TWI473620B

TWI473620B - 促進生髮的胜肽、含其之組合物及該胜肽之運用

Info

Publication number: TWI473620B
Application number: TW102149199A
Authority: TW
Inventors: Min Chuan Huang; Mei Ieng Chen
Original assignee: Univ Nat Taiwan
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2015-02-21
Also published as: TW201414487A

Description

促進生髮的胜肽、含其之組合物及該胜肽之運用

本發明關於一種促進生髮的物質、組合物及方法，尤指一種以胜肽為有效成分的生髮組合物。

掉髮是綜合遺傳因子、環境因子及生理狀態的結果。隨著環境汙染物的增加以及生活壓力的累積，掉髮逐漸變成多數男性一生中難以避免的困擾。由於掉髮問題直接影響一個人外在的美觀，因此有效治療掉髮乃至於促進生髮的方法將具有極大的經濟價值。

市場上有多種生髮產品，其中以落健和柔沛最為常見。落健雖然具有不錯的臨床效果，但仍有近半數的人僅能長出細短的毛髮，更遑論其引發的諸如頭皮癢、視力模糊、胸痛、血壓過低、性慾降低等副作用。另一方面，柔沛雖然也有增加髮量的功效，但其效果在使用一年之後便會顯著地下降，同時也具有多種如性慾下降、勃起障礙和射精障礙等副作用，尤其可能引發男性胎兒外生殖器官異常，因此不適合供懷孕或準備懷孕的女性使用。

中華民國專利公告第I338582號揭露一種新穎的生髮組合物，其係使用乳鐵蛋白作為唯一的有效成分。雖然乳鐵蛋白應可預期具有較少的副作用，但乳鐵蛋白的大小約為78~80 kDa，毛囊是否能有效率地吸收這樣大的分子仍存有疑慮。此外，乳鐵蛋白通常係分離自動物，因此較難維持產品批次間的穩定度。這些因素都很有可能會降低以乳鐵蛋白作為唯一有效成分的生髮組合物的實際效應。

綜上所述，目前市場上的生髮產品仍未完善，已知的潛在產品的效力仍有待進一步確認，因此領域之中確實需要投入更多的研究，以研發出不論在效果及副作用上皆表現優異的生髮產品。

爰是，本發明之一目的為提供一種促進生髮之組合物，其有效成分不僅具有較少的副作用，同時容易被毛囊所吸收。

本發明之又一目的為提供一種促進生髮之方法，其有效成分係可簡易經生化工程來合成，以穩定批次間產品的療效。

為達上目的，本發明提供一種促進生髮的胜肽，其具有如SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05、或其組合之序列。

本發明又提供一種促進生髮的組合物，其包含：前述胜肽；及醫藥可接受之載劑。

較佳地，前述組合物包含：100 nM~100mM之前述胜肽；及前述醫藥可接受之載劑。

較佳地，前述組合物的形式為：滴劑、擦劑、軟膏、貼布、粉末或懸浮液。

較佳地，前述組合物為洗髮劑、潤髮乳、生髮水或髮膠。

較佳地，前述載劑為水、醇類、蘆薈膠、尿囊素、甘油、維生素A油、維生素E油、礦物油或其組合。

較佳地，前述組合物進一步包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑、香料或其組合。

較佳地，前述組合物的施用方式係藉由塗抹、噴灑或蒸泡的方式將前述組合物與一對象的一皮膚區域接觸。

較佳地，前述對象為一具有毛囊或毛囊表皮細胞的溫血動物。

本發明再提供一種用於製備促進生髮之組合物的方法，其中前述組合物包含有效量之前述之胜肽。

較佳地，前述有效量為：10^-11 ~10^-5 mol/(cm² ．day)。

綜上所述，本發明有鑑於傳統採用乳鐵蛋白作為有效成分之生髮組合物的優點及缺點，於嘗試多種組合之後，研究出乳鐵蛋白中具有優異生髮效果的胜肽片段。這些片段最大者為25個胺基酸，最小者則僅有5個胺基酸，可有效地被毛囊所吸收。並且，在現今生化合成的技術水準下，此長度之胜肽片段可輕易地以人工製備，不僅使得批次間產品的效力更加穩定，更可省去繁瑣的萃取步驟，降低生產成本。據此，本發明保有了傳統採用乳鐵蛋白作為有效成分之生髮組合物的低副作用優點，更解決了批次間製備不穩定及吸收不佳的缺點。

第一圖顯示本發明實施例一中各胜肽於刺激髮幹增長的實驗結果。

第二圖顯示本發明實施例二中各胜肽於刺激真皮乳頭細胞生長的實驗結果。

第三圖係為本發明實施例三所用之16色灰階比色卡。

第四A圖顯示本發明實施例三中，脫毛10天之後的控制組小鼠。

第四B圖顯示本發明實施例三中，脫毛10天之後的實驗組小鼠。

第四C圖顯示以16色灰階比色卡比對本發明實施例三中控制組和實驗組小鼠的脫毛區域的量化結果。

乳鐵蛋白係一種大小約為78~80kDa的醣蛋白，主要分佈在哺乳動物之母乳、唾液、眼淚及黏膜分泌液等體液。科學上對於乳鐵蛋白的認識主要著重於其抑制細菌生長和促進及調節免疫系統的角色。近年來的研究則指出乳鐵蛋白有潛力作為促進生髮之組合物的有效成分。然而，考量實際於產業中及臨床上的利用，本發明進一步探討乳鐵蛋白中有效的胜肽片段，以期能突破傳統中以乳鐵蛋白作為有效成分之生髮組合物的缺點。

本發明所稱「胜肽」的序列係源自乳鐵蛋白之胺基酸序列。可行地，該胜肽可自於生物體所萃取得到的乳鐵蛋白中分離；較佳地，係以生化合成的方式依照所欲之序列製造出本發明之胜肽。

本發明之胜肽包括SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05或其組合，係如下表一中所示。發明所屬領域具有通常知識者當可理解，在不影響本發明之胜肽的正常生理作用的情況下，可於表一所述之序列的5’端或3’端額外修飾領域中習知的其他胜肽片段，以提升本發明之胜肽的特性(如穩定度)，而仍符合本發明之精神。

本發明之促進生髮的組合物係包含前述SEQ ID NO：01、SEQ ID NO：02、SEQ ID NO：03、SEQ ID NO：04、SEQ ID NO：05或其組合之胜肽作為有效成分，其含量較佳地為100 nM~100mM。本發明之組合物通常係局部施予有需要之個體的頭皮；其中，於使用上，前述胜肽的有效量較佳地為10^-11 ~10^-5 mol/(cm² ‧day)。本發明之組合物形式可為，但不限於滴劑、擦劑、軟膏、貼布、粉末或懸浮液，其亦可添加於洗髮劑、潤髮乳、生髮水或髮膠中，以利使用者日常使用。前述施予包括，但不限於塗抹、噴灑或蒸泡。

本發明之促進生髮的組合物可另包含一醫藥可接受之載劑。所謂「醫藥可接受」係指不會實質上對有效成分的效力產生負面影響，也不會對使用者的生理產生不良的反應。前述載劑包括，但不限於水、醇類、蘆薈膠、尿囊素、甘油、維生素A油、維生素E油、礦物油或其組合。

本發明之促進生髮的組合物可另包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑、香料或其組合，以進一步提供組合物於利用上所需的特性。

本發明所謂之「促進生髮」係指於實驗室實驗中觀察到刺激髮幹增長及真皮乳頭細胞增生的結果，尤其表示在動物實驗中觀察到顯著增加毛髮量的功效。

以下內容將搭配圖式說明本發明之細節，須注意的是，以下實施例僅用於示例式地說明本發明之特色及優點，而不用於限制本發明之申請專利範圍。

實施例一：本發明之胜肽於促進毛囊髮幹生長的功效 [胜肽製備]

有鑑於傳統含乳鐵蛋白之促進生髮組合物的缺點，本發明欲研究出乳鐵蛋白中有利於毛髮生長的胜肽片段。據此，本發明依據乳鐵蛋白的相關研究或隨機地揀選出10組序列，並以生化合成的方式製得該10個胜肽。部分該等胜肽已揭露於科學文獻中，但從未有任何研究指出其潛在的促進毛髮生長的能力。該10組胜肽分別為：LfcinB：FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF(即本發明SEQ ID NO：01)；Lf 1-13：APRKNVRWCTISQ(即本發明SEQ ID NO：02)； Lf 8-25：WCAVSNPEATKCFQWQRN(即本發明SEQ ID NO：03)；Lf 152-182：FFSASCVPGADKGQFPNLCRLCAGTG-ENKCA；Lf 265-284：DLIWKLLSKAQEKFGKNKSR；Lf 268-284：WKLLSKAQEKFGKNKSR；Lf 319-324：YLGSGY(即本發明SEQ ID NO：04)；Lf 524-528：RYYGY(即本發明SEQ ID NO：05)；Lf 661-667：KYLGPQY；Lf 679-695：YEKYLGPQYVAGITNLK。

[毛囊分離]

本實驗採用六周大的Wistar大鼠(樂斯科生物科技股份有限公司)。首先以4%之水合氯醛(chloral hydrate)將前述大鼠麻醉(10 ml/kg；Merck,Darmstadt,Germany)，再用二氧化碳使其安樂死。然後將大鼠兩頰的皮膚剪下，用1X PBS沖洗後，保存於4℃之含有抗生素的DMEM培養液。

[毛囊培養與實驗]

用剪刀和鑷子把鼠鬚的完整毛囊自皮膚上取下，並放到培養基(DMEM w/10% FBS)中培養。實驗組的毛囊培養中，分別加入12.84 μM的LfcinB、Lf 1-13、Lf 8-25、Lf 152-182、Lf 265-284、Lf 268-284、Lf 319-324、Lf 524-528、Lf 661-667及Lf 679-695；控制組的毛囊培養則加入1X的PBS。使毛囊培養5天。實驗結果以平均值±標準差的方式來呈現，各組間差異以統計分析(Student T-test)，若p<0.05或p<0.01則判讀為具有顯著差異。

[實驗結果]

請參第一圖，控制組中髮幹所增加的平均長度為 44.0±33.6μm(n=5)。相較之下，LfcinB組的髮幹所增加的平均長度為132.5±78.9μm(n=4；p<0.05)；Lf 1-13組為173.3±61.9μm(n=6；p<0.01)；Lf 8-25組為112±50.7μm(n=5；p<0.05)；Lf 152-182組為50.0±20.0μm(n=3)；Lf 265-284組為82.5±35.0μm(n=4)；Lf 268-284組為76.7±61.2μm(n=6)；Lf 319-324組為98.0±53.6μm(n=5；p<0.05)；Lf 524-528組為102.5±55.0μm(n=4；p<0.05)；Lf 661-667組為45.0±217.3μm(n=4)；Lf 679-695組為62.9±15.0μm(n=7)。實驗結果顯示，經LfcinB、Lf 1-13、Lf 8-25、Lf 319-324及Lf 524-528處理的確可顯著地刺激髮幹增長。

實施例二：本發明之胜肽於促進真皮乳頭細胞生長的功效

如同實施例一所述，取得LfcinB、Lf 1-13、Lf 8-25、Lf 152-182、Lf 265-284、Lf 268-284、Lf 319-324、Lf 524-528、Lf 661-667及Lf 679-695之胜肽，以進行本實施例的實驗。

[分離真皮乳頭細胞]

參照實施例一中所述的方法取得六周大之大鼠(購買自樂斯科生物科技股份有限公司)兩頰鼠鬚的毛囊。將所得毛囊的根部剪碎後置於第一膠原酶溶液(collagenase I solution；2mg/ml、DMEM w/1% FBS)中，並放置在37℃、5%的二氧化碳培養箱中培養2個小時。待外根鞘變得鬆動之後，添加含有10% FBS的DMEM培養液，並於輕微攪拌後離心，以將第一膠原酶溶液與培養中的細胞分離。然後重新添加含20%FBS的DMEM培養液來培養真皮乳頭細胞。於觀察到細胞貼附於培養皿底部並有向外延展的型態之後，每三天更新一次培養液，並於培養七天之後進行本實施例之實驗。

[細胞培養與實驗]

真皮乳頭細胞的培養皆係於含20%FBS的DMEM培養基中進行。於實驗組中，分別加入12.84 μM的LfcinB、Lf 1-13、Lf 8-25、Lf 152-182、Lf 265-284、Lf 268-284、Lf 319-324、Lf 524-528、Lf 661-667及Lf 679-695；控制組則加入1X的PBS。使細胞培養3天。3天之後以倒立顯微鏡觀察細胞，並拍照及記錄細胞數目。實驗結果以平均值±標準差的方式來呈現，各組間差異以統計分析(Student T-test)，若p<0.05或p<0.01則判讀為具有顯著差異。

[實驗結果]

請參第二圖，以控制組的細胞量為100%，分別計算各實驗組別相對於控制組的細胞量(相對增生量)。控制組的真皮乳頭細胞的相對數量為100.3±28.5%。LfcinB組細胞的相對增生量為218.0±85.4%(p<0.05)；Lf 1-13組為218±45.7%(p<0.01)；Lf 8-25組為150.4±7.5%(p<0.05)；Lf 152-182組為115.3±17.4%；Lf 265-284組為147.9±23.0%(p<0.05)；Lf 268-284組為112.8±7.5%；Lf 319-324組為185.5±30.4%(p<0.05)；Lf 524-528組為162.9±21.7%(p<0.05)；Lf 661-667組為117.8±15.7%；Lf 679-695組為117.8±26.4%。實驗結果顯示，經LfcinB、Lf 1-13、Lf 8-25、Lf 265-284、Lf 319-324及Lf 524-528處理的確可顯著地刺激真皮乳頭細胞生長。

實施例三：以小鼠試驗測試本發明之胜肽於促進毛髮生長的功效

於本實施例中，以前述LfcinB(SEQ ID NO：01)為例進行小鼠試驗，以測試本發明之胜肽於活體動物上是否能展現優異的促進毛髮生長的效果。

自台大醫學院動物中心購得7周大的C57BL6小鼠(黑毛)。先以4%之水合氯醛(chloral hydrate)將其麻醉(10 ml/kg；Merck,Darmstadt,Germany)，然後將石蠟塗抹在小鼠背上的選定區域(約9 cm² 面積的皮膚)。待石蠟乾掉之後，把石蠟連同毛髮撕下。

然後將脫毛完畢的小鼠隨機分成兩組(每組各有5隻小鼠)，控制組每天於脫毛區域擦拭1X PBS、10uL，實驗組則擦拭2.56×10^-8 mol的LfcinB。於10天之後，以16色灰階比色卡(第三圖)比對小鼠的脫毛區域，紀錄該區域內黑色色度，以判斷毛髮新生的程度。實驗結果將以平均值±標準差的方式來呈現，各組間差異以統計分析(Student T-test)，若p<0.05則判讀為具有顯著差異。

請參第四A及四B圖，為實驗10天之後，小鼠背部的脫毛區域的毛髮新生狀況。於圖中可明顯看出，相較於控制組的小鼠的脫毛區域僅有非常少數的毛髮新生(第四A圖)，經LfcinB處理的小鼠的脫毛區域已幾乎佈滿新生的短毛(第四B圖)。再請參第四C圖，其係量化以比色卡比對脫毛區域內黑色色度。由圖中可知，經LfcinB處理的小鼠的脫毛區域的黑色色度為控制組小鼠的的脫毛區域的黑色色度的兩倍以上，此差異和第四A及四B圖中所示者一致。

所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。

<110> 國立臺灣大學

<120> 促進生髮的胜肽、含其之組合物及該胜肽之運用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 1

<210> 2

<211> 13

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<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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<223> peptide

<400> 4

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptide

<400> 5

Claims

一種用於製備促進生髮之組合物的方法，其中前述組合物包含一有效量之胜肽，且前述胜肽具有如SEQ ID NO：02之序列。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述有效量為：10^-11 ~10^-5 mol/(cm² ．day)。