TWI550088B

TWI550088B - 使老化細胞回春之方法及其組合物

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Publication number: TWI550088B
Application number: TW103101564A
Authority: TW
Inventors: 楊台鴻; 張旭賢; 高于婷; 蔡靜雯
Original assignee: 國立台灣大學
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2016-09-21
Also published as: TW201529853A

Description

使老化細胞回春之方法及其組合物

本發明係關於一種使老化細胞回春的方法及其組合物，更特別地，係關於一種利用特殊材料使老化細胞回春的方法及其組合物。

衰老(aging，senescence，senility)又稱老化，通常指生物發育成熟後，在正常情況下隨著年齡的增加，機能減退，身體穩定性下降，結構中心成分退化，趨向死亡的不可逆的現象。衰老和死亡是生命的基本現象，衰老過程發生在生物界的整體水準、種群水準、個體水準、細胞水準以及分子水準等不同的層次。生命要不斷的更新，種族要不斷的繁衍。而這種過程就是在生與死的矛盾中進行的。至少從細胞水準來看，死亡是不可避免的。

衰老是生物界的普遍規律，細胞作為生物有機體的基本單位，也在不斷地新生和衰老死亡。衰老是一個過程，這一過程的長短即細胞的壽命，它隨組織種類而不同，同時也受環境條件的影響。高等動物體細胞都有最大分裂次數，細胞分裂一旦達到該次數就要死亡。各種動物的細胞最大分裂數各不相同，人類細胞為50~60次。一般說來，細胞最大分裂數與動物的平均壽命成正比。細胞衰老時會出現水分減少、老年色素一脂褐色素累積、酶活性降低、代謝速率變慢等一系列變化。關於細胞衰老，目前已有不少學說，主要包括遺傳因素說、細胞損傷學說、生物大分子衰老學說等，但都不盡然能圓滿地解決問題。

p53和pRB蛋白是兩種關鍵的腫瘤抑制因子，在誘導衰老方面有著決定性的作用，一般的兩條衰老訊號路徑是指pRB訊號路徑(signal pathway)和p53訊號路徑。

人類的細胞衰老路徑表現為兩條平行的路徑，這樣將使得細胞不容易繞過衰老過程，從而抑制了腫瘤的發生。但是這種設想受到了近年來的一些實驗的挑戰，如人的肺纖維細胞，透過體細胞同源重組技術，使得p53或PRB失去活性，可以避開衰老過程。

關於p53和pRB蛋白的作用，現在有一種比較認可的學說是：p53/p21路徑指的是端粒功能異常、DNA損傷引起的衰老過程；p16/pRB路徑指的是致癌基因的表達、染色質斷裂、多種多樣的脅迫等等引起的衰老過程。但是現在這兩條路徑的標記分子尚未找到，並且在不同種、不同組織的細胞中兩條路徑的重要性又有所不同，所以對於衰老路徑的理解正處於不斷深化的過程中。

上述兩個路徑情況減述如下：

(一)p53/21路徑：

p53蛋白可以啟動下游分子，如p21CIP1/WAF1，或是其他的蛋白分子來啟動pRB實現衰老過程(小鼠)；而且，在人身上，可以不依賴pRB啟動衰老。p53失去活性會導致一些複製型衰老的細胞徹底地逆轉衰老過程。類似地，p21(p53的轉錄啟動的標靶，是一種細胞週期的抑制分子)的失去活性，會使得細胞繞過端粒依賴的複製型衰老，進入一種危機狀態。p53在細胞對DNA損傷反應(包括衰老反應)過程中是一個關鍵性的調節因子。在人的細胞中，p53的缺失會延遲或是阻斷複製型衰老。

致癌基因(RAS oncogene)的表現透過活性氧(ROS)來實現，而ROS是在有絲分裂以及細胞衰老的過程中是必需的。RAS的過量表現，可能會透過p53依賴的損傷反應(即產生大量的DNA損傷的ROS)來導致衰老反應；同時RAS也會誘導p16的表現，p16是pRB的啟動劑。兩個蛋白都能阻礙潛在的腫瘤細胞的增殖。

總之，在一些細胞中，DNA損傷引起的衰老感應，端粒異常，以及一些致癌性基因的表現會透過p53路徑來導致細胞衰老，p53路徑在當中起的作用不僅是必要而且還是充分條件。

(二)pRB/p16路徑

p53對於一些細胞逆轉衰老抑制非常有效，但也不完全。有些細胞在p53去除後，還能呈現衰老狀態。這種細胞往往或多或少地表現細胞週期的抑制因子p16。

小鼠體內的研究證明p16阻礙了自發性的惡性腫瘤的發生。細胞培養的研究證明，p16阻止了由p53失活引起的逆轉衰老的現象；並且對RAS引導的衰老過程是必需的。p16的表現可透過脅迫刺激，例如：過量表現致癌基因RAS、或是較艱苦的培養環境，被p21或p16ink4a蛋白分子激發。p16是pRB的正向調節分子，而且還能透過自身的訊號路徑來實現作為腫瘤抑制劑的功能。值得一提的是，p21在抑制細胞週期依賴的激酶方面，是比p16更普遍的抑制劑，它可以導致磷酸化的程度降低，促進pRB的啟動。在成人的纖維細胞中，如果p53失去活性，p21表現，細胞增殖過程仍可繼續；但是如果p16表現了，那麼增殖過程就會停止了。並且，在成人的纖維母細胞中，p21和p16，一般是兩者擇其一表現。

pRB蛋白在衰老的過程中是以低磷酸化的活性狀態表現活性的，透過結合E2F蛋白家族的成員來抑制目標基因的表達。有趣的是，一旦pRB路徑啟動了之後(尤其是被p16啟動的)，就算是p53失去活性，p16不表現，或pRB失去活性都不能逆轉衰老過程的發生。這個過程被認為是pRB在轉錄因子的目標基因或者是其他的基因池上，形成抑制性的染色體之後，維持異染色體的過程不需要p16或是pRB的參與。

pRB路徑在誘導有關衰老基因的表達方面鮮為人知。因為pRB/E2F並不直接調控那些在衰老細胞中高表達的基因，而是間接地控制這些基因(如不表現那些抑制因子，等等)。

由此可見，老化過程中p53及pRB之表現機制即為監控老化過中不可缺少的機制，其亦代表了細胞週期中老化的發生，而這些發現亦建立了p53及pRB為不可逆的衰老途徑中的重要因子，同時也是維持不可逆細胞週期中止(cell cycle arrest)的重要成分。

目前學術上，對於預防老化的多採用將老化的細胞放置在較年輕的環境中，或是將細胞以低氧濃度處理。而在醫學的臨床應用則是採用PRP(Platelet Rich Plasma)的ACR(Autologous Cell Rejuvenation)技術，得到富含高濃度自體生長因子，刺激組織修復，有效延緩老化，更進一步達到回春的效果。然而，目前學術上將老化細胞置於年輕環境中可能具有排斥現象，因年輕的血清及ECM皆來自異體。而醫學臨床上若將細胞以低氧濃度處理，則實際臨床應用機會較低，因人類處於低於18%氧氣濃度的環境會導致攝取氧氣之不足，血液中氧的分壓過低，血紅素處於不飽和狀態，各部分組織的細胞就都會由於供氧不足出現一定的變化，表現出相對應的缺氧症狀。

目前臨床使用的回春技術，雖然採用自體血漿，完全不排斥，且富含生長因子，但由於生長因子並不穩定，高濃度的生長因子卻也可能引發腫瘤之生成。

因此，本發明據此提供一種新的方法，在細胞進入不可逆的衰老途徑後，建立起可逆的老化模式，藉由利用一種特殊的材料，使老化細胞產生實質上球形，造成低氧的環境，達到使衰老的細胞回春的效果且不會產生上述問題。

緣此，本發明提供一種使老化細胞回春的方法，其可透過利用特殊材料將已老化的細胞形成實質上球形，以致於實質上球形的球心至球的邊緣部分造成不同程度上的低氧狀態，致使老化的細胞具有回春的效果，且具不同程度的老化細胞皆可回春。且經由實驗證實細胞經處理後仍屬正常細胞，無不正常細胞增生現象。

於是，本發明提供一種使老化細胞回春的方法，其可包含下列步驟：(a)將生物相容性高分子材料溶於溶液中；(b)將溶液製成一載體；以及(c)將已老化細胞置於該載體上培養1-14天、較佳為3-7天、更佳為3天，使老化細胞回春；其中，生物相容性高分子材料可為聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、幾丁聚醣、甲基纖維素、瓊脂、透明質酸或其混合物。

較佳地，透過生物相容性高分子材料可使已老化細胞內部形成低血清環境。

較佳地，透過生物相容性高分子材料可使已老化細胞產生實質上球體形狀，致使造成低氧環境。

較佳地，以生物相容性高分子材料及溶液之總重為基礎，生物相容性高分子材料之重量百分比可為0.05wt%-50wt%，較佳為0.2wt%-30wt%，更佳為0.5wt%-10wt%。

較佳地，溶液可為醋酸、二甲亞碸、乙醇、磷酸緩衝液、水或其混合物。

較佳地，醋酸溶液濃度可為0.05wt%-75wt%，較佳為0.1wt%-50wt%，更佳為1wt%-10wt%。

較佳地，二甲亞碸溶液濃度可為25wt%-99.9wt%，較佳為50wt%-99.9wt%，更佳為75wt%-99.9wt%。

較佳地，乙醇溶液濃度可為25wt%-99.9wt%，較佳為50wt%-99.9wt%，更佳為75wt%-99.9wt%。

較佳地，已老化細胞可為老化的纖維母細胞、脂肪幹細胞、間葉幹細胞、十字韌帶細胞或其組合。

此外，本發明更提供一種使老化細胞回春之組合物，係包含：生物相容性高分子材料；以及溶液；其中，生物相容性高分子材料可為聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、幾丁聚醣、甲基纖維素、瓊脂、透明質酸或其混合物。

本發明一個或一個以上實施例的細節將於所附圖式和以下描述中予以闡述。根據這些描述和圖式和申請專利範圍，將可容易地瞭解本發明的其他特徵、目的和優點。由於本發明在於強調利用幾丁聚醣等具生物相容性之高分子材料使得已老化之細胞得以回春之特性及效用，且於實施方式中將舉出實驗案例證實其特性，使得本發明之上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明。

第一圖係利用西方點墨法表現p53、p21、p16及β-肌動蛋白之分析圖；第二圖係細胞在表皮細胞生長因子(EGF)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)培養後轉移至幾丁聚醣膜培養3天(d3)及7天(d7)之細胞形態圖；第三圖係細胞於各生物相容性高分子材料培養(A：控制組(TCPS；tissue culture polystyrene)；B：1wt%幾丁聚醣溶於3wt%的醋酸中；C：5wt%聚乙烯醇溶於二甲亞碸(DMSO)中；D：0.6wt%聚羥乙基丙烯酸甲酯溶於乙醇中；E：12wt%甲基纖維素溶於磷酸緩衝液(PBS)中；F：1wt%瓊脂溶於二次水(ddH₂O)中)3天後的細胞形態示意圖；第四圖係老化細胞培養30天後轉移至幾丁聚醣膜3天(d30+chid3)及7天(d30+chid7)的p53、p21、p16及β-肌動蛋白之西方點墨法分析圖；第五圖係係老化細胞培養於表皮細胞生長因子(EGF)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)條件30天(d30)與培養30天後轉移至幾丁聚醣膜3天(d30+chid3)的p53、p21及β-肌動蛋白之西方點墨法分析圖；第六圖係老化細胞培養30天(d30)與培養30天後轉移至幾丁聚醣膜3天(d30+chid3)的細胞增生比較圖(**p<0.01)第七圖係細胞於軟瓊脂中的非固著依賴性(anchorage-independent)生長比較圖；以及第八圖係老化細胞培養於低氧狀態、含氧量正常狀態及幾丁聚醣3天的HIF1-α於西方點墨法表現分析圖；其中下方的號碼1、5、9為DMEM培養；2、6、10為EGF 10ng/ml培養；3、7、11為EGF 25ng/ml培養；4、8、12為EGF 50ng/ml培養。

本發明之優點及特徵以及達到其方法將參照例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。在圖中，成分或元件的尺寸及相對尺寸為了清晰易懂而以誇示方法表示。整篇說明書中，相同的元件符號指的是相同的元件。如本文中所使用的，術語”及/或”包含任何及所有一或多相關所列物件的組合。

除非另外定義，所有使用於本文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的內容一致的意思，且除非明顯地定義於本文，將不以過度理想化或過度正式的意思理解。

以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含於不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發明之申請專利範圍。這些實施例之提供使得本發明之揭露完整與明暸，熟知此技術之人將能經由該些實施例了解本發明之範疇。

於本文中，術語「載體」為細胞培養中一用以承載物質之媒介。

於本文中，術語「低氧狀態」係指生物的組織或細胞不能獲取足夠的氧，或能獲取但無法運用，具體而言，本文中的低氧狀態係指氧氣濃度低於約15%。

於本文中，術語「低血清環境」係指限制生物組織或細胞的血清供應，使其不能獲取足夠的養分，具體而言，本文中的低血清環境係指培養環境之血清濃度低於約5%。

本發明之目的在於提供一種使老化細胞回春的方法，在此發明中會利用特殊的材料作為老化細胞於培養盤上的基材，該基材主要為生物相容性高分子材料，其可使得已老化之細胞形成實質上球形，以致於球形的球心至球的邊緣部分造成不同程度上的低氧狀態，且形成低血清環境，致使老化的細胞具有回春的效果，且具不同程度的老化細胞皆可回春。

於是，本發明提供一種使老化細胞回春的方法，其可包含下列步驟：(a)將生物相容性高分子材料溶於溶液中；(b)將該溶液製成一載體；以及(c)將已老化細胞置於載體上培養1-14天，較佳為3-7天，更佳為3天，使老化細胞回春。

此外，本發明更提供一種使老化細胞回春之組合物，係包含：生物相容性高分子材料；以及溶液。

本發明較佳實施例中，生物相容性高分子材料可為聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、幾丁聚醣、甲基纖維素、瓊脂、透明質酸或其混合物。

以下實驗例中將展示以生物相容性高分子材料作為老化細胞於培養盤上的基材，實施例中所使用之材料將以幾丁聚醣為準，聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、甲基纖維素、瓊脂等為輔，測試結果如第一圖~第八圖所示。除非另外說明，否則輔助之材料皆利用與幾丁聚醣相同的實驗條件及背景做測試，且應可得到相同或相似之結果。而其他的生物相容性高分子材料，例如：透明質酸等，由於與上述材料性質相近，故結果理應相同或相近。。其中，實施例的試驗結果僅為例示性說明，將不意欲限制本發明之範圍。本發明之範圍，將以後附之申請專利範圍為準。

實施例

本發明係參照後文中數個實施例做更進一步地描述一種使老化細胞回春的材料與方法，其並非意欲限制本發明之範圍。

實施例1 細胞培養

先從健康的成人取得原代的(primary)人類包皮纖維母細胞。然後再將樣品置於細胞培養基(DMEM；Dulbecco's Modified Eagle's Medium)中，以1mg/ml的分散酶(dispase)自真皮中分離出表皮層，接著再將真皮樣品置於100mm的細胞培養皿且切成邊長2-3mm的方形。於DMEM中以10%的胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)(GIBCO)及1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)、在37℃及5%的CO₂環境下培養的真皮樣品直到纖維母細胞自真皮樣品遷移出才移除。接著將纖維母細胞於細胞培養皿中繼代培養。以下實施例所指的細胞若無特別說明，皆指纖維母細胞；惟，纖維母細胞僅為例示性，非為限制性，例如：脂肪幹細胞、間葉幹細胞、十字韌帶細胞或上述之組合等皆可於本發明中使用。

實施例2 利用西方點墨法觀察細胞老化蛋白之表現

將細胞裂解並透過裂解緩衝液來收集可溶性蛋白，接著於4℃以16,000g的條件離心5分鐘。將上清液轉移至緩衝液(laemmli buffer)且於95℃加熱5分鐘。蛋白質的萃取係透過聚丙烯醯胺膠電泳(SDS-PAGE)分離且轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。經阻隔(blocking)之後，PVDF膜係與一級抗體(primary antibody)，例如：小鼠單株抗體p21(Cell Signaling)、p53(Calbiochem)、p16(BD pharmingenTM)以及β-抗肌動蛋白(anti β-actin)(Millipore)於25℃環境下2小時培養，置於4℃整夜的環境下。之後，PVDF膜再與經過氧化酶標定之二級抗體(peroxidase-labeled secondary antibody)於25℃環境下培養2小時，再以化學螢光檢測系統(chemiluminescence detection system)偵測。所有的免疫點墨法皆進行三次以上重複試驗。

本實施例中，細胞生長因子係選用經表皮細胞生長因子(EGF；Epidermal Growth Factor)誘導而老化之細胞；惟，此僅為例示性，非為限制性，例如：經繼代不斷培養而老化之細胞亦可利用。由先前技術可得知，p53/p21及pRB/p16為細胞週期中扮演誘導老化的重要角色。其中，本發明係選出p53、p21及p16來檢測細胞是否進入細胞週期中止(cell cycle arrest)及變得老化。如第一圖所示，將細胞培養30天後，西方點墨法分析所有的已處理細胞雖無表現出p16，但確實表現出p53及p21。

實施例3 製備以生物相容性高分子材料塗佈之培養盤

溶解於3wt%醋酸溶液的1wt%幾丁聚醣溶液(去乙醯化程度85%；Sigma-Aldrich，St.Louis,Cat.No.c-3646)添加至細胞培養盤(Corning Costar)中的每一孔且於60℃乾燥24小時，再以氫氧化鈉溶液中和；其中，中和係指pH達到約7之條件。細胞培養盤接著再以純水(Milli-Q water)清洗，再暴露至紫外光的環境下整夜。

在細胞放置於幾丁聚醣塗佈細胞培養盤培養後，係觀察到僅有少數懸浮的纖維母細胞或球狀體附著於幾丁聚醣膜上。如第二圖所示，無論以EGF(Epidermal Growth Factor)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)條件處理，於7天時的實質上球體形態皆明顯大於3天時的實質上球體形態。

此外，請參見第三圖；第三圖係細胞於各生物相容性高分子材料培養(A：控制組(TCPS；tissue culture polystyrene)；B：1wt%幾丁聚醣溶於3wt%的醋酸中；C：5wt%聚乙烯醇溶於99.9Wt%的二甲亞碸(DMSO)中；D：0.6wt%聚羥乙基丙烯酸甲酯溶於99.9Wt%的乙醇中；E：12wt%甲基纖維素溶於磷酸緩衝液(PBS)中；F：1wt%瓊脂溶於二次水(ddH2O)中)3天後的細胞形態示意圖。其中可發現，相較於控制組(第三A圖)細胞無聚集的情況下，細胞於各個有機材料(第三B-第3F圖)培養三天後，細胞皆主動的聚集為多細胞球體。其中，應注意的是，生物相容性高分子材料亦可包含透明質酸，由於透明質酸與上述材料性質相似，故所屬領域通常知識者亦可設計相同或相似的實驗條件達成相同或相似的效果。

如第四圖所示，確認培養細胞30天(d30)後表現出p53及p21，即確認細胞已邁向老化途徑後，將其轉移至幾丁聚醣表面培養3天(d30+chid3)及7天(d30+chid7)可發現幾丁聚醣表面培養3天(d30+chid3)的表現強度比表現7天(d30+chid7)來的低。

接著，請參閱第五圖。確認培養細胞30天(d30)表現出p53及p21，即確認細胞已邁向老化途徑後，將其轉移至幾丁聚醣表面培養3天(d30+chid3)，接著轉移至細胞培養盤(TCPS；tissue culture polystyrene)，即可發現無論是在表皮細胞生長因子(EGF；Epidermal Growth Factor)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)條件下，p53與p21的表現量皆明顯降低。

實施例4 BrdU增生分析

將細胞置於100μl/孔的培養基中且在添加BrdU之前使其附著良好。0.2μl的BrdU係添加至每個孔中，其中該些細胞係培養於37℃的環境下12小時。經過BrdU併入之後，係利用30分鐘來固定溶液(Fixing Solution)(Millipore)以固定細胞且使DNA失去活性，接著利用清洗緩衝液(Wash Buffer)(Millipore)清洗三次。再添加100μl/孔的anti-BrdU單株抗體且於室溫培養1小時。以1：2000稀釋山羊抗小鼠之過氧化酶軛合物抗體(Goat anti-Mouse IgG peroxidase conjugate)，並將100μl滴入每個孔中。此步驟應包含於室溫下培養30分鐘。利用清洗緩衝液(Wash Buffer)清洗三次。接著加入TMB(tetramethylbenzidine)過氧化酶基質並於黑暗中的室溫培養30分鐘。30分鐘後，透過利用ELISA讀取器於波長370/492nm來讀取培養盤之數據。

BrdU可併入經複製細胞的新合成的DNA中，其中該些細胞係於細胞週期的S相(Sphase)中。由第六圖可發現，細胞培養於EGF(Epidermal Growth Factor)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)條件下30天皆具有較低的BrdU併入量。然而，當這些低增生細胞轉移至幾丁聚醣膜3天再移至細胞培養盤(TCPS，tissue culture polystyrene)後，可明顯發現該些細胞恢復細胞增生的能力，且統計上可看出顯著地增加。由此可透過併入BrdU來觀察於該些細胞中DNA合成，且該些細胞係殖於幾丁聚醣上。其中，應注意的是，本發明利用BrdU鑑定老化細胞是否回春僅為例示性，非為限制性；許多目前已發展成熟之鑑定老化回春的實驗方法應皆可應用於本案中。

實施例5 軟瓊脂群落形成分析

此分析係於六孔的細胞培養盤(Costar)上且殖入20000細胞。底部的膠體係透過1%的瓊脂糖(agarose)溶液、2X的DMEM、20%的胎牛血清以及抗體混合而成。頂部的膠體係由0.7%的瓊脂糖(agarose)溶液、2X的DMEM、胎牛血清及20000個細胞所組成。該些細胞係維持於37℃、5%的CO2培養箱中2星期。2星期後，於每個孔中加入2mg/ml的甲基噻唑基四唑(MTT)且將細胞培養盤培養於37℃、5%的CO₂條件下3小時。此時，以MTT染色呈陽性反應之細胞將可由顯微鏡所觀測到。

細胞培養於EGF(Epidermal Growth Factor)10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml或以DMEM(即無EGF)條件下30天，接著轉移至幾丁聚醣3天。該些細胞再殖入軟瓊脂2天再以MTT染色以檢測這些細胞是否轉形(transformation)。由於這些細胞的高度增生，所以應確認這些細胞是否轉形。本實施例利用海拉細胞(HeLa cell)做為正控制(positive control)以確保此分析為可行的。更進一步地，由第七圖的半定量分析可看出，僅海拉細胞(HeLa cell)表現出群落，但其他並沒有。可顯示本實驗經幾丁聚醣培養之老化細胞雖保持高度增生，但是並沒有如海拉細胞(HeLa cell)般呈現不正常且不斷持續分裂增生的情況。

實施例6 HIF1-α的表現

細胞培養於幾丁聚醣3天後，將該些細胞裂解且可溶性蛋白質係由裂解緩衝液收集。由於HIF1-α被認為與低氧環境(hypoxia)有關，因此本實施例係檢測當老化細胞培養於幾丁聚醣3天時，HIF1-α是否被表現。本實施例係以西方點墨法分析，且利用0.5% O₂處理的細胞作為正控制(positive control)，且該些細胞並沒有做任何的負控制(negative control)。由第八圖可看出，老化細胞經幾丁聚醣培養3天後可表現出HIF1-α，低氧狀態(0.5% O₂)的族群亦是。然而，含氧量正常狀態(normoxia)僅有較低之HIF1-α表現。

結果與討論

於本發明中，可發現的是，將已老化細胞置於幾丁聚醣表面，在細胞間碰撞(intercellular collision)之後，細胞有著高度運動性的(motile)且自動地聚集為多細胞球體(即形成實質上球體形狀)。由第二圖亦可發現，球體隨著培養期間而增加。7天時的球體形態皆明顯大於3天時的球體形態。而由第三圖可知，利用本發明之生物相容性高分子材料，例如：聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、幾丁聚醣、甲基纖維素、瓊脂，處理過後之老化細胞，細胞皆明顯地自動聚集為多球體形態。

所以在幾丁聚醣的培養期間為細胞回春的重要條件。本發明中發現老化細胞於幾丁聚醣上培養3天較培養七天擁有較佳的可行性。由第四圖可知，老化標記，例如：p53或p21，在當老化細胞轉移至幾丁聚醣培養3天(d30+chid3)接著轉移至TCPS培養之後有較低的表現量，由此可知在幾丁聚醣培養3天的老化細胞可達到較佳之回春效果，換言之，於幾丁聚醣培養3天的期間是用來使細胞回春的最佳培養期間。而為了驗證上述結果，本發明將老化細胞於幾丁聚醣上培養3天接著轉移至TCPS培養，結果如第五圖所示，老化細胞於幾丁聚醣上培養3天(d30+chid)具有較低的p53及p21表現量。且進一步發現這些細胞具有較高的增生活性，且不會轉形(如第六、七圖所示)。由此可知，於幾丁聚醣培養3天的老化細胞係足以克服老化的屏障，甚至使細胞回春達到最佳化。

更進一步地，本發明亦釐清為何可透過於幾丁聚醣培養3天即可使老化細胞回春的可能原因。由第八圖可證明低氧狀態(hypoxia)係與細胞回春有關。透過檢測較低氧氣狀態對於纖維母細胞的影響，可各觀察到細胞複製性的衰老(replicative senescence)降低且壽命增加。一般的解釋是老化係與端粒(telomere)的縮短及自由基理論相關，兩者皆與氧氣的供應相關，而人類端粒酶催化次單元(hTERT)係與端粒酶活性有關，且低氧狀態在轉錄階段係誘導hTERT的表現；而針對氧化壓力(oxidative stress)，低氧狀態係防止自由基的產生，故可知與防止老化有關聯。

此外，低氧狀態可誘導因子(HIF)為受氧調控的(oxygen-regulated)基因表現的主要調控者，且第八圖顯示HIF係與細胞回春相關。於該實施例中，培養於幾丁聚醣的老化細胞係表現出HIF1-α，其建議了此培養系統使得該細胞成為低氧狀態。因此，本發明可說明將老化細胞培養於幾丁聚醣上形成了低氧狀態而導致了細胞回春。故幾丁聚醣可創造優異的條件使得細胞成為低氧狀態，透過低濃度的氧，成為使老化細胞回春的途徑。

綜上所述，本發明所提供的一種使老化細胞回春的方法及其組合物，具備下述優點：

1.回春後之細胞仍屬正常細胞，無不正常增生的情況；

2.不同程度的老化細胞皆可達到回春，方法具便利性、自體不排斥；

3.以本發明之生物相容性高分子材料處理之老化細胞，雖會聚集形成球體，且形成環境惡劣的低氧狀態，但不會走上凋亡的途徑。

4.將老化細胞置於發明之生物相容性高分子材料培養約1-10天，較佳為3-7天，更佳為10天，即可使該老化細胞達到最佳之回春狀態。

其它實施態樣

所有揭露於本發明書之特徵係可使用任何方式結合。本說明書所揭露之特徵可使用相同、相等或相似目的的特徵取代。因此，除了特別陳述強調處之外，本說明書所揭露之特徵係為一系列相等或相似特徵中的一個實施例。

此外，依據本說明書揭露之內容，熟悉本技術領域者係可輕易依據本發明之基本特徵，在不脫離本發明之精神與範圍內，針對不同使用方法與情況作適當改變與修飾，因此，其它實施態樣亦包含於申請專利範圍中。

Claims

一種使老化細胞回春之方法，其包含下列步驟：(a)將一生物相容性高分子材料溶於一溶液中；(b)將該溶液製成一載體；以及(c)將一已老化細胞置於該載體培養1-14天，使該老化細胞回春；其中該生物相容性高分子材料為聚乙烯醇、聚羥乙基丙烯酸甲酯、幾丁聚醣、甲基纖維素、瓊脂、透明質酸或其混合物；其中該溶液包含醋酸溶液、二甲亞碸溶液、乙醇溶液、磷酸緩衝液、水或其混合物；其中該已老化細胞為一老化的纖維母細胞、一脂肪幹細胞一間葉幹細胞、一十字韌帶細胞或其組合。
根據申請專利範圍第1項之方法，其係透過該生物相容性高分子材料使該已老化細胞內部形成一低血清環境。
根據申請專利範圍第1或2項之方法，其係透過該生物相容性高分子材料使該已老化細胞產生一實質上球體形狀，以形成一低氧環境。
根據申請專利範圍第1項之方法，其中以該生物相容性高分子材料及該溶液之總重為基礎，該生物相容性高分子材料之重量百分比為0.05wt%-50wt%。
根據申請專利範圍第4項之方法，其中該醋酸溶液濃度為0.05wt%-75wt%。
根據申請專利範圍第4項之方法，其中該二甲亞碸溶液濃度為25wt%-99.9wt%。
根據申請專利範圍第4項之方法，其中該乙醇溶液濃度為25wt%-99.9wt%。