TWI480287B - 與蘭科植物花型調控有關的基因 - Google Patents

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TWI480287B
TWI480287B TW102137217A TW102137217A TWI480287B TW I480287 B TWI480287 B TW I480287B TW 102137217 A TW102137217 A TW 102137217A TW 102137217 A TW102137217 A TW 102137217A TW I480287 B TWI480287 B TW I480287B
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Description

與蘭科植物花型調控有關的基因
本發明有關於一種來自蝴蝶蘭的新穎基因，而此新穎基因與蘭科植物花型的調控有關。
蘭科植物，俗稱蘭花或胡姬花，為開花植物中種類最多，且生物多樣性最廣的一科。蘭科植物的花型優雅且其開花期長達一至四個月，因而相當受到社會大眾的喜愛並廣泛地作為觀賞用花。此外，蘭科植物亦為我國台灣外銷數量最多的花卉種類之一。
多數的開花植物，其花朵由外而內依序為萼片(sepal)、花瓣(petal)、雄蕊(stamen)及雌蕊(pistil)。依分子生物學的觀點來看，這些開花植物的花朵是遵照所謂「ABC模式(ABC model)」發育而成的。A群基因的單獨表現可控制萼片的發育；A群基因與B群基因的共同表現可控制花瓣的發育；B群基因與C群基因的共同表現可控制雄蕊的發育；C群基因的單獨表現可控制雌蕊的發育(請參閱Plant Mol Biol.2000；42(1)：115-49)。
蘭科植物雖然屬於開花植物，但其花朵的發育機制相當複雜，非「ABC模式」所能完全解釋的。一般而言，蘭科植物的花型至少可 略分為以下三類型：野生型、大唇瓣型及三唇瓣型。野生型花型的蘭科植物(如第1A至1C圖左列所示)，其花朵有三枚花瓣、三枚萼片及一個蕊柱(gynandrium)，於這些花瓣中，上側二枚為相互對稱的並稱為翼瓣(wing)，下側一枚不同於翼瓣並稱為唇瓣(labellum)。大唇瓣型花型的蘭科植物(如第1C圖右列所示)，相較於野生型花型者，其花朵的唇瓣已翼瓣化(petal-like)。三唇瓣型花型的蘭科植物(如第1A及1B圖右列所示)，相較於野生型花型者，其花朵的翼瓣或萼片已唇瓣化(labellum-like)。然而，花型可能會決定蘭科植物在市場上的經濟價值。而且，培育蘭科植物通常需費一至三年不等，通常於整個培育期間的晚期才能確知其花型。因此，若能於整個培育期間的早期先行預測蘭科植物的花型，從中淘汰非市場需要花型者，確實可減少培育期間中所需投入的時間、人力或金錢等成本。
於是，在第一方面，本發明提出一種單離的核酸分子，其包含：一選自由以下所組成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；(ii)編碼SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10之胺基酸序列的核苷酸序列；及(iii)與(i)或(ii)之序列互補的核苷酸序列。
在第二方面，本發明提出一種單離的蛋白質，其為前述核酸分子所編碼的。
在第三方面，本發明提出一種重組載體，其包含：前述核酸分子。
在第四方面，本發明提出一種經轉殖的細胞，其包含：前述載體。
在第五方面，本發明提出一種經轉殖的組織，其包含：前述載體。
在第六方面，本發明提出一種調控蘭科植物花型的方法，其包含以下步驟：改變一含前述核酸分子的轉錄本於蘭科植物中的含量。
在第七方面，本發明提出一種調控蘭科值物花型的方法，其包含以下步驟：改變前述蛋白質於蘭科植物中的含量。
在第八方面，本發明提出一種生產轉殖蘭科植物的方法，其包含以下步驟：改變一含前述核酸分子的轉錄本於一蘭科植物組織中的含量；及培育蘭科植物組織，以得到轉殖蘭科植物。
在第九方面，本發明提出一種預測蘭科植物花型的方法，其包含以下步驟：提供一取自蘭科植物的生物樣本；測定一含前述核酸分子的轉錄本於生物樣本中的含量；及依據轉錄本的含量判斷蘭科植物的花型。
在第十方面，本發明提出一種預測蘭科植物花型的方法，其包含以下步驟：提供一取自蘭科植物的生物樣本；測定前述蛋白質於生物樣本中的含量；及依據蛋白質的含量判斷蘭科植物的花型。
在第十一方面，本發明提出一種引子對，其包含：一具SEQ ID NO：13之核苷酸序列的正向引子；及一具SEQ ID NO：14之核苷酸序列的反向引子。
在第十二方面，本發明提出一種引子對，其包含：一具SEQ ID NO：15之核苷酸序列的正向引子；及一具SEQ ID NO：16之核苷酸序列 的反向引子。
第1A圖為照片圖，以區別野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵、及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵。
第1B圖為照片圖，以區別野生型花型Phalaenopsis amabilis的花朵、及三唇瓣型花型Phalaenopsis amabilis的花朵。
第1C圖為照片圖，以區別野生型花型Phalaenopsis‘98201’的花朵、及大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’的花朵。
第2圖為BLAST結果圖，以比對蝴蝶蘭AGL6基因之野生型蛋白質、與其他物種基因之蛋白質。
第3圖為親緣關係圖，以顯示蝴蝶蘭AGL6基因之野生型蛋白質、與其他物種基因之蛋白質的關係。
第4A圖為定量反轉錄PCR結果圖，以比較蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之各花器中的表現量、與其於三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之各花器中的表現量；圖中簡寫為：NS，野生型花型蝴蝶蘭的萼片；NP，野生型花型蝴蝶蘭的翼瓣；NL，野生型花型蝴蝶蘭的唇瓣；NC，野生型花型蝴蝶蘭的蕊柱；PS，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的萼片；PP，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的翼瓣；PL，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的唇瓣；PC，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的蕊柱。
第4B圖為定量反轉錄PCR結果圖，以比較蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis amabilis之各花器中的表現量、與其於三唇瓣型花型Phalaenopsis amabilis之各花器中的表現量；圖中簡寫為：NSU，野生型花型蝴蝶蘭的上萼片；NSD，野生型花型蝴蝶蘭的下萼片；NP，野生型花型蝴蝶蘭的翼瓣；NL，野生型花型蝴蝶蘭的唇瓣；NC；野生型花型蝴蝶蘭的蕊柱；MSU，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的上萼片；MSD，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的下萼片；MP，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的翼瓣；ML，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的唇瓣；MC，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的蕊柱。
第4C圖為定量反轉錄PCR結果圖，以比較蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis‘98201’之各花器中的表現量、與其於大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’之各花器中的表現量；圖中簡寫：NS，野生型花型蝴蝶蘭的萼片；NP，野生型花型蝴蝶蘭的翼瓣；NL，野生型花型蝴蝶蘭的唇瓣；NC，野生型花型蝴蝶蘭的蕊柱；BPS，大唇瓣型花型蝴蝶蘭的萼片；BPP，大唇瓣型花型蝴蝶蘭的翼瓣；BPL，大唇瓣型花型蝴蝶蘭的唇瓣；BPC，大唇瓣型花型蝴蝶蘭的蕊柱。
第5A圖為照片圖，以區別野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的擬原球體、及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的擬原球體。
第5B圖為照片圖，以區別野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵、及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵。
第5C圖為定量反轉錄PCR結果圖，以比較蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本 於野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的表現量、與其於三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的表現量；圖中簡寫為：NPLB，野生型花型蝴蝶蘭的擬原球體；MPLB，三唇瓣型花型蝴蝶蘭的擬原球體。
第6圖為DNA電泳圖，以顯示蝴蝶蘭AGL6基因的野生型轉錄本、與蝴蝶蘭AGL6基因的突變型轉錄本；圖中簡寫為：WT，野生型花型Phalaenopsis‘98201’的唇瓣；Big lip，大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’的唇瓣。
第7圖為比對圖，以比較蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本、與蝴蝶蘭AGL6基因之突變型轉錄本的序列。
第8A圖為照片圖，以顯示二個野生型花型Phalaenopsis‘98201’的花朵(分別編號為WT1及WT2)、及七個大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’的花朵(分別編號為1至7)。
第8B圖為DNA電泳圖，以確認蝴蝶蘭AGL6基因於第8A圖所示蝴蝶蘭之唇瓣中的轉錄本為野生型或突變型；圖中各徑說明為：徑1，編號WT1的蝴蝶蘭；徑2，編號WT2的蝴蝶蘭；徑3，編號2的蝴蝶蘭；徑4，編號6的蝴蝶蘭；徑5，編號1的蝴蝶蘭；徑6，編號3的蝴蝶蘭；徑7，編號5的蝴蝶蘭；徑8，編號7的蝴蝶蘭；徑9，編號4的蝴蝶蘭。
本發明攸關一種新穎基因，其係自蝴蝶蘭中所鑑別出來的，且本發明人將之命名為AGL6基因。據本發明人的實驗，AGL6基因於蝴蝶蘭中表現有不同形式及/或含量的轉錄本，而透過此種表現方式可決定蝴蝶蘭的花型。
本發明之第一實施方式關於一種單離的核酸分子，此核酸分子包含：一選自由下列所組成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；(ii)編碼SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10之胺基酸序列的核苷酸序列；及(iii)與(i)或(ii)之序列互補的核苷酸序列。
首先，探討(i)提到的序列。SEQ ID NO：1的序列共有904個核苷酸，其編碼序列(coding sequence)為編號1至720核苷酸組成的序列，可編碼一240個胺基酸的胺基酸序列(SEQ ID NO：6)。SEQ ID NO：2的序列共有730個核苷酸，其編碼序列為編號1至489核苷酸組成的序列，可編碼一163個胺基酸的胺基酸序列(SEQ ID NO：7)。SEQ ID NO：3的序列共有694個核苷酸，其編碼序列為編號1至447核苷酸組成的序列，可編碼一149個胺基酸的胺基酸序列(SEQ ID NO：8)。SEQ ID NO：4的序列共有599個核苷酸，其編碼序列為編號1至93核苷酸組成的序列，可編碼一31個胺基酸的胺基酸序列(SEQ ID NO：9)。SEQ ID NO：5的序列共有574個核苷酸，其編碼序列為編號1至327核苷酸組成的序列，可編碼一109個胺基酸的胺基酸序列(SEQ ID NO：10)。而，SEQ ID NO：1至5的序列均為本發明人初次自蝴蝶蘭的cDNA庫(cDNA pool)分離的，更明確地說，SEQ ID NO：1的序列是取自於野生型花型之蝴蝶蘭或三唇瓣型花型之蝴蝶蘭的cDNA庫，SEQ ID NO：2至5的序列是取自於大唇瓣型花型之蝴蝶蘭的cDNA庫。經比對後，SEQ ID NO：2至5的序列均具有一相對於SEQ ID NO：1之序列100%同一性(identity)。由上得知：AGL6基因能於蝴蝶蘭中轉錄含SEQ ID NO：1至5之任一序列的選擇性剪切轉錄本(alternative spliced transcript)，並利用此轉錄本決定蝴蝶蘭的花型。
其次，探討(ii)提到的序列。含SEQ ID NO：1至5之任一序列的轉錄本可決定蝴蝶蘭的花型，且SEQ ID NO：1至5的序列各編碼SEQ ID NO：6至10的胺基酸序列，因此可進一步地推測：AGL6基因能於蝴蝶蘭內轉譯含SEQ ID NO：6至10之任一序列的蛋白質，而利用此蛋白質決定蝴蝶蘭的花型。據植物基因的編碼表(codon usage in plant genes)，編碼SEQ ID NO：6至10之任一序列的核苷酸序列不限於前面已提及者。理論上，SEQ ID NO：1之序列的編碼序列及其簡併序列(degenerate sequence)均可編碼SEQ NO ID：6的序列；SEQ ID NO：2之序列的編碼序列及其簡併序列均可編碼SEQ NO ID：7的序列；SEQ ID NO：3之序列的編碼序列及其簡併序列均可編碼SEQ NO ID：8的序列；SEQ ID NO：4之序列的編碼序列及其簡併序列均可編碼SEQ NO ID：9的序列；SEQ ID NO：5之序列的編碼序列及其簡併序列均可編碼SEQ NO ID：10的序列。依此，SEQ ID NO：1至5之任一序列的編碼序列或其簡併序列，係於(ii)提到之序列的範圍。
接著，探討(iii)提到的序列。可合理地理解：與(i)或(ii)之序列互補的序列同樣可實現(i)或(ii)之序列的前述生物功能(亦即，決定蝴蝶蘭的花型)。
須提出的是，本實施方式之單離的核酸分子，除了可從自然界(如：蝴蝶蘭)中分離得到外，還可透過基因工程技術(請參閱Molecular Cloning：A Laboratoy Manual，第四版)或化學合成技術(請參閱Tetrahedron Lett.1983；24(3)：245-48)製備得到。
本發明之第二實施方式關於一種單離的蛋白質，此蛋白質為第一實施方式之核酸分子所編碼的。據第一實施方式所述，此蛋白質至少可含有：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10的胺基酸序列，並可決定蝴蝶蘭的花型。
須指出的是，本實施方式之單離的蛋白質，不僅可從自然界(如蝴蝶蘭)中分離取得外，亦可採用基因工程技術(請參閱Molecular Cloning：A Laboratoy Manual，第四版)或化學合成技術(請參閱J Am Che Soc.1963；85(14)：2149-54)製備得到。
本發明之第三實施方式關於一種重組載體，此載體包含：第一實施方式之核酸分子。此載體能依其目的，如複製核酸分子或製備蛋白質，轉殖至一細胞內。另外，此載體可視情況地需要：一可操作地連結至核酸分子的啟動子，如此啟動子向上調控(up-regulate)核酸分子來加速製備蛋白質。
本發明之第四實施方式關於一種經轉殖的細胞，此細胞包含：第三實施方式之載體。此細胞可用來大量複製核酸分子或製備蛋白質，且其可以為但不限於，一原核細胞或一真核細胞；較佳地，為一蘭科植物細胞。
本發明之第五實施方式關於一種經轉殖的組織，此組織包含：第三實施方式之載體。同第四實施方式所述，此組織亦可用來大量複製核酸分子或製備蛋白質，且其可以為但不限於，一蘭科植物的種子、原球體(protocorm)或擬原球體(protocorm-like body)。
本發明之第六實施方式關於一種調控蘭科植物花型的方 法，此法包含下列步驟：改變一含第一實施方式之核酸分子的轉錄本於蘭科植物中的含量。首先，於本實施方式，蘭科植物可以為但不限於，蝴蝶蘭。其次，本實施方式之改變步驟的細節依後續實例的結果分為以下幾個層面討論：
第一、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，進行改變步驟時，可抑制轉錄本的含量至等於或小於轉錄本於一參考蘭科植物中之含量但不為無的程度，參考蘭科植物的花型為野生型。這樣一來，調控之蘭科植物的花型可能為野生型。
第二、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，進行改變步驟時，可提升轉錄本的含量至大於轉錄本於一參考蘭科植物中之含量的程度，參考蘭科植物的花型為野生型。如此一來，調控之蘭科植物的花型可能為三唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至調控的蘭科植物內，以實現提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技術領域人士慣用的，如基因槍(gene gun)、真空侵入(vacuum infiltration)、花粉管轉殖(pollen tube pathway)、或農桿菌轉殖(Agrobacterium-mediated transformation)，故不再詳述。
第三、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇 序列互補的序列為前提下，進行改變步驟時，可提升轉錄本的含量至有的程度。這麼一來，調控之蘭科植物的花型可能為大唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至調控的蘭科植物內，以完成提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技術領域人士慣用的，如基因槍、真空侵入、花粉管轉殖、或農桿菌轉殖，故不再詳述。
本發明之第七實施方式關於一種調控蘭科植物花型的方法，此法包含下列步驟：改變第二實施方式之蛋白質於蘭科植物中的含量。首先，於本實施方式，蘭科植物可以為但不限於，蝴蝶蘭。接著，本實施方式之改變步驟的細節依後續實例的結果分為以下幾個層面討論：
第一、於第二實施方式之蛋白質含有SEQ ID NO：6的胺基酸序列為前提下，操作改變步驟時，可抑制蛋白質的含量至等於或小於蛋白質於一參考蘭科植物中之含量但不為無的程度，參考蘭科植物的花型為野生型，如此調控之蘭科植物的花型可能為野生型。
第二、於第二實施方式之蛋白質含有SEQ ID NO：6的胺基酸序列為前提下，操作改變步驟時，可提升蛋白質的含量至大於蛋白質於一參考蘭科植物中之含量的程度，參考蘭科植物的花型為野生型，藉此調控之蘭科植物的花型可能為三唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至調控的蘭科植物內，以達到提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技 術領域人士慣用的，如基因槍、真空侵入、花粉管轉殖、或農桿菌轉殖，故不再詳述。
第三、於第二實施方式之蛋白質含有SEQ ID NO：7至10的任一胺基酸序列為前提下，操作改變步驟時，可提升蛋白質的含量至有的程度，據此調控之蘭科植物的花型可能為大唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至調控的蘭科植物內，以達成提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技術領域人士慣用的，如基因槍、真空侵入、花粉管轉殖、或農桿菌轉殖，故不再詳述。
本發明之第八實施方式關於一種生產轉殖蘭科植物的方法，此法包含下列步驟：改變一含第一實施方式之核酸分子的轉錄本於一蘭科植物組織中的含量；及培育蘭科植物組織，以得到轉殖蘭科植物。首先，於本實施方式，蘭科植物組織可以為但不限於，一種子、一原球體或一擬原球體，且蘭科植物可以為但不限於，蝴蝶蘭。其次，本實施方式之培育步驟為本發明所屬技術領域人士熟悉的，故不再贅述。接著，本實施方式之改變步驟的細節依後續實例的結果分為以下幾個層面討論：
第一、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，實施改變步驟時，可抑制轉錄本的含量至等於或小於轉錄本於一參考蘭科植物組織中之含量但不為無的程度，參考蘭科植物的花型為野生型。藉此，轉殖蘭科植物的花型可能為野生型。
第二、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，實施改變步驟時，可提升轉錄本的含量至大於轉錄本於一參考蘭科植物組織中之含量的程度，參考蘭科植物的花型為野生型。如此，轉殖蘭科植物的花型可能為三唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至蘭科植物組織內，以實現提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技術領域人士慣用的，如基因槍、真空侵入、花粉管轉殖、或農桿菌轉殖，故不再詳述。
第三、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，實施改變步驟時，可提升轉錄本的含量至有的程度。如此，轉殖蘭科植物的花型可能為大唇瓣型。較佳地，可轉殖第三實施方式的重組載體(於此，其核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列)至蘭科植物組織內，以完成提升含量之目的。一般而言，轉殖過程採用的手段為本發明所屬技術領域人士慣用的，如基因槍、真空侵入、花粉管轉殖、或農桿菌轉殖，故不再詳述。
本發明之第九實施方式關於一種預測蘭科植物花型的方法，此法包含下列步驟：提供一取自蘭科植物的生物樣本；測定一含第一實施方式之核酸分子的轉錄本於生物樣本中的含量；及依據轉錄本的含量 判斷蘭科植物的花型。首先，於本實施方式，生物樣本可以為但不限於，一種子、一原球體或一擬原球體，且蘭科植物可以為但不限於，蝴蝶蘭。然後，本實施方式之測定步驟可採用但不限於，定量反轉錄PCR(quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR)或北方點墨法(Northern blotting)來達到測定含量之目的。接著，本實施方式之判斷步驟的細節依後續實例的結果分為以下幾個層面討論：
第一、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：1的序列、編碼SEQ ID NO：6之胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，執行判斷步驟時，可比較轉錄本的含量、與轉錄本於一參考生物樣本中的含量，參考生物樣本是一野生型花型之蘭科植物提供的，其中當轉錄本於生物樣本中的含量等於或小於轉錄本於參考生物樣本中的含量但不為無時，預測之蘭科植物的花型可能為野生型；而，當轉錄本於生物樣本中的含量大於轉錄本於參考生物樣本中的含量時，預測之蘭科植物的花型可能為三唇瓣型。
第二、於第一實施方式之核酸分子含有SEQ ID NO：2至5的任一序列、編碼SEQ ID NO：7至10之任一胺基酸序列的序列、或與選擇序列互補的序列為前提下，執行判斷步驟時，可測定轉錄本的含量為有或無，其中當轉錄本含量為有時，預測之蘭科植物的花型可能為大唇瓣型。
本發明之第十實施方式關於一種預測蘭科植物花型的方法，此法包含下列步驟：提供一取自蘭科植物的生物樣本；測定第二實施方式之蛋白質於生物樣本中的含量；及依據蛋白質的含量判斷蘭科植物的花型。首先，於本實施方式，生物樣本可以為但不限於，一種子、一原球 體或一擬原球體，且蘭科植物可以為但不限於，蝴蝶蘭。然後，本實施方式之測定步驟可採用但不限於，酵素免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或西方點墨法(Western blotting)來達到測定含量之目的。接著，本實施方式之判斷步驟的細節依後續實例的結果分為以下幾個層面討論：
第一、於第二實施方式之蛋白質含有SEQ ID NO：6的胺基酸序列為前提下，履行判斷步驟時，可比較蛋白質的含量、與蛋白質於一參考生物樣本中的含量，參考生物樣本是一野生型花型之蘭科植物提供的，其中當蛋白質於生物樣本中的含量等於或小於蛋白質於參考生物樣本中的含量但不為無時，預測之蘭科植物的花型可能為野生型；而，當蛋白質於生物樣本中的含量大於蛋白質於參考生物樣本中的含量時，預測之蘭科植物的花型可能為三唇瓣型。
第二、於第二實施方式之蛋白質含有SEQ ID NO：7至10的任一序列為前提下，履行判斷步驟時，可測定蛋白質的含量為有或無，其中當蛋白質含量為有時，預測之蘭科植物的花型可能為大唇瓣型。
本發明之第十一實施方式關於一種引子對，此引子對包含：一具SEQ ID NO：13之核苷酸序列的正向引子；及一具SEQ ID NO：14之核苷酸序列的反向引子。正向引子與反向引子均對應SEQ ID NO：1至5之序列的部分片段，而兩者可搭配來增幅每一序列。如此一來，本實施方式的引子對可用於如第九實施方式提及的定量反轉錄PCR而測定轉錄本的含量，並可進一步地預測蘭科植物的花型。
本發明之第十二實施方式關於一種引子對，此引子對包含： 一具SEQ ID NO：15之核苷酸序列的正向引子；及一具SEQ ID NO：16之核苷酸序列的反向引子。正向引子與反向引子均對應SEQ ID NO：1至5之序列的部分片段，而兩者可搭配來增幅每一序列。這麼一來，本實施方式的引子對可用於如第九實施方式提到的定量反轉錄PCR而測定轉錄本的含量，並可進一步地預測蘭科植物的花型。
茲提出下述實例，予以詳細說明本發明的實施方式。
《實例1：蝴蝶蘭的培育》
如第1A圖所示，由左至右各自顯示野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵、及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵，可看出右列顯示者的翼瓣已唇瓣化。
如第1B圖所示，由左至右各自顯示野生型花型Phalaenopsis amabilis的花朵、及三唇瓣型花型Phalaenopsis amabilis的花朵，可看出右列顯示者的萼片已唇瓣化。
如第1C圖所示，由左至右各自顯示野生型花型Phalaenopsis‘98201’的花朵、及大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’的花朵，可看出右列顯示者的唇瓣已翼瓣化。
本實例是培育上述蝴蝶蘭於受自然光照且溫度為26至30℃的水牆溫室(屏東科技大學農園生產系提供的)，並摘取它們的花朵。
《實例2：蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本的鑑識》
取野生型花型Phalaenopsis‘98201’的花朵，並於採集其各花器後，包含萼片(又分為上萼片及下萼片)、翼瓣、唇瓣與蕊柱，依Cell Res. 2005；15：639-57揭示的萃取流程取得各花器總量RNA。
依SMART RACE cDNA Amplification套組(購自Clontech)的操作說明書，對1mg之各花器總量RNA進行反轉錄PCR，而取得一5’-RACE-Ready cDNA及一3’-RACE-Ready-cDNA。再依同一操作說明書，利用AGL6GSP1引子(SEQ ID NO：11)對5’-RACE-Ready cDNA進行PCR，而取得一5’-RACE產物，以及利用AGL6GSP2引子(SEQ ID NO：12)對3’-RACE-Ready-cDNA進行PCR，而取得一3’-RACE產物。
5’-RACE產物與3’-RACE產物各接合至pGEM-T EASY載體(購自Promega)後，將所得之接合產物轉形至E.coli INVαF中。利用藍白選篩法及PCR從菌落中篩選出具5’-RACE產物或3’-RACE產物之質體的菌株。利用AGL6eteF引子(SEQ ID NO：13)及AGL6eteR引子(SEQ ID NO：14)對質體定序，而得到蝴蝶蘭AGL6基因之野生型cDNA(SEQ ID NO：1)的序列。
由上可知，蝴蝶蘭AGL6基因的野生型轉錄本至少含有SEQ ID NO：1的序列。經DNA STAR EditseqTM expert sequence analysis軟體分析，SEQ ID NO：1的序列編碼有一240個胺基酸的序列(SEQ ID NO：6)。換言之，蝴蝶蘭AGL6基因的野生型蛋白質含有此240個胺基酸的序列。
請參照第2圖，為蝴蝶蘭AGL6基因之野生型蛋白質與其他物種基因之蛋白質的BLAST結果。依此可知，蝴蝶蘭AGL6基因的野生型蛋白質與文心蘭(Oncidium)MADS1基因的蛋白質有達90%相似性(similarity)。
請參照第3圖，為蝴蝶蘭AGL6基因之野生型蛋白質與其他 物種基因之蛋白質的親緣關係，此關係是MEGA 5的Neighbor-Joining法所建立的。由圖式發現，蝴蝶蘭AGL6基因之野生型蛋白質與文心蘭MADS1基因之蛋白質的關係最為密切。
《實例3：蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本的表現量》
本實例是利用定量反轉錄PCR測定蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於各花器中的表現量。先依SMART PCR cDNA Synthesis套組(購自Clontech)的操作說明，對1mg的各花器總量RNA進行反轉錄PCR，而得到一首股cDNA。接著，利用real-AGL6-F引子(SEQ ID NO：15)及real-AGL6-R引子(SEQ ID NO：16)對首股cDNA進行PCR來得到一蝴蝶蘭AGL6基因的野生型cDNA，與利用PhActr-F引子(SEQ ID NO：17)及PhActr-R引子(SEQ ID NO：18)對首股cDNA進行PCR來得到一Actin基因的cDNA。最後，依據兩cDNA的螢光強度取得蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本的表現量。
請參閱第4A圖，蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之唇瓣中的表現量、與其於三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之唇瓣中的表現量均可明顯地測得，但後者較前者高。
請參閱第4B圖，蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis amabilis之唇瓣中的表現量、與其於三唇瓣型花型Phalaenopsis amabilis之唇瓣中的表現量均可明顯地測得，但後者比前者高。
請參閱第4C圖，蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis‘98201’之唇瓣中的表現量、與其於大唇瓣型花型 Phalaenopsis‘NPU-1459’之唇瓣中的表現量均可明顯地測得，但前者相對於後者高。
於此，本發人據信若AGL6基因之野生型轉錄本於蝴蝶蘭之非花朵中的含量仍存在前面觀察到的現象時，AGL6基因之野生型轉錄本於蝴蝶蘭之非花朵中的含量將可作為預測蝴蝶蘭花型的依據。如第5A圖所示，由左至右分別顯示野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的擬原球體、及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的擬原球體，可看出兩者並無明顯差異；相反地，如第5B圖所示，由左至右分別顯示野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵以及三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’的花朵，可看出兩者明顯不同。於此，仿照前述取得各花器總量RNA的方法及測定蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於各花器中之含量的方法，測定蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的含量、及蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的含量。測定結果如第5C圖所示，可得到蝴蝶蘭AGL6基因之野生型轉錄本於三唇瓣型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的含量明顯高於其於野生型花型Phalaenopsis Brother Spring Dancer‘KHM190’之擬原球體中的含量。此意謂著，AGL6基因之野生型轉錄本於蝴蝶蘭非花朵中的含量可用來預測蝴蝶蘭的花型為野生型或三唇瓣型。
《實例4：蝴蝶蘭AGL6基因之突變型轉錄本的鑑識》
本實例是利用反轉錄PCR來鑑識蝴蝶蘭AGL6基因之突變型轉錄本。首先，照SMART PCR cDNA Synthesis套組(購自Clontech)的操作說明，對1mg的各花器總量RNA進行反轉錄PCR，而得到一首股cDNA。接著，利用real-AGL6-F引子(SEQ ID NO：15)及real-AGL6-R引子(SEQ ID NO：16)對首股cDNA進行PCR來得到一蝴蝶蘭AGL6基因的cDNA。最後，對得到的cDNA電泳來確認蝴蝶蘭AGL6基因之轉錄本為野生型或突變型。
如第6圖，蝴蝶蘭AGL6基因於野生型花型Phalaenopsis‘98201’之唇瓣中的轉錄本為野生型，但其於大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’之唇瓣中的轉錄本為突變型，其中突變型轉錄本至少含有SEQ ID NO：2至5的任一序列，而突變型轉錄本的每一序列與野生型轉錄本的序列於第7圖提出比對。
為確認前述的現象是否具再現性，於本實例，取二個野生型花型Phalaenopsis‘98201’的花朵(分別編號為WT1及WT2)、及七個大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’的花朵(分別編號為1至7)(如第8A圖所示)，並依照前述方法來確認蝴蝶蘭AGL6基因於其唇瓣中的轉錄本為野生型或突變型。如第8B圖所示，蝴蝶蘭AGL6基因於野生型花型Phalaenopsis‘98201’之唇瓣中的轉錄本均為野生型，而其於大唇瓣型花型Phalaenopsis‘NPU-1459’之唇瓣中的轉錄本均為突變型。因此，證明了上述現象確實有再現性。
上述實例僅為說明本發明之原理及其功效，然非限制本發明。習於本技術之人士對上述實例所做的修飾與變化仍不違背本發明之精 神。本發明之權利範圍應如後續之申請專利範圍所示。
<110> 國立屏東科技大學
<120> 與蘭科植物花型調控有關的基因
<160> 18
<210> 1
<211> 904
<212> DNA
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<221> CDS
<222> (1)...(720)
<400> 1
<210> 2
<211> 730
<212> DNA
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<221> CDS
<222> (1)...(489)
<400> 2
<210> 3
<211> 694
<212> DNA
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<221> CDS
<222> (1)...(447)
<400> 3
<210> 4
<211> 599
<212> DNA
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<221> CDS
<222> (1)...(93)
<400> 4
<210> 5
<211> 574
<212> DNA
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<221> CDS
<222> (1)...(327)
<400> 5
<210> 6
<211> 240
<212> PRT
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<400> 6
<210> 7
<211> 163
<212> PRT
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<400> 7
<210> 8
<211> 149
<212> PRT
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<400> 8
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<400> 9
<210> 10
<211> 109
<212> PRT
<213> 蝴蝶蘭(Phalaenopsis sp.)
<400> 10
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18

Claims (21)

  1. 一種單離的核酸分子，係包括：一選自由以下所組成之群組的序列：(i)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5的核苷酸序列；(ii)編碼SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10之胺基酸序列的核苷酸序列；以及(iii)與(i)或(ii)之序列互補的核苷酸序列。
  2. 一種單離的蛋白質，係如請求項第1項所述之核酸分子所編碼的，且包括：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
  3. 一種重組載體，係包括：如請求項第1項所述之核酸分子。
  4. 如請求項第3項所述之重組載體，進一步地包括：一可操作地連結至該核酸分子的啟動子。
  5. 一種經轉殖的細胞，係包括：如請求項第3或4項所述之重組載體。
  6. 如請求項第5項所述之細胞，係為一真核細胞、或一原核細胞。
  7. 如請求項第5項所述之細胞，係為一蘭科植物細胞。
  8. 一種經轉殖的組織，係包括：如請求項第3或4項所述之重組載體。
  9. 如請求項第8項所述之組織，係為一蘭科植物的種子、原球體(protocorm)、或擬原球體(protocorm-like body)。
  10. 一種調控蘭科植物花型的方法，係包括：提升一含如請求項第1項所述之核酸分子的轉錄本於該蘭科植物中的含量至有的程度，使該蘭科植物的花型為大唇瓣型。
  11. 如請求項第10項所述之方法，其中該提升步驟係包括：轉殖如請求項第3或4項所述之重組載體至該蘭科植物內。
  12. 一種調控蘭科植物花型的方法，係包括：提升如請求項第2項所述之蛋白質於該蘭科植物中的含量至有的程度，使該蘭科植物的花型為大唇瓣型。
  13. 如請求項第12項所述之方法，其中該提升步驟係包括：轉殖如請求項第3或4項所述之重組載體至該蘭科植物內。
  14. 一種生產轉殖蘭科植物的方法，係包括：提升一含如請求項第1項所述之核酸分子的轉錄本於一蘭科植物組織中的含量至有的程度；以及培育該蘭科植物組織，以得到該轉殖蘭科植物，而該轉殖蘭科植物的花型為大唇瓣型。
  15. 如請求項第14項所述之方法，其中該提升步驟係包括：轉殖如請求項第3或4項所述之重組載體至該蘭科植物組織內。
  16. 如請求項第14項所述之方法，其中該蘭科植物組織係為一種子、一原球體、或一擬原球體。
  17. 如請求項第15項所述之方法，其中該蘭科植物組織係為一種子、一原 球體、或一擬原球體。
  18. 一種預測蘭科植物花型的方法，係包括：提供一取自該蘭科植物的生物樣本；測定一含如請求項第1項所述之核酸分子的轉錄本於該生物樣本中的含量；以及依據該轉錄本的含量判斷該蘭科植物的花型，其中當該轉錄本的含量為有時，該蘭科植物的花型為大唇瓣型。
  19. 如請求項第18項所述之方法，其中該生物樣本係為一種子、一原球體、或一擬原球體。
  20. 一種預測蘭科植物花型的方法，係包括：提供一取自該蘭科植物的生物樣本；測定如請求項第2項所述之蛋白質於該生物樣本中的含量；以及依據該蛋白質的含量判斷該蘭科植物的花型，其中當該蛋白質的含量為有時，該蘭科植物的花型為大唇瓣型。
  21. 如請求項第20項所述之方法，其中該生物樣本係為一種子、一原球體、或一擬原球體。
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