TWI488863B - 去醣基化之血球凝集素蛋白及其製備方法 - Google Patents

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Description

去醣基化之血球凝集素蛋白及其製備方法
本發明係關於一種流感病毒的血球凝集素蛋白，且特別有關於一種可誘導產生交叉保護與中和性反應的去醣基化血球凝集素蛋白。
流感是一種世界性的疾病，每年皆會季節性的流行。流感病毒的宿主範圍很廣泛，從鳥類到各種哺乳動物，包括人類、家禽、豬和馬(Kalthoff et al.,2010)。流感病毒屬於RNA病毒，正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)，且可分成A、B與C型。A型流感的基因含有8個負股RNA片段，其編碼11個病毒蛋白，包括3個表面蛋白：血球凝集素蛋白(hemagglutinin,HA)、神經氨酸酶(NA)與基質蛋白(M)，以及RNA聚合酶(PB1、PB2、PA)、核蛋白(NP)、非結構蛋白(NS1、NS2)與新發現的凋亡前PB1-F2蛋白(Viswanathan et al.,2010)。
高病原性禽流感(HPAI)可造成大量禽類死亡及在人類中造成高死亡率，而2009年爆發之流行性感冒更造成人類嚴重的威脅。由於血球凝集素(HA)在流感病毒演化過程中具高度變異性，對於發展可以對抗多種類流感病毒的多價型疫苗而言仍是一大挑戰。
由於病毒個體之間變異性很大，而目前一般型預防流感疫苗僅只能針對單一性之病毒，且就算單一種類之純品系病毒出現變異型之機會也相當高。
傳統上，依據血球凝集素的結構，可分成2個部 分，分別為球狀部(globular head)與軀幹部(stem region)。然而，目前所開發多價型疫苗仍然以重新修飾血球凝集素球狀部之醣基化為開發主軸，但存在以下缺點：(1)球狀部並未尋找到高度保守之醣基化位置，因此疫苗之廣泛性效果不佳；(2)因此，球狀部去醣基化大多以限制酶切割球狀部上之醣基，而將醣基之碳鏈切得越短，多價型疫苗之效果越佳，但能將其醣基之碳鏈切除幾個仍是目前最大之障礙。
由於流感病毒具有高度變異性，對於發展可以對抗多種類流感病毒的多價型疫苗而言仍是一大挑戰。先前技術均為探討血凝素球狀部之醣基化位置，但由於球狀部之醣基化位置變異性過高，因此很難比對出在球狀部之高度保留性位置。
有鑑於此，本發明係關於開發一種可誘導產生交叉保護與中和性反應的去醣基化血球凝集素，以解決目前多價型流感疫苗效果不佳的問題。
本發明提供一種去醣基化血球凝集素，其軀幹部之醣基化位置被去除。
在本發明一實施例中，其中該血球凝集素為流感病毒之血球凝集素。
在本發明一實施例中，其中該流感病毒包括H5N1禽流感病毒與pH1N1新興流感病毒。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H5N1禽流感病毒的第19、20、及34個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H5N1禽流感病毒的第484個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H1N1新興流感病毒的第32、33及45個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置 包括H1N1新興流感病毒的第503個胺基酸。
本發明另提供一種去醣基化血球凝集素的製備方法，包括：1)提供一流感病毒血球凝集素序列；2)一定義步驟，依據該流感病毒血球凝集素序列之結構區分一球狀部和一軀幹部；3)一辨識步驟，辨識該軀幹部之一醣基化位置4)一去除醣基化步驟，利用一去除方法去除該些醣基化位置，其中該去除方法包括將該些軀幹部醣基化位置之胺基酸進行置換、取代或修飾；其中，該軀幹部去醣基化之血球凝集素具有不同亞型流感病毒之特徵，可為該多價型流感疫苗之主要成份。
在本發明一實施例中，其中該禽流感病毒血球凝集素序列包括H5N1禽流感病毒序列與pH1N1新興流感病毒序列。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H5N1禽流感病毒的第19、20、及34個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H5N1禽流感病毒的第484個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H1N1新興流感病毒的第32、33及45個胺基酸。
在本發明一實施例中，其中該軀幹部醣基化位置包括H1N1新興流感病毒的第503個胺基酸。
本發明更提供一種多價型流感疫苗，包括本發明之去醣基化血球凝集素，以及一藥學上可接受之佐劑或載體。
第1圖顯示流感病毒的軀幹部位置及N-醣基(N-linked glycans)。
第2圖顯示重組HA醣蛋白的設計。
第3A-3D圖顯示野生型HA與軀幹部去醣基化HA分子量上的差異。
第4A-4D圖顯示野生型HA與去醣基化HA所刺激的抗-H5N1與抗-H1N1 IgG力價。
第5A-5H圖顯示軀幹部去醣基化H5 HA免疫血清對不同分支(clades)H5N1pp病毒的中和活性與IC50。
第6A-6B圖顯示軀幹部去醣基化H5 HA免疫血清對pH1N1及H3N2病毒的中和活性。
第6C圖顯示軀幹部去醣基化H5 HA免疫血清亦能抑制重組H7HA蛋白的血球凝集能力。
第7A-7D圖顯示軀幹部去醣基化H1 HA免疫血清對pH1N1，H3N2病毒與H5N1pp病毒的中和活性與IC50。
第7E圖顯示軀幹部去醣基化H1 HA免疫血清亦能抑制重組H7HA蛋白的血球凝集能力。
本發明係提供一種去醣基化血球凝集素，其軀幹部之醣基化位置被去除。
本發明中所述之“血球凝集素(Hemagglutinin，以下簡稱HA)”屬於同源三聚體第I型穿膜醣蛋白，且其是流感病毒的主要套膜(envelope)蛋白，使病毒的病毒體可進入宿主細胞(Skehel and Wiley,2000)。HA前驅物為HA0，在內質網中形成三聚體，且透過高基氏體運送至細胞表面。HA0可被切割(cleavage)分為HA1與HA2，且此切割是膜 融合與病毒感染所必須的過程(Garten and Klenk,1999；Skehel and Wiley,2000)。依據HA的結構，可區分成2個部分，分別為球狀部(globular head)與軀幹部(stem region)。
在抗原變異過程中，許多胺基酸序列改變且發生蛋白醣基化。A型流感之HA的N-端醣基透過N-糖苷與保守之醣基化區Asn-X-Ser/Thr的天冬醯胺(Asn)連接，其中X可為非脯胺酸(Proline)的任何胺基酸(Kornfeld and Kornfeld,1985)。
HA球狀部醣基的位置與數目在各流感病毒之間的差異極大(Abe et al.,2004；Wagner et al.,2000)，也因此利用去球狀部醣基化HA所開發之多價型流感疫苗於預防廣泛型流行性感冒時並未獲得顯著之預防效果。
因此，本發明係題通一種軀幹部去醣基化HA，該軀幹部去醣基化HA於實施例中顯示出具有廣泛性之預防效果。
應注意的是，本發明係去除HA軀幹部之至少一個醣基化位置，以獲得本發明之去醣基化血球凝集素。
本發明中所述之“醣基化位置”係指可連接一或多個醣基的胺基酸位置。
在本發明中，醣基化位置的移除數目並無特別限制，可為1或1個以上，例如，2、3、4、5個以上。
醣基化位置的去除方式並無特別限制，可使用任何適當的基因工程移除醣基化的胺基酸，包括，但不限於，胺基酸的刪除、突變、置換、修飾等，使此處胺基酸無法與醣基連接。本技術領域人士自可依照不同的需求選擇適當的方法進行。本發明之“去醣基化”，即代表此位置已無法與醣基產生連接。
在本發明中，較佳去除具高度保留性的醣基化位置。
在一實施例中，軀幹部之醣基化移除位置可選擇 H5N1禽流感病毒的第19、20、34及/或第484個胺基酸，例如，選擇H5N1禽流感病毒的第19、20及34個胺基酸，或選擇H5N1禽流感病毒的第484個胺基酸。
在另一實施例中，軀幹部之醣基化胺基酸移除位置可選擇pH1N1新興流感病毒的第32、33、45及/或第503個胺基酸，例如，選擇pH1N1新興流感病毒的第32、33及45個胺基酸，或選擇pH1N1新興流感病毒的第503個胺基酸。第1圖顯示pH1N1與H5N1病毒之血凝素軀幹部以及本發明實施例所選定的軀幹部之去醣基化位置。
在本發明一較佳實施例中，軀幹部之醣基化移除位置為pH1N1新興流感病毒的第503個胺基酸。
本發明之去醣基化血球凝集素可在人體或動物體內誘發流感病毒的中和抗體，且可對不同的流感病毒產生交叉反應，因此可同時對多種流感病毒產生廣泛性的保護效果。另外，在小鼠攻毒試驗中，亦證實本發明之去醣基化血球凝集素可有效地保護動物抵抗同種病毒的感染。
本發明另提供一種去醣基化血球凝集素的製備方法，包括：1)提供一流感病毒血球凝集素序列；2)一定義步驟，依據結構區分該流感病毒血球凝集素序列之一球狀部和一軀幹部；3)一辨識步驟，辨識該軀幹部之一醣基化位置4)一去除醣基化步驟，利用一去除方法去除該些醣基化位置，其中該去除方法包括將該些軀幹部醣基化位置之胺基酸進行置換、取代或修飾；其中，該軀幹部去醣基化之血球凝集素具有不同亞型流感病毒之特徵，可為該多價型流感疫苗之主要成份。
在本發明之方法中，最重要的步驟為定義和辨識流感病毒的HA序列，較佳為HA軀幹部的序列，並找出具高度保留性的HA軀幹部醣化位置。
此高度保留性HA軀幹部醣化位置的數目並無特別限制，至少為1個以上，例如，可為2、3、4、5個以上。
接著，利用基因工程等方式，將此高度保留性 HA軀幹部醣化位置的胺基酸去除，使此位置無法進行醣基化，以獲得去醣基化的HA。去除方式無特別限制，可使用任何習知的方法將軀幹部醣化位置去除。
本發明更提供一種流感疫苗，包括本發明之去醣 基化血球凝集素(HA)，以及一藥學上可接受之佐劑或載體。
本發明之流感疫苗包括抗原與佐劑。抗原即為本 發明之去醣基化HA，此去醣基化HA可於動物細胞、昆蟲細胞、低等真核生物或原核生物中表現。動物細胞可包括猴COS細胞、CHO細胞、人類腎臟293細胞、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、3T3細胞、CV-1細胞、其他經轉殖的靈長類細胞、正常的雙套細胞、由體外培養之原生組織衍生細胞株、原生移殖體、HeLa細胞、老鼠L細胞、BHK、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。昆蟲細胞可為Sf9細胞、Sf21細胞或Hi-5細胞。低等真核生物包括酵母菌，如Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces strains、Candida或任何可表現異源性蛋白的酵母菌。原核生物可包括Escherichia coli 、Bacillus subtilis 、Salmonella typhimurium 、或任何可表現異源性蛋白的細菌。
本發明並無包含tween80以及triton X-100由上 述可知，由於本發明之去醣基化HA可在人體或動物體內誘發抵抗流感病毒的中和抗體，對不同的流感病毒產生交叉反應，因此，本發明之含有以去醣基化HA作為抗原的流感疫苗，具有良好的廣效型效果。
【實施例】
1.去醣基化血球凝集素蛋白(HA)的製備
a. 質體的設計與製備
利用NetNGlyc Server預測可能的N-醣基 (N-linked glycan)。進行點突變移除H5N1(A/Thailand/KAN-1 /2004)HA與2009年流行的H1N1(A/Texas/05/2009)的HA N-醣基。利用以丙胺酸(Ala，A)取代天冬胺酸(Asn，N)來移除N-醣基化位置，以去除醣基化序列位址(motif)Asn-X-Ser/Thr(即H5N1(KAN-1)HA Asn 19、20、34[NNSTEQVDTIMEKNVT→AASTEQVDTIMEKAVT])，pH1N1(Texas)HA Asn 32、33、45[NNSTDTVDTVLEKNVT→AASTDTVDTVLEKAVT]，H5N1(KAN-1)HA Asn 484[NGT→AGT]，pH1N1(Texas)HA Asn 503[NGT→AGT]，以下簡稱為“H5 N19,20,34A”、“H5 N484A”、“H1 N32,33,45A”、“H1 N503A”，如圖2所示。
b. 質體的製備
設計含有上述突變位點的引子(primer)，並以野 生型HA作為模板，進行PCR反應，反應結束後以35μl的ddH2 O洗湜PCR產物，接著與4μl 10x限制酶緩衝液及1μl的DpnI限制酶混合，於37℃反應1.5小時。將經限制酶處理的產物添加至100μl的TOP 10勝任細胞中(E.coli )。將樣本置於冰上30分鐘，並以42℃熱休克處理30秒後，立即置於冰上2分鐘。將E.coli 加至LB培養液中並塗佈於培養皿上(含有0.1%的胺基青黴素(Ampicillin))。選取菌落並利用高速質體套組(High-Speed Plasmid kit，Geneaid)分離、純化質體。
c. 重組bacmid的製備
在獲得含突變點HA的pFastBac載體菌落後，添加1μl的質體DNA至100μl的E.coli DH10Bac勝任細胞中，使質體DNA構築至桿狀病毒載體(以下簡稱bacmid)中。將樣本置於冰上35分鐘，並以42℃熱處理45秒。接著，將轉染的E.coil 加至1ml的LB培養液中，於37℃培養4小時。最後，取30μl的E.coli 菌液塗佈於培養皿上(含有0.1%卡 那霉素(Kanamycin)、健大黴素(Gentamycin)、四環黴素(Tetracycline)、X-gal與IPTG)於37℃培養2天後，選取含有重組bacmid的白色菌落。
c. 轉染
使用TurbofectTM in vitro 轉染試劑(Thermo)進 行轉染。在實驗之前，先將1x106 cells/well的細胞置於6孔盤中1小時使其貼附。將3-5μg的bacmid DNA與8μl TurbofectTM 試劑及92μl的OPTI-MEM(Gibco)混合，並置於室溫15分鐘。接著，將樣本接種至孔洞中並進行轉染4.5-6小時。移除上清液，並加入2ml含有5% FBS的SF900TM SFM(Gibco)培養液，在28℃培養箱中培養3-5天。
d. 去醣基化之血球凝集素蛋白(HA)的製備與純化
製備含重組bacmid DNA的第一與第二代桿狀病毒(baculovirus)。將15ml的第二代桿狀病毒加至600-1000ml的Sf9細胞，且在28℃下培養48小時。將感染後的細胞與培養基以2,000rpm離心30分鐘，並收集上清液。
將含有水溶性HA重組蛋白的上清液以Amicon Millipore濃縮裝置進行濃縮至35ml左右。將pH值調整至7.35-7.4，且以10,000rpm離心10分鐘。獲得上清液並與Ni-NTA樹酯(resin)反應6小時，或於4℃下反應隔夜。之後，收集含有重組HA蛋白的樹酯(resin)並通過ATKA PrimeTM 純化系統，利用緩衝液A和緩衝液B(含有5%甘油、30mM Tris-HCL、50mM NaCl與500mM咪唑(imidazole))進行洗湜及回收樣本。最後，收集含有HA重組蛋白的洗湜液並將體積濃縮至1ml。以PBS透析純化的HA蛋白並儲存於4℃或-20℃下。
2. 去醣基化血球凝集素蛋白(HA)的分析
a. SDS-PAGE
使用SDS-PAGE電泳(Tris-glycine SDS-polyacrylamide Gel Electrophoresis)分析蛋白質。將5%的焦集膠體(3.4ml的H2 O+830μl的30%丙烯醯胺混合物、630μl的1M Tris(pH 6.8)、50μl的10% SDS、50μl的10%過硫酸胺與5μl的TEMED)作為上層，12%的分離膠體(3.3ml的H2 O+4ml的30%丙烯醯胺混合物、2.5ml的1M Tris(pH 8.8)、100μl的10% SDS、100μl的10%過硫酸胺與10μl的TEMED)作為下層。樣本在150V的電壓下進行電泳2小時。在電泳後，以0.25%的考馬斯亮藍(Coomassie Briliant Blue R-250，Sigma)將SDS-PAGE膠體染色隔夜。接著，使用去染緩衝液(300ml的甲醇、100ml的醋酸與600ml的dH2 O)去除染劑。參照第3A圖，野生型H5的分子量約72 kDa，且去醣基化的“H5 N19,20,34A”與“H5 N484A”的分子量則稍微小於72 kDa。參照第3B圖，野生型H1包括3個主要的bands，分別為HA0、HA1與HA2。“H1 N503A”與野生型H1類似，包括3個主要的bands，其中“H1 N503A”的HA2分子量稍微小於野生型H1的HA2，表示“H1 N503A”已去醣基化。然而，“H1 N32,33,45A”只有1個帶(bands)，其分子量略小於72kDa。
b. 西方墨點法
將1-2μg的HA蛋白質與含5μl含DTT的追蹤染 劑(loading dye)以3：1混合，並以沸水加熱5分鐘。接著將樣本以1.5μl的PNGaseF處理，並與2μl的G7緩衝液、2μl的10%NP-40於37℃下混合2小時。將溶液添加至SDS-PAGE膠體中。電泳後，將膠體以135V的電壓轉染至硝基纖維素(NC)膜上，轉染過程為35分鐘。以5%的牛奶封阻NC膜2小時或隔夜。之後，加入利用TBST緩衝液以1：5000比例稀釋的抗-His共軛HRP抗體(GeneTex)，反應1小時。最後，進行呈色。PNGase F可去除所有的N-醣基，在經PNGase F處理後，“H5 N19,20,34A”與“H5 N484A”的分子量會稍微減少，與經PNGase F處理之野生型H5 WT的分子量相同(第3C圖)。 同樣地，在經PNGase F處理後，“H1 N32,33,45A”與“H1 N503A” 的分子量也降低(第3D圖)。
3. 去醣基化血球凝集素蛋白(HA)的免疫試驗
a. 小鼠免疫
由國家實驗動物中心購買6-8週齡的BALB/c小鼠。每組5隻，以肌肉注射20μg的重組蛋白(rH5HA WT、rH5HA N19,20,34A、rH5HA N484A、rH1HA WT、rH1HA N32,33,45A或rH1HA N503A)與10μg的CpG/10% PELC進行免疫。在第二次免疫後14天，收集血液樣本。將血清樣本置於56℃下30分鐘進行補體去活化，並儲存於-20℃，供後續實驗使用。
b. HA特異性IgG力價
分別將2μg/ml純化的rH5HA WT或rH1HA WT蛋白塗佈於96孔盤中隔夜後，利用ELISA封阻緩衝液(PBS與1% BSA)進行封阻1小時，接著，加入序列稀釋的樣本(rH5HA WT、rH5HA N19,20,34A、rH5HA N484A；rH1HA WT、rH1HA N32,33,45A或rH1HA N503A)，反應1小時後，以PBST(PBS與0.05% Tween-20)清洗。加入抗-小鼠IgG共軛HRP(1：30000)(GeneTex)。最後，加入TMB於黑暗中反應15分鐘，加入2N H2 SO4 溶液中止ELISA反應。以分光光度儀偵測OD450nm 數值。參照第4A-4B圖，相較於以野生型H5與H1蛋白(H5 WT、H1 WT)，以驅幹部去醣基化HA免疫可產生較高的整體IgG，但不顯著。進一步分析交叉反應發現，“H5HA N19,20,34A”與“H5HA N484A”的IgG交叉反應力價明顯大於野生型(第4C圖)。同樣地，H1 N503A亦可產生比野生型更大的交叉反應IgG(第4D圖)。
c. H5 HAs的H5N1中和抗體力價
於10公分的培養皿置入4x106 的HEK 293A細胞，且共轉染pNL luc E- R- ，含編碼HA(A/Thailand/1(KAN-1)/2004)的pcDNA 3.1(+)，與含編碼NA(A/Vietnam/1203/2004)的pcDNA 3.1(+)。於37℃下轉染48小時後，收集假型病毒 顆粒(pseudotyped viruses particles)，並以100kDa的濾膜(MILLPORE)進行濃縮。利用偵測螢光酶(luciferase)的活性來確定各分支H5N1假型病毒(H5N1pp)(KAN-1、Indonesia、Qinghai、Anhui)的力價。將序列稀釋的血清與50 TCID50 的H5pp各以50μl等體積混合，於37℃下反應1小時。接著，將上述混合物加至1.5x104 /well MDCK細胞置於96孔盤，在37℃下培養48小時。之後，以PBS清洗，再以50μl的瓦解緩衝液(lysis buffer)浸潤5分鐘。利用將H5N1假型病毒轉染至MDCK細胞後減少的螢光酶來判讀中和抗體力價與logIC50。參照第5A-5D圖，H5N1病毒的中和抗體呈現劑量依賴性(dose-dependent)，且由第5E-5H圖可知，相較於野生型H5，去醣基化的H5 N19,20,34A及H5 N484A抗原可獲得較高的中和抗體；其中相較於野生型H5HA,H5 N19,20,34A更可顯著提高同源及異源型的中和性抗體(第5E和5G圖示)。
d. H5 HAs的pH1N1中和抗體力價
本實施例利用病毒菌斑減少中和試驗(Plagues reduction neutralization test，PRNT)分析血清的中和抗體力價。
首先，將6x105 /well的MDCK細胞接種於6孔 盤中。將序列稀釋的血清與相同體積的pH1N1病毒(PR8x Texas 2009)混合並於37℃反應一小時，其中病毒的力價為在50μl的病毒稀釋液中含有50 PFU。接著，將血清/病毒混合物感染6孔盤中的MDCK細胞。37℃下反應1小時後，移除上清液，並以PBS緩衝液清洗2次。將含有0.5%瓊脂的MEM-α加至6孔盤中，於37℃，5% CO2 的環境下培養2-3天，且以2%結晶紫溶液染色以計數菌斑量(plagues)。參照第6A、6B圖，rH5HA蛋白可刺激針對異源亞型(heterosubtypic)pH1N1及H3N2病毒的中和抗體，但軀幹部去醣基化組別(H5 N484A及H5 N19,20,34A)並無產生較高的中和性抗體。
e. H5 HAs對H7HA的血球凝集抑制效應(Hemagglutination inhibition,HAI)
本實施例是使去醣基化H5HAs蛋白免疫後的血清和受體破壞酵素酶(Receptor-destroying enzyme,RDE)以1：3的比例在37℃下作用18-20小時，去除非專一性可能影響血球凝集的受體干擾，接著利用56℃作用30分鐘去除RDE的活性。接著，將經過RDE處理的血清進行序列稀釋，並使其與含有4HA Unit/25ul的重組H7HA(A/shanghai/2/2013(H7N9))蛋白在室溫下作用30分鐘，再使其與0.5%火雞紅血球反應，室溫下作用30分鐘，觀察其血球凝集的現象。參照第6C圖，施打疫苗H5HA蛋白後皆可達到WHO所規範的保護能力(HAI≧40)。但相較於野生型H5HA，去醣基化的H5HA，尤其是H5 N19,20,34A具有更強的抑制血球凝集能力，顯示此實施例對於異源型且不同族系(Group)的流感病毒似乎可達到更廣泛的跨族系保護效果。
f. H1 HAs的pH1N1中和抗體力價
本實施例與實施例3d類似，僅將去醣基化H5HAs蛋白置換為去醣基化H1HAs蛋白。參照第7A圖，H1 N503A免疫組中血清對同亞型pH1N1的中和活性呈現劑量依賴性。且結果顯示相較於野生型H1HA，軀幹部去醣基化H1 N503A及H1 N32,33,45A可產生較多的針對同源的中和抗體(圖7A)。
g. H1 HAs的H5N1中和抗體力價
本實施例與實施例3c類似，僅將去醣基化H5HAs蛋白置換為H1HAs蛋白。參照第7C圖，H1 N32,33,45A與H1 N503A免疫組中血清對異源亞型H5N1pp的中和活性呈現劑量依賴性。參照第7D圖，H1 N503A免疫組具有比H1 N32,33,45A免疫組(2.758)更高的IC50(431.3)。
h. H1 HAs的H3N2中和抗體力價
本實施例與實施例3f類似，僅將pH1N1病毒 (PR8x Texas2009)置換為H3N2(Udorn)病毒。參照第7B圖，H1 N503A免疫組中血清對異源亞型H3N2病毒的中和活性亦呈現劑量依賴性。然而針對異源亞型H3N2病毒中和抗體的生成，組間則無顯著差異性(圖7B)。
i. H1 HAs對H7HA的血球凝集抑制效應(HAI)本實施例與實施例3e類似，僅將去醣基化H5HAs蛋白置換為H1HAs蛋白。參照第7E圖，H1 N32,33,45A具有更強的抑制血球凝集能力，顯示此實施例對於異源型且不同族系的流感病毒似乎可達到更廣泛的跨族系保護效果。
由實施例3c-3i可知，驅幹部去醣基化H5 N19,20,34A可產生針對同源不同分支(clades)H5N1病毒株之較強的中和抗體，並具有抑制跨族系異源型H7HA血球凝集的能力。然而，軀幹部去醣基化H1 N503A及H1 N32,33,45A亦皆可產生較多的針對同源pH1N1病毒的中和抗體，其中H1 N503A更可產生針對異源亞型H5N1pp的中和抗體，可有效中和病毒；H1 N32,33,45A則具有更高的抑制跨族系異源型H7HA血球凝集的能力。
所有說明書中所揭示之發明技術特點可以任意方式組合。說明書中揭示之每一技術特點可以提供相同、等同或相似目的之其他方式替換。因此，除非另有特別說明，文中所有揭示之特點均只是等同或相似特點之一般系列之實例。
由上述可知，熟習此技藝者能輕易地了解本發明之必要特徵，在不脫離其精神與範圍之下能就本發明做許多改變與調整以應用於不同用途與條件。
<110> 清華大學
<120> 去醣基化之血球凝集素蛋白及其製備方法
<150>
<151>
<160>
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 576
<212> PRT
<213> H5N1 H5HA(A/Thailand/KAN-1/2004)
<400> 1
<210> 1
<211> 582
<212> PRT
<213>： pH1N1 H1HA(A/Texas/05/2009)
<400> 2

Claims (13)

  1. 一種去醣基化血球凝集素，包含：一HA1模組和一HA2模組，而該HA1模組和該HA2模組依結構可區分為一軀幹部和一球狀部；其中位於該軀幹部之該HA1模組和該HA2模組醣基化胺基酸位置之醣基被去除，使該胺基酸位置無法與醣基產生連接。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中該血球凝集素為流感病毒之血球凝集素。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中該軀幹部去醣基化位置之胺基酸為Asn。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中該流感病毒包括H5N1禽流感病毒與pH1N1新興流感病毒。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中H5N1禽流感病毒之該軀幹部為該HA1模組之第1-57個胺基酸和該HA2模組之第343-527個胺基酸。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中該醣基化胺基酸位置包括H5N1禽流感病毒的軀幹部之該HA1模組第19、20、及34個胺基酸或/和該HA2模組第484個胺基酸。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中H1N1新興流感病毒之該軀幹部為該HA1模組之第1-63個胺基酸和該HA2模組之第350-553個胺基酸。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之去醣基化血球凝集素，其中該醣基化胺基酸位置包括pH1N1新興流感病毒的軀幹部之該HA1模組第32、33及45個胺基酸或/和該HA2模組第503個胺基酸。
  9. 一種去醣基化血球凝集素的製備方法，包括：提供一流感病毒血球凝集素序列；一定義步驟，依據結構區分該流感病毒血球凝集素序列之一球狀部和一軀幹部；一辨識步驟，辨識該軀幹部之一醣基化位置；一去除醣基化步驟，利用一去除方法去除該些醣基化位置，其中該去除方法包括將該些軀幹部醣基化位置之胺基酸進行置換、取代或修飾，使該胺基酸無法與醣基產生連接；其中，該軀幹部去醣基化之血球凝集素具有不同亞型流感病毒之特徵，可為該多價型流感疫苗之主要成份。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之去醣基化血球凝集素的製備方法，其中該流感病毒血球凝集素序列包括H5N1禽流感病毒序列與pH1N1新興流感病毒序列。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之去醣基化血球凝集素的製備方法，其中該辨識步驟中之該軀幹部之該HA1模組之該醣基化位置包括H5N1禽流感病毒的第19、20、及34個 胺基酸或/和該軀幹部之該HA2模組之該醣基化胺基酸位置包括H5N1禽流感病毒的第484個胺基酸。
  12. 如申請專利範圍第10項所述之去醣基化血球凝集素的製備方法，其中該辨識步驟中之該軀幹部之該HA1模組之該醣基化胺基酸位置包括pH1N1新興流感病毒的第32、33及45個胺基酸或/和該HA2模組之該醣基化胺基酸位置包括H1N1新興流感病毒的第503個胺基酸。
  13. 一種多價型之流感疫苗，包括如申請專利範圍第1項所製造之去醣基化血球凝集素，以及一藥學上可接受之佐劑或載體。
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年03月19日，Harris, A.K., et al.,"Structure and Accessibility of HA Trimers on Intact 2009 H1N1 Pandemic Influenza Virus to Stem Region-Specific Neutralizing Antibodies", PNAS, Mar. 2013, Vol.110, No.12, P.4592-4597. *

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