TWI548410B - 使用雙功能性之烷化劑及ｄｎａ修復抑制劑之組合以治療癌症之方法 - Google Patents

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Description

使用雙功能性之烷化劑及DNA修復抑制劑之組合以治療癌症之方法
本申請案係關於包含雙功能性烷化劑及DNA修復抑制劑之組合的組合物及該組合物在治療癌症，尤其抗藥性癌症中的用途。
DNA烷化劑通常用作化學治療藥以治療各種兒科及成人癌症[1]，其藉由直接與DNA相互作用以引起DNA損傷來發揮其細胞毒性效應。存在兩種類型之DNA烷化劑，單功能性烷化劑及雙功能性烷化劑。雙功能性氮芥烷化劑二氯甲基二乙胺為50多年以前最先引入臨床實踐的抗腫瘤藥物[2]。目前，各種雙功能性烷化劑仍廣泛用於治療患有惡性疾病之患者，諸如氮芥(例如美法侖(melphalan)[3])、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)[4])、烷基磺酸鹽(例如白消安(busulfan)[5])、氮丙啶(例如塞替派(thiotepa)[6])、鉑類藥物(例如順鉑(cisplatin)[7])及天然產物絲裂黴素C(MMC)[8]。雖然單功能性烷化劑主要形成遺傳毒性單臂加合物以進一步誘導突變性及致癌性DNA損傷，但雙功能性烷化劑在DNA上形成單臂加合物、股內交聯及股間交聯(ICL)，且亦形成DNA-蛋白質交聯[9]。ICL致使複製體解離並折攏，隨後誘導DNA雙股斷裂(DSB)(9,10)。因此，雙功能性烷化劑對ICL之誘導干擾細胞週期進程並引發細胞死亡。由於相較於其他DNA損傷而言修復ICL較為困難，因此形成ICL為雙功能性烷化劑之細胞毒性中的重要步驟，且被認為是靶向癌症療法中的重要事件[10,11]。基於MMC及雙(胺基甲酸酯)吡咯聯啶，吾等先前已合成一系列雙功能性烷化劑，3a-氮雜環戊二烯幷[a]茚-1-基之雙(羥甲基)衍生物及其雙(甲基胺基甲酸酯)衍生物(參看下圖)，且該等烷化劑在各種活體外細胞模型及活體內異種移植小鼠模型中顯示有效抗癌活性[12]。應注意，吾等已在2009年10月28日申請之美國臨時專利61/255,620中揭示此等雙功能性烷化劑。在3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之一系列衍生物中，BO-1012及BO-1509誘導顯著量之ICL並抑制移植於裸小鼠中之人類乳癌細胞生長[12]。
在DNA修復抑制劑中，三氧化二砷(ATO)為經批准用於治療復發性或難治性急性前髓細胞白血病(APL)之抗贅生性化學治療劑[13]。亦已報導ATO在足以於患者中安全使用之低濃度下可降低骨髓瘤細胞中之細胞生存力、誘導其細胞凋亡並抑制其腫瘤生長[14]。最近研究已進一步證明，ATO高度有效於引發各種實體腫瘤細胞中之活體外細胞凋亡及抑制異種移植動物模型中之腫瘤生長[15]。ATO對抗實體腫瘤之有前景之臨床前活性支持進一步研究ATO之臨床應用。然而，對患有轉移性腎細胞癌[16]及轉移性黑素瘤[17]之患者進行的II期臨床試驗之初步報導表明，ATO作為單一治療劑使用對實體腫瘤之功效可能有限。
另外，許多報導已顯示，ATO可與誘導細胞凋亡[18-20]、還原麩胱甘肽[19]、抑制DNA甲基化[21]或誘導DNA損傷[22]之藥劑組合使用。ATO亦在活體外及活體內藉由增強自噬效應及預防腫瘤侵襲而增強對人類子宮頸癌及惡性神經膠質瘤細胞之輻射敏感性[22-26]。此外，ATO與美法侖及抗壞血酸組合對抗骨髓瘤之II期試驗顯示，在患有復發性或難治性多發性骨髓瘤之患者中，在高劑量美法侖中添加ATO及抗壞血酸安全且具良好耐受性[24]。
吾等之早期研究及其他研究已報導砷化合物對各種腫瘤模型之抗腫瘤效應[22,25-27]。許多研究已顯示，砷藉由各種機制抑制DNA修復所涉及之蛋白質的活性[28,29]，並干擾鹼基切除修復及核苷酸切除修復[30]。Qian等人研究三氧化二砷用於治療晚期原發性肝癌及膽囊癌[27]。
已報導另一種DNA修復抑制劑LY294002(圖1，一種類黃酮衍生物)能夠抑制DNA修復PI3K或PI3/Akt路徑，且在活體外具有抗增殖及促凋亡活性[31]。亦顯示此藥劑抑制人類腫瘤癌症異種移植中之腫瘤生長並誘導其細胞凋亡[32,33]。另一種AKT抑制劑曲西立濱(TCN，核苷類似物)為最初發現之DNA合成抑制劑。此核苷與許多人類癌症有關，包括前列腺癌[34]。
由於先天及後天抗藥性為普遍性問題，且為造成臨床化學療法失敗之關鍵因素，因此，開發一種針對抗DNA損傷劑之癌症的療法至關重要。
在一個實施例中，本發明提供一種用於治療癌症之醫藥組合物，其包含有效量之雙功能性烷化劑、有效量之DNA修復抑制劑及醫藥學上可接受之載劑。該雙功能性烷化劑較佳為3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之衍生物，諸如BO-1012或BO-1509。該DNA修復抑制劑較佳為三氧化二砷、LY294002或曲西立濱。
在另一實施例中，本發明提供一種治療哺乳動物個體所患之癌症的方法，該方法包含投與該個體以有效量之雙功能性烷化劑及有效量之DNA修復抑制劑。可在對該個體投與DNA修復抑制劑之前投與雙功能性烷化劑，或以相反順序投藥，或可同時投藥。
該方法中所使用之雙功能性烷化劑較佳為3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之衍生物，諸如BO-1012或BO-1509。該方法中所使用之DNA修復抑制劑較佳為ATO、LY294002或曲西立濱。
藉由本發明方法治療之癌症可能對個別治療劑具抗藥性。該癌症可能為下列之一：人類肺癌；人類膀胱癌；人類乳癌；人類前列腺癌；人類神經膠質瘤癌；及人類口腔癌。
I. BO-1012與ATO之組合
先天或後天治療劑抗藥性為癌症化學療法失敗之重要因素。在本研究中，吾等探查組合合成雙功能性烷化劑BO-1012與三氧化二砷(ATO)對人類肺癌H460細胞中之細胞毒性的效應，與所使用之若干種其他癌細胞株相比，人類肺癌H460細胞對BO-1012及ATO更具抗藥性。吾等之結果顯示，與單獨用任一藥劑處理相比，用BO-1012處理H460細胞1小時，接著用ATO處理72小時協同增強細胞毒性效應。改良彗星檢定法(modified comet assay)表明ATO顯著抑制BO-1012所誘導之DNA股間交聯之修復。因此，在用此藥物組合處理之H460細胞中DNA雙股斷裂之蛋白質標記物γH2AX明顯增加並形成細胞核聚焦點。組合處理亦引起重度G2/M停滯及細胞凋亡。在異種移植小鼠模型中，吾等證明用BO-1012與ATO組合處理協同減少接種有H460細胞之裸小鼠之腫瘤體積。類似地，BO-1012與ATO之組合有效降低順鉑抗藥性NTUB1/P人類膀胱癌細胞之生長。此等結果揭示，雙功能性烷化劑與ATO之組合可為治療具有先天或後天抗藥性之癌症的合理策略。
II. BO-1509與LY294002及曲西立濱之組合
此外，吾等最近發現BO-1509(3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之另一種衍生物)與LY294002或曲西立濱之組合協同殺死培養物中之人類肺腺癌CL-1-5。在所用劑量下，BO-1509與LY294002之組合的CI值在0.132至0.953之範圍，而BO-1509與曲西立濱之組合的CI值為0.175至0.643。在CL-1-5異種移植動物模型中，BO-1509與LY294002或曲西立濱(triciribine)之組合顯著抑制腫瘤生長。本發明結果揭示，3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚與DNA修復抑制劑之組合能夠有效地抑制先天或後天抗藥性癌症。
以下實例僅出於進一步說明之目的提供，而不意欲限制本發明之揭示內容。
材料及方法
試劑及化學物質。BO-1012及BO-1509係如先前所述之四步反應合成[12]。簡而言之，吲哚-2-甲酸與4-甲氧基苯甲醯氯偶合獲得1-(4-甲氧基苯甲醯基)-2,3-二氫-1H-吲哚-2-甲酸，該酸藉由在乙酸中與乙炔二甲酸二甲酯反應轉化成二酯。藉由LiAlH4/CH2Cl2還原二酯，接著用異氰酸甲酯或異氰酸乙酯處理，分別獲得所欲呈非晶形固體狀之BO-1012(甲基胺基甲酸3-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-胺甲醯基氧基甲基-8H-3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚-1-基-甲酯)及BO-1509(乙基胺基甲酸3-(4-甲氧基-苯基)-2-甲基-胺甲醯基氧基甲基-8H-3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚-1-基-甲酯)。藉由質譜以及1H及13C核磁共振確證BO-1012及BO-1509之結構。ATO及其他藥劑係購自Merck(Darmstadt，Germany)，LY294002及曲西立濱係購自Cayman Chemical(MI)，且美法侖及塞替派係購自Sigma-Aldrich(St. Louis，MO)。用於細胞培養之化學物質係獲自Gibco(Grand Island，NY)且胎牛血清(FBS)係獲自HyClone(Logan，UT)。
細胞株及細胞培養物。H460(人類大細胞肺癌細胞)、H1299(人類大細胞肺癌p53缺陷細胞)、PC3(人類前列腺癌細胞)、U87(人類神經膠質瘤細胞)及MCF7(人類乳癌細胞)係購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(Rockville，MD)。OEC-M1(人類齒齦鱗狀細胞癌細胞)係獲自Dr. C.-L. Meng(台灣國防醫學院)[36]。NTUB1(人類膀胱移行癌細胞)及順鉑抗藥性亞細胞株NTUB1/P係由Dr. Y.-S. Pu(台灣國立台灣大學附設醫院)提供[37,38]。CL-1-5(人類肺腺癌細胞)係獲自Dr. P. C. Yang(國立台灣大學)。所有細胞株(除了U87，其於MEM培養基中生長)均在補充有10% FBS及抗生素之RPMI1640培養基中培養，在37℃下於含5% CO2之濕潤氛圍中培育。
細胞生存力量測定。使用細胞增殖試劑WST-1(Roche Molecular Biochemicals，Penzberg，Germany)評估細胞生存力，該試劑為在活細胞中由粒線體去氫酶裂解之四唑鎓鹽。簡而言之，在96孔板之各孔中接種2,000至7,000個細胞，並於37℃下培育隔夜隨後進行藥物處理。與單獨BO-1012(0.1至80 μM)、單獨ATO(1至8 μM)或BO-1012加ATO一起培育72小時後，以1:10稀釋度向各孔中添加WST-1溶液，且在37℃下於5% CO2中培育細胞4小時。使用自動酶聯免疫吸附檢定(ELISA)讀板器由460 nm下之吸光度評估細胞生存力。使用CompuSyn軟體(1.0.1版；CompuSyn,Inc.)計算各藥物(單獨或組合)之IC50值。由Chou-Talalay組合指數(CI)評估ATO與BO-1012之間的相互作用[39]，其中CI<1指示協同作用；CI=1指示相加作用；且CI>1指示拮抗作用。
改良單細胞凝膠電泳檢定(彗星檢定)及DNA ICL修復檢定。使用如先前所述之改良彗星檢定分析H460細胞中DNA ICL之形成及修復[12]。
細胞週期分析。用BO-1012及ATO個別或組合如上文所述處理H460細胞。如先前所述執行細胞週期分析[40]。簡而言之，在處理結束時，以胰蛋白酶處理附著細胞，用冰冷70%乙醇固定，並在含1% Triton X-100及0.1 mg/ml RNase A之PBS中用4 μg/ml碘化丙啶(PI)染色，接著進行流動式細胞測量分析(FACScan流動式細胞儀，Becton Dickinson，San Jose，CA)。使用ModFit LT 2.0軟體(Verity Software House，Topsham，ME)分析細胞週期時相分佈。
量測組蛋白γH2AX磷酸化。用BO-1012、ATO或兩種藥劑之組合處理24小時、48小時或72小時後，用70%乙醇固定細胞16小時，用PBS洗滌，並與小鼠抗γH2AX抗體(Upstate)一起培育2小時，接著與FITC結合山羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，PA)一起培育30分鐘。接著，在含有4 μg/mL PI及0.1 mg/mL RNase A之PBS中將細胞染色，並用FACScan流動式細胞儀分析。根據對照直方圖對經γH2AX標記之細胞進行圈選(gate)，並針對各處理計算其在總共10,000個細胞中之百分比。
免疫螢光染色。在載玻片上培養H460細胞，接著如上文所述用BO-1012及ATO個別及其組合處理24小時、48小時或72小時。為了觀察γH2AX，用冷PBS洗滌細胞並用100%冰冷甲醇固定30分鐘。用PBS洗滌載玻片並在室溫下與抗γH2AX抗體一起培育2小時，接著與結合Alexa Fluor 488之二次抗體(Molecular Probes，Eugene，OR)及DAPI一起培育。用50%甘油固定後，對載玻片進行共焦影像分析(Radiance 2100 System，Bio-Rad)。細胞核中具有至少4個γH2AX聚焦點之細胞視為陽性。
細胞凋亡檢定。使H460細胞暴露於BO-1012、ATO或兩種藥劑之組合，接著藉由流動式細胞測量術使用磷脂結合蛋白V-FITC細胞凋亡偵測套組(Calbiochem，La Jolla，CA)根據製造商之說明書偵測細胞凋亡。在磷脂結合蛋白V流動式細胞測量術檢定中，僅對磷脂結合蛋白V染色呈陽性之細胞(右下象限)及對磷脂結合蛋白V及DNA染色均呈陽性之細胞(右上象限)分別表示早期及晚期細胞凋亡群體。僅對DNA染色呈陽性之細胞(左上象限)表示壞死性群體。
異種移植小鼠模型及療法。動物管理經中央研究院實驗動物管理及使用委員會(Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Committee)批准並按照其指南進行。自國家實驗室動物中心(National Laboratory Animal Center)(Taipei，Taiwan)獲得6週齡之雄性Balb/c裸小鼠。動物圈養於不含特定病原體(SPF)之環境中處於控制光及濕度條件下，且任意取食經滅菌之食物及水。裝運後，使動物適應48小時，接著接種腫瘤。在小鼠背部經皮下接種於50 μL PBS(pH 7.4)中之H460、NTUB1或NTUB1/P細胞。當所得腫瘤之直徑達到80至100 mm3時，將小鼠隨機分配至不同處理組。經腹膜內注射ATO(5毫克/公斤體重)、BO-1012(2.5毫克/公斤)或兩種藥劑之組合，每日5次(QD×5)。為了監測腫瘤形成，使用測徑規量測腫瘤之最長及最短直徑。根據下式計算腫瘤體積(以mm3計)：腫瘤體積=(長度×寬度2)/2。每2至3天亦量測小鼠體重，並用作處理之全身性毒性的指示物。對於CL-1-5異種移植模型，吾等對6週齡雄性裸小鼠經皮下注射1000萬個CL-1-5細胞。在第8天，當腫瘤為約200 mm3時，根據所指示之方案，用BO-1509、LY294002及曲西立濱單獨或組合處理小鼠。如上文所述監測腫瘤體積及小鼠體重。
末端脫氧核苷酸轉移酶介導之dUTP缺口末端標記(TUNEL)檢定。使用Dead End套組(Promega，Madison，WI)，借助於自動染色器(Dako，Carpinteria，CA)執行TUNEL檢定以定量異種移植腫瘤部分中之凋亡細胞。根據製造商之說明書進行該檢定。
免疫組織化學染色。對處理後1天之小鼠所產生之腫瘤進行增殖細胞核抗原(PCNA)之免疫組織化學分析。最後一次注射藥物後1天(第6天)，將各組之3隻小鼠處死並將腫瘤製成切片，接著用抗PCNA抗體(PC-10，小鼠IgG，DakoCytomation，Carpinteria，CA)染色。接著根據LSAB2抗生蛋白鏈菌素-生物素複合物系統(Dako Corp.)之製造商說明書執行標準免疫組織化學染色。
統計分析。所有數據表示至少3次獨立實驗。數據呈現為平均值±SE形式。使用史都登氏t檢驗法(Student's t-test)評估差異統計顯著性。
結果
ATATO增強BO-1012對人類實體腫瘤細胞之毒殺性。吾等最近報導BO-1012展現在活體外針對人類淋巴母細胞白血病及各種實體腫瘤及在活體內針對腫瘤異種移植之有效抗癌活性[12]。在此研究中，吾等首先研究ATO能否增強人類實體腫瘤細胞株對BO-1012誘導之細胞死亡。用不同濃度之BO-1012(0.1至80 μM)或ATO(1至8 μM)處理6種腫瘤細胞株(H460、H1299、PC3、U87、MCF7及OEC-M1)72小時。BO-1012針對此等腫瘤細胞株之抑制效應範圍較廣，IC50值在5.2 μM(OEC-M1細胞)至63.8 μM(H460細胞)之範圍。OEC-M1及MCF7細胞對BO-1012高度敏感，而H460及H1299細胞更具抗藥性(圖1A)。類似地，ATO對OEC-M1及MCF7細胞之細胞毒性明顯強於對H460細胞之毒殺效果(圖1A)。
為了克服H460、H1299及PC3細胞對此兩種藥劑之先天抗藥性，吾等用BO-1012及ATO共同處理腫瘤細胞株72小時。與ATO一起共同處理顯著降低BO-1012之IC50值，表明組合BO-1012與ATO協同增強BO-1012對此等先天抗藥性細胞株之細胞毒性(圖2)。相比之下，用BO-1012與ATO共同處理在諸如OCE-M1及MCF7細胞之敏感細胞株中未顯示協力細胞毒性效應(未顯示數據)。
由於H460細胞對BO-1012與ATO之組合的抗藥性最強，因此使用該等細胞進一步研究此兩種藥劑之協同效應。如圖1B中所示，用0至40 μM BO-1012處理H460細胞1小時未顯著降低細胞生長速率；然而，當隨後將經BO-1012處理之H460細胞暴露於ATO(0至8 μM)72小時時，細胞生存力實質性降低。由Chou-Talalay組合指數(CI)評估ATO與BO-1012之間的相互作用[39]。所有處理中之組合指數均<1(圖1C)，由此確證用BO-1012與ATO二者處理具有協同細胞毒性效應。
ATO抑制BO-1012所誘導之DNA ICL之修復。藉由使用鹼性凝膠遷移檢定，吾等確證類似於美法侖及塞替派，BO-1012可在活體外與DNA相互作用形成ICL(圖3)。因而採用改良彗星檢定研究經BO-1012及ATO處理之H460細胞中的ICL形成。如圖4A中所示，在經BO-1012、美法侖或塞替派處理1小時之H460細胞中，ICL以劑量依賴性方式增加。BO-1012所誘導之ICL量高於美法侖或塞替派。單獨使用ATO不會引起ICL(未顯示數據)。然而，用ATO後處理經BO-1012處理之H460細胞顯著延遲ICL之修復(圖4B)。在不存在ATO的情況下，在H460細胞中BO-1012所誘導之ICL的半衰期為約26.2小時，但在ATO存在下，半衰期為約82.7小時。此等結果表明ATO會干擾ICL之修復。
ATO增強BO-1012所誘導之γH2AX形成。由於ICL在DNA複製期間會引起DNA DSB[41]，因此吾等測定BO-1012與ATO組合對DSB標記物磷酸化組蛋白γH2AX出現的效應[42]。採用免疫螢光染色檢查細胞核中γH2AX聚焦點之形成(圖4C、圖4D)。影像分析顯示，單獨BO-1012在48小時誘導γH2AX細胞核聚焦點，接著聚焦點之數目在72小時減少；具有γH2AX聚焦點之細胞在總共100個計數細胞中之百分比在48小時及72小時分別為36.5%及25.9%，相較之下，在未經處理之細胞中為6.2%及7.2%。雖然BO-1012處理24小時不誘導形成γH2AX細胞核聚焦點(5.4%)，但大量γH2AX在細胞質中積聚(圖4C)，此現象與在24小時藉由流動式細胞測量術偵測到γH2AX陽性細胞數目增加相一致(未顯示數據)。單獨使用ATO僅導致γH2AX聚焦點少量增加(26.8%)。然而，在經BO-1012與ATO之組合處理的H460細胞中在24小時顯現大量γH2AX細胞核聚焦點。在24小時，具有γH2AX聚焦點之細胞的百分比為>80%，且在72小時僅略微下降(60.8%)。此等結果表明，ATO後處理增強ICL轉化成DSB，加速γH2AX在細胞核中聚集，並干擾BO-1012所誘導之ICL之修復。
ATO增強BO-1012所誘導之細胞週期停滯。ATO延長H460細胞中由BO-1012所誘導之細胞週期干擾之持續時間。由於DNA損傷可能抑制細胞週期進程，因此吾等研究BO-1012、ATO及兩種藥劑之組合對H460細胞中之細胞週期進程的效應。用10或20 μM BO-1012處理H460細胞1小時，隨後用8 μM ATO處理不同時段後，使用流動式細胞儀分析細胞週期分佈。如圖5中所示，相較於未經處理之對照，單獨8 μM ATO所顯示之對細胞週期分佈之效應極小，而BO-1012處理顯著干擾細胞週期進程。在所使用之濃度下，BO-1012處理致使細胞在24小時積聚於S期，且在48小時積聚於G2/M期，接著細胞週期分佈恢復至與在72小時對照中所見者相同。當經BO-1012處理之H460細胞經ATO後處理時，分別在48小時及72小時注意到顯著S及G2/M停滯。吾等推斷，ATO之效應係藉由抑制BO-1012所誘導之DNA損傷之修復，從而延長細胞週期延遲來介導。
ATO與BO-1012協力增強磷脂結合蛋白V + 細胞。細胞凋亡通常係由DNA損傷及細胞週期干擾引發。此外，單獨ATO已顯示誘導細胞凋亡[43]。因此，吾等檢查BO-1012是否誘導細胞凋亡，以及此效應是否可藉由用ATO後處理來增強。用BO-1012處理H460細胞1小時，接著用ATO處理24小時、48小時及72小時後，執行磷脂結合蛋白V細胞凋亡檢定，且藉由流動式細胞測量術測定磷脂結合蛋白V+細胞之百分比(圖6)。圖6A顯示細胞凋亡之代表性流動式細胞測量術直方圖。右上象限及右下象限中之磷脂結合蛋白V+細胞分別指示晚期及早期細胞凋亡。如圖6B中所示，8 μM ATO與10 μM或20 μM BO-1012之組合在誘導磷脂結合蛋白V+細胞方面遠比單獨任一藥劑有效。
ATO增強BO-1012在異種移植H460腫瘤裸鼠之治療功效。BO-1012與ATO在培養細胞中之協同細胞毒性效應吸引吾等研究組合BO-1012與ATO在異種移植動物模型中針對先天抗藥性H460細胞之潛在益處。將H460細胞經皮下接種至裸小鼠之後肢中。腫瘤形成後，每日用2.5 mg/kg BO-1012及/或5 mg/kg ATO經由靜脈內注射處理小鼠5天(QD×5)。如圖5A中所示，BO-1012與ATO組合處理顯著抑制裸小鼠中之H460腫瘤生長達約82%(在第23天)。BO-1012與ATO組合處理誘導明顯腫瘤生長延遲，達到500 mm3之腫瘤體積需要23.3天，相比之下，在未經處理之對照、單獨ATO及單獨BO-1012組中，分別需要7天、7.1天及9.4天(圖7A)。
在實驗結束(在第23天)時，當處死動物時測定腫瘤尺寸及重量。如圖7B中所示，相較於經單獨BO-1012或ATO處理之動物，在經BO-1012與ATO之組合處理的動物中腫瘤尺寸及重量協同降低。在經單獨BO-1012或BO-1012加ATO處理之動物中，通常用於評估處理所誘導之全身性毒性的小鼠體重損失小於6%(圖7C)。此等結果表明，BO-1012及其與ATO之組合不引起明顯全身性毒性。
為了進一步檢查BO-1012與ATO之組合的抗癌效應，吾等在最後一次處理後24小時(亦即第6天)執行組織病理學評估。使用藉由TUNEL檢定所測定之細胞凋亡標記物含量，在經BO-1012與ATO之組合處理之腫瘤中細胞凋亡顯著增加。此外，細胞增殖標記物PCNA得以顯著抑制(圖7D)。此等結果表明，BO-1012與ATO組合處理不僅誘導凋亡性細胞死亡，且實質性抑制腫瘤細胞生長。
ATO與BO-1012之組合在活體外及活體內可克服膀胱尿道上皮癌之順鉑抗藥性。除了諸如H460之具有先天抗藥性之細胞以外，吾等亦研究用BO-1012與ATO處理針對具有後天抗藥性之細胞的抗癌效應。來源於人類膀胱尿道上皮癌細胞株NTUB1之NTUB1/P細胞[37]之順鉑抗藥性為母細胞之60倍。吾等確證順鉑在NTUB1及NTUB1/P中之IC50值分別為3.6及211.7 μM。除此之外，吾等亦發現單獨BO-1012針對NTUB1及NTUB1/P之IC50值分別為24.8及85.4 μM，而單獨ATO之IC50值分別為0.4及3.8 μM。因而，NTUB1/P細胞對BO-1012及ATO之抗藥性分別為NTUB1細胞的3.4倍及9.5倍。使用與圖1B中所述相同之處理方案，吾等在NTUB1/P細胞(圖8B)而非NTUB1細胞(圖8A)之培養物中觀察到對細胞生長抑制之顯著協同效應。為了確證組合處理在動物模型中之抗癌活性，吾等用2.5 mg/kg BO-1012及/或5 mg/kg ATO(靜脈內注射，QD×5)處理帶有NTUB1或NTUB1/P異種移植之裸小鼠。單獨ATO不能有效抑制裸小鼠中NTUB1或NTUB1/P腫瘤生長(分別見圖8C及8D)。相比之下，BO-1012幾乎完全抑制NTUB1腫瘤，但在帶有NTUB1/P異種移植之小鼠中僅觀察到腫瘤體積減少55%。值得注意的是，使用BO-1012與ATO相同劑量之組合使NTUB1/P腫瘤體積減少92%以上。
BO-1509與DNA修復抑制劑之組合在活體外及活體內顯著抑制人類肺腺癌細胞生長。吾等已證明ATO可充當DNA修復抑制劑以增強雙功能性烷化劑之抗腫瘤活性，同時，吾等進一步確證BO-1509與LY294002(PI3K抑制劑)或曲西立濱(AKT抑制劑)對人類肺腺癌CL-1-5之協同細胞毒性(圖9及圖10)。在所測試之所有組合劑量下，CI值均小於1，表明BO-1059與PI3K抑制劑或AKT抑制劑之組合在所培養之肺癌細胞中顯示協同細胞殺死效應。為了確證PI3K抑制劑或AKT抑制劑對DNA修復之效應，吾等預先執行西方墨點檢定(Western blot assay)以分析Rad51之蛋白質含量，Rad51為同源重組修復所涉及之必需組分。如圖11中所示，用BO-1509處理CL-1-5細胞顯著增加Rad51，表明BO-1509所誘導之DNA損傷顯著活化Rad51。然而，用LY294002處理幾乎消除了BO-1509所誘導之Rad-51活化，表明LY294002可抑制BO-1509所誘導之DNA損傷之修復。此外，吾等亦觀察到LY294002會抑制BO-1509所誘導之AKT，因為在用BO-1509與LY294002之組合處理的細胞中偵測到可忽略不計量之pATK。在CL-1-5異種移植模型中(圖12)，吾等之結果顯示單獨LY294002或曲西立濱(AKTi)完全不能抑制腫瘤生長。BO-1509單獨引起約70%腫瘤生長抑制，而BO-1509與LY294002之組合引起>95%抑制(圖12A)。在用BO-1509與曲西立濱之組合處理的患腫瘤動物中，腫瘤生長抑制之效力類似於單獨BO-1509，表明LY2940022在抑制DNA修復方面比曲西立濱有效。由於在小鼠體重方面不存在顯著變化(圖12B)，因此單獨或組合藥物之副作用可能極小或可容許。
討論
先天或後天因化學治療藥物引發抗藥性之腫瘤對治療癌症患者是有所限制。癌細胞中之高DNA修復能力經常指示為一種抗藥性機制[44]。在最近數十年中，新穎治療策略及藥物設計在癌症化學療法中已引起極大興趣。本研究首次報導使用新合成之MMC衍生物BO-1012[12]與DNA修復抑制劑ATO之組合的有效治療效應。相較於單獨用任一藥劑處理，此藥物組合策略有效地抑制培養物及異種移植小鼠模型中H460人類大細胞肺癌生長。與其他人類實體腫瘤相比，H460細胞相對而言對數種化學治療處理具抗藥性，諸如BO-1012、ATO(圖1)、美法侖及塞替派(未顯示數據)。此外，單獨使用習知化學療法或與離子照射組合在帶有H460異種移植之小鼠中的治療功效並不令人滿意；但在藥物處理期間H460腫瘤生長得以抑制，處理後生長快速恢復[45]。因此，H460細胞提供一種先天抗藥性細胞株以用於評估新治療劑之功效。在此研究中，吾等發現與單獨使用BO-1012相比，ATO與BO-1012之組合能增強對H460細胞腫瘤生長之抑制。
另外，吾等評估此藥物組合在具有後天順鉑抗藥性之細胞中之效力。鉑類化學療法已變成治療患者之實體癌症最常開立處方之化學治療藥[46]。鉑抗藥性為一個主要臨床問題，因為不存在可用於避免此種腫瘤抗藥性之已知藥物。吾等發現用ATO與BO-1012之組合處理在抑制後天順鉑抗藥性人類膀胱癌NTUB1/P之生長方面比用任一單一藥劑處理有效。因而，吾等之研究揭示，雙功能性烷化劑與ATO組合可能為處理具有先天或後天抗藥性之人類癌細胞的有效方案。
許多合成及天然雙功能性烷化劑展現抗癌活性，因為其可誘導DNA ICL[8,47]。已報導天然抗癌劑MMC及其類似物與DNA雙股交聯[48]，且數種合成雙功能性烷化劑正在研發中[12]。然而，尚無研究報導此等藥劑是否在臨床試驗中。已證明最近合成之BO-1012為人類癌症中之有效DNA交聯劑。據信，此藥劑之抗癌活性機制在於誘導DNA ICL及其他細胞反應。一旦用雙功能性烷化劑處理誘導複製叉停止移動或折攏，即需要修復路徑識別該問題並允許複製恢復。當折攏之複製叉被識別時，其引發細胞週期停滯、DNA修復或細胞死亡(經由細胞凋亡)。在本研究中，吾等確證BO-1012藉由誘導DNA ICL來發揮其抗癌效應，DNA ICL可引起DSB、細胞週期停滯及最終細胞死亡。與臨床上所使用之美法侖及塞替派相比，BO-1012明顯誘導更高量之ICL(圖1C及S2)且因此展現有效抗癌活性。
吾等目前之結果證明BO-1012所誘導之DNA損傷仍可修復，尤其在具相對抗藥性之癌細胞中，諸如H460細胞。抗癌藥之功效高度依賴於DNA修復能力。許多研究已顯示，DNA修復有缺陷之細胞展現對諸如依託泊苷(etoposide)、MMC及離子輻射之癌症治療劑敏感[50]。令人遺憾的是，在惡性細胞中經常觀察到高度DNA修復活性，由此導致對化學治療藥物之抗藥性[51]。因此，抑制DNA修復活性為用於增強抗癌化學治療劑之功效的有價值策略。先前研究已報導可藉由消耗DNA修復蛋白質O-6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(MGMT)來克服對O6-烷化劑之抗藥性[52]。實際上，DNA修復蛋白質為抗癌藥物研發之標靶[53]。DNA損傷劑替莫唑胺與MGMT抑制劑之組合目前正在臨床試驗中[54]。由於已報導砷會藉由下調DNA聚合酶β(Pol β)及AP核酸內切酶[55]來削弱鹼基切除修復活性，並經由與鋅之競爭性相互作用來抑制PARP-1[56]及XPA[57]活性，因此吾等推測ATO抑制DNA修復以增強諸如BO-1012之DNA損傷劑的治療效應。然而，仍不清楚ATO以何種方式干擾ICL之修復。
大量證據已顯示，ATO為治療患有復發性/難治性急性前髓細胞白血病及多發性骨髓瘤之患者的有效治療劑，且僅報導有輕度副作用[13,58]。因此，基於ATO之化學療法對於耐受或不能回應於其他化學治療方案治療之患者而言為一項有前景的治療選擇[58]。由於治療實體腫瘤所使用之高劑量ATO與臨床風險相關[59]，因此ATO與其他治療劑之組合可能為降低ATO劑量之良好策略。在本研究中發現，在低於毒性劑量以下之ATO能夠與BO-1012協力抑制人類實體腫瘤生長。
最近，已針對患有惡性病之患者研發出各種分子標靶藥物。雖然此類型藥物對癌細胞具有高度特異性，但在治療期間經常快速地形成抗藥性[60]。因而，克服抗藥性對於癌症療法之成功而言為一個具有挑戰性的問題。在本研究中，舉例而言，吾等發現諸如H460、H1299、PC3及NTUB1/P細胞之對BO-1012更具抗藥性之細胞株良好回應於ATO之添加。因此，用BO-1012及ATO組合治療顯示改良具有先天或後天抗藥性之癌症之治療功效的新途徑。
除ATO以外，許多靶向DNA修復路徑之組分的化合物亦已在癌症療法之臨床試驗中[61]。據報導LY294002能夠抑制DNA修復PI3K或PI3/Akt路徑，且在活體外具有抗增殖及促凋亡活性[31]。亦顯示此藥劑抑制人類腫瘤癌症異種移植中之腫瘤生長並誘導細胞凋亡[32,33]。曲西立濱為具有AKT抑制活性之核苷類似物，且為最初發現之DNA合成抑制劑。此核苷牽涉於許多人類癌症中，包括前列腺癌[34]。已顯示，抑制AKT可藉由引起BRCA1及Rad51之細胞質滯留而抑制同源重組修復[62]。基於吾等當前之結果，吾等已發現此等DNA修復抑制劑可增強烷化劑之抗癌功效，此係經由此等DNA修復抑制劑對烷化劑所誘導之DNA損傷之修復的抑制活性所介導。由於經常在各種抗藥性癌細胞中觀察到DNA修復活性增強，因此該組合尤其有效於征服抗藥性細胞。
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圖1顯示在人類癌細胞株中ATO增強BO-1012之細胞毒性。
圖1A顯示BO-1012及ATO對人類癌細胞株之細胞毒性。用不同濃度之BO-1012或ATO處理6種人類癌細胞株(H460、H1299、PC3、U87、MCF7及OECM1)72小時。藉由WST-1檢定測定細胞生存力。圖1B顯示經BO-1012與ATO之組合處理之H460細胞中之細胞毒性增強。用BO-1012處理H460細胞1小時，洗滌，接著用ATO處理72小時。*，p<0.05；**，p<0.001，均與單獨用ATO處理之細胞相比。圖1C顯示Fa-CI曲線圖。藉由如材料及方法中所述之非恆定比值組合法獲得CI相對於受影響分數(Fa)之等效線圖分析。所有ATO與BO-1012組合之CI均<1，表明ATO與BO-1012在H460細胞中協同相互作用。
圖2顯示BO-1012與ATO共同處理之協同細胞毒性。
H460、H1299及PC3細胞用BO-1012與ATO二者共同處理72小時。評估細胞生存力，並計算BO-1012與ATO組合處理或BO-1012不與ATO組合處理之IC50值。*，各細胞株中與單獨BO-1012處理相比，p<0.05。
圖3顯示BO-1012、美法侖及塞替派引起DNA ICL形成。將pEGFP-N1質體DNA與不同濃度之藥物一起培育。在處理結束時，藉由如材料及方法中所述之鹼性凝膠遷移檢定分析DNA ICL。ss，單股DNA；交聯，DNA ICL。
圖4顯示ATO抑制BO-1012所誘導之DNA損傷之修復並擴大DSB形成。
圖4A顯示BO-1012、美法侖及塞替派誘導ICL。用不同濃度的BO-1012、美法侖或塞替派處理H460細胞1小時，接著進行如材料及方法中所述之改良彗星檢定法。由尾面力矩之降低百分比計算DNA ICL之百分比。
圖4B顯示ATO抑制BO-1012所誘導之DNA ICL之修復。用40 μM BO-1012處理H460細胞1小時，洗滌，接著用8 μM ATO處理16、24及48小時。*，在所指示時間與單獨BO-1012處理相比，p<0.05。圖4C顯示ATO增強BO-1012所誘導之γH2AX細胞核聚焦點之形成。如上所述用BO-1012及ATO單獨或組合處理H460細胞。處理後，如材料及方法中所述偵測γH2AX(綠色)免疫螢光染色。細胞核用DAPI(藍色)染色。圖4D顯示在螢光顯微鏡下測定，含有4個γH2AX細胞核聚焦點之細胞的百分比。*，在各時間點與對照相比，p<0.05。
圖5顯示BO-1012及ATO單獨或組合所誘導之細胞週期干擾。用10或20 μM BO-1012處理H460細胞1小時，洗滌，接著用8 μM ATO處理24、48或72小時。處理後，藉由流動式細胞測量術如材料及方法中所述執行細胞週期分析。顯示具有相似結果之3個獨立實驗的代表性DNA直方圖。在各直方圖頂部顯示細胞週期分佈。
圖6顯示BO-1012及ATO單獨或組合所誘導之凋亡性細胞死亡。
用10或20 μM BO-1012處理H460細胞1小時，洗滌，接著用4或8 μM ATO處理24、48或72小時。處理後，使用磷脂結合蛋白V染色分析培養物之細胞凋亡。圖6A顯示凋亡性細胞死亡之代表性流動式細胞測量分析。用20 μM BO-1012處理H460細胞1小時，接著用8 μM ATO處理24、48或72小時。圖6B顯示磷脂結合蛋白V+細胞之百分比(右上及右下象限)。*，在各時間點與對照相比，p<0.05。
圖7顯示組合ATO與BO-1012對H460異種移植之協同抗癌活性。具有H460異種移植之裸小鼠每日經靜脈內注射5 mg/kg ATO、2.5 mg/kg BO-1012或兩種藥劑之組合，持續5天(由箭頭指示)。圖7A顯示每2或3天用測徑規量測之腫瘤體積。每組有6至7隻動物。圖7B顯示在第23天帶有腫瘤之小鼠的代表性影像。在底部顯示平均腫瘤重量。*，與對照相比，p<0.05。圖7C顯示小鼠體重之變化。每2或3天量測體重。圖7D顯示PCNA免疫組織化學及TUNEL檢定。最後一次處理後1天(亦即第6天)，自各組獲取異種移植腫瘤部分，製成切片，並如材料及方法中所述進行PCNA免疫組織化學及TUNEL檢定。
圖8顯示組合ATO與BO-1012對人類膀胱癌細胞(NTUB1)及其衍生之順鉑抗藥性細胞(NTUB1/P)的協同抗癌活性。圖8A及8B顯示BO-1012及ATO單獨及組合在NTUB1(A)及NTUB1/P(B)細胞中之細胞生存力分析。如圖1A中所述檢定細胞生存力。*，在各濃度下，與單獨ATO相比，p<0.05。圖8C及8D顯示BO-1012及ATO單獨及組合針對NTUB1(C)及NTUB1/P(D)腫瘤之抗癌活性。如圖7A中所述處理帶有NTUB1或NTUB1/P異種移植之小鼠。每組有4至6隻動物。在所指示之時間用測徑規量測腫瘤體積。
圖9顯示BO-1509及LY294002(PI3K抑制劑)對人類肺腺癌CL-1-5之協同細胞毒性。
CL-1-5細胞以3,000個細胞/孔之細胞密度塗佈於96孔板上。隔夜培育後，用不同濃度之BO-1509或LY294002或其組合處理細胞72小時。藉由台盼藍檢定(Almar blue assay)測定細胞數目。圖9A及9B分別顯示經BO-1509及LY294002處理之CL-1-5之存活率曲線。圖9C顯示經BO-1509與LY294002之1:2比率之組合處理之CL-1-5的存活率曲線。圖9D顯示根據Chou及Thalay開發之等式計算的CI值。
圖10顯示BO-1509及曲西立濱(AKT抑制劑)對人類肺腺癌CL-1-5之協同細胞毒性。
如圖9中所述，圖10A及10B分別顯示經BO-1509及曲西立濱處理之CL-1-5之存活率曲線。圖10C顯示經BO-1509與曲西立濱之1:6.25比率之組合處理之CL-1-5的存活率曲線。圖10D顯示根據Chou及Thalay開發之等式計算的CI值。
圖11顯示在CL-1-5細胞中LY294002消除BO-1509所活化之AKT及Rad51。
用BO-1509(10或20 μM)及LY294002(20及40 μM)單獨或組合處理對數式生長之CL-1-5細胞24小時。在處理結束時，收集全細胞溶解物。藉由西方墨點檢定測定AKT、pAKT及Rad51之蛋白質含量。β-肌動蛋白用作裝載對照。
圖11顯示BO-1509可活化AKT以形成pAKT並增強Rad51之表現，Rad51為同源重組修復之必需組分(第4道及第5道)。用BO-1509及LY294002組合處理不僅抑制AKT之活化，且抑制Rad51之合成(第6道及第7道)。
圖12顯示組合BO-1509及DNA修復抑制劑(LY294002或曲西立濱)對CL-1-5異種移植之協同抗癌活性。
將1000萬個CL-1-5細胞之等分試樣注射至6週齡雄性裸小鼠中。在第8天，當腫瘤為約200 mm3時，將具有CL-1-5異種移植之小鼠分成6組(每組n=3)。第1組經靜脈內注射單獨媒劑，第2組經靜脈內注射10 mg/Kg BO-1509(Q2D×5)，第3組經靜脈內注射40 mg/Kg LY294002(QD×9)，第4組經靜脈內注射1 mg/Kg AKTi(曲西立濱)(Q2D×5)，第5組經靜脈內注射BO-1509加AKTi(QD×5)，且第6組經靜脈內注射BO-1509(Q2D×5)加LY294002(QD×9)。圖12A顯示每2或3天用測徑規量測之腫瘤體積。圖12B顯示小鼠體重無顯著變化。
(無元件符號說明)

Claims (8)

  1. 一種3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之衍生物之用途，其係用於製造與DNA修復抑制劑組合以治療哺乳動物個體之癌症的藥物。
  2. 如請求項1之用途，其中該藥物係在投與該DNA修復抑制劑之前投與該個體。
  3. 如請求項1之用途，其中該DNA修復抑制劑係選自由ATO、LY294002及曲西立濱組成之群。
  4. 如請求項1之用途，其中該癌症對個別治療劑具有抗藥性。
  5. 如請求項1之用途，其中該癌症係選自人類肺癌、人類膀胱癌、人類乳癌、人類前列腺癌、人類神經膠質瘤癌及人類口腔癌。
  6. 一種用於治療癌症之醫藥組合，其包含有效量之3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之衍生物及有效量之DNA修復抑制劑。
  7. 如請求項6之組合，其中該3a-氮雜-環戊二烯幷[a]茚之衍生物係選自由BO-1012及BO-1509組成之群。
  8. 如請求項6或7之組合，其中該DNA修復抑制劑係選自由三氧化二砷、LY294002及曲西立濱組成之群。
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