TWI547693B - 感測方法及感測晶片 - Google Patents

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Description

感測方法及感測晶片
本發明係關於一種感測方法及感測晶片，尤指一種用以感測待測物中之有機分子的感測方法及感測晶片。
目前市面上有各種感測方法及裝置，常見的感測方法例如酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)，常見的感測裝置例如實驗用孔盤或晶片。
以酵素連結免疫吸附法為例，其為一種被廣泛應用的感測方法，已有多年的歷史，其至少包括待測樣品為抗原或抗體兩種方式，分別論述如下：當待測樣品為抗原時，酵素連結免疫吸附法包含如下之操作步驟：將具有專一性之抗體固著(coating)於塑膠孔盤上，固著時間約需12~18小時，固著完成後洗去多餘抗體；加入待測物和固著之抗體進行反應，反應時間約需0.5~2小時，待測物中若含有和固著之抗體具有反應性之抗原，則其會與塑膠孔盤上固著之抗體進行專一性鍵結；洗去多餘待測物，加入帶有酵素且和該抗原具有反應性之抗體與該抗原鍵結，鍵結時間約需0.5~1 小時；洗去多餘未鍵結之帶有酵素的抗體，加入酵素受質使酵素呈色，呈色時間約需0.5小時，以光譜儀讀取呈色結果(即吸光值(OD值))，實驗完成總共約需1~2天。
當待測樣品為抗體時，酵素連結免疫吸附法包含如下之操作步驟：將已知之抗原固著(coating)於塑膠孔盤上，固著時間約需12~18小時，完成後洗去多餘之抗原；加入待測物和固著之抗體進行反應，反應時間約需0.5~2小時，檢體中若含有和固著之抗體具有反應性之一次抗體，則其會與塑膠孔盤上固著之抗原進行專一性鍵結；洗去多餘待測物，加入帶有酵素之二次抗體，與待測之一次抗體鍵結，鍵結時間約需0.5~2小時；洗去多餘未鍵結之二次抗體，加入酵素受質使酵素呈色，呈色時間約需0.5小時，以光譜儀讀取呈色結果(即吸光值(OD值))，實驗完成總共約需1~2天。酵素連結免疫吸附法在靈敏度上有其限制。
酵素連結免疫吸附法一般使用實驗用孔盤來進行，但根據實驗的需求，亦可使用晶片或其他感測裝置來進行。反之，實驗用孔盤及晶片亦可用於酵素連結免疫吸附法之外的感測方法。
目前市面上的實驗用孔盤有各式各樣的結構及材質，舉例來說：以孔數來分有6、12、24、48、96、384及1536孔等；以底部構造來分有平底(Flat bottom)、圓底(Round bottom)、V型底(V-bottom)及結合圓底及平底特色的易清洗底等；以材質來分有聚苯乙烯(polystyrene,PS)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚氯乙烯(poly(vinyl chloride),PVC)等；以顏色來分有透明、黑色、白色、黑色透明底及白色透明底等；以用途來分有一般分析用、細胞培養及細胞分析用、免疫分析用及保存用等。一般免疫分析用的 孔盤多為聚苯乙烯材質，結構多為96孔孔盤。一般免疫分析用的孔盤其底部表面或未經修飾(un-treated)、或是使用照射(irradiation)技術使原本孔盤表面上的苯環產生羧基(carboxyl group)及羥基(hydroxyl group)使其和欲固著(coating)於其上的分子結合能力增加。
目前市面上的感測晶片依製程的不同可分為微陣列晶片(microarray)及實驗室晶片(lab-on-a-chip)。微陣列晶片依探針之材質又可分為基因晶片及蛋白質晶片。
為了提昇感測之靈敏度，改進現有的感測方法及裝置或提供新的感測方法及裝置，為本領域技術人士的重要課題。
本發明之第一面向係提供一種感測晶片，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該晶片包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一矽烷(silane)，固著於該複數局部基材表面；以及一第二有機分子，固著於這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
本發明之第二面向係提供一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一矽烷(silane)固著於該複數局部基材表面；以及(3)將一第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中 該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
本發明之第三面向係提供一種感測晶片，用以感測一待測物中之一第一有機分子，包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一第二有機分子，固著至該複數相間隔的奈米粒子，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性；以及一改質劑，固著於該複數局部基材表面，並誘使該第二有機分子遠離該複數局部基材表面。
本發明之第四面向係提供一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一改質劑固著於該複數局部基材表面，該改質劑增強一第二有機分子於這些相間隔的奈米粒子表面之吸附性；以及(3)將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
11‧‧‧感測晶片
111‧‧‧基材
112‧‧‧奈米粒子
113‧‧‧局部基材表面
114‧‧‧矽烷
115‧‧‧第二有機分子
116‧‧‧第一有機分子
117‧‧‧改質劑
118‧‧‧第三有機分子
119‧‧‧酵素
120‧‧‧受質
42、52、62‧‧‧有孔元件
421、521、621‧‧‧通孔
43、53、63‧‧‧感測裝置
7‧‧‧框架
第一圖顯示本發明第一實施例之感測晶片。
第二圖顯示本發明第二實施例之感測晶片。
第三圖(a)顯示本發明第一實施例之感測方法。
第三圖(b)顯示本發明第二實施例之感測方法。
第四圖(a)顯示本發明第一及第二實施例中之感測晶片。
第四圖(b)顯示本發明第一及第二實施例中之有孔元件。
第四圖(c)顯示本發明第一及第二實施例中之感測裝置。
第五圖(a)顯示本發明第一及第二實施例中之感測晶片。
第五圖(b)顯示本發明第一及第二實施例中之有孔元件。
第五圖(c)顯示本發明第一及第二實施例中之感測裝置。
第六圖(a)顯示本發明第一及第二實施例中之感測晶片。
第六圖(b)顯示本發明第一及第二實施例中之有孔元件。
第六圖(c)顯示本發明第一及第二實施例中之感測裝置。
第七圖顯示本發明第一及第二實施例中實施例之框架。
第八圖顯示本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤的比較。
第九及十圖顯示以本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用eBioscience的人類/小鼠轉化生長因子beta 1 ELISA套組(human/mouse TGF beta 1 ELISA kit,Cat.No.88-8350-88)，利用三明治ELISA法來定量人類/小鼠(human/mouse)TGF beta 1。
第十一圖顯示以本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用eBioscience的人類/小鼠轉化生長因子beta 1 ELISA套組(human/mouse TGF beta 1 ELISA kit,Cat.No.88-8350-88)，利用三明治ELISA法來定量人類/小鼠(human/mouse)TGF beta 1。
第十二圖顯示以本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用市售的C-反應蛋白(C-Reactive Protein，CRP)ELISA套組，利用三明治ELISA法來定量C-反應蛋白。
第十三圖(a)顯示以本發明之玻璃基板上有金奈米粒子，且金奈米粒子 表面以胺基矽烷修飾的感測裝置進行ELISA。
第十三圖(b)顯示以本發明之玻璃基板上僅有金奈米粒子的感測裝置進行ELISA。
第十三圖(c)顯示以本發明之玻璃基板表面直接以胺基矽烷修飾的感測裝置進行ELISA。
第十三圖(d)顯示以本發明之僅有玻璃基板的感測裝置進行ELISA。
第十四圖(a)顯示本發明之在低濃度條件下(濃度偵測極限測試)，以玻璃基板上有金奈米粒子，且金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾之材質的感測裝置進行ELISA之濃度偵測極限測試。
第十四圖(b)顯示本發明之在低濃度條件下(濃度偵測極限測試)，以僅有玻璃基板之材質的感測裝置進行ELISA之濃度偵測極限測試。
有關本發明之技術內容、特點及功效，藉由以下較佳實施例的詳細說明將可清楚的呈現。
請參閱第一圖及第三圖(a)，本發明第一實施例係提供一種感測晶片11，用以感測一待測物中之一第一有機分子116。
該感測晶片11包含一基材111，在該基材111上具複數相間隔的奈米粒子112以及在該複數相間隔的奈米粒子112間之複數局部基材表面113；一矽烷(silane)114，固著於該複數局部基材表面113；以及一第二有機分子115，固著於這些相間隔的奈米粒子112表面，其中該第二有機分子115與該第一有機分子116兩者間具有專一性。
如第四至六圖所示，本實施例之感測晶片11能夠可裝卸地設置於一具有一通孔421、521、621的有孔元件42、52、62，以在該有孔元件42、52、62的一端關閉該通孔421、521、621，以形成一感測裝置43、53、63。如第六圖所示之該感測裝置63可直接用以感測該待測物中之該第一有機分子116；如第四及五圖所示之該感測裝置43、53可進一步組裝於如第七圖所示之一框架7以進行該待測物中之該第一有機分子116的感測。以該感測裝置43、53、63進行感測可使用任何可和實驗用孔盤配合使用的儀器，例如光譜儀及自動微孔盤洗盤機，其中該光譜儀可為酵素連結免疫吸附法測讀儀(ELISA reader)。
本實施例之感測晶片可為一蛋白質晶片或一基因晶片，該蛋白質晶片或該基因晶片可直接用以感測，無需結合其他元件。
該第二有機分子115可直接固著於這些相間隔的奈米粒子112的表面。該待測物可為血液、尿液、細胞培養液及其他體液，但不限於此。該第一有機分子116可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。該基材可以一透光材質製成。這些相間隔的奈米粒子112係由一金屬所製成，該金屬係選自由金(Au)、銀(Ag)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鉬(Mo)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鋁(Al)、鐵(Fe)、鎂(Mg)、錫(Sn)、鈦(Ti)，鉈(Ta)及銥(Ir)、上述金屬之合金及其組合所組成之群組。該奈米粒子之一形狀係選自由圓形、島形、長條形、三角形、星形、環形、中空形及其組合所組成之群組。該奈米粒子的粒徑可為1~200nm。該局部基材表面113具有一直徑，該直徑可為1~100nm。該矽烷114可為烷基矽烷、胺基矽烷或其他矽烷，胺基矽烷舉例來說可為3-胺基丙基三甲氧基矽烷(aminopropryltrimethoxysilane, APTMS)或3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)。該第二有機分子115可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。
本實施例之感測晶片11或感測裝置43、53、63可加入適合的抗體、標準品、緩衝液、呈色劑、阻斷液、受質液及終止液等以製成一套組。
請參閱第一圖及第三圖(a)，本發明第一實施例又提供一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子116。
該感測方法包含下列步驟：提供一感測晶片11，該感測晶片11包含一基材111、在該基材111上複數相間隔的奈米粒子112以及在該複數相間隔的奈米粒子112間之複數局部基材表面113；使一矽烷(silane)114固著於該複數局部基材表面113；以及將一第二有機分子115固著至這些相間隔的奈米粒子112表面，其中該第二有機分子115與該第一有機分子116兩者間具有專一性。
本實施例之感測方法在將該第二有機分子115固著至這些相間隔的奈米粒子112表面後，可進行一酵素連結免疫吸附法，亦即，加入一待測物至該通孔421、521、621中；在該待測物中之該第一有機分子116與第二有機分子115專一性結合後，加入具有一酵素119之一第三有機分子118至該通孔421、521、621中；在該第三有機分子118與該第一有機分子116專一性結合後，將該酵素119之一受質120加入該通孔421、521、621中以進行一呈色反應；加入一終止液終止該呈色反應以獲得一呈色反應結果；以及讀取該呈色反應結果之一數值。
如第四至六圖所示，本實施例之感測方法可進一步將該感測 晶片11可裝卸地設置於一具有一通孔421、521、621的有孔元件42、52、62，以在該有孔元件42、52、62的一端關閉該通孔421、521、621，以形成一感測裝置43、53、63。如第六圖所示之該感測裝置63可直接用以感測該待測物中之該第一有機分子116；如第四及五圖所示之該感測裝置43、53可進一步組裝於如第七圖所示之一框架7以進行該待測物中之該第一有機分子116的感測。以該感測裝置43、53、63進行感測可使用任何可和實驗用孔盤配合使用的儀器，例如光譜儀及自動微孔盤洗盤機，其中該光譜儀可為酵素連結免疫吸附法測讀儀(ELISA reader)。
該第二有機分子115可直接固著於這些相間隔的奈米粒子112的表面。該待測物可為血液、尿液、細胞培養液及其他體液，但不限於此。該第一有機分子116可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。該基材111可以一透光材質製成。這些相間隔的奈米粒子112係由一金屬所製成，該金屬係選自由金(Au)、銀(Ag)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鉬(Mo)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鋁(Al)、鐵(Fe)、鎂(Mg)、錫(Sn)、鈦(Ti)，鉈(Ta)及銥(Ir)、上述金屬之合金及其組合所組成之群組。該奈米粒子112之一形狀係選自由圓形、島形、長條形、三角形、星形、環形、中空形及其組合所組成之群組。該奈米粒子112的粒徑可為1~200nm。該複數局部基材表面115具有一直徑，該直徑可為1~100nm。該矽烷114可為烷基矽烷、胺基矽烷或其他矽烷，胺基矽烷舉例來說可為3-胺基丙基三甲氧基矽烷(aminopropryltrimethoxysilane,APTMS)或3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)，但不限於此。第二有機分子115可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。
請參閱第二圖及第三圖(b)，本發明第二實施例係提供一種感測晶片11，用以感測一待測物中之一第一有機分子116。
該感測晶片11包含一基材111，在該基材111上具複數相間隔的奈米粒子112以及在該複數相間隔的奈米粒子112間之複數局部基材表面113；一第二有機分子115，固著至該複數相間隔的奈米粒子112表面，其中該第二有機分子115與該第一有機分子116兩者間具有專一性；以及一改質劑117，固著於該複數局部基材表面113，並驅使該第二有機分子115離開該複數局部基材表面113。
如第四至六圖所示，本實施例之感測晶片11能夠可裝卸地設置於一具有一通孔421、521、621的有孔元件42、52、62，以在該有孔元件42、52、62的一端關閉該通孔421、521、621，以形成一感測裝置43、53、63。如第六圖所示之該感測裝置63可直接用以感測該待測物中之該第一有機分子116；如第四及五圖所示之該感測裝置43、53可進一步組裝於如第七圖所示之一框架7以進行該待測物中之該第一有機分子116的感測。以該感測裝置43、53、63進行感測可使用任何可和實驗用孔盤配合使用的儀器，例如光譜儀及自動微孔盤洗盤機，其中該光譜儀可為酵素連結免疫吸附法測讀儀(ELISA reader)。
本實施例之感測晶片11可為一蛋白質晶片或一基因晶片，該蛋白質晶片或該基因晶片可直接用以感測，無需結合其他元件。
該第二有機分子115可直接固著於這些相間隔的奈米粒子112的表面。該待測物可為血液、尿液、細胞培養液及其他體液，但不限於此。該第一有機分子116可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。該 基材111可以一透光材質製成。這些相間隔的奈米粒子112係由一金屬所製成，該金屬係選自由金(Au)、銀(Ag)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鉬(Mo)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鋁(Al)、鐵(Fe)、鎂(Mg)、錫(Sn)、鈦(Ti)，鉈(Ta)及銥(Ir)、上述金屬之合金及其組合所組成之群組。該奈米粒子112之一形狀係選自由圓形、島形、長條形、三角形、星形、環形、中空形及其組合所組成之群組。該奈米粒子112的粒徑可為1~200nm。該局部基材表面113具有一直徑，該直徑可為1~100nm。該改質劑117可為矽烷(silane)、醇胺或烯胺。該矽烷可為烷基矽烷、胺基矽烷或其他矽烷，胺基矽烷舉例來說可為3-胺基丙基三甲氧基矽烷(aminopropryltrimethoxysilane,APTMS)或3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)，但不限於此。第二有機分子115可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。
本實施例之感測晶片11或感測裝置43、53、63可加入適合的抗體、標準品、緩衝液、呈色劑、阻斷液、受質液及終止液等，以製成一套組。
請參閱第二圖及第三圖(b)，本發明第二實施例又提供一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子116。
該感測方法包含下列步驟：提供一感測晶片11，該感測晶片11包含一基材111、在該基材111上複數相間隔的奈米粒子112以及在該複數相間隔的奈米粒子112間之複數局部基材表面113；使一改質劑117固著於該複數局部基材表面，該改質劑117增強一第二有機分子115於這些相間隔的奈米粒子112表面之吸附性；以及將該第二有機分子115固著至這些相間隔的奈米粒子112表面，其中該第二有機分子115與該第一有機分子116兩者間 具有專一性。
本實施例之感測方法在將一第二有機分子115固著至這些相間隔的奈米粒子112表面後，可進行一酵素連結免疫吸附法，亦即，加入一待測物至該通孔421、521、621中；在該待測物中之該第一有機分子116與第二有機分子115專一性結合後，加入具有一酵素119之一第三有機分子118至該通孔421、521、621中；在該第三有機分子118與該第一有機分子116專一性結合後，將該酵素119之一受質120加入該通孔421、521、621中以進行一呈色反應；加入一終止液終止該呈色反應以獲得一呈色反應結果；以及讀取該呈色反應結果之一數值。
如第四至六圖所示，本實施例之感測方法可進一步將該感測晶片可裝卸地設置於一具有一通孔421、521、621的有孔元件42、52、62以在該有孔元件42、52、62的一端關閉該通孔421、521、621，以形成一感測裝置43、53、63。如第六圖所示之該感測裝置63可直接用以感測該待測物中之該第一有機分子116；如第四及五圖所示之該感測裝置43、53可進一步組裝於如第七圖所示之一框架7以進行該待測物中之該第一有機分子116的感測。以該感測裝置進行感測可使用任何可和實驗用孔盤配合使用的儀器，例如光譜儀及自動微孔盤洗盤機，其中該光譜儀可為酵素連結免疫吸附法測讀儀(ELISA reader)。
該第二有機分子115可直接固著於這些相間隔的奈米粒子112的表面。該待測物可為血液、尿液、細胞培養液及其他體液，但不限於此。該第一有機分子116可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。該基材111可以一透光材質製成。這些相間隔的奈米粒子112係由一金屬所製 成，該金屬係選自由金(Au)、銀(Ag)、鈀(Pd)、鉑(Pt)、鉻(Cr)、鈷(Co)、鉬(Mo)、銅(Cu)、鎳(Ni)、鋁(Al)、鐵(Fe)、鎂(Mg)、錫(Sn)、鈦(Ti)，鉈(Ta)及銥(Ir)、上述金屬之合金及其組合所組成之群組。該奈米粒子之一形狀係選自由圓形、島形、長條形、三角形、星形、環形、中空形及其組合所組成之群組。該奈米粒子的粒徑可為1~200nm。該複數局部基材表面115具有一直徑，該直徑可為1~100nm。該改質劑117可為矽烷(silane)、醇胺或烯胺。該矽烷可為烷基矽烷、胺基矽烷或其他矽烷，胺基矽烷舉例來說可為3-胺基丙基三甲氧基矽烷(aminopropryltrimethoxysilane,APTMS)或3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTS)，但不限於此。第二有機分子115可為一蛋白質，該蛋白質可為一抗原或一抗體。
將本發明之感測晶片用於進行一般酵素連結免疫吸附法，透過設置於基材上之奈米粒子，可有效增強酵素連結免疫吸附法的偵測訊號，使其偵測極限降低到<1pg/mL。
以本發明之感測晶片執行一般酵素連結免疫吸附法之方法為：先製作金奈米粒子陣列，在其表面修飾矽烷(silane)，直接固著(coating)蛋白質隔夜(over night)，接著進行一般酵素連結免疫吸附法檢測的標準流程。結果發現金奈米粒子可以增強訊號因而提高OD值，使劑量(dose)與反應(response)之間的距離可以拉得比較開，其機制係透過金奈米粒子表面吸附蛋白質，蛋白質被金奈米粒子吸附後呈現三維立體結構，使蛋白質結構能夠有效展開，從吸附方位的觀點來看，具有較高的專一性。即使在低濃度時，訊號點跟訊號點之間也可有效被區分開。此外，修飾矽烷是必須的，主要是讓蛋白質固著可以更加均勻，使其在低濃度時，訊號點與訊號點之 間不會亂跳，提高整個訊號的穩定性，使其偵測極限可以達到0.064pg/ml，達到可量測低濃度的效果。
本發明之感測晶片應用於酵素連結免疫吸附法，可以直接而有效地進行蛋白質固著(coating)，不同蛋白質的表面結構特性使其可透過三種主要的力吸附於金奈米粒子表面上，此三種力分別為疏水作用力、電荷引力及配位鍵結合力。
疏水作用力：在本發明之感測方法及感測晶片實施例中，當烷基矽烷吸附於奈米粒子之間的基材後，烷基矽烷可以增加基材接觸角(contact angle)，所增加的接觸角可幫助蛋白質靠近金奈米粒子表面。一旦蛋白質與金奈米粒子表面十分接近(之間的距離約小於1nm)，蛋白質的疏水區很有可能與金奈米粒子表面的疏水區接觸並且與之結合。因此，對於富含非極性胺基酸(例如色胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸或苯丙胺酸)的蛋白質而言，其可與金奈米粒子表面發生強的結合作用。故透過烷基矽烷本身的末端官能基特性，確實能加強蛋白質吸附於金奈米粒子之表面。
電荷引力：胺基矽烷分子吸附於基材後末端所帶的NH2，在水溶液中易形成NH3 +，造成胺基矽烷分子帶有正電荷，因此對於帶有正電荷的蛋白質，會形成排斥作用。金奈米粒子表面帶有負電荷，負電荷會吸引帶有正電荷的蛋白質並足以使其靠近結合區的表面，環境pH值低於等電點時蛋白質帶有正電荷，因此會與金奈米粒子表面發生強烈的吸引作用。尤其是富含離胺酸和精胺酸的蛋白質區域在環境pH值低於離胺酸的等電點(pH 10.4)和精胺酸的等電點(pH 12.5)時會帶有大量的正電荷。因此，胺基矽烷分子所帶之正電荷有助於富含離胺酸和精胺酸的蛋白質吸附於金奈米粒 子之表面。
配位鍵結合力：配位鍵結合力是所有吸引力中最強的，含有大量富含硫的胺基酸(半胱胺酸和甲硫胺酸)的蛋白質和金奈米粒子表面會強力結合，這是由在金原子(具有傳導帶電子的能力)和硫原子(帶有價電子)之間的吸引力造成的。
透過這三種力，金奈米粒子可以有效率的吸附蛋白質，使其蛋白質吸附效率有效提升，可用最少的蛋白質濃度及最短的時間進行固著(coating)，同時得出的訊號結果也優於一般市售的酵素連結免疫吸附法孔盤。
因此，本發明之感測方法及感測晶片具有靈敏度高、成本便宜以及節省時間等優點，且其可用於檢測不同抗體及病毒。
本發明可應用於實驗開發，如免疫分析化學分析及酵素分析等；建立實驗程序，如動力學功能及溫度控制等；抗體鑑定，如抗體/配位體親合性篩檢、單株抗體抗原表位測定、腫瘤細胞篩選並鑑定期數、抗獨特性抗體篩選、抗體濃度測定及片段篩檢等；以及臨床前與臨床上診斷，如生物標記分析及重點照護等，用途十分廣泛。
實驗例
1.以胺基矽烷修飾本發明之感測晶片以進行抗原或抗體之偵測實驗：先以能量較弱的氧氣電漿對本發明之感測晶片的基板表面做親水性改質，再將基板泡入3-胺基丙基三乙氧基矽烷(3-aminopropyltrimethoxysilane,APTMS)溶液中，便可以使APTMS與奈米粒 子間的空白基板結合，接著直接加入抗體(抗原)就可使抗體(抗原)固著於奈米粒子上，再加入待測物抗原(抗體)與其反應，以進行抗原或抗體之偵測實驗。
2.本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤的比較：請參閱第八圖，分別以本發明之感測裝置與Corning的COR-9018孔盤針對轉化生長因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)進行ELISA。TGF-β會促進腫瘤的惡化、侵潤和轉移，是一種癌症惡化指標。以本發明之感測裝置進行ELISA可測得濃度遠低於1pg/ml的TGF-β，靈敏度明顯優於Corning的COR-9018孔盤。
3.分別以本發明的感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用eBioscience的人類/小鼠轉化生長因子beta 1 ELISA套組(human/mouse TGF beta 1 ELISA kit,Cat.No.88-8350-88)以三明治ELISA法來定量人類/小鼠轉化生長因子beta 1：
分析盤準備：
步驟1. 用1X被覆緩衝液(coating buffer)稀釋捕獲抗體(capture antibody)，並加100μl稀釋後的捕獲抗體到每個分析盤的孔(well)中，將盤子密封後置於4度C隔夜(O/N)。
步驟2. 隔夜後，吸乾每個孔的捕獲抗體液體後，每個孔用100μl的清洗液(wash buffer)清洗。共清洗5次，使用八爪分注器時儘量沿著96孔分析盤的管壁加入，以減少氣泡產生，於最後一次清洗步驟後，倒蓋分析盤於擦手紙上，以除去殘餘的清洗液。
步驟3. 加100μl的阻隔緩衝液(blocking buffer)(1X分析稀釋 液(assay diluent))到每個孔中，並置於室溫至少一小時。
步驟4. 步驟3後，吸乾每個孔的液體，每個孔用100μl的清洗液清洗。共清洗5次。
ELISA流程：
步驟1. 標準品及樣本：將標準品由最高濃度1000pg/ml往下序列稀釋七個濃度，並且最後一點(第八點)為空白值(blank)，並將每個濃度的標準品及樣品(在1X分析稀釋液中)加100μl到每個孔中，每個標準品及樣品進行三重複試驗。加入後置於室溫至少兩小時。
步驟2. 測定：於步驟1後，吸乾每個孔的液體，每個孔用100μl的清洗液清洗。共清洗5次。於每個孔中加入100μl(在1X分析稀釋液中)稀釋後的檢測抗體(detection antibody)，並置於室溫下一小時。
步驟3. 結合卵白素-辣根過氧化物酶(Avidin-HRP)：於步驟2後，吸乾每個孔的液體，每個孔再用100μl的清洗液清洗。共清洗5次。於每個孔中加入100μl(在1X分析稀釋液中)稀釋後的Avidin-HRP，並於室溫避光靜置30分鐘。
步驟4. 加TMB受質(TMB substrate)(受質液(Substrate solution))：於步驟3後，吸乾每個孔的液體，每個孔再用100μl的清洗液清洗。共清洗7次。於每個孔中加入100μl的受質，並於室溫避光靜置呈色15分鐘(清洗前先在孔加入清洗液浸泡1~2分鐘)。
步驟5. 加50μL終止液(Stop Solution)到每個孔後利用ELISA分析儀於450nm吸收波長測定結果，並用630nm波長校正。
※注意：反應終止後15分鐘至30分鐘內利用ELISA分析儀測 定結果。
請參閱第九及十圖，Corning的COR-9018孔盤最低偵測濃度為8pg/mL，本發明的感測裝置(本實施例中為96孔微孔盤)最低偵測濃度為0.064pg/mL。由於整個TGF-β家族都有9個半胱胺酸，這9個半胱胺酸中8個會2個為一組雙硫鍵(disulfide bond)形成半胱胺酸結(cysteine knot)，而這個結構即為整個TGF-β超家族的共同特徵，第9個半胱胺酸則會與另外一個次單元的半胱胺酸形成雙硫鍵產生雙聚體。其他的TGF-β保守結構多為藉由疏水性交互作用(hydrophobic interactions)形成的二級結構。因此，這類型蛋白質的結構特性與金奈米粒子的表面結構特性，透過配位鍵結合力，可使這類型蛋白質有效的吸附於金奈米粒子表面，故在低濃度時可以降低雜訊，提高整體訊號靈敏度。
4.分別以本發明的感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用eBioscience的人類/小鼠轉化生長因子beta 1 ELISA套組(human/mouse TGF beta 1 ELISA kit,Cat.No.88-8350-88)，以三明治ELISA法來定量人類/小鼠轉化生長因子beta 1：請參閱第十一圖及表1，其中第十一圖係由表1的數據繪製而成。在實驗中，本發明的感測裝置在TGF-beta 1濃度偵測極限最佳可達0.064pg/ml，而在市售分析套組塑膠孔盤中，Corning的COR-9018孔盤濃度偵測極限僅達8pg/ml，本發明的感測裝置之濃度偵測極限超過傳統孔盤100倍(0.064pg/ml：8pg/ml)。
5.分別以本發明的感測裝置與Corning的COR-9018孔盤使用市售的ELISA套組，以三明治ELISA法來定量C-反應蛋白(C-Reactive Protein，CRP)：請參閱第十二圖及表2。第十二圖係由表2的數據繪製而成。本發明的感測裝置對CRP濃度偵測極限最佳可達0.32pg/ml，而在市售分析套組塑膠孔盤中，Corning的COR-9018孔盤濃度偵測極限可達8pg/ml，本發明的感測裝置之濃度偵測極限超過傳統孔盤約25倍(0.32pg/ml：8pg/ml)。
6.以(1)玻璃基板上有金奈米粒子，且金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾、(2)玻璃基板上僅有金奈米粒子、(3)玻璃基板表面直接以胺基矽烷修飾、以及(4)僅有玻璃基板四種不同材質的感測裝置進行ELISA之比較：請參閱第十三圖(a)至第十三圖(d)。使用金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾的感測裝置，針對eBioscience的人類/小鼠轉化生長因子beta 1 ELISA套組(human/mouse TGF beta 1 ELISA kit,Cat.No.88-8350-88)進行實驗，其訊號靈敏度最佳可達0.064pg/ml，而一般塑膠孔盤的訊號靈敏度僅為8pg/ml，因此金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾的感測裝置之訊號靈敏度超過傳統孔盤100倍以上(0.064pgml：8pg/ml)。玻璃基板上僅有金奈米粒子，未以胺基矽烷修飾時，在低濃度時其訊號較不穩定而易跳動，可信度下降，因此其訊號靈敏度較金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾的感測裝置差。玻璃基板表面直接以胺基矽烷修飾以及僅有玻璃基板之兩種材質的感測裝置皆無法提高靈敏度。
7.在低濃度條件下(濃度偵測極限測試)，針對以玻璃基板上有金奈米粒子，且金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾以及僅有玻璃基板兩種 不同材質的感測裝置來進行ELISA之濃度偵測極限測試的比較：請參閱第十四圖(a)及第十四圖(b)。玻璃基板上有金奈米粒子，且金奈米粒子表面以胺基矽烷修飾的感測裝置之濃度偵測極限，遠優於僅有玻璃基板的感測裝置。
8.應用本發明之感測晶片的蛋白質晶片：將一般蛋白質晶片上的反應區改為具有奈米粒子陣列及有機分子層之反應區，該蛋白質晶片的規格為75mm*25mm，並具有60mm*21mm的反應區。
9.應用本發明之感測晶片的基因晶片：將一般基因晶片上的反應區改為具有奈米粒子陣列及有機分子層之反應區，採用核酸探針雜交進行核酸序列測定，接著經掃描儀讀取後產生圖形文件，經過劃格(Griding)、確定雜交點範圍(Spot Identifying)、過濾背景雜訊(Noise Filtering)等圖像識別過程，最終得到基因表達的螢光信號強度值，並以列表形式輸出。
實施例
1.一種感測晶片，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該晶片包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一矽烷(silane)，固著於該複數局部基材表面；以及一第二有機分子，固著於這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
2.如實施例1所述的感測晶片，其中該感測晶片可裝卸地設置於一具有一通孔的有孔元件以在該有孔元件的一端關閉該通孔，以形成 一感測裝置。
3.如實施例1-2所述的感測晶片，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該感測晶片為一蛋白質晶片或一基因晶片。
4.一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一矽烷(silane)固著於該複數局部基材表面；以及(3)將一第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
5.如實施例4所述的感測方法，該方法更包含：將一第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面後，進行一酵素連結免疫吸附法。
6.如實施例4-5所述的感測方法，其中：該第二有機分子係直接固著至這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該第二有機分子為一抗原或一抗體。
7.一種感測晶片，用以感測一待測物中之一第一有機分子，包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一第二有機分子，固著至該複數相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性；以及一改質劑，固著於該複數局部基材表面，並誘使該第二有機分子遠離該複數局部基材表面。
8.如實施例7所述的感測晶片，其中該改質劑為一矽烷 (silane)。
9.如實施例7-8所述的感測晶片，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該感測晶片為一蛋白質晶片或一基因晶片。
10.一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一改質劑固著於該複數局部基材表面，該改質劑增強一第二有機分子於這些相間隔的奈米粒子表面之吸附性；以及(3)將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
11.如實施例10所述的感測方法，該方法更包含：將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面後，進行一酵素連結免疫吸附法。
12.如實施例10-11所述的感測方法，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該第一有機分子為一抗原或一抗體。
11‧‧‧感測晶片
111‧‧‧基材
112‧‧‧奈米粒子
113‧‧‧局部基材表面
115‧‧‧第二有機分子
116‧‧‧第一有機分子
117‧‧‧改質劑
118‧‧‧第三有機分子
119‧‧‧酵素
120‧‧‧受質

Claims (9)

  1. 一種感測晶片，藉由一酵素連結免疫吸附法感測一待測物中之一第一有機分子，該晶片包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一矽烷(silane)，固著於該複數局部基材表面；以及一第二有機分子，固著於這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的感測晶片，其中該感測晶片可裝卸地設置於一具有一通孔的有孔元件以在該有孔元件的一端關閉該通孔，以形成一感測裝置。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的感測晶片，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該感測晶片為一蛋白質晶片或一基因晶片。
  4. 一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一矽烷(silane)固著於該複數局部基材表面；(3)將一第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性；以及 (4)將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面後，進行一酵素連結免疫吸附法。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的感測方法，其中：該第二有機分子係直接固著至這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該第二有機分子為一抗原或一抗體。
  6. 一種感測晶片，藉由一酵素連結免疫吸附法感測一待測物中之一第一有機分子，包含：一基材，在該基材上具複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；一第二有機分子，固著至該複數相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性；以及一矽烷(silane)，固著於該複數局部基材表面，並誘使該第二有機分子遠離該複數局部基材表面。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的感測晶片，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該感測晶片為一蛋白質晶片或一基因晶片。
  8. 一種感測方法，用以感測一待測物中之一第一有機分子，該方法包含下列步驟：(1)提供一感測晶片，該晶片包含一基材、在該基材上複數相間隔的奈米粒子以及在該複數相間隔的奈米粒子間之複數局部基材表面；(2)使一矽烷(silane)固著於該複數局部基材表面，該矽烷增強一第二有 機分子於這些相間隔的奈米粒子表面之吸附性；(3)將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面，其中該第二有機分子與該第一有機分子兩者間具有專一性；以及(4)將該第二有機分子固著至這些相間隔的奈米粒子表面後，進行一酵素連結免疫吸附法。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的感測方法，其中：該第二有機分子係直接固著於這些相間隔的奈米粒子的表面；以及該第一有機分子為一抗原或一抗體。
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