組(positive control)，並以結合率=(含有本發明化合物存在時所得之螢光值/不存在本發明化合物時所得之螢光值)算出各濃度化合物之結合率。所得結果示於圖1。圖1中，橫軸為競爭化合物之濃度，縱軸為ThT結合率。由圖中之結果可知，逐漸增加競爭化合物的濃度時，可觀察到隨著本發明化合物的濃度增加，螢光染劑ThT之結合率逐漸降低，意指與類澱粉蛋白結合之螢光染劑ThT被取代因而螢光值降低，驗證本發明化合物能與乙型類澱粉蛋白良好地結合。而且由圖1亦可知，本發明之化合物與已知與乙型類澱粉蛋白具高度親和力之PiB及BTA-1相較，在低濃度時具有與其等已知化合物相當之ThT結合率。

由上述結果可知，由於本發明化合物具有與乙型類澱粉蛋白良好結合之能力，故而預期能發展成為對於退化性神經斑塊(Seline plaque，SPs)與(Neurofibrillary tangles，NFTs)具專一性的體內檢測阿茲海默氏症工具之一，因而可用以診斷阿茲海默氏症及定量腦內之類澱粉蛋白，於醫療產業上具有相當價值。

Claims (6)

1. 一種下式(1)所示之N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉在製備用於診斷阿茲海默氏症之藥學組合物的用途：
2. 如請求項1之用途，其中該N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉之脂溶性>2。
3. 如請求項1之用途，其中該N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉具有與類澱粉蛋白結合之能力。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其係用以定量腦內之類澱粉蛋白。
5. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該N-(4-異丙基苯基)-5-胺基異吲哚啉又可經放射性元素進行標記。
6. 如請求項5之用途，其中該放射性元素為C-11或F-18。