TWI519787B - 癌症轉移之評估方法及生物標記、抑制癌症轉移之醫藥組成物、及分泌蛋白質體之分析方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種肺癌轉移之評估方法、一種肺癌轉移之生物標記、一種用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物以及一種分泌蛋白質體之分析方法。
癌症,亦稱惡性腫瘤,為由控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。作為全球癌症死因之首,肺癌缺乏了有效的診斷工具及治療方法以預防癌症的轉移。於肺癌之中,非小細胞肺癌(NSCLC)的患者占了約85%,且於所有的非小細胞肺癌組織學類型中,肺腺癌最為常見。許多肺癌患者被診斷為具遠端轉移(distant metastases),而大部分的癌症患者死於癌轉移而非其原發腫瘤。肺癌患者於五年內存活率為15.2%,然而,若為具遠端轉移者,五年內存活率僅2.8%。癌轉移無疑是癌症致命的步驟,不幸的是,於臨床上,目前缺乏有效率的診斷以及預測工具對於癌轉移以及其癌症發展進程進行預測。為了進一步增進患者存活率,許多學者投入癌轉移的機制等相關研究,以期發現與轉移相關重要的生物標記,並且能夠有效地進行治療。
癌症的最終進程,轉移,指的是腫瘤細胞從腫瘤部位,透過血液或淋巴系統移動至其他部位,是一個複雜的過程。於移動的過程中,需要許多的蛋白質協助腫瘤細胞的移動,譬如分泌蛋白質(secretory protein),透過許多的途徑從細胞中分泌,包括傳統的內質網-高基氏體途徑、囊泡運輸途徑、
特殊通道(channel),此時分泌的蛋白質總稱為分泌蛋白質體。先前研究中,細胞分泌蛋白質體透過蛋白質體學技術應用於癌症研究中。該類癌症研究包括三個主要的部份,即開發臨床生物標記、了解癌症進程的機制、以及治療癌症的策略。先前已有些文獻報導一些生物標記與癌症轉移與侵略相關,例如蛋白酶MMP-9、血管新生相關如VEGF等。
然而,現今技術以及目前已發現的生物標記,對於癌轉移及其癌症發展進程預測仍然有其不足之處,在預測的準確度以及技術方面依然有進步空間亟需相關領域者持續的開發。
本發明之目的在於提供一種肺癌轉移之評估方法,包括:(A)提供一受試者之檢體樣品,該檢體樣品係包括一正常組織、及一待檢腫瘤組織;(B)分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之一生物標記之表現量,其中該生物標記係為一帕金森氏疾病第七型(Parkison disease type 7,PARK7)之基因型或蛋白質;以及(C)比較該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之該生物標記之表現量,當該待檢腫瘤組織中之該生物標記之表現量低於該正常組織中之該生物標記之表現量,代表該受試者具有癌症轉移之風險。
其中,於該評估方法的步驟(A)中,該「腫瘤組織」,可為譬如細胞組織、血液、體液或蛋白質,然本發明並不限於此。
特別是,於該評估方法的步驟(B)中,係分別檢測正常組織及待檢腫瘤組織中之PARK7之mRNA、蛋白質、蛋白質之衍生物、或蛋白質之胜肽鏈之表現量。
較佳為,於步驟(B)中分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之PARK7之蛋白質表現量。
本發明所提供之肺癌轉移評估方法,係透過西方墨點法、PCR、凝膠電泳法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、免疫組織化學法(IHC)、免疫沉澱法(IP)、或質譜分析法(MS)分別檢測正常組織及待檢腫瘤組織中之PARK7之蛋白質之表現量。
本發明所提供之肺癌轉移評估方法,特別是,該肺癌為非小細胞肺癌。
本發明亦提供一種肺癌轉移之生物標記,該標記可為PARK7之核苷酸序列、PARK7核苷酸序列之互補股、PARK7寡核苷酸序列之衍生物、PARK7蛋白質序列、PARK7蛋白質序列之衍生物、PARK7蛋白質序列之片段、PARK7蛋白質序列之變異體、或PARK7蛋白質序列所對應之抗體。
特別是,本發明提供之肺癌轉移之生物標記為PARK7之該蛋白質序列、PARK7蛋白質序列之衍生物、PARK7蛋白質序列之片段、PARK7蛋白質序列之變異體、或PARK7蛋白質序列所對應之抗體。
本發明所提供之肺癌轉移之生物標記PARK7,可作為癌症罹患風險評估之生物標記、癌症診斷之生物標記、亦可作為癌症進程預測之生物標記,其中,PARK7之核苷酸鏈序列係為SEQ ID NO:1所示之序列。
本發明所提供之肺癌轉移之生物標記,其中PARK7之蛋白質序列係為SEQ ID NO:2所示之序列。
本發明之另一目的在於提供一種用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物,該siRNA化合物包括一目標序列,且該目標序列選自PARK7基因。
特別是,該PARK7基因序列係包括20-25個寡核苷酸。
特別是,該PARK7之基因序列為SEQ ID NO:1。
本發明又一目的在於提供一種分泌蛋白質體之分析方法,包括下列步驟:(A)提供一中空纖維管柱培養系統,其中該中空纖維管柱培養系統係包括一個或複數個中空纖維管柱、一循環幫浦、一培養液供應單元、及一排出單元,該循環幫浦之相對兩端係分別與該等中空纖維管柱及該培養液供應單元連接,該等中空纖維管柱之相對兩端係分別與該循環幫浦及該排出單元連接,該循環幫浦係將該培養液供應單元中之培養液提供至該等中空纖維管柱,且流經該等中空纖維管柱之培養液則藉由該排出單元排出;(B)培養一待分析細胞於該中空纖維管柱培養系統中,其中該待分析細胞係培養於該等中空纖維管柱與管柱間;(C)收集該待分析細胞所分泌之分泌蛋白質體;(D)純化該分泌蛋白質體並分析該分泌蛋白質體之蛋白質種類,並將所得到之該
分泌蛋白質體之蛋白質種類與一蛋白質體資料庫進行比對。
該中空纖維管柱培養系統係一非靜置系統,利用中空纖維管柱的高度表面積,模擬細胞在體內的3D環境下生長,並且可提高細胞生長數量。該系統可使細胞代謝物排出,因此可以降低細胞的死亡率,並且能夠藉由小體積的採樣得到足量的分泌蛋白質,利於進行分泌蛋白質的分析。
本發明所提供之一種分泌蛋白質體之分析方法,特別是,於步驟(D)中以液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)對於分泌蛋白質體進行分析。
該分泌蛋白質體之分析方法中,於步驟(D),係純化該分泌蛋白質體,並選擇性的標定或不標定該分泌蛋白質體,以分析該分泌蛋白質體之蛋白質種類。
特別是,當分泌蛋白質體未經標定時,藉由該分泌蛋白質體中蛋白質之m/z、電荷及滯留時間,對於該分泌蛋白質體中之蛋白質進行分析。
並且,於上述之分析方法中,用於該中空纖維管柱培養系統之培養液可為無血清培養液或有血清培養液。然而為了避免血清汙染或血清置換影響細胞生長,較佳為無血清培養。
接下來,參考隨附圖式,將於此更加詳述本發明的示例性實施例,但應注意的是本發明的範疇並非僅限於所舉
的實施例,下列實施例係為了使本發明更容易被理解,於本領域具有通常知識者,在不悖離本發明申請專利範圍所揭示的精神及範圍下,可進行各種不同的修飾、添加以及取代。
以下係以肺腺癌細胞株為例,詳細說明本發明之一具體實施例,並參閱流程圖(圖2),以使本發明更容易被理解並加以應用。
利用中空纖維管柱培養系統(HFC system)獲得CL1細胞株狀況液(conditioned media,CM)
在本實施例中,利用源自同樣親代之肺腺癌細胞株,低侵略性的CL1-0細胞株與高侵略性的CL1-5細胞株,穩定培養於含有10%胎牛血清(FBS)RPMI-1640培養基中。接著,逐漸降低上述血清培養基含量,最後馴化CL1-0以及CL1-5,使其得以於無血清培養基(含15% CDM-HD血清取代物的RPMI1640培養基,1%抗生素)成長,約過2至3代,以顯微鏡(200X)觀察CL1-0以及CL1-5的細胞型態(圖1A),並利用MTT技術測試細胞生長情況,參見圖1B、1C,可見兩細胞株馴化前後於外細胞型態以及生長情況皆無明顯差異。接著將馴化的細胞株移至中空纖維管柱培養系統(HFC system)。
接著,將密度為5x107的CL1-0與CL1-5懸浮於該無血清培養基,培養於該中空管柱匣之中空纖維束外腔(ESC),從該中空纖維管柱培養系統之中空纖維束外腔(ESC)每隔24小時蒐集15 mL含有分泌蛋白質體的狀況液(conditioned
media,CM),且用以維持細胞生長的培養基每日換新,此外,每日評估葡萄糖以及乳酸濃度,以對細胞株於中空纖維管柱培養系統(HFC system)的生長情況進行監控。
為了獲得CL1-0與CL1-5的分泌蛋白質體,將蒐集自中空纖維束外腔(ESC)的狀況液(conditioned media,CM)以10,000 x g離心,去除細胞殘屑後,利用Bradford分析(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)對分泌蛋白質體中的蛋白質濃度進行定量。
為證明細胞內蛋白質為細胞分泌出而非細胞死亡釋放,將總共100 μg的狀況液樣品分成兩部分,其中一份狀況液用以進行外泌體純化(exosome purification),比對進行外泌體純化的狀況液樣品(50 μg)與另一份狀況液樣品(50 μg)中的家務基因(housekeeping gene),GAPDH之表現量。參閱圖3,GAPDH於狀況液與源於該狀況液的外泌體中,表現量相近,確認細胞內蛋白質透過外泌體分泌釋放至細胞外。
樣品純化與分析
膠體電泳分離(stacking gel)法為習知建立以提純分泌蛋白質體樣品之用,係將狀況液(conditioned media,CM)樣品混合染劑以及0.5M DTT後,置於包括50%分離膠體(running gel)以及4%焦集膠體(stacking gel)的膠體中,並以55V電壓進行電泳30分鐘,蛋白質體樣品中的蛋白質會被滯留於分離膠體與焦集膠體之間。
於本實施例中,將細胞生長期間(第2天至第10天)蒐集的狀況液樣品,接著利用膠體電泳分離(stacking gel)將CL1-0和CL1-5兩株肺癌細胞之狀況液樣品中蛋白質回收作後續染色與膠體水解成胜肽片斷實驗使用。
上述膠體並以Coomassie Brilliant Blue R-250進行染色,切下所有染色膠體帶並以胰蛋白水解脢切割之(膠內酶解In-gel digestion),以0.5M DTT,56℃下還原上述染色膠體帶,再以飽和碘乙醯胺於室溫下對其烷基化。上述每一步驟皆需進行1小時。
20 μL的0.1 μg/μL胰蛋白水解脢加入上述染色膠體帶,並且於37℃進行隔夜酵素水解。染色膠體帶中的蛋白質經水解後形成胜肽,該胜肽樣品以C18 Tip純化後,以質譜儀對該些胜肽樣品進行分析。
質譜儀分析
於本實施例中,來自CL1-0和CL1-5兩株肺癌細胞之狀況液樣品,以二維線性離子阱式傅立葉轉換電場軌道多次質譜系統(LTQ-Orbitrap)進行分析。該二維線性離子阱式傅立葉轉換電場軌道多次質譜系統(LTQ-Orbitrap)係結合質譜儀與微電灑離子源(Nanoelectrospray,廠牌為ThermoElectron,San Jose,CA)以及奈米流液相層析儀(Nanoflow HPLC,廠牌為Agilent Technologies 1200 series)。
蛋白質定性以及定量
於本實施例中蛋白質定性部分,係將利用Mascot資料庫搜尋,並挑選於Mascot資料庫定義中,能夠辨識出具有至少兩不重複序列之蛋白質,且該兩序列蛋白質皆定義為RANK 1胜肽者,即為本發明之候選蛋白質,其中,於CL1-0與CL1-5分別蒐集到412與531個候選蛋白質。
接著,這些候選蛋白質以IDEAL-Q軟體,針對該些候選蛋白質於LC-MS/MS分析之m/z、電荷以及滯留時間進行蛋白質定量分析。
藉由此方法,偵測出50個候選蛋白質於CL1-0與CL1-5細胞株中的表現量不同,且這些候選蛋白質中,25個候選蛋白質於CL1-0表現量高,而另外25個候選蛋白質於CL1-5表現量高。
透過交互蛋白質體分析篩選候選蛋白質
接下來,將上述50個候選蛋白質以SPRING 9.0資料庫,對其交互作用進行分析,並依據分析結果,篩選出7個蛋白質,而其中於高侵略性的CL1-5細胞株中,ACTN4、FN1、PARK7、PRDX4以及GRP78蛋白質表現量高,而低侵略性的CL1-0細胞株中,MYO6與GSR蛋白質的表現量高。
於本實施例中,如圖4所示,將7個蛋白質進一步以西方點墨法進行分析(其中Tubulin為家務基因,控制組),並將西方點墨法的結果與質譜儀結果,針對其一致性進行比較。
其中,PARK7蛋白質於西方點墨法結果與質譜儀結果一致,證實該蛋白質高度表現於CL1-5細胞株中。
蛋白質PARK7於肺腺癌細胞中,對於細胞的生長、移動/侵略有著顯著影響
為了更進一步確認PARK7蛋白質涉及癌轉移相關功能及成為生物標記的潛力,於本實施例中,另外以肺癌細胞株A549進行測試。如圖5所示,首先,分別將CL1-5、A549以及CL1-0分別以PARK1 siRNA處理(購自Santa Cruz,CA,USA),該siRNA序列為sc-37080A的正意股(sense):CUCCACUUGUUCUUAAAGATT(SEQ ID NO:3)以及反意股(antisense):UCUUUAAGAACAAGUGGAGTT(SEQ ID NO:4)、sc-37080B之正意股(sense):CGACGAUCACUUAGAGAAATT(SEQ ID NO:5)以及反意股(antisense):UUUCUCUAAGUGAUCGUCGTT(SEQ ID NO:6)、sc-37080C之正意股(sense):GGAAGUAUGGAAGUCACAATT(SEQ ID NO:7)以及反意股(antisense):UUGUGACUUCCAUACUUCCTT(SEQ ID NO:8),並且與處理凌亂siRNA(scramble siRNA)的控制組進行對照。如圖5A所示,首先,藉由確認處理PARK7 siRNA或是轉染PARK7 DNA的質體之細胞株的PARK7蛋白質表現量,以確認確實於細胞中成功的以siRNA抑制PARK7表現,或者因轉染PARK7 DNA的質體使得PARK7蛋白質表現量增加。
MTT分析實驗結果顯示,當PARK7於CL1-5(圖5B)以及A549細胞(圖5C)中的合成及分泌量降低時,細胞生長大幅降低。
經由PARK7 siRNA處理的CL1-0,MTT分析實驗結果顯示,細胞生長亦受影響而略為下降(圖5D),進一步將CL1-0分別轉染入空質體(控制組)以及帶有PARK7 DNA的質體,MTT分析實驗結果顯示,可見轉染有PARK7質體DNA的CL1-0細胞生長較控制組佳(圖5E)。
此外,圖5F顯示CL1-5以及A549細胞株的移動能力,因PARK7 siRNA處理而大幅降低,而在低侵略性的CL1-0中,亦觀察到細胞生長以及移動能力隨著PARK7蛋白質表現量下降而同步下降的情況。相反的,當過度表現PARK7於低侵略性的CL1-0細胞株時,其生長能力以及移動能力增加。
臨床組織樣品及血漿中蛋白質PARK7的表現
接下來,於本實施例中,以臨床的組織樣品以及血漿確認PARK7的表現。利用包含有64個癌組織及31個鄰近正常組織的組織微陣列。國際上,癌症的診斷期數係依照腫瘤大小(T)、腋下淋巴結轉移與否(N)、遠處是否轉移(M)等這三個定義為TNM系統,PARK7的表現量與TNM階段以及淋巴結轉移具有高度關聯性。此外,由圖6A,PARK7在癌組織的表現量明顯高於正常組織。由ROC曲線(Receiver operating characteristic curve)結果顯示,可藉由不同PARK7表現量以清楚分辨第一期與第二期之病人(圖6B)。此外,血漿樣品中亦觀察到患者PARK7表現量明顯高於健康組別,由圖6C與6D之Kaplan-Meier可知,當PARK7表現量的切點值(cut-off value)落於第一四分位數(quartile)時,患者表現
出三年內存活率與病展存活率,然而,若該切點值低於該四分位數時,患者存活率較切點值高於四分位數的患者來得低。
圖1A係於無血清培養基(SFM)馴化前與馴化後,以顯微鏡(200X)觀察CL1-0以及CL1-5的細胞型態
圖1B係以MTT技術測試CL1-0細胞於無血清培養基(SFM)馴化前與馴化後生長情況。
圖1C係以MTT技術測試CL1-5細胞於無血清培養基(SFM)馴化前與馴化後生長情況。
圖2係根據本發明實施例,對肺腺癌細胞株進行分泌蛋白質體分析之流程圖。
圖3比較家務蛋白質G3PDH在等量狀況液中經過外泌體純化與未經過之表象量差異。
圖4係根據本發明實施例,以西方墨點法對CL1-0與CL1-5細胞株中,候選蛋白質的表現量進行比較。
圖5A係根據本發明實施例,處理PARK7 siRNA或轉染PARK7 DNA的質體之細胞株的PARK7蛋白質表現量。
圖5B係根據本發明實施例,CL1-5細胞株以PARK7 siRNA處理後之生長情況。
圖5C係根據本發明實施例,A549細胞株以PARK7 siRNA處理後之生長情況。
圖5D係根據本發明實施例,CL1-0細胞株以PARK7 siRNA處理後之生長情況。
圖5E係根據本發明實施例,CL1-0細胞株以轉染PARK7質體DNA後之生長情況。
圖5F係根據本發明實施例,CL1-5、A549以及CL1-0細胞株以PARK7 siRNA處理或轉染PARK7質體DNA後,每區域細胞移動數目。
圖6A係根據本發明實施例,PARK7的表現量在正常周邊細胞組織與不同TNM階段之癌化組織有統計上之差異。
圖6B係根據本發明實施例之ROC曲線(Receiver operating characteristic curve),可清楚分辨第一期與第二期TNM階段。
圖6C 係根據本發明實施例總存活率之Kaplan-Meier估計量。
圖6D 係根據本發明實施例病展存活率之Kaplan-Meier估計量。
<110> 國立成功大學
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Claims (10)
- 一種肺癌轉移之評估方法,包括:(A)提供一受試者之檢體樣品,該檢體樣品係包括一正常組織、及一待檢腫瘤組織;(B)分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之一生物標記之表現量,其中該生物標記係為一帕金森氏疾病第七型(Parkison disease type 7,PARK7)之基因型或蛋白質,並分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之PARK7之蛋白質、蛋白質之衍生物、或蛋白質之胜肽鏈之表現量,其中PARK7之核苷酸鏈序列係為SEQ ID NO:1所示之序列;以及(C)比較該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之該生物標記之表現量,當該待檢腫瘤組織中之該生物標記之表現量高於該正常組織中之該生物標記之表現量,代表該受試者具有癌症轉移之風險。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中於步驟(B)中,係分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之PARK7之蛋白質之表現量。
- 如申請專利範圍第2項所述之評估方法,其中係透過西方墨點法、PCR、凝膠電泳法、酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)、免疫組織化學法(IHC)、免疫沉澱法(IP)、或質譜分析法(MS)分別檢測該正常組織、及該待檢腫瘤組織中之PARK7之蛋白質之表現量。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中PARK7之蛋白質序列係為SEQ ID NO:2所示之序列。
- 如申請專利範圍第1項所述之評估方法,其中該肺癌係為一非小細胞肺癌。
- 一種肺癌轉移之生物標記,其係為PARK7之一蛋白質序列、該蛋白質序列之衍生物、該蛋白質序列之片段、該蛋白質序列之變異體、及該蛋白質序列所對應之抗體所組成之群組。
- 如申請專利範圍第6項所述之生物標記,其中PARK7之核苷酸鏈序列係為SEQ ID NO:1所示之序列。
- 如申請專利範圍第6項所述之生物標記,其中PARK7之蛋白質序列係為SEQ ID NO:2所示之序列。
- 一種用以抑制肺癌轉移之siRNA化合物,包括:一目標序列,該目標序列係選自PARK7之基因,其中該PARK7之基因序列係為SEQ ID NO:1。
- 如申請專利範圍第9項所述之siRNA化合物,其中該目標序列係包括20-25個寡核苷酸。
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TW101140274A TWI519787B (zh) | 2012-10-31 | 2012-10-31 | 癌症轉移之評估方法及生物標記、抑制癌症轉移之醫藥組成物、及分泌蛋白質體之分析方法 |
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