TWI488969B

TWI488969B - 牛蒡子苷進行生物轉化製備牛蒡子苷元二聚體的方法

Info

Publication number: TWI488969B
Application number: TW102124651A
Authority: TW
Inventors: Ping Chung Kuo; zi yu Chen; Miao Fan Chen
Original assignee: Univ Nat Formosa
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-06-21
Also published as: TW201502275A

Description

牛蒡子苷進行生物轉化製備牛蒡子苷元二聚體的方法

本發明為一種製備牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)的方法，利用立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )將牛蒡子苷(arctiin)水解後，得到牛蒡子苷元(arctigenin)與牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)。

從天然來源純化的有機小分子提供了一個無可比擬的靈感來源，由於其顯著的生物性功能，提供了有機化學和疾病治療的優勢。雖然有些化合物可以通過化學方法合成，有些問題仍然存在，包括複雜的操作、安全性、污染和生產成本。生物製劑一直被認為是一個用來合成有機化合物的經濟的技術，對於化學和藥物化合物而言是發展一種新的生產路線。與化學合成相比，生物轉化是一個用來生產生物活性化合物的有用方法，其優點為具有高立體(stereo-)和位置(regio-)的選擇性、反應條件溫和、簡單的操作程序，和環境安全性。

隨著永續發展概念的興起，「綠色化學」已成為一個重要議題。所謂綠色化學就是設計較安全的化學品或化學反應過程來取代危險物質的使用，或是盡可能減少與消除這些危險物質對環境的衝擊。在現今生活中，含有化學物質的商品處處可見，但商品的安全與否，成為我們使用時的擔憂。然而在醫藥進展已不可同日而語中，生物製藥(biopreparation)一直被認為是一大趨勢，所謂的生物製藥是以基因工程、細胞工程和發酵工程等技術，利用生物體來生產基因重組蛋白和單株抗體產品。不但能在生物體外促進天然的和人工合成的化學分子的諸多轉化反應，並且顯示出優良的化學選擇性、位置選擇性和立體選擇性。因此，生物轉化(biotrans- formation)提供了許多經由化學方法不能或不易合成的化合物的合成方法。

研究表明，利用生物轉化能合成和製備許多具有醫藥及農藥功能的複雜化合物。Wu報導從槐角(Fructus sophorae )分離得到的化合物sophoricoside與裂褶菌(Schizophyllum commun )進行生物轉化，形成化合物4',5,7-trihydroxy-isoflavone、4',7-dihydroxy-5-methoxyisoflavone及5,7-dihydroxy-4'-methoxy-isoflavone，其中化合物4',7-dihydroxy-5-methoxyisoflavone對人類乳腺癌細胞(MCF-7)具有細胞毒殺活性(cytotoxicity)。絕大多數的生物轉化所需條件非常溫和，反應產物單純，從本質上來講生物轉化是一個不汙染環境的綠色化學過程。生物轉化不但經濟效益明顯，而且對環境及綠色化工產業都由很好的發展。

民國84~93年間，台灣地區葉菜類平均年栽培面積為8,753 公頃，年產量為298,959公噸，主要栽培地區集中在彰化、雲林一帶。在台灣所栽培的葉菜類中，甘藍栽培面積最廣，產量亦最多。在設施育苗過程中，由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn AG-4)引起的甘藍幼苗立枯病，是甘藍苗床栽培的主要病害；它常藉由病原菌汙染之介質，帶菌種子及罹病組織殘體等方式，將病原菌導入栽培設施中。本病原菌會引起甘藍種子在出土前腐爛或於出土後引起幼苗地基部脫水縊縮，莖部變細，進而腰折倒伏死亡。

R.solani 係1858年Kühn根據馬鈴薯黑痣病之病原菌所命名，屬擔子菌門(Amastigomycota)、不完全菌絲孢綱(Hyphomycetes)、無孢子菌目(Agonomycetales)、無孢子菌科(Agonomycetaceae)及絲核屬(Rhizoctonia )。目前根據菌絲融合(anastomosis)、型態、生理特性和病原性，至少可將本菌分成12個菌絲融合群，AG-1~AG11和AG-GI，其中AG-1又可分為三個亞群，AG-2亦分成三個亞群。R.solani 包含下面五種特徵：(1)幼期的營養菌絲細胞為多核；(2)菌絲隔膜具明顯的隔膜孔(dolipore septum)構造；(3)菌絲分枝經常發生在菌絲之隔膜(septum)附近，分枝夾角一般成銳角或90度；(4)菌絲分枝處有縊縮，且分枝菌絲在起點附近有隔膜；(5)菌絲呈暗褐色等基本特徵。但經常也有下列特徵：會形成菌核(sclerotium)和念珠體的細胞(monilioid cell)，菌絲寬度大於5 μm，生長速率快且通常具病原性。主要是以菌絲侵害寄主植物，當菌絲接觸到寄主植物表面時，即形成舌瓣狀附著器(lobate)及感染褥(infection cushion)，並分泌多種酵素共同作用，再由舌瓣狀附著器及感染褥處長出侵入菌絲穿透寄主植物角質層，侵入植物表皮細胞內，之後再膨大而形成正常菌絲，在細胞內及細胞間生長延伸，最後於危害部份產生菌核。

牛蒡(Arctium lappa L.)是一種多年生草本植物，已很長一段時間在許多國家作為一種蔬菜栽培。牛蒡的種子在傳統醫藥中被廣泛用於作為利尿、抗發炎、解毒劑。牛蒡子含有豐富的二苄基丁內酯型木酚素(dibenzylbutyrolactone lignans)，其具有抗增殖和細胞凋亡的影響是最著名的。在以往的文獻中，牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)對於利用細菌脂多醣(LPS)活化的小鼠腹腔巨噬细胞，具有顯著抑制其一氧化氮(NO)生成的效果。發炎反應與許多疾病的發病率和死亡率是有關聯的，並被確認是部分血管組織對有害刺激的複雜生物反應。發炎反應是寄主受到感染或損傷的反應，涉及到聚集白血球和發炎反應因子的釋放，包括一氧化氮。由誘導型一氧化氮合酶(iNOS)所持續釋放的一氧化氮和由環氧合酶-2(COX-2)所釋放的前列腺素E2(PGE2)被認為是發炎的介質，可藉由細菌脂多醣或免疫刺激所引起。據報導指出，由巨噬細胞產生過量的一氧化氮和前列腺素E2，和其他細胞暴露於內毒素中，可能會導致敗血性休克、腦損傷、心肌缺血、糖尿病、動脈硬化，和其他局部或全身性發炎不良反應。因此，抑制一氧化氮合成和前列腺素E2的產生作為一個重要的治療目標。由於牛蒡子苷元二聚體為低毒性，因此用於治療各種抗發炎的疾病將是一個很好選擇。然而，天然牛蒡子苷元二聚體的含量是非常有限的，要進行後續生物活性測試(bioactivity examinations)是相當不容易的。此外，到現在為止，仍然沒有與本化合物相關的化學合成報導。

本發明之目的即在於提供一種製備牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)的方法，包含步驟：(1)將牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養，過濾後經減壓濃縮，得到粗萃物；(2)將步驟(1)所得粗萃物以乙酸乙酯與水進行萃取，經減壓濃縮得到乙酸乙酯分畫層水分畫層；(3)將步驟(2)乙酸乙酯分畫層以層析方法分離，以溶劑沖提、濃縮，分離得到化合物牛蒡子苷元(arctigenin)及牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)。

為達成前述發明目的，其中該步驟(1)牛蒡子苷先溶於二甲基亞碸。

為達成前述發明目的，其中該步驟(1)立枯絲核菌培養在馬鈴薯葡萄瓊脂上三天。

為達成前述發明目的，其中該立枯絲核菌培養在馬鈴薯葡萄瓊脂上，進一步切取菌絲尖端相同大小的菌塊，移至培養液中，與牛蒡子苷一起培養。

為達成前述發明目的，其中該步驟(1)牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養七日。

為達成前述發明目的，其中該步驟(1)牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養後，可進一步加入甲醇使立枯絲核菌死亡。

為達成前述發明目的，其中該步驟(3)溶劑為氯仿與甲醇混合溶劑。其中該氯仿與甲醇混合比例為300：1。

為達成前述發明目的，其中該步驟(3)溶劑沖提，進一步以漸增極性方式沖提。

為達成前述發明目的，其中該步驟(3)牛蒡子苷元，可進一步利用層析分離，以正己烷與乙酸乙酯以200：1的比例混合溶劑分離純化。

圖一為牛蒡子苷(arctiin)、牛蒡子苷元(arctigenin)及牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)結構。

圖二為(A)牛蒡子苷、(B)牛蒡子苷元及(C)牛蒡子苷元二聚體之HPLC層析圖。

圖三為牛蒡子苷、牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體濃度與時間關係之變化圖。

圖四為牛蒡子苷不同監測時間(A)第0天、(B)第2天、(C)第4天、(D)第6天、(E)第8天及(F)第10天之HPLC層析圖。

圖五為立枯絲核菌培養液中加入牛蒡子苷元，牛蒡子苷元不同監測時間(A)第7天、(B)第8天、(C)第10天、(D)第36天之HPLC層析圖。

本發明將就下列實施例作進一步說明，然該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為實施本發明之限制。本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn AG-4)在台灣造成眾多作物形成嚴重的倒伏(damping-off diseases)，尤其是用於生長在育苗盤系統(cell-plug systems)商業化生產的蔬菜幼苗是一個重大問題。在我們的實驗室中，我們長期把重點放在尋找對抗立枯絲核菌AG-4的植物性農藥。在測試的提取物中，牛蒡子甲醇萃取物對植物病原真菌的增長沒有表現出顯著的抑制。然而根據我們的初步的HPLC測定顯示，甲醇提取物中的指標化合物牛蒡子苷(arctiin)被轉化為其它化合物。因此，在本研究中，立枯絲核菌被使用作為生物催化劑，牛蒡子苷的生物轉化過程進行進一步探討。此外，用HPLC監測生物轉化，來確定動態過程中所涉及的各組成部分的相對含量。

一般製備

熔點是用熔點測定裝置測定。紫外光譜是由紫外-可見分光光度計測定，紅外光譜利用KBr壓片方法在紅外光譜儀測定。¹ H-與¹³ C-NMR、COSY、HMQC、HMBC與NOESY光譜是由超導核磁共振儀測定，並利用四甲基矽烷(tetramethylsilane，TMS)為內標(internal standard)。使用標準的脈衝序列和參數的NMR實驗，所有的化學位移(chemical shifts)皆以百萬分率(ppm，δ)報導。低解析和高解析的ESI質譜，分別經由陽離子與陰離子模式的質譜儀所測定。使用的甲醇為HPLC等級，管柱層析是使用矽膠(70-230 mesh)進行。指標化合物牛蒡子苷元和牛蒡子苷，是由我們的實驗室進行純化，並與文獻報導的光譜和物理數據比較以確定其化學結構。牛蒡子苷元和牛蒡子苷的純度以HPLC偵測皆大於98%。

真菌材料

立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn AG-4)菌株，取自中興大學植物病理學系病害管理研究室，係由甘藍立枯病的罹病植株所分離獲得，先前技術中可知其為該領域具通常知識者易於取得。取4.28 g Yeast Malt Broth(YMB)及200 mL二次水配製成液態培養基，於滅菌釜滅菌25分鐘、冷卻，以3號打洞器切取立枯絲核菌菌絲尖端相同大小的菌塊至液態培養基中，於室溫下往復式震盪培養120 rpm，27℃，3天。

將牛蒡子苷進行生物轉換

前述培養在YMB的立枯絲核菌液取5 mL轉換至含有300 mL培養液之500 mL愛倫美氏錐形瓶，培養於120 rpm攪拌27℃、3天。含有立枯絲核菌的培養液生長後，再加入50 mg的牛蒡子苷溶於1 mL DMSO，且再額外培養七天；同時準備兩組僅含有菌絲體的培養液或牛蒡子苷溶於DMSO之培養液的對照組。在這兩組對照組中，並沒有觀察到任何代謝產物。

代謝產物發酵與分離

經由發酵後，培養液與菌絲體經過濾分離。培養液利用氯化鈉達飽和並以乙酸乙酯(EtOAc)萃取；菌絲體也是利用乙酸乙酯萃取。經減壓濃縮除去溶劑，得到粗萃物5.3 g。粗萃物以乙酸乙酯與水進行分配萃取，合併每次抽取之乙酸乙酯層，經減壓濃縮除去溶劑得到乙酸乙酯分畫層0.5 g及水分畫層4.8 g。乙酸乙酯分畫層0.5 g，直接以矽膠管柱層析分離，以氯仿與甲醇(300：1)混合溶劑沖提並漸增極性沖提、濃縮，分離得到九個畫分。第四畫分，利用薄層層析分離，以正己烷：乙酸乙酯(200：1)混合溶劑分離，純化得到牛蒡子苷元(arctigenin)(70 mg)。第七畫分，得到一個白色固體，為diarctigenin(260 mg)。

牛蒡子苷元為無色粉末，熔點207-209℃.¹ H NMR and¹³ C NMR：參考Han et al.,Phytochemistry 1994,37,1161-1163。

牛蒡子苷元二聚體為白色粉末，熔點183-185℃；[α]_D ²⁵ +200(c 0.1,CHCl₃ )；UV(MeOH)λ_max (log ε)287(2.69),238(2.83),203(4.21)mm；IR(KBr)ν_max 3400,2908,1728,1594,1489,1242,1034 cm^-1 ；¹ H-NMR(CDCl₃ ,400 MHz)：δ 6.72(1H,d,J=2.0 Hz,H-6'),6.69(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.67(1H,d,J=2.0 Hz,H-2'),6.53(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6),6.46(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.06(1H,s,OH),4.14(1H,m,H-9),3.88(1H,m,H-9),3.86(3H,s,OCH₃ -3'),3.81(3H,s,OCH₃ -4),3.70(3H,s,OCH₃ -3),2.96(2H,d,J=4.8 Hz,H-7'),2.69(1H,m,H-7),2.56(3H,m,H-7,8,8')；¹³ C-NMR(CDCl₃ ,100 MHz)：δ 178.7(C-9'),148.9(C-3),147.7(C-4),147.4(C-3'),141.5(C-4'),130.4(C-1),129.3(C-1'),124.2(C-5'),123.8(C-6'),120.6(C-6),111.7(C-2),111.1(C-5),110.9(C-2'),71.3(C-9),56.0(OCH₃ -3'),55.8(OCH₃ -4),55.7(OCH₃ -3),46.6(C-8'),40.7(C-8),38.0(C-7),34.4(C-7')；ESI-MS m/z(rel.int. %)：m/z 765([M+Na]⁺ ,26),739(66),648(23),381(100)；HR-ESI-MS m/z 765.2870[M+Na]⁺ (calcd for C₄₂ H₄₆ O₁₂ Na,765.2881).

牛蒡子苷生物轉化的監測

取0.4 g YMB及20 mL二次水配製成液態培養基，於滅菌釜滅菌25分鐘、冷卻，分別將牛蒡子苷(arctiin)及牛蒡子苷元(arctigenin)粉末0.05 g分別加入滅菌之YMB培養基中。以3號打洞器切取菌絲尖端相同大小的菌塊至液態培養基中，於室溫下震盪培養，牛蒡子苷分別取培養0、2、4、6、8及10天的樣品，牛蒡子苷元分別取培養7、8、10及36天的樣品，再以HPLC進行監測，分析條件參考文獻所提供之溶媒系統，修改後分析方法如下。波長：280 nm、分析時間：55分鐘、動相：水+甲醇(60+40，v/v)、流速：0.4 mL/min、層析管柱：逆相層析管柱Agilent HC-C18，4.6×250 mm，5 μm。

實施例一立枯絲核菌對牛蒡子苷的生物轉化

立枯絲核菌Kühn AG-4菌株，取自中興大學植物病理學系病害管理研究室，係由甘藍立枯病的罹病植株所分離獲得。馬鈴薯葡萄瓊脂(potato dextrose agar；PDA)平板上培養立枯絲核菌(R.solani )三天，重複二次，使每次實驗的菌齡相近(接種源)。將培養在馬鈴薯葡萄瓊脂的立枯絲核菌轉換至含有培養基的錐形瓶中，培養在27℃三天。取牛蒡子苷粉末0.5 g加入液態培養基(4.28 g Yeast Malt Broth及200 mL二次水配製成液態培養基，於滅菌釜滅菌25分鐘、冷卻)中。再以3號打洞器切取菌絲尖端相同大小的菌塊，移至液態培養基中，於室溫下牛蒡子苷與立枯絲核菌共同震盪培養7天，讓立枯絲核菌可以完全分解牛蒡子苷。加入甲醇使立枯絲核菌死亡，經自然過濾法濾出代謝液，經減壓濃縮除去溶劑，得到粗萃物5.3 g。同時建立兩組對照組，分別僅含有菌絲體(mycelia)的培養液或牛蒡子苷溶於DMSO之培養液。在這兩組對照組中，並沒有觀察到任何代謝產物。

粗萃物以乙酸乙酯與水進行分配萃取，合併每次抽取之乙酸乙酯層，經減壓濃縮除去溶劑得到乙酸乙酯分畫層0.5 g及水分畫層4.8 g。乙酸乙酯分畫層以矽膠管柱層析分離，氯仿與甲醇(300：1)混合溶劑沖提並漸增極性沖提、濃縮，分離得到九個畫分。第四畫分，利用薄層層析分離，以正己烷：乙酸乙酯(200：1)混合溶劑分離，純化得到牛蒡子苷元。第七畫分，得到一個白色固體，為牛蒡子苷元二聚體。化合物牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體(圖一)，產率分別為21.0%及37.4%。

利用矽膠管柱層析，以氯仿與甲醇(300：1)沖提，再進一步利用薄層色層分析純化得到一個白色固體。由高解析電噴灑質譜測得其偽分子量為765.2870，顯示其分子式為C₄₂ H₄₆ O₁₂ (理論值[M+Na]⁺ ：765.2881)，推測本化合物為木酚素(lignan)二聚體。在¹ H-NMR光譜中，可以發現芳香性質子區域於δ 6.46(1H,d,J =2.0 Hz,H-2)、6.53(1H,dd,J =8.4,2.0 Hz,H-6)及6.69(1H,d,J =8.4 Hz,H-5)出現一組互相偶合的ABX型質子吸收訊號，於δ 6.67(1H,d,J =2.0 Hz,H-2')及6.72(1H,d,J =2.0 Hz,H-6')出現一組間位偶合(meta -coupled)的質子吸收訊號，由其化學位移與偶合形式，推測本化合物分別具有一個三取代與一個四取代的芳香環。較高磁場區於δ 2.56(3H,m,H-7,8,8')、2.69(1H,m,H-7)、2.96(2H,d,J =4.8 Hz,H-7')、3.88(1H,m,H-9)及4.14(1H,m,H-9)出現八個互相偶合的質子吸收訊號，此為二苄基丁烷類木酚素化合物的特徵質子吸收訊號，因此推定本化合物為具有二苄基丁烷基苯骨架的木酚素化合物。另外於δ 3.70(3H,s,OCH₃ -3)、3.81(3H,s,OCH₃ -4)及3.86(3H,s,OCH₃ -3')出現三個甲氧基的質子吸收訊號。由¹³ C-NMR光譜，可以發現具有21個碳原子吸收訊號，於δ_C 34.4(C-7')、38.0 (C-7)及71.3(C-9)有三個亞甲基碳原子吸收訊號，δ_C 40.7(C-8)、46.6(C-8')、110.9(C-2')、111.1(C-5)、111.7(C-2)、120.6(C-6)及123.8(C-6')有七個次甲基碳原子吸收訊號，δ_C 55.7(OCH₃ -3)、55.8(OCH₃ -4)及56.0(OCH₃ -3')有三個甲氧基碳原子吸收訊號。由HMBC光譜顯示，H-6'(δ6.72)與碳原子訊號C-2'(δ_C 110.9)、C-5'(δ_C 124.2)、C-1'(δ_C 129.3)、C-4'(δ_C 141.5)；H-6(δ6.53)與碳原子訊號C-7(δ_C 38.0)、C-5(δ_C 111.1)、C-2(δ_C 111.7)、C-1(δ_C 130.4)、C-4(δ_C 147.7)；H-7(δ2.69)與碳原子訊號C-8(δ_C 40.7)、C-8'(δ_C 46.6)、C-9(δ_C 71.3)、C-2(δ_C 111.7)、C-6(δ_C 120.6)、C-1(δ_C 130.4)；H-7'(δ2.96)與碳原子訊號C-8(δ_C 40.7)、C-8'(δ_C 46.6)、C-2'(δ_C 110.9)、C-6'(δ_C 123.8)、C-1'(δ_C 129.3)、C-9'(δ_C 178.7)；H-9(δ3.88)與碳原子訊號C-7'(δ_C 34.4)、C-7(δ_C 38.0)、C-8(δ_C 40.7)、C-8'(δ_C 46.6)、C-9'(δ_C 178.7)具有² J ,³ J -HMBC correlation。因此由上述的光譜特徵推定本化合物結構為diarctigenin，經文獻搜尋結果比對光譜資料確認結構無誤。此光譜數據與先前報導的化合物牛蒡子苷元二聚體相同。¹ H和¹³ C NMR訊號經由NOESY和HMBC光譜確認。這是第一個牛蒡子苷元二聚體以生物合成的報告，在這個步驟中所使用的試劑成本相對較低，因此這將是適合生產大規模的牛蒡子苷元二聚體。

實施例二利用HPLC監測生物轉化過程

為了研究生物製劑的機制，利用HPLC分析生物轉化的時間過程。粗產物在最佳化HPLC分析條件下，被設計如下實驗部分。應用所開發的HPLC色譜分析方法，被用來進行評估化合物的相對含量，包含牛蒡子苷、牛蒡子苷元與牛蒡子苷元二聚體，並評估在培養過程中產量的改變。參考文獻所提供之條件，得到牛蒡子苷、牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體之HPLC層析圖如圖二所示。

監測牛蒡子苷在立枯絲核菌培養液中的變化結果如表一、圖三、圖四所示。結果顯示第2天培養液中的牛蒡子苷還有超過一半以上尚未轉化，而牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體已經生成，其中牛蒡子苷元二聚體為主要產物。在第四天時，牛蒡子苷含量明顯的下降，產物牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體含量明顯增加。第八天時，牛蒡子苷元及牛蒡子苷元二聚體含量已經達到平衡。

為了確認牛蒡子苷元是否也會進行同樣的轉化，單獨只有牛蒡子苷元作為最初起始物質在含有立枯絲核菌的培養基培養，然而，並未發現牛蒡子苷元與牛蒡子苷元二聚體的代謝物生成(圖五A-D所示)。顯示牛蒡子苷元二聚體的生成與牛蒡子苷是有關連性的。

根據以上結果，牛蒡子苷合理的代謝途徑為葡萄糖部分與木酚素連結的地方被水解，導致一酚類自由基(phenolic radical)生成。這個自由基可從培養基中抓取氫來生成牛蒡子苷元。部分的中間體自由基轉化成phenylic radical，並進行二聚反應生成牛蒡子苷元二聚體產物。當牛蒡子苷不存在時，並未生成累積對於形成牛蒡子苷元二聚體有關的酚類自由基(phenolic radical)。因此，並未生產二聚木酚素-牛蒡子苷元二聚體。

我們的研究揭示了立枯絲核菌作為生物催化劑，將牛蒡子苷轉換成高產量的牛蒡子苷元與牛蒡子苷元二聚體。目前的研究將是一個很好的方法來大規模生產提供藥用和生物活性試驗的牛蒡子苷元二聚體。上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

Claims

一種製備牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)的方法，包含步驟：(1)將牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養，過濾後經減壓濃縮，得到粗萃物；(2)將步驟(1)所得粗萃物以乙酸乙酯與水進行萃取，經減壓濃縮得到乙酸乙酯分畫層水分畫層；(3)將步驟(2)乙酸乙酯分畫層以層析方法分離，以氯仿與甲醇混合比例300：1為溶劑漸增極性沖提、濃縮，分離得到化合物牛蒡子苷元(arctigenin)及牛蒡子苷元二聚體(diarctigenin)。
如申請專利範圍第1項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該步驟(1)牛蒡子苷先溶於二甲基亞碸。
如申請專利範圍第1項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該步驟(1)立枯絲核菌培養在馬鈴薯葡萄瓊脂上三天。
如申請專利範圍第3項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該立枯絲核菌培養在馬鈴薯葡萄瓊脂上，進一步切取菌絲尖端相同大小的菌塊，移至培養液中，與牛蒡子苷一起培養。
如申請專利範圍第1項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該步驟(1)牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養七日。
如申請專利範圍第1項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該步驟(1)牛蒡子苷(arctiin)加入含立枯絲核菌(Rhizoctonia solani )的培養液中培養後，可進一步加入甲醇使立枯絲核菌死亡。
如申請專利範圍第1項之製備牛蒡子苷元二聚體的方法，其中該步驟(3)牛蒡子苷元，可進一步利用層析分離，以正己烷與乙酸乙酯以200：1的比例混合溶劑分離純化。