TWI466895B - 特異性結合plvap之單株抗體及蛋白、含有該單株抗體及蛋白之用於診斷及治療肝細胞癌的組成物、以及該單株抗體及蛋白用於診斷及治療肝細胞癌之用途 - Google Patents

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Description

特異性結合PLVAP之單株抗體及蛋白、含有該單株抗體及蛋白之用於診斷及治療肝細胞癌的組成物、以及該單株抗體及蛋白用於診斷及治療肝細胞癌之用途
本發明係關於在個體中診斷肝細胞癌之方法、在個體中治療肝細胞癌之方法、PLVAP蛋白之多肽拮抗劑、及包含該等多肽拮抗劑之組成物及套組。
肝細胞癌(HCC)為最頻發的原發性肝臟惡性疾病且為全世界第五大人類最常見癌症。HCC亦為癌症相關死亡之第四大主要病因(Parkin DM,Bray F,Ferlay J,Pisani P. Estimating the world cancer burden:Globocan 2000. Int J Cancer 2001;94:153-156)。據世界衛生組織(World Health Organization)估計，1990年全世界約有430,000例肝癌新增病例，且彼年有類似數目之患者死於此疾病。
HCC之發病機制係與慢性B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)感染以及肝硬化誘發之肝病狀相關(Bruix J等人,J Hepatol 35:421-430,2001；Bruix J等人,Cancer Cell 5:215-219,2004)。因此，在HBV及HCV感染最流行之諸如中國大陸、香港、臺灣、韓國及日本的東亞國家及地區HCC之發病率最高(Bruix J等人,Cancer Cell 5:215-219,2004；Haskell CM.第46章Liver:Natural History,Diagnosis and Staging in「Cancer Treatment」第5版W. B,Saunders公司,Philadelphia,Haskell CM及Berek JS編)。然而，西方國家HCC之發病率正穩步增長(Parkin DM等人,Int J Cancer 94;153-156,2001)。在過去十年中，美國HCC之發病率增長在所有癌症中居第二位且死亡率增長最快(Ann Int Med 139:817-823,2003)。因此，在美國及遍布全世界，HCC為死亡率及發病率之主要病因，且患有HCC之人群因醫院費用及失業而擔負重大經濟負擔。
HCC之成功控制需要在疾病發展早期正確診斷該疾病。然而，已證明使用諸如成像研究、針芯生檢(needle core biopsy)及/或細針抽吸(fine needle aspiration)之當前技術區分小HCC腫瘤與包括轉移性腫瘤、膽管癌、局部結節性增生、發育不良性及再生性肝結節之其他惡性或非惡性肝病具有挑戰性(Ferrell LD等人,Am J Surg Pathol 17:1113-1123,1993；Horigome H等人,Hepato-Gatroenterology 47:1659-1662,2000；Kalar S等人,Arch Pathol Lab Med 131:1648-1654,2007；Seki S等人,Clin Cancer Res 6:3460-3473,2000)。此外，治療性處理HCC之嘗試在很大程度上已告失敗(Bruix J等人,J Hepatol 35:421-430,2001；Bruix J等人,Cancer Cell 5:215-219,2004；Haskell CM.第46章Liver:Natural History,Diagnosis and Staging in「Cancer Treatment」第5版,W. B,Saunders公司,Philadelphia,Haskell CM及Berek JS編；Szklaruk J等人,AJR 180:441-453,2003)。因此，即使接受主動療法，在美國HCC患者之五年存活率仍僅為10.5%，此量值僅次於胰腺癌(ACS Cancer Facts & Figures(2007))。因此，迫切需要鑑別區分HCC與其他肝病變且有利於早期偵測此疾病之更可靠標誌。另外，迫切需要開發治療HCC之新穎且更有效的治療劑。
在一具體實例中，本發明係關於特異性結合人類質膜小泡相關性蛋白(Plasmalemma Vesicle-Associated Protein，PLVAP)之人類化抗體，其中該抗體包含至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102及其組合；及至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108及其組合。
在另一具體實例中，本發明係關於一種特異性結合人類PLVAP之人類化抗體，其中該抗體包含至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其組合；及至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92及其組合。
在另一具體實例中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含至少一種特異性結合PLVAP蛋白(例如人類PLVAP蛋白)之人類化抗體。在另一具體實例中，該醫藥組成物進一步包含第二治療劑，諸如化學治療劑。
在另一具體實例中，本發明係關於一種特異性結合人類PLVAP之經分離多肽，其包含至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102及其組合；及至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108及其組合。在另一具體實例中，該多肽為嵌合抗體。
在另一具體實例中，本發明提供一種特異性結合人類PLVAP之經分離多肽，其包含至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其組合；及至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92及其組合。在另一具體實例中，該多肽為嵌合抗體。
在其他具體實例中，本發明係關於鼠類融合瘤KFCC-GY4、其細胞、及由鼠類融合瘤KFCC-GY4產生之抗體。
在其他具體實例中，本發明係關於鼠類融合瘤KFCC-GY5、其細胞、及由鼠類融合瘤KFCC-GY5產生之抗體。
在另一具體實例中，本發明係關於在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC的方法，其包含將治療有效量之特異性結合PLVAP之人類化抗體投予該個體。在一特定具體實例中，該抗體係經由動脈內輸注(例如肝動脈輸注、動脈化學栓塞療法(transarterial chemoembolization))投予個體且可在個體之肝臟中抑制腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成或腫瘤發展。在另一具體實例中，PLVAP拮抗劑係與諸如化學治療劑之第二治療劑組合投予。
本發明之例示性具體實例的描述如下。
定義
如本文所用之術語「質膜小泡相關性蛋白」、「PLVAP」及「PV-1」係指天然產生或內源性PLVAP(例如哺乳動物、人類)蛋白及胺基酸序列與天然產生或內源性PLVAP蛋白相同或實質上相同之蛋白(例如，重組蛋白、合成蛋白)。因此，在本文中可互換使用之術語「質膜小泡相關性蛋白」、「PLVAP」及「PV-1」包括藉由例如哺乳動物(例如人類)中天然發生之替代性拼接或其他細胞過程所產生的PLVAP蛋白之多態變異體或對偶基因變異體及其他同功異構物。PLVAP蛋白較佳為具有SEQ ID NO:23之胺基酸序列(參見，Genbank編號NP_112600及圖24)的人類蛋白。
如本文所定義之「PLVAP拮抗劑」為一種藥劑(例如抗體、小分子、肽、擬肽、核酸)，在一具體實例中，其抑制(例如降低、遏制)PLVAP蛋白之活性；或在另一具體實例中，其抑制(例如降低、阻止)PLVAP基因及/或基因產物之表現。可受本發明拮抗劑抑制之PLVAP蛋白之活性包括(但不限於)肝細胞癌瘤之形成、生長、血管形成及/或發展。在一特定具體實例中，PLVAP拮抗劑特異性結合哺乳動物(例如人類)PLVAP蛋白且抑制PLVAP蛋白之活性。
如本文所用之「特異性結合」係指藥劑(例如抗體)與PLVAP基因產物(例如RNA、蛋白質)結合之親和力(例如結合親和力)為PLVAP拮抗劑結合非PLVAP蛋白之親和力的至少約5倍，較佳至少約10倍。
如本文所用之術語「多肽」係指胺基酸之聚合物但長度不定。因此，「多肽」涵蓋蛋白質、肽及寡肽。
如本文所用之術語「抗體」係指對目標、抗原或抗原決定基具有親和力之多肽且包括天然產生或經工程改造之抗體。術語「抗體」涵蓋多株抗體、單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、鑲飾抗體(veneered antibody)及單鏈抗體以及抗體片段(例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、scFv、scFab、dAb)。(參見，例如Harlow等人,Antibodies A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。)
術語「抗體可變區」係指獨立地或當與其他抗體可變區組合(例如VH /VL 對)時特異性結合抗原決定基之抗體區(例如VH 、VHH 、VL )。
術語「抗原決定基(epitope)」係指通常由抗體VH /VL 對結合之結構單元。抗原決定基界定抗體之最小結合位點且由此表示抗體之特異性目標。
術語「互補決定區」或「CDR」係指來自重鏈或輕鏈之抗體可變區的高變區，其含有能夠特異性結合抗原目標(例如抗原決定基)之胺基酸序列。典型重鏈或輕鏈將具有三個展現抗體對特定抗原決定基之特異性的CDR(CDR1、CDR2、CDR3)。
如本文所定義之術語「抗原結合片段」係指含有一或多個CDR且單獨對抗原決定子具有親和力之抗體部分。非限制性實例包括Fab片段、F(ab)'2 片段、重鏈-輕鏈二聚體及單鏈結構，諸如完整輕鏈或完整重鏈。
如本文所用之術語「特異性」係指抗體優先結合抗原決定基之能力且未必意指高親和力。
術語「親和力」係指抗體與抗原決定子之間的結合強度之量度。親和力視許多因素而定，該等因素包括抗體與抗原決定子之間的立體化學配合緊密度、兩者之間的接觸面積大小以及帶電基團及疏水基團之分布。
如本文所用之術語「親和力常數」或「Kd 」係指用於度量抗體對抗原之親和力的解離常數。親和力常數愈低，則免疫球蛋白對抗原或抗原決定子之親和力愈高，反之亦然。此類常數易於由如抗體反應之標準動力學方法所量測的締合-解離反應之速率常數來計算。
如本文所提及之術語「競爭」意謂第一多肽(例如抗體)與目標抗原之結合受第二多肽(例如抗體)之結合抑制。舉例而言，結合可在空間上因例如結合域之實體阻斷或因結合域之結構或環境改變以致其對目標之親和力(affinity/avidity)下降而受抑制。
如本文所用之術語「肽」係指由約2個至約100個胺基酸殘基組成之化合物，其中一個胺基酸之胺基經由肽鍵與另一個胺基酸之羧基連接。該等肽之長度典型地小於約100個胺基酸殘基且較佳為約10個、約20個、約30個、約40個或約50個殘基。
如本文所用之術語「擬肽」係指並非肽或蛋白質但模擬其結構態樣之分子。擬肽拮抗劑可由習知化學方法製備(參見，例如Damewood J.R.「Peptide Mimetic Design with the Aid of Computational Chemistry」,Reviews in Computational Biology ,2007,第9卷，第1-80頁,John Wiley and Sons公司,New York,1996；Kazmierski W.K.,「Methods of Molecular Medicine:Peptidomimetic Protocols 」, Humana Press,New Jersey,1999)。
術語「肝細胞癌」、「HCC」及「肝癌」在本文中可互換用於指代由肝臟主要細胞類型-肝細胞引起之癌症。
如本文所定義之「療法」為將特定治療劑或預防劑投予個體(例如哺乳動物、人類)，對該個體產生所要治療或預防效益。
如本文所定義之「治療有效量」為在投藥條件下足以達成所要治療或預防作用之量，諸如足以在HCC患者之肝臟中抑制(亦即，降低、阻止)腫瘤形成、腫瘤生長(增生、大小)、腫瘤血管形成及/或腫瘤發展(侵襲、轉移)的量。療法有效性(例如減小/消除腫瘤及/或阻止腫瘤生長)可由任何適宜之方法(例如原位免疫組織化學、成像法(超音波、CT掃描、MRI、NMR)、併入3 H-胸苷)測定。
如本文所定義之「治療攝生法」為將特定劑量(例如水平、量、數量)之一或多種治療劑或預防劑按特定時程或以特定時間間隔(例如數分鐘、數天、數週、數月)投予哺乳動物個體的攝生法。
如本文所用之「個體」係指哺乳動物個體。術語「哺乳動物個體」在本文中定義為包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、乳牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、天竺鼠、大鼠、小鼠或其他牛類、羊類、馬類、犬類、貓類、齧齒動物類或鼠類物種。適宜之個體的實例包括(但不限於)患有HCC或處於HCC發展之風險中的人類患者。HCC發展之高風險群體之實例包括患有慢性肝炎感染(B型肝炎、C型肝炎)之個體及患有肝硬化或相關肝病狀之個體。
如本文所用之術語「預防」意謂降低個體形成或發展HCC腫瘤之概率/可能性或風險，延遲個體與HCC相關之病狀的發作、減輕個體之HCC相關病狀之一或多個症狀的嚴重性或其任何組合。一般而言，預防性攝生法之個體將很有可能歸類為「處於風險中」，例如發展HCC之個體的風險高於相關基線群體所代表之個體的風險。
如本文所用之術語「治療」意謂將醫學病狀(例如與HCC相關之病狀)削弱至醫學病狀根據臨床上可接受之標準得到改善(例如個體肝臟中HCC腫瘤之數目減少及/或大小減小)的程度。
如本文所用之術語「低嚴格度」、「中等嚴格度」、「高嚴格度」或「極高嚴格度條件」描述核酸雜交及洗滌之條件。進行雜交反應之導則可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中，其以全文引用的方式併入本文中。彼參考文獻中描述水性及非水性方法且可使用任一方法。本文所提及之特定雜交條件如下：(1)低嚴格度雜交條件為在約45℃下於6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，接著在至少50℃下(就低嚴格條件而言，洗滌溫度可增至55℃)以0.2×SSC、0.1% SDS洗滌兩次；(2)中等嚴格度雜交條件為在約45℃下於6×SSC中，接著在60℃下以0.2×SSC、0.1% SDS洗滌一或多次；(3)高嚴格度雜交條件為在約45℃下於6×SSC中，接著在65℃下以0.2×SSC、0.1% SDS洗滌一或多次；及較佳地，(4)極高嚴格度雜交條件為在65℃下於0.5M磷酸鈉、7% SDS中，接著在65℃下以0.2×SSC、1% SDS洗滌一或多次。極高嚴格度條件(4)為較佳條件，且除非另作說明，否則應使用該等極高嚴格度條件。
除非另作定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有此項技術(例如細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術及生物化學)中之一般技術者通常所理解之相同含義。關於分子、遺傳及生物化學方法(一般參見Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.及Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版,John Wiley & Sons公司，其以引用的方式併入本文中)及化學方法，使用標準技術。
PLVAP
質膜小泡相關性蛋白(PLVAP)(亦稱為PV1)為表現限制在某些血管內皮細胞中之II型整合膜醣蛋白(Mol Biol Cell 15 :3615-3630(2004))。已顯示PLVAP為網孔內皮之網孔及氣孔隔膜之關鍵結構組分(同上)。另外，PLVAP表現為形成內皮網孔隔膜所必需且可能與調節內皮滲透性及轉運有關(Am J Physiol Heart Circ Physiol 286:H1347-1353,2004)。已報導人類PLVAP基因之基因組組織(Stan RV,Arden KC,Palade GE. cDNA and protein sequence,genomic organization,and analysis of cis regulatory elements of mouse and human PLVAP genes. Genomics 72:304-313,2001)。
如本文所述，發明者已證明人類HCC患者之肝臟中PLVAP基因表現在肝細胞癌組織中相對於鄰近非腫瘤性組織顯著升高。另外，本發明者已確定PLVAP蛋白主要在HCC腫瘤周圍或內部之血管內皮細胞中表現且定位於此，而不在與其他肝病變相關之細胞中表現或定位於此。因此，PLVAP代表HCC診斷及治療之新穎目標。
治療方法
在一態樣中，本發明係關於一種在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC的方法，其包含將治療有效量之至少一種PLVAP拮抗劑投予該個體，其中該PLVAP拮抗劑在個體之肝臟中抑制一或多個HCC腫瘤的形成、生長、血管形成及/或發展。在一特定態樣中，本發明之PLVAP拮抗劑在HCC患者之肝臟中抑制肝細胞周圍之血管內皮細胞中之PLVAP蛋白的表現或活性。
在一態樣中，將治療有效量之PLVAP拮抗劑投予需要其之個體以抑制腫瘤生長或殺死腫瘤細胞。舉例而言，通常按達成最有效治療(例如最佳地殺死腫瘤細胞)之特定給藥時程及水平投予直接抑制腫瘤生長之藥劑(例如化學治療劑)。一般而言，在相對較短之治療時段(例如一至數天)內投予大約最大耐受劑量，繼之以治療停止(off-therapy)時段。在一特定實例中，每隔一天投予150mg/kg最大耐受劑量之化學治療劑環磷醯胺，共計三劑，第一個週期後21天施以第二個週期。(Browder等人Can Res 60:1878-1886,2000。)
可投予治療有效量之PLVAP拮抗劑(例如抑制性小分子、中和抗體、抑制性核酸(例如siRNA、反義核苷酸))，例如在第一個週期中，以一次時間間隔/劑或以數次密集時間間隔(數分鐘、數小時、數天)投予大約最大耐受劑量之拮抗劑，一段適宜之治療停止時段(例如一或多週)後施予另一/第二個週期。PLVAP拮抗劑之適宜給藥時程及量可易於由一般熟練臨床醫師決定。與化學治療劑相比，特定PLVAP拮抗劑之較小毒性可使投藥週期之間的時間縮短。當用作佐劑療法(adjunvant therapy)(例如手術、輻射療法、其他主要療法之佐劑療法)時，較佳按類似於其他癌症療法(例如化學療法)之給藥時程或按熟練臨床醫師所決定之更有效/最有效抑制(減少、阻止)腫瘤生長之給藥時程投予治療有效量之PLVAP拮抗劑。治療有效量之抗體PLVAP拮抗劑的治療攝生法可為例如每次治療每公斤體重約0.01mg至約300mg且較佳每1至7天約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg，歷經約4個月至約6個月時段。抗腫瘤有效量之小分子PLVAP拮抗劑的治療攝生法可為例如每1至7天約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約1mg/kg，歷經約4個月至約6個月時段。
在另一態樣中，可以規律性給藥攝生法投予PLVAP拮抗劑，藉以相對於最大耐受性給藥更頻繁地投予較低劑量。許多臨床前研究已證明，與最大耐受劑量(MTD)對應攝生法相比，規律性攝生法之抗腫瘤功效更優越，抗血管生成作用更有效且毒性及副作用(例如骨髓抑制作用)降低(Bocci等人,Cancer Res,62 :6938-6943,(2002)；Bocci等人,Proc. Natl. Acad. Sci .,100 (22):12917-12922,(2003)；及Bertolini等人,Cancer Res,63 (15):4342-4346,(2003))。規律性化學療法似乎有效克服與化學療法相關之一些缺點。
PLVAP拮抗劑可作為抗血管生成療法之一部分以規律性給藥攝生法來投予，以抑制(減少、阻止)需要抑制(減少、阻止)血管生成之患者的血管生成。該抗血管生成療法可藉由阻斷供應腫瘤維持腫瘤生長及使腫瘤能夠轉移所需之營養素的新血管形成而間接影響(抑制、減少)腫瘤生長。以此方式使腫瘤缺乏營養素及血液供應可最終使得腫瘤細胞死於壞死及/或凋亡。先前工作已指出，當涉及阻斷血管生成因子(例如VEGF、bFGF、TGF-α、IL-8、PDGF)或其信號傳導之癌症療法更頻繁地投予較低劑量，從而提供抗血管生成劑之連續血液含量時，其臨床結果(抑制內皮細胞介導之腫瘤血管生成及腫瘤生長)更有效。(參見Browder等人,Can. Res. 60:1878-1886,2000；Folkman J.,Sem. Can. Biol. 13:159-167,2003)。抗血管生成治療攝生法已與血管生成靶向抑制劑(凝血栓蛋白1(thrombospondin 1)及血小板生長因子-4(TNP-470))及化學治療劑環磷醯胺一起使用。每6天投予低於最大耐受劑量之劑量的TNP-470，且投予170mg/kg劑量之環磷醯胺(同上)。此治療攝生法使得腫瘤完全消退(同上)。實際上，抗血管生成治療劑當與例如直接抑制腫瘤生長之藥劑(例如化學治療劑)的其他抗癌治療劑共同投子時最有效(同上)。
本文所述之治療方法包含將PLVAP拮抗劑投予個體。PLVAP拮抗劑可如下投予需要其之個體：作為主要療法(例如作為療法或治療攝生法中之主要治療劑)；作為輔助療法(例如作為與療法或治療攝生法中之另一治療劑一起使用之治療劑，其中治療劑組合提供所要治療；「輔助療法(adjunct therapy)」亦稱為「附屬療法(adjunctive therapy)」)；與輔助療法組合；作為佐劑療法(例如作為已給予療法或治療攝生法中之主要治療劑後給予需要其之個體的治療劑)；或與佐劑療法(例如化學療法(例如他莫昔芬(tamoxifen)、順鉑(cisplatin)、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、阿黴素(doxorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、奧曲肽(octreotide)、達卡巴仁(dacarbazine，DTIC)、順鉑(Cis-platinum)、西咪替丁(cimetidine)、環磷醯胺)、輻射療法(例如質子束療法)、激素療法(例如抗雌激素療法、雄激素去除療法(ADT)、促黃體激素釋放激素(LH-RH)激動劑、芳香酶抑制劑(AI，諸如安美達錠(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、來曲唑(letrozole))、雌激素受體調節劑(例如他莫昔芬、雷諾昔酚(raloxifene)、托瑞米芬(toremifene))或生物學療法)組合。在癌症治療攝生法期間亦可施予許多其他療法來減輕疾病作用及/或癌症治療之副作用，該等療法包括控制疼痛(麻醉劑、針灸)、胃不適(抗酸劑)、眩暈(抗眩暈藥物)、噁心(抗噁心藥物)、感染(例如增加紅血球/白血球計數之藥物)之療法及其類似療法，所有該等療法易於為熟習此項技術者所瞭解。
因此，PLVAP拮抗劑可作為佐劑療法投予(例如與另一主要癌症療法或治療一起)。作為佐劑療法，PLVAP拮抗劑可在如輻射及/或手術移除腫瘤之主要療法之前、之後投予或與之並行投予。在一些具體實例中，該方法包含投予治療有效量之PLVAP拮抗劑及一或多種其他療法(例如佐劑療法、其他靶向療法)。佐劑療法(例如化學治療劑)及/或一或多種其他靶向HCC療法及PLVAP拮抗劑可以獨立調配物或以聯合調配物形式同時(例如並行)共同投予。或者，療法可以獨立組成物形式在熟練臨床醫師所決定之適當時間範圍(例如足以允許療法之醫藥作用重疊之時間)(例如癌症治療時間段/時間間隔，諸如1.5至5小時)內依序投予。佐劑療法及/或一或多種其他靶向HCC療法及PLVAP拮抗劑可以單劑或多劑按適於達成所要治療作用(例如抑制腫瘤生長、抑制血管生成及/或抑制癌症轉移)之次序及時程投予。
可以單劑或多劑投予一或多種作為PLVAP拮抗劑之藥劑。適宜之投藥劑量及攝生法可由臨床醫師決定且視所選藥劑、醫藥調配物及投藥途徑、多種患者因素及其他考慮因素而定。就投予PLVAP拮抗劑與一或多種其他療法或治療(佐劑療法、靶向療法、癌症治療相關療法及其類似療法)而言，PLVAP拮抗劑典型地以單劑(藉由例如注射、輸注、經口)投予，接著若有需要或有指示，則以特定時間間隔(例如一或多小時)重複數劑。
待投予之PLVAP拮抗劑之量(例如治療有效量)可由臨床醫師使用本文提供之導則及此項技術中已知之其他方法來決定且視若干因素而定，該等因素包括例如所選特定藥劑、個體年齡、敏感性、藥物耐受性及總體健康狀況。舉例而言，小分子之適宜劑量可為每次治療每公斤體重約0.001mg至約100mg、約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、約0.01mg至約1mg。抗體之適宜劑量可為每次治療每公斤體重約0.01mg至約300mg且較佳為每次治療每公斤體重約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、約1mg至約10mg。當PLVAP拮抗劑為多肽(線性多肽、環狀多肽、擬多肽)時，較佳劑量將產生約0.1μg/mL至約200μg/mL之肽血漿濃度。決定針對特定藥劑、患者及癌症之劑量完全在熟習此項技術者之能力範圍內。劑量較佳不會引起不良副作用或產生極小不良副作用(例如免疫原性反應、噁心、眩暈、反胃、黏性過高症候群、充血性心臟衰竭、中風、肺水腫)。
投藥方法
根據本發明之方法，將治療有效量之PLVAP拮抗劑(例如抗體，諸如經放射性同位素標記之抗體)投予哺乳動物個體以治療HCC。
可使用多種投藥途徑，包括例如經口、經膳食、局部、經皮、經直腸、非經腸(例如動脈內、靜脈內、肌肉內、皮下注射、皮內注射)、靜脈內輸注及吸入(例如支氣管內、鼻內或經口吸入、鼻內滴劑)之投藥途徑，需視藥劑及待治療之特定癌症而定。若有指示，則投藥可為局部投藥或全身性投藥。較佳投藥模式可視所選特定藥劑而變；然而，一般優選動脈內投藥(例如肝動脈輸注、動脈化學栓塞療法(TACE))投予本發明之治療劑(例如抗體，諸如經放射性同位素標記之抗體)來治療肝細胞癌。
舉例而言，使用肝動脈輸注可將化學治療劑(例如PLVAP抗體，諸如經放射性同位素標記之PLVAP抗體)經由肝動脈直接遞送至HCC腫瘤，例如在HCC之常規TACE治療期間(Camma等人,Radiology 224 :47-54,2002；Befeler等人,Clinics in Liver Disease 9 :287-300,2005；Abou-AlfaJAMA 299 :1716-1718,2008)。此程序係藉助於螢光鏡檢查(x射線類型)成像來完成。簡言之，將導管插入腹股溝之股動脈中且穿入主動脈內。使導管自主動脈進入肝動脈或其支脈中。一旦鑑別出肝動脈之供給肝癌之支脈，即輸注化學療法。通常執行此程序之介入放射醫師可決定各時間段患者接受化學療法之量。一些患者可以6至12週之時間間隔經歷重複時間段。6至12週內重複肝臟之成像研究來評估對治療作出反應之腫瘤大小。
或者，可使用動脈化學栓塞療法(TACE)(一種類似於動脈內輸注之程序)將PLVAP拮抗劑(例如抗體)投予需要其之個體。在TACE中，動脈內輸注治療劑與另一用特定阻斷化合物(諸如明膠海綿(gelfoam)、油乳液或甚至小金屬線圈)阻斷(亦即栓塞)小血管之步驟組合。因此，TACE具有將腫瘤暴露於高濃度化學療法且局部限制藥劑以阻止或減少其被血流帶走之潛在優點。同時，TACE剝奪腫瘤所需之血液供應，此可使得腫瘤細胞損傷或死亡。
對於PLVAP抗體之動脈內投藥，較佳使用對PLVAP具有高親和力(例如Kd 小於10-7 M)之抗體以使所輸注之抗體將集中於HCC血管中。預期嵌合抗體及人類化抗體分別具有最多4天及最多14-21天之循環半衰期。在一特定具體實例中，將具有短循環半衰期(例如約1天至約5天，例如約1、2、3、4或5天)之高親和力PLVAP抗體(例如抗原結合片段、單鏈抗體)投予患者以減小其投藥所產生之任何毒性及其他不良副作用。在另一具體實例中，將具有長循環半衰期(例如約5天至約24天)之高親和力PLVAP抗體投予患者以治療HCC。
在許多情況下，將優先投予大負荷劑量，接著在治療時段內投予週期性的(例如每週)維持劑量。抗體亦可由緩釋遞送系統、泵及用於連續輸注至HCC中之其他已知遞送系統遞送。可基於特定抗體之藥物動力學來改變給藥攝生法以提供該特定抗體所要之循環量。因此，應計算劑量以便維持所要治療水平。
實際劑量及治療攝生法將由醫師在考慮癌症性質(原發性或轉移性)、腫瘤數目及大小、其他療法及患者特性下決定。鑒於肝細胞癌危急生命之性質，可能使用具有顯著副作用之大劑量。
可以許多方式將基於核酸之PLVAP拮抗劑(例如siRNA、反義寡核苷酸、天然或合成核酸、核酸類似物)引入相關哺乳動物個體中。舉例而言，可使核酸自表現載體或PCR產物內源性地表現於宿主細胞中，或將核酸封裝於合成或經工程改造之組成物(例如脂質體、聚合物、奈米粒子)中，隨後可直接引入哺乳動物個體之血流中(藉由例如注射、輸注)。亦可使用既定基因療法策略及方案(參見，例如Tochilin V. P.Annu Rev Biomed Eng 8:343-375，2006；Recombinant DNA and Gene Transfer,Office of Biotechnology Activities,National Institutes of Health Guidelines)，將抗PLVAP核酸或核酸表現或體(例如反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體及單純疱疹病毒載體、經工程改造之載體、非病毒介導之載體)直接引入哺乳動物個體中。
類似地，當藥劑為蛋白質或多肽時，可經由重組蛋白質活體內表現來投予該藥劑。活體內表現可藉由根據適宜方法(參見，例如美國專利第5,399,346號)進行體細胞表現來達成。另外，亦可將編碼多肽之核酸併入反轉錄病毒載體、腺病毒載體或其他適宜載體(較佳為複製缺陷型感染性載體)中進行遞送，或可引入能夠表現多肽之經轉染或經轉型宿主細胞中進行遞送。在後一具體實例中，可植入(單獨或於障壁裝置中)、注射或以其他方式引入有效表現治療有效量之多肽之量的細胞。
診斷及預後方法
本發明涵蓋診斷及預後方法，其包含評估哺乳動物個體(例如患有肝腫瘤之哺乳動物個體)之樣本(例如肝生檢樣本、細針抽吸樣本)中的PLVAP表現。對於本發明之診斷方法，樣本中之PLVAP表現或樣本中之PLVAP表現相對於適宜對照組增加指示個體患有HCC及/或個體為使用PLVAP拮抗劑進行抗癌療法之候選者。
對於本發明之預後方法，個體樣本中之PLVAP表現或樣本中之PLVAP表現相對於適宜對照組增加指示不良預後。該預後可為針對患者存活之預後、針對轉移風險之預後及/或針對復發風險之預後。
適於此等方法之樣本包括組織樣本、生物體液樣本、細胞(例如腫瘤細胞)樣本及其類似物。可使用自個體取樣之任何方式(例如抽血、脊椎穿剌、組織抹片或組織刮片或組織生檢)獲得樣本。因此，樣本可為生檢試樣(例如腫瘤、息肉、塊體(實體、細胞))、抽出物、抹片或血液樣本。樣本可為具有腫瘤(例如癌瘤生長)及/或腫瘤細胞或疑似具有腫瘤及/或腫瘤細胞之肝臟的組織。舉例而言，腫瘤生檢樣本可在切開生檢(open biopsy)中獲得，切開生檢為一種自目標區域移出整個(切除生檢(excisional biopsy))或部分(切片生檢(incisional biopsy))塊體之程序。或者，腫瘤樣本可經由經皮生檢獲得，經皮生檢為一種用針狀儀器經由小切口或穿刺(有或無成像裝置輔助下)進行以獲得個體細胞或細胞團簇(例如細針抽吸(FNA))或組織芯或組織片段(針芯生檢)之程序。生檢樣本可在細胞學上(例如抹片)、組織學上(例如冷凍或石蠟切片)或使用任何其他適宜方法(例如分子診斷方法)來檢查。腫瘤樣本亦可藉由試管內收集所培養之源自個體組織之人類細胞獲得。必要時，可在分析之前由在可分析條件中保存樣本之蛋白質及/或核酸的適宜儲存方式(諸如快速冷凍或受控冷凍攝生法)來儲存腫瘤樣本。必要時，可在例如二甲亞碸(DMSO)、甘油或丙二醇-蔗糖之冷凍保護劑存在下進行冷凍。出於分析之目的，可酌情在儲存之前或之後將腫瘤樣本匯合。腫瘤樣本可來自患有例如肝細胞癌之肝癌的患者。
可用於評估樣本(例如生物樣本)中PLVAP之存在或量的適宜檢定為熟習此項技術者所知。偵測PLVAP蛋白或肽之方法包括如流動式細胞測量術(例如FACS分析)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)之免疫學及免疫化學方法，包括化學發光檢定、放射免疫檢定、免疫墨漬法(例如西方墨漬法)、免疫組織化學法(IHC)及其他基於抗體之定量法(例如基於珠粒之檢定)。其他適宜方法例如包括質譜法。舉例而言，可使用針對PLVAP之抗體來直接或間接地利用例如免疫組織化學法(IHC)測定樣本中PLVAP之存在及/或表現量。舉例而言，可由適宜之方法自生檢獲取石蠟切片，將其固定於載片上且與一或多種抗體組合。在一特定具體實例中，在樣本中之肝細胞周圍之血管內皮細胞中偵測到PLVAP蛋白指示HCC。
一種用於本發明之診斷及預後應用的例示性ELISA檢定描述於本文實施例9中。
偵測PLVAP基因表現之方法包括PLVAP核酸擴增及/或觀測。為偵測PLVAP基因表現，可由此項技術中之常規適宜方法自個體分離核酸(參見，例如Sambrook等人，1989)。隨後可對經分離核酸進行擴增(經由例如聚合酶鏈反應(PCR)(例如直接PCR、定量即時PCR、反轉錄酶PCR)、連接酶鏈反應、自持序列複製、轉錄擴增系統、Q-β複製酶或其類似方法)及觀測(經由例如在擴增期間對核酸進行標記，暴露於嵌入化合物/染料、探針)。亦可在取自例如腫瘤生檢之組織樣本之石蠟切片中直接使用例如經標記核酸探針(例如螢光原位雜交(FISH))之核酸探針，或使用其他適宜方法來偵測PLVAP RNA(例如mRNA)或其表現。亦可由南方墨漬法或於溶液中(例如染料、探針)評估其PLVAP基因表現。另外，可使用基因晶片、微陣列、探針(例如量子點)或其他該類裝置(例如感測器、奈米感測器/偵測器)來偵測PLVAP基因之表現及/或差異表現。
在一具體實例中，可藉由偵測患者樣本中PLVAP基因產物(例如PLVAP mRNA、PLVAP蛋白)之表現來診斷肝細胞癌。因此，該方法不需要比較患者樣本中之PLVAP表現與對照組中之PLVAP表現。可由本文所述之方法或其他適宜檢定來判定PLVAP存在與否。在另一具體實例中，可藉由比較樣本中之PLVAP表現與適宜對照組之PLVAP表現來測定PLVAP表現之增加。適宜對照組包括例如個體之非贅生性組織樣本、非癌性細胞、非轉移性癌細胞、非惡性(良性)細胞或其類似物或適宜之已知或經測定參考標準。參考標準可為PLVAP蛋白或RNA表現之典型的正常或標準化範圍或量(例如表現標準)。因此，該方法不需要評估適宜對照組中基因/蛋白質之表現。
在另一具體實例中，可藉由偵測患者樣本中之PLVAP基因複本數來診斷肝細胞癌。舉例而言，在一些具體實例中，PLVAP基因複本數大於2(例如基因複本數為3或4)可診斷患HCC。典型地，正常人類細胞之PLVAP基因複本數應為2。因此，雖然可使用對照組，但基於PLVAP基因複本數之診斷方法不需要偵測患者對照樣本中之PLVAP基因複本數。適宜之對照組包括例如個體之非贅生性組織樣本、非癌性細胞、非轉移性癌細胞、非惡性(良性)細胞或其類似物或適宜之已知或經測定參考標準(例如PLVAP基因複本數目為2之參考標準)。患者樣本中之PLVAP基因複本數可由諸如螢光原位雜交(FISH)之適宜技術來測定。
PLVAP抗體
如本文所述，結合PLVAP之抗體在診斷及治療人類個體之HCC方面具有效用。舉例而言，可使用特異性結合PLVAP之抗體來藉由免疫組織化學染色(IHC)偵測肝芯生檢試樣或針抽出物中肝細胞癌之毛細血管內皮細胞上之PLVAP的存在。另外，可用適當示蹤劑(例如放射性同位素)標記針對PLVAP之抗體(例如人類化抗體、嵌合抗體)以進行免疫正電子發射斷層攝影術(免疫PET)(Clin Cancer Res 12:1958-1960,2006；Clin Cancer Res 12:2133-2140,2006)，來測定個體肝臟中之佔位性病灶是否為肝細胞癌。出於治療目的，亦可用細胞毒性劑(放射性或非放射性的)標記抗PLVAP抗體(例如人類化抗體)(Weiner LM,Adams GP,Von Mehren M. Therapeutic monoclonal antibodies: General principles,Cancer:Principles & Practice of Oncology.第6版,DeVita VT,Hellman S,Rosenberg SA編,Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins;2001:495-508;Levinson W,Jawetz E. Medical Microbiology & Immunology.第4版,Stamford:Appleton & Lange;1996:307-47；Scheinberg DA,Sgouros G,Junghans RP. Antibody-based immunotherapies for cancer,Cancer Chemotherapy & Biotherapy:Principles and Practice.第3版,Chabner BA,Longo DL編,Philadelphia:Lippincott Williams & Wilkins;2001:850-82)。
因此，在一具體實例中，本發明提供一種結合(例如特異性結合)PLVAP蛋白(例如人類PLVAP蛋白(SEQ ID NO:23))之抗體。特異性結合PLVAP蛋白之抗體尤其可為多株抗體、單株抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化抗體、鑲飾抗體及單鏈抗體以及抗體片段(例如Fv、Fc、Fd、Fab、Fab'、F(ab')、scFv、scFab、dAb)。(參見，例如Harlow等人,Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。特異性結合PLVAP蛋白之抗體可由習知方法或其他適宜技術產生、構築、工程改造及/或分離。舉例而言，可針對適當免疫原產生對PLVAP蛋白具有特異性之抗體，該適當免疫原為諸如重組哺乳動物(例如人類)PLVAP蛋白(例如SEQ ID NO:23)或其一部分(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40)(包括合成分子，例如合成肽)。已描述多種此類免疫方法(參見，例如Kohler等人,Nature,256: 495-497(1975)及Eur. J. Immunol .6: 511-519(1976)；Milstein等人,Nature 266:550-552(1977) ；Koprowski等人,美國專利第4,172,124號；Harlow,E.及D. Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,NY)；Current Protocols In Molecular Biology ,第2卷(增刊27,'94夏季),Ausubel,F.M.等人編,(John Wiley & Sons:New York,NY),第11章(1991))。亦可藉由用表現PLVAP之細胞(例如癌細胞/細胞系)或經工程改造以表現PLVAP之細胞(例如經轉染細胞)使適宜之宿主(例如小鼠)免疫來產生抗體。(參見，例如Chuntharapai等人,J. Immunol .,152:1783-1789(1994)；Chuntharapai等人，美國專利第5,440,021號。)
在免疫後之適當時間，例如當抗體力價最高時，可自經免疫動物獲得抗體產生細胞且由標準技術使用該等抗體產生細胞製備單株抗體，該等技術為諸如最初由Kohler及Milstein描述之融合瘤技術(Nature 256 :495-497,1975)、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人,Immunol. Today 4:72,1983)、EBV-融合瘤技術(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss公司，第77-96頁,1985)或三源融合瘤(trioma)技術。產生融合瘤之技術已為熟知(一般參見Current Protocols in Immunology,Coligan等人(編),John Wiley ＆ Sons公司,New York,NY,1994)。簡言之，使不朽細胞系(典型地為骨髓瘤)與如上所述經免疫原免疫之哺乳動物之淋巴細胞(典型地為脾細胞)融合，且篩選所得融合瘤細胞之培養上清液以鑑別產生結合本文所述之多肽之單株抗體的融合瘤。
出於產生針對本發明多肽之單株抗體的目的，可應用許多用於使淋巴細胞與不朽化細胞系融合之熟知方案中之任一方案(參見，例如Current Protocols in Immunology,同上；Galfre等人,Nature ,266 :55052,1977；R.H. Kenneth,Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses,Plenum Publishing公司,New York,New York,1980；及Lerner,Yale J. Bio1. Med. 54 :387-402,1981)。此外，一般技術人員應瞭解，該等方法之許多變化亦應適用。
在一具體實例中，本發明係關於一種由鼠類融合瘤KFCC-GY4產生之單株抗PLVAP抗體。在另一具體實例中，本發明係關於一種由鼠類融合瘤KFCC-GY5產生之單株抗PLVAP抗體。本發明進一步係關於鼠類融合瘤細胞系KFCC-GY4及KFCC-GY5本身以及自此等融合瘤獲得之細胞。
在一個製備單株抗體分泌融合瘤之替代方案中，可藉由用目標多肽篩選重組免疫球蛋白組合文庫(例如抗體噬菌體呈現文庫)，從而分離結合多肽之免疫球蛋白文庫成員來鑑別並分離針對PLVAP蛋白之單株抗體。產生及篩選噬菌體呈現文庫之套組可購得(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM 噬菌體呈現套組，目錄號240612)。另外，尤其適用於產生及篩選抗體呈現文庫之方法及試劑的實例可見於例如美國專利第5,223,409號；PCT公開案第WO 92/18619號；PCT公開案第WO 91/17271號；PCT公開案第WO 92/20791號；PCT公開案第WO 92/15679號；PCT公開案第WO 93/01288號；PCT公開案第WO 92/01047號；PCT公開案第WO 92/09690號；PCT公開案第WO 90/02809號；Fuchs等人,Bio /Technology 9 :1370-1372,1991；Hay等人,Hum. Antibodies Hybridomas 3 :81-85,1992；Huse等人,Science 246 :1275-1281,1989；及Griffiths等人,EMBO J. 12 :725-734,1993。
抗體片段(例如抗原結合片段)可由酶促裂解或重組技術產生。舉例而言，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分別產生Fab或F(ab')2 片段。具有必需受質特異性之其他蛋白酶亦可用於產生Fab或F(ab')2 片段。
亦可使用在天然終止位點上游已引入一或多個終止密碼子之抗體基因以多種截斷形式產生抗體。舉例而言，可設計編碼F(ab')2 重鏈部分之嵌合基因以包括編碼重鏈CH1 域及鉸鏈區之DNA序列。
本發明及術語「抗體」亦涵蓋包含源自不同物種之部分的單鏈抗體、人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、靈長類化(CDR移植)抗體或鑲飾抗體。此等抗體之各個部分可由習知技術以化學方式連接在一起，或可使用遺傳工程改造技術製備成相連蛋白。舉例而言，可表現編碼嵌合鏈或人類化鏈之核酸來產生相連蛋白。參見，例如Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Cabilly等人，歐洲專利第0,125,023 B1號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Boss等人，歐洲專利第0,120,694 B1號；Neuberger,M.S.等人,WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人,歐洲專利第0,194,276 B1號；Winter,美國專利第5,225,539號；Winter,歐洲專利第0,239,400 B1號；Queen等人，歐洲專利第0 451 216 B1號；及Padlan,E.A.等人,EP 0 519 596 A1。亦參見Newman,R.等人,BioTechnology,10: 1455-1460(1992)(關於靈長類化抗體)及Ladner等人，美國專利第4,946,778號；及Bird,R.E.等人,Science,242: 423-426(1988)(關於單鏈抗體)。
在一特定具體實例中，本發明係關於特異性結合PLVAP(例如包含SEQ ID NO:23之人類PLVAP蛋白)之嵌合抗體。在一具體實例中，本發明之嵌合抗體包含人類IgG4之至少一個重鏈及至少一個輕鏈(例如κ輕鏈)。本發明之例示性嵌合抗體的產生及其特性之測定描述於本文實施例7中。
在另一具體實例中，本發明係關於特異性結合PLVAP(例如包含SEQ ID NO:23之人類PLVAP蛋白)之人類化抗體。本發明之人類化抗體可包含例如至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102及其組合；及/或至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108及其組合。
可使用合成或重組DNA技術利用標準方法或其他適宜技術產生人類化抗體。亦可使用PCR突變誘發方法構築編碼人類化可變區之核酸(例如cDNA)序列來改變編碼人類鏈或人類化鏈之DNA序列，諸如先前人類化可變區之DNA模板(參見，例如Kamman.M.等人,Nucl. Acids Res.,17 :5404(1989)；Sato,K.等人,Cancer Research,53 :851-856(1993)；Daugherty,B.L.等人,Nucleic Acids Res.,19(9): 2471-2476(1991)；及Lewis,A.P.及J.S. Crowe,Gene,101 :297-302(1991))。使用此等或其他適宜方法，亦可易於產生變異體。在一具體實例中，可使經選殖可變區(例如dAb)突變，且可選擇編碼具有所要特異性之變異體的序列(例如自噬菌體文庫；參見，例如Krebber等人,U.S. 5,514,548；Hoogenboom等人,WO 93/06213,1993年4月1日公開)。
亦可由商業來源產生及/或自商業來源獲得人類化抗體，該等商業來源包括例如Antitope有限公司(Cambridge,UK)。基於Antitope有限公司之Composite Human AntibodyTM 技術產生人類化抗體之例示性方法描述於本文實施例8中。
可使用產生或分離具有必需特異性之抗體的其他適宜方法，包括例如自文庫(例如噬菌體呈現文庫)選擇重組抗體或抗體結合片段(例如dAb)之方法或依賴於使轉殖基因動物(例如小鼠)免疫之方法。能夠產生人類抗體集合庫(repertoire)之轉殖基因動物在此項技術中已為熟知(例如(Abgenix,Fremont,CA))且可使用適宜之方法產生(參見，例如Jakobovits等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :2551-2555(1993)；Jakobovits等人,Nature,362 :255-258(1993)；Lonberg等人，美國專利第5,545,806號；Surani等人，美國專利第5,545,807號；Lonberg等人,WO 97/13852)。
對PLVAP具有特異性之抗體一旦產生即可易於使用此項技術中所熟知之篩選及分離特異性抗體之方法來鑑別。參見，例如Paul(編),Fundamental Immunology,Raven Press,1993；Getzoff等人,Adv. in Immunol. 43:1-98,1988；Goding(編),Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press有限公司,1996；Benjamin等人,Ann. Rev. Immunol. 2:67-101，1984。多種檢定可用於偵測特異性結合PLVAP蛋白之抗體。例示性檢定詳細描述於Antibodies:ALaboratory Manual,Harlow及Lane(編),Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988中。該等檢定之代表性實例包括：並行免疫電泳、放射免疫檢定、放射免疫沈澱、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、點漬墨漬檢定或西方墨漬檢定、抑制檢定或競爭檢定及夾心檢定。
在某些具體實例中，本發明之抗體對PLVAP具有高結合親和力。該等抗體對PLVAP之親和力(例如結合親和力)(以Kd 表示)較佳應為至少約10-7 M(例如約0.4×10-7 M、約0.6×10-7 M、約4.06×10-7 M、約4.64×10-7 M)或更高，例如至少約10-8 M(例如約5.98×10-8 M)、至少約10-9 M或至少約10-10 M(例如約9.78×10-10 M)，諸如約9.78×10-10 M。抗體之結合親和力可易於由一般熟習此項技術者使用例如史卡查分析(Scatchard analysis)(Scatchard,G.,Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672,1949)來測定。結合親和力亦可使用市售生物感測儀器(BIACORE,Pharmacia Biosensor,Piscataway,N.J.)測定，在該儀器中蛋白質固定於受體晶片之表面上。參見Karksson,J. Immunol. Methods 145:229-240,1991及Cunningham及Wells,J. Mol. Biol. 234:554-563,1993。此系統允許測定締合速率及解離速率(自其可計算結合親和力)及評估結合之化學計量。
本發明之抗體可包括標記，諸如允許偵測生物樣本中之抗體及抗體所結合之蛋白質(例如PLVAP)的可偵測標記。可偵測標記尤其適於診斷應用。舉例而言，可用可由熟習此項技術者使用γ計數器、閃爍計數器或自動放射攝影術或其他適宜方式偵測之放射性同位素(radioactive isotope/radioisotope)標記PLVAP抗體。適用於本發明目的之同位素包括(但不限於)：3 H、125 I、131 I、32 P、35 S、14 C、51 Cr、36 Cl、57Co、58 Co、59 Fe及75 Se。
亦可用螢光化合物(例如染料)標記本發明抗體。當經螢光標記之抗體暴露於適當波長之光時，隨後因化合物之螢光而可偵測該化合物之存在。最常用之螢光標記為異硫氰酸螢光素、玫瑰紅(rhodamine)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、藻藍蛋白(phycocyanin)、別藻藍蛋白(allophycocyanin)、鄰苯二甲醛及螢光胺(fluorescamine)。亦可使用諸如152 Eu或其他鑭系金屬之螢光發射金屬標記本發明抗體。可使用金屬螯合基使此等金屬與抗體分子連接，該等金屬螯合基為諸如二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、四氮雜環十二烷四乙酸(DOTA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。
本發明抗體亦可與化學發光化合物偶合。適用之化學發光標記化合物的實例為流明諾(luminol)、異流明諾(isoluminol)、舍瑪緹吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓鹽及草酸酯。
同樣地，可使用生物發光化合物標記本發明抗體。生物發光為一種在催化蛋白增加化學發光反應之效率的生物系統中所發現之化學發光類型。生物發光蛋白之存在係藉由偵測發光之存在測定。出於標記抗體之目的，適用之生物發光化合物為螢光素、螢光素酶及水母發光蛋白(aequorin)。
舉例而言，若可偵測標記為放射性γ發射體，則經標記抗體之偵測可由閃爍計數器實現；或舉例而言，若標記為螢光物質，則由螢光計實現。在酶標記之情況下，偵測可由使用該酶之受質的比色法實現。亦可藉由目測比較受質之酶促反應程度與類似製備之標準物的酶促反應程度來實現偵測。
因此，亦可使用本發明抗體作為組織切片之染色劑。舉例而言，可使結合PLVAP之經標記抗體與患者之組織樣本(例如肝組織生檢樣本或細針抽出物)接觸。隨後可洗滌此切片且使用適當方式偵測標記。
出於治療HCC之目的，本發明之PLVAP抗體可包括放射性標記或增強表現PLVAP之細胞(例如HCC細胞周圍之血管內皮細胞)之破壞的其他治療劑。適於在HCC療法中使用之放射性同位素標記之實例包括(但不限於)125 I、131 I、90 Y、67 Cu、217 Bi、211 At、212 Pb、47 Sc、109 Pd、111 In及118 Re。視情況可使用在用諸如硼之中子輻射轟擊後即發射α及β粒子之標記作為治療性PLVAP抗體之標記。
治療性抗體亦可包括能夠選擇性地殺死表現PLVAP之細胞的細胞毒性劑。舉例而言，可使用細菌毒素，諸如白喉毒素(diphtheria toxin)或篦麻毒素(ricin)。產生包含白喉毒素之片段A之抗體的方法教示於美國專利第4,675,382號(1987)中。白喉毒素含有兩個多肽鏈。B鏈使毒素與細胞表面上之受體結合。A鏈實際上進入細胞質且藉由使延伸因子2失活來抑制蛋白質合成，該因子伴隨ETP水解使核糖體沿mRNA易位。參見Darnell,J.等人,Molecular Cell Biology,Scientific American Books公司,第662頁(1986)。或者，可製備包含篦麻毒素(一種毒性凝集素)之抗體。其他適宜之細胞毒性劑為熟習此項技術者所知。
對於活體內偵測，可使本發明之PLVAP抗體直接或藉由使用中介官能基與放射性核種結合。常用於使以金屬陽離子形式存在之放射性同位素與抗體結合之中介基團為二伸乙三胺五乙酸(DTPA)或四氮雜環十二烷四乙酸(DOTA)。以此方式結合之金屬陽離子的典型實例為99 Tc、123 I、111 In、131 I、97 Ru、67 Cu、67 Ga及68 Ga。
此外，可用包括順磁性原子之NMR成像劑標記本發明抗體。使用NMR成像劑允許使用NMR技術於活體內診斷患者之HCC的存在及程度。以此方式尤其適用之元素為157 Gd、55 Mn、162 Dy、52 Cr及56 Fe。
PLVAP拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑可為抑制(例如降低、遏制)PLVAP基因產物之活性的任何藥劑。PLVAP活性包括(但不限於)HCC腫瘤之形成、生長、血管形成或發展。在一特定具體實例中，PLVAP拮抗劑藉由特異性結合PLVAP基因產物(例如PLVAP RNA、PLVAP蛋白)來抑制PLVAP基因產物之活性。PLVAP拮抗劑亦涵蓋抑制(降低、減少、阻止)PLVAP基因或基因產物(例如PLVAP RNA、PLVAP蛋白)之表現(例如轉錄、mRNA加工、轉譯)的藥劑。PLVAP拮抗劑尤其可為抗體、小分子、肽、擬肽或核酸。
抗體拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑可為特異性結合PLVAP蛋白之抗體。該等抗體包括(但不限於)本文所述之任何PLVAP特異性抗體。
小分子拮抗劑
PLVAP拮抗劑亦可為小分子。小分子之實例包括有機化合物、有機金屬化合物、無機化合物以及有機化合物、有機金屬化合物或無機化合物之鹽。小分子中之原子典型地經由共價鍵及/或離子鍵鍵聯在一起。小有機分子中之原子排列可表示鏈(例如碳-碳鏈或碳-雜原子鏈)或可表示含碳原子之環(例如苯或多環系統)或含碳與雜原子組合之環(亦即雜環，諸如嘧啶或喹唑啉)。雖然小分子可具有任何分子量，但其一般包括小於約5,000道爾頓(dalton)之分子。舉例而言，該等小分子可小於約1000道爾頓，且較佳小於約750道爾頓，或更佳小於約500道爾頓。小分子及其他非肽PLVAP拮抗劑可在自然界中發現(例如鑑別、分離、純化)及/或以合成方法產生(例如經由傳統有機合成、生物介導性合成或其組合)。參見，例如Ganesan,Drug Discov. Today 7(1):47-55(2002年1月)；Lou,Drug Discov. Today,6(24):1288-1294(2001年12月)。天然產生之小分子的實例包括(但不限於)激素、神經傳遞質、核苷酸、胺基酸、糖、脂質及其衍生物。
肽拮抗劑
本發明之PLVAP拮抗劑亦可為結合PLVAP蛋白之肽。該肽可包含任何適宜之L-胺基酸及/或D-胺基酸，例如常見α-胺基酸(例如丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸)、非α-胺基酸(例如β-丙胺酸、4-胺基丁酸、6-胺基己酸、肌胺酸、抑胃酶胺酸(statine))及非常見胺基酸(例如瓜胺酸、高瓜胺酸、高絲胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、鳥胺酸)。肽上之胺基、羧基及/或其他官能基可為自由的(例如未經修飾)或經適宜保護基保護。胺基及羧基之適宜保護基及添加或移除保護基之方法在此項技術中已知且揭示於例如Green及Wuts,「Protecting Groups in Organic Synthesis」 ,John Wiley and Sons,1991中。亦可使用此項技術中已知之方法使肽之官能基衍生(例如烷基化)。
必要時，肽PLVAP拮抗劑可包含一或多種修飾(例如胺基酸連接子、醯化、乙醯化、醯胺化、甲基化、末端修飾子(例如環化修飾))。肽亦可含有化學修飾(例如N-甲基-α-胺基取代)。另外，肽拮抗劑可為已知及/或天然產生之肽的類似物，例如具有保守性胺基酸殘基取代之肽類似物。此等修飾可改良肽之各種性質(例如溶解性、結合性)，包括其PLVAP拮抗活性。
肽類PLVAP拮抗劑可為線性、分枝或環狀的，例如具有包括數個醯胺鍵之雜原子環結構的肽。在一特定具體實例中，肽為環肽。該等肽可由熟習此項技術者使用標準技術產生。舉例而言，肽可藉由酶促裂解或化學裂解自原生蛋白得到或移出或可由例如固相肽合成(例如梅里菲爾德型合成(Merrifield-type synthesis))之適宜方法合成(參見，例如Bodanszky等人, 「Peptide Synthesis 」,John Wiley ＆ Sons,第2版,1976)。作為PLVAP拮抗劑之肽亦可例如使用重組DNA方法或其他適宜方法產生(參見，例如Sambrook J.及Russell D.W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
可合成肽且將其組裝成包含數個至許多離散分子物質之文庫。可使用組合化學方法製備該等文庫且可使用任何適宜方法進行篩選來判定文庫是否包含具有所要生物活性之肽。隨後可使用熟習此項技術者已知之適宜方法分離該等肽拮抗劑。
擬肽拮抗劑
PLVAP拮抗劑亦可為擬肽。舉例而言，可製備具有與肽相同之官能基的多醣。舉例而言，可藉由在肽劑結合或將結合目標分子之環境中建立該肽劑之三維結構來設計擬肽。擬肽包含至少兩個組成部分，結合部分及骨架或支撐結構。
結合部分為將與例如人類PLVAP之目標分子反應或與之形成複合物(例如經由疏水性或離子相互作用)之化學原子或基團。舉例而言，擬肽中之結合部分可與肽或蛋白質拮抗劑中之結合部分相同。結合部分可為以與肽拮抗劑中之結合部分相同或類似之方式與受體反應的原子或化學基團。舉例而言，可使用計算化學來設計結合PLVAP蛋白之肽的肽模擬物。適於在設計肽中之鹼性胺基酸之擬肽中使用之結合部分的實例包括含氮基團，諸如胺、銨、胍及醯胺或鏻。適於在設計酸性胺基酸之擬肽中使用之結合部分的實例包括例如羧基、低碳烷基羧酸酯、磺酸、低碳烷基磺酸酯或亞磷酸或其酯。
支撐結構為當與結合部分結合時提供擬肽之三維構型的化學實體。支撐結構可為有機或無機的。有機支撐結構之實例包括多醣、有機合成聚合物之聚合物或寡聚物(諸如聚乙烯醇或聚乳酸交酯)。支撐結構較佳具有與肽骨架或肽支撐結構實質上相同之大小及尺寸。此可藉由計算或量測肽及擬肽之原子及鍵的大小來決定。在一具體實例中，肽鍵之氮可經氧或硫取代，例如形成聚酯骨架。在另一具體實例中，羰基可經磺醯基或亞磺醯基取代，從而形成聚醯胺(例如聚磺醯胺)。可製備肽之反醯胺(reverse amide)(例如用一或多個-CONH-基團取代-NHCO-基團)。在另一具體實例中，可用聚矽烷骨架取代肽骨架。
此等化合物可由已知方法製造。舉例而言，可由以下方法製備聚酯擬肽：用羥基取代胺基酸上之相應α-胺基，從而製備羥酸且繼而酯化羥酸，視情況封阻鹼性及酸性側鏈以使副反應最少。決定化學結構後，一般可容易地鑑別決定出適當化學合成途徑。
可合成擬肽且將其組裝成包含數個至許多離散分子物質之文庫。可使用熟知組合化學方法製備該等文庫且可進行篩選來判定文庫是否包含一或多種具有所要活性之擬肽。隨後可由適宜之方法分離該等擬肽拮抗劑。
核酸拮抗劑
PLVAP拮抗劑亦包括多種核酸，包括抑制PLVAP基因表現之核酸分子(例如siRNA、反義寡核苷酸、核糖核酸酶)。舉例而言，小干擾型核糖核酸(siRNA)及加工成細胞中之短siRNA樣分子之類似短髮夾型核糖核酸(shRNA)可阻止PLVAP蛋白之表現(轉譯)。siRNA分子可為長度一般為約20個至約25個核苷酸之聚核苷酸且經設計以結合特異性RNA序列(例如PLVAP mRNA序列)。siRNA以序列特異性方式使基因表現保持靜默，該等siRNA結合目標RNA(例如具有互補序列之RNA)且使RNA經內切核糖核酸酶降解。能夠抑制PLVAP基因產物表現之siRNA分子可由適宜之方法產生。可使用若干演算法來設計結合相關基因序列之siRNA分子(參見，例如Mateeva O.等人，Nucleic Acids Res . 35(8):Epub,2007；Huesken D.等人,Nat. Biotechnol . 23:995-1001；Jagla B.等人,RNA 11:864-872,2005；Shabalinea S.A.BMC Bioinformatics 7:65,2005；Vert J.P.等人,BMC Bioinformatics 7:520,2006)。可利用可穩定表現siRNA或shRNA之表現載體。(參見，例如Brummelkamp,T.R.,Science 296:550-553,2002；Lee,NS等人,Nature Biotechnol . 20:500-505,2002；Miyagishi,M.及Taira,K.,Nature Biotechnol . 20:497-500,2002；Paddison,P.J.等人,Genes & Dev . 16:948-958,2002；Paul,C.P.等人,Nature Biotechnol . 20:505-508；2002；Sui,G.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(6):5515-5520,2002；Yu,J-Y等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052,2002；Elbashir,SM等人,Nature 411:494-498,2001)。siRNA/shRNA分子之穩定表現有利於癌症治療，因為其使分子能夠長期表現，從而潛在地減少及/或消除對重複治療之需要。
亦可使用反義寡核苷酸(例如DNA、核糖探針(riboprobe))作為抑制PLVAP表現之PLVAP拮抗劑。反義寡核苷酸一般為短(約13個至約25個核苷酸)單股核酸，其與目標核酸序列(例如mRNA)特異性雜交且誘導目標核酸降解(例如經由RNase H依賴性機制使RNA降解)或空間上阻礙拼接或轉譯機構發展。(參見，例如Dias N.及Stein C.A.,Mol. Can. Ther . 1:347-355,2002)。可使用許多不同類型之反義寡核苷酸作為PLVAP拮抗劑，包括甲基膦酸寡核苷酸、硫代磷酸寡核苷酸、核糖2'位之氫經O -烷基(例如甲基)置換之寡核苷酸、聚醯胺核酸(PNA)、磷醯二胺嗎啉代寡聚物(去氧核糖部分經嗎啉環置換)、PN(核糖3'位之氧經胺基以N3'→P5'置換)及嵌合寡核苷酸(例如2'-O -甲基/硫代磷酸酯)。可使用預測演算法設計反義寡核苷酸以使之對某種蛋白質具有特異性。(參見，例如Ding,Y.及Lawrence,C. E.,Nucleic Acids Res. ,29: 1034-1046,2001；Sczakiel,G.,Front. Biosci. ,5: D194-D201,2000；Scherr,M.等人,Nucleic Acids Res. ,28: 2455-2461,2000；Patzel,V.等人,Nucleic Acids Res. ,27: 4328-4334,1999；Chiang,M.Y.等人,J. Biol. Chem. ,266: 18162-18171,1991；Stull,R. A.等人,Nucleic Acids Res. ,20: 3501-3508,1992；Ding,Y.及Lawrence,C. E.,Comput. Chem. ,23: 387-400,1999；Lloyd,B. H.等人,Nucleic Acids Res. ,29: 3664-3673,2001；Mir,K. U.及Southern,E. M.,Nat. Biotechnol. ,17: 788-792,1999；Sohail,M.等人,Nucleic Acids Res. ,29: 2041-2051,2001；Altman,R. K.等人,J. Comb. Chem. ,1: 493-508,1999)。可由適宜之方法產生反義寡核苷酸；例如使用自動化核酸合成儀(來自例如Applied Biosystems)合成核酸(例如DNA、RNA、PNA)(亦參見Martin,P.,Helv. Chim. Acta 78:486-504,1995)。亦可使反義寡核苷酸在含有適當表現載體之細胞中穩定表現。
反義寡核苷酸可經由吸附胞吞過程由目標細胞(例如腫瘤細胞)吸收。因此，在個體(例如哺乳動物)治療中，可經由例如注射或輸注將反義PLVAP寡核苷酸遞送至目標細胞(例如腫瘤細胞)。舉例而言，經純化寡核苷酸或siRNA/shRNA可單獨投予或以與適宜之藥物遞送媒劑(例如脂質體、陽離子聚合物(例如聚-L-離胺酸)、PAMAM樹枝狀聚合物、聚氰基丙烯酸烷酯奈米粒子及聚乙亞胺)之調配物形式投予或與適宜之載體肽(例如同源異型轉錄因子(homeotic transcription factor)、觸足肽(Antennapedia peptide)、HIV-1之Tat蛋白、E5CA肽)偶合。
亦可使用核糖核酸酶作為抑制PLVAP表現之PLVAP拮抗劑。核糖核酸酶為具有酶促活性之RNA分子。一類核糖核酸酶能夠以核苷酸鹼基序列特異性方式使其他獨立RNA分子重複地裂解為兩個或兩個以上碎片。參見Kim等人，Proc Natl Acad Sci USA ,84 :8788(1987)；Haseloff及Gerlach,Nature ,334 :585(1988)；及Jefferies等人,Nucleic Acid Res ,17 :1371(1989)。該等核糖核酸酶典型地具有兩個功能域：催化域及引導核糖核酸酶與目標RNA經由互補鹼基配對而結合之結合序列。一旦經特異性設計之核糖核酸酶與目標mRNA結合，該核糖核酸酶即酶促裂解目標mRNA，典型地降低該目標mRNA之穩定性且破壞其直接轉譯所編碼蛋白質之能力。核糖核酸酶已裂解其RNA目標後，即自彼目標RNA釋放出且其後可結合並裂解另一目標。亦即，單一核糖核酸酶分子可重複地結合並裂解新目標。
根據本發明，核糖核酸酶可靶向編碼PLVAP之mRNA任何部分。選擇核糖核酸酶目標序列及設計並製備核糖核酸酶之方法一般在此項技術中已知。參見，例如美國專利第4,987,071號、第5,496,698號、第5,525,468號、第5,631,359號、第5,646,020號、第5,672,511號及第6,140,491號，各專利以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，可將適宜之核糖核酸酶設計成多種構型，諸如錘頭型基元、髮夾型基元、D型肝炎病毒基元、I型內含子基元或RNase PRNA基元。參見，例如美國專利第4,987,071號、第5,496,698號、第5,525,468號、第5,631,359號、第5,646,020號、第5,672,511號及第6,140,491號；Rossi等人,AIDS Res Human Retroviruses 8 :183(1992)；Hampel及Tritz,Biochemistry 28 :4929(1989)；Hampel等人,Nucleic Acids Res ,18 :299(1990)；Perrotta及Been,Biochemistry 31 :16(1992)；及Guerrier-Takada等人,Cell ,35 :849(1983)。
核糖核酸酶可由用於常規RNA合成之相同方法合成。舉例而言，適宜之方法揭示於Usman等人,J Am Chem Soc ,109 :7845-7854(1987)及Scaringe等人,Nucleic Acids Res ,18 :5433-5441(1990)中。經修飾之核糖核酸酶可由以下文獻中所揭示之方法合成：例如美國專利第5,652,094號；國際公開案第WO 91/03162號、第WO 92/07065號及第WO 93/15187號；歐洲專利申請案第92110298.4號；Perrault等人,Nature ,344 :565(1990)；Pieken等人,Science ,253 :314(1991)；及Usman及Cedergren,Trends Biochem Sci ,17 :334(1992)。
本發明之PLVAP拮抗劑亦可為結合PLVAP蛋白且抑制其活性之核酸分子(例如寡核苷酸)。適宜之核酸PLVAP拮抗劑包括能夠經由除經典華特生-克里克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)以外之相互作用以高親和力及特異性來結合相關特定分子(例如人類PLVAP)之適體(aptamer)(Tuerk及Gold,Science 249:505(1990)；Ellington及Szostak,Nature 346:818(1990))。
適體，如噬菌體呈現或單株抗體(MAb)所產生之肽能夠特異性結合所選目標且經由結合來阻斷其目標發揮功能之能力。藉由自隨機序列寡核苷酸之彙集庫(pool)中用試管內選擇過程產生，已產生超過100種蛋白質之適體，該等蛋白質包括生長因子、轉錄因子、酶、免疫球蛋白及受體。典型適體之大小為10-15kDa(30-45個核苷酸)，以低於奈莫耳之親和力結合其目標，且區別對待密切相關之目標(例如典型地不會結合來自相同基因家族之其他蛋白質)。一系列結構研究已顯示適體能夠使用推動抗體-抗原複合物中之親和力及特異性的相同類型之結合相互作用(氫鍵結、靜電互補、疏水性接觸、空間排阻等)。
可使用例如美國專利第5,475,096號及美國專利第5,270,163號中所述之稱為「指數富集的配位體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)」(SELEX)之標準方法產生及鑑別結合相關目標(例如人類PLVAP蛋白)之適體。
鑑別PLVAP拮抗劑
可在化合物及/或文庫(例如化學物質、肽、核酸文庫)之篩選(例如高產量篩選)中鑑別對PLVAP基因產物具有結合特異性之藥劑。
可例如藉由篩選市售組合抗體文庫(Dyax公司，MorphoSys AG)鑑別特異性結合人類PLVAP之抗體。適宜之組合抗體文庫及篩選此等文庫之標準方法描述於Hoet等人,Nature Biotechnology 23 (3):344-348(2005)及Rauchenberger等人,J. Biol. Chem. 278 (40):38194-38205(2003)中，其內容以引用的方式併入本文中。亦可使用所熟知之化學方法製備該等文庫或分子集合。
或者，可例如藉由用PLVAP蛋白、蛋白片段或肽以及破壞抗原耐受性之佐劑使小鼠免疫來鑑別特異性結合人類PLVAP之鼠類抗體。可針對所要特異性及活性篩選此等抗體，隨後使用已知技術人類化以產生適於治療人類疾病之藥劑。
可自以下眾多可用化合物文庫來鑑別化合物或小分子：例如國家癌症研究所化學物質儲存庫(Chemical Repository of the National Cancer Institute)及分子文庫小分子儲存庫(Molecular Libraries Small Molecules Repository)(PubChem)，以及哈佛大學化學及細胞生物學研究所(Institute of Chemistry and Cell Biology at Harvard University)之文庫及可購自商業來源(例如Chembridge、Peakdale、CEREP、MayBridge、Bionet)之其他文庫。亦可使用諸如熟知組合化學方法之熟知化學方法製備該等文庫或分子集合。可篩選文庫來鑑別結合且抑制PLVAP之化合物。
所鑑別之化合物可充當使用熟知藥物化學方法進一步多樣化之先導化合物。舉例而言，可製備作為前導物質之結構變異體的化合物集合且針對PLVAP結合性及/或抑制活性進行篩選。此可得以開發出使化合物結構與生物活性相聯繫之結構活性關係。可進一步開發出具有適宜結合性及抑制活性的化合物以供活體內使用。
可進一步評估結合PLVAP之藥劑的PLVAP拮抗活性。舉例而言，可在偵測及/或鑑別結合及拮抗PLVAP蛋白之藥劑的篩選或結合檢定中使用包含PLVAP蛋白之組成物。適於使用之組成物包括例如天然表現PLVAP蛋白之細胞(例如肝血管內皮細胞)、該等細胞之提取物及重組PLVAP蛋白。
可在例如評估測試藥劑抑制PLVAP與參考藥劑結合之能力的競爭性結合檢定中鑑別結合PLVAP蛋白之藥劑。參考藥劑可為全長PLVAP蛋白或其部分。可用適宜標記(例如放射性同位素、抗原決定基標記、親和標記(例如生物素及抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素)、自旋標記、酶、螢光基團、化學發光基團、染料、金屬(例如金、銀)、磁性珠粒)來標記參考藥劑，且可測定使檢定中PLVAP蛋白飽和所需之經標記參考藥劑的量。可使用適宜對照組(例如未經標記藥劑、單獨標記)測定PLVAP蛋白與測試藥劑之間形成複合物的特異性。
50%抑制經標記參考藥劑之特異性結合所需的測試藥劑濃度(IC50 值)即定為測試藥劑抑制參考藥劑與PLVAP蛋白之間形成複合物的能力。總結合(例如複合物中之總標記)減去非特異性結合較佳即定為特異性結合。在過量未經標記參考藥劑存在下在複合物中仍偵測到的標記量較佳即定為非特異性結合。適於在該方法中使用之參考藥劑包括特異性結合PLVAP之分子及化合物，例如結合PLVAP之抗體。
可藉由篩選具有拮抗(降低、遏制、抑制)PLVAP之一或多種活性(諸如腫瘤血管形成)之能力的藥劑來鑑別拮抗PLVAP蛋白之藥劑。該等活性可由熟習此項技術者使用任何適當試管內或活體內檢定來評估。
醫藥組成物
本發明之PLVAP拮抗劑可作為醫藥組成物或生理組成物之一部分，例如作為包含PLVAP拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物之一部分投予哺乳動物個體。包含PLVAP拮抗劑(例如特異性結合PLVAP之抗體)之調配物或組成物或包含PLVAP拮抗劑及一或多種其他治療劑(例如化學治療劑，例如阿黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、奧曲肽)之組成物將根據所選投藥途徑而變(例如溶液、乳液或膠囊)。適宜之醫藥載劑可含有不與PLVAP拮抗劑相互作用之惰性成分。可使用標準醫藥調配技術，諸如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中所述之技術。適於非經腸投藥之醫藥載劑包括例如無菌水、生理鹽水、抑菌生理鹽水(含有約0.9%mg/ml苯甲醇之生理鹽水)、磷酸鹽緩衝生理鹽水、漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏乳酸鹽(Ringer's lactate)及其類似物。調配物亦可包括少量增強活性成分之有效性的物質(例如乳化劑、助溶劑、pH值緩衝劑、潤濕劑)。囊封組成物之方法(諸如於硬明膠或環糊精包衣中)在此項技術已知。對於吸入，可將藥劑溶解且裝載於適於投藥之分配器(例如霧化器或噴霧器或加壓氣霧劑分配器)中。
診斷套組
本發明亦提供在個體中偵測肝細胞癌之存在的診斷套組。該等套組包含至少一種偵測樣本(例如哺乳動物個體之生物樣本)中PLVAP基因表現之藥劑(例如核酸探針、抗體)。可例如藉由偵測樣本中之PLVAP基因產物(諸如PLVAP mRNA或PLVAP蛋白)來偵測PLVAP基因表現。
因此，在一具體實例中，該套組包含至少一種與PLVAP RNA(例如mRNA、hnRNA)轉錄物特異性雜交之核酸探針(例如寡核苷酸探針)。該等探針能夠在高嚴格度條件下與PLVAP RNA雜交。
在另一具體實例中，該套組包括一對能夠與樣本中之PLVAP基因產物(例如mRNA、cDNA)特異性雜交之寡核苷酸引子。該等引子可在任何標準核酸擴增程序(例如聚合酶鏈反應(PCR)，例如RT-PCR、定量即時PCR)中使用來測定樣本中之PLVAP基因產物之含量。
在另一具體實例中，本發明之套組包括特異性結合PLVAP蛋白(例如人類PLVAP蛋白)之抗體。該等抗體包括本文所述之任何本發明PLVAP抗體。在一具體實例中，抗體包含具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列的VH 域及具有SEQ ID NO:9之胺基酸序列的VL 域。在另一具體實例中，抗體包含具有SEQ ID NO:14之胺基酸序列的VH 域及具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的VL 域。
本發明套組中之診斷劑可包括一或多種標記(例如可偵測標記)。診斷劑之眾多適宜標記在此項技術中已知且包括(但不限於)本文所述之任何標記。在一特定具體實例中，診斷劑(例如抗體)包括放射性同位素，使得該劑可用於免疫正電子發射斷層攝影術(免疫PET)。
現將由以下實施例說明本發明，該等實施例不欲以任何方式限制本發明。
實施例 實施例1：HCC肝組織中之PLVAP表現相對於非HCC肝組織升高 材料及方法： 組織樣本
出於治療目的自手術移出人類患者之新鮮試樣收集HCC及鄰近非腫瘤性肝臟之組織。在主治病理學醫師之直接監督下收集此等試樣。將所收集之組織立即於液氮中儲存在辜公亮基金會孫逸仙治癌中心(Koo Foundation Sun Yat-Sen Cancer Center，KF-SYSCC)之腫瘤庫。十八名HCC患者之配對的組織樣本可用於研究。研究經機構審查委員會(Institutional Review Board)批准且獲得所有患者之書面同意。此研究之十八名HCC患者的臨床特性概述於表1中。
測定mRNA轉錄物之特徵
使用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)自冷凍於液氮中之組織中分離出總RNA。使用RNAEasy Mini套組(Qiagen,Valencia,CA)進一步純化經分離之RNA，且使用RNA 6000 Nano檢定在Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)中評估其品質。研究所用之所有RNA樣本的RNA完整度數值(RIN)皆大於5.7(8.2±1.0，平均值±SD)。根據Affymetrix方案由8μg總RNA製備雜交目標且與含有針對約13,000個人類基因之22,238個探針組的Affymetrix U133A GeneChip雜交。雜交後立即使用Affymetrix GeneChip流體台400及EukGE WS2v4方案對經雜交陣列進行自動化洗滌及染色。其後，在Affymetrix GeneArray掃描儀2500中掃描U133A GeneChip。
測定微陣列資料之存在及不存在呼叫
使用Affymetrix微陣列分析套件(Microarray Analysis Suite，MAS)5.0軟體產生所有18對HCC及鄰近非腫瘤肝組織之微陣列資料的存在呼叫(present call)。測定存在呼叫之所有參數皆為預設值。由MAS 5.0將各探針組測定為「存在」、「不存在」或「微弱」。類似地，使用dChip 2004版軟體處理相同微陣列資料來測定微陣列上各探針組之「存在」、「不存在」或「微弱」狀態。
鑑別具有極端差異表現之探針組
為鑑別在HCC與鄰近非腫瘤肝組織之間具有極端差異表現之基因，根據以下規則使用以實用提取與報表語言(Practical Extraction and Report Language，PERL)編寫之軟體：由MAS 5.0與dChip將在HCC中呼叫「存在」且在鄰近非腫瘤肝組織中呼叫「不存在」或「微弱」之探針組即定為「腫瘤特異性基因」。由MAS 5.0與dChip將在HCC中呼叫「不存在」或「微弱」且在配對的鄰近非腫瘤肝組織中呼叫「存在」之探針組即定為「非腫瘤肝組織特異性基因」。圖1中展示描繪鑑別演算法之流程圖。
即時定量反轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)
使用TaqManTM 即時定量反轉錄酶PCR(qRT-PCR)來定量mRNA。根據製造商之說明書，使用1500ng寡聚(dT)引子及來自Invitrogen(Carlsbad,CA))之600個單元的SuperScriptTM II反轉錄酶自各樣本之8μg總RNA合成cDNA，最終體積為60μl。對於各RT-PCR反應，遵循製造商之說明書(ABI及Roche)，使用0.5μl cDNA作為模板，最終體積為25μl。使用Applied Biosystems 7900HT即時PCR系統進行PCR反應。實驗所需之探針及試劑係獲自Applied Biosystems(ABI)(Foster City,CA)。用於PLVAP之即時定量RT-PCR之引子及探針的序列為5'-CCTGCAGGCATCCCTGTA-3'(正向引子)(SEQ ID NO:25)；5'-CGGGCCATCCCTTGGT-3'(逆向引子)(SEQ ID NO:26)；及5'-CCCCATCCAGTGGCTG-3'(探針)(SEQ ID NO:27)。使用次黃標呤-鳥標呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)管家基因(housekeeping gene)作為標準化之內源參考。所有樣本皆在相同PCR板上針對相同目標mRNA及內源參考HPRT mRNA二重複進行。根據製造商之說明書(2號用戶公告(User Bulletin #2)，ABI Prism 7700序列偵測系統)，由比較Ct法計算目標mRNA之相對量。非腫瘤性肝樣本選作供計算用之相對校準物。
結果：
圖2中展示18對HCC及鄰近非腫瘤性肝組織之PLVAP基因表現強度。配對的HCC及鄰近非腫瘤性肝組織之平均基因表現強度分別為759.8±436.5及170.6±53.4(平均值±SD)。兩組之間的配對t測試之p值為2.8×10-5 。此等結果指示PLVAP在HCC中而非非腫瘤性肝組織中表現。當82個不配對的HCC樣本顯示與18個配對的HCC樣本之研究結果基本上相同的平均表現強度810.4±482.0(平均值±SD)(由t測試，p=0.62)(圖2)時，HCC中之此PLVAP表現升高得到進一步證實。
為證實PLVAP在HCC肝組織中而非非腫瘤性肝組織中顯著表現，對18對HCC及鄰近非腫瘤性肝組織之RNA樣本進行即時定量RT-PCR。HCC中之PLVAP mRNA之量相對於非腫瘤性肝組織顯著較高(參見圖3A及表2)。雖然結果顯示兩組之間有一定重疊，但對於所測試之所有個體而言，除一名個體以外，相同個體內HCC中之PLVAP轉錄物皆多於鄰近非腫瘤性肝組織(圖3B)。此例外情況可能與組織儲存過程中RNA降解程度不均有關。
實施例2：PLVAP係由HCC血管內皮細胞特異性表現 材料及方法： 經福馬林固定之石蠟包埋組織的雷射捕捉顯微解剖(LCM)
使用來自Arcturus Bioscience公司(Mountain View,CA)之ArcturusIIe系統、CapSureTM HS LCM帽及ParadiseTM 試劑系統對來自石蠟塊之經福馬林固定組織進行LCM。根據製造商之說明書，切割7微米厚的組織切片，脫石蠟，復水，染色且脫水以進行LCM。使用7.5μm雷射光斑大小在50mW功率及1.3ms持續時間下捕捉目標細胞於CapSureTM HS LCM帽上。據估計，各帽上捕捉5000至6000個細胞。然而，因細胞量少，各帽上僅捕捉1000至2000個肝細胞癌血管內皮細胞。
自LCM組織切片提取RNA以用於定量RT -PCR
根據製造商之說明書，使用ParadiseTM 試劑系統對如上所述捕捉於CapSureTM HS LCM帽上之細胞進行RNA提取、cDNA合成、試管內轉錄及反義RNA擴增。隨後使用經合成之反義RNA作為兩步TaqMan即時定量RT-PCR之模板來定量LCM所捕捉之細胞中之PLVAP及β-肌動蛋白mRNA。遵循製造商之方案，使用4.5μl反義RNA及TaqMan反轉錄試劑(ABI)進行第一步(亦即，反轉錄)，最終體積為10μl。使用2.4μl cDNA模板、引子/探針混合物及來自Applied Biosystems之TaqMan通用PCR Master Mix進行第二步(亦即，即時PCR)，最終體積為25μl。在Smart Cycler II(Cephid公司,Sunnyvale,CA)中進行即時PCR。在50℃下初始培育反應物2分鐘，隨後在95℃下培育10分鐘。其後，執行45次以下循環：在95℃下變性15秒且在60℃下黏接/延伸40秒。引子及探針之序列列於表3中。
表3：用於雷射捕捉顯微解剖所製備之樣本中之PLVAP及β-肌動蛋白含量的即時定量RT-PCR之引子及探針序列
製備重組融合PLVAP51-442 蛋白之表現載體
藉由將編碼PLVAP之胺基酸殘基51至442之PCR片段插入-T Easy載體(Promega公司,Madison,WI)中來產生質體-T Easy-PLVAP51-442 。藉由使用以下引子組5'-AACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3'(SEQ ID NO:34)及5'-TGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3'(SEQ ID NO:35)由來自OriGene(Rockville,MD)之PLVAP之cDNA純系擴增PCR片段。為構築質體pET-15b-PLVAP51-442 ，自-T Easy-PLVAP51-442 切下在各各別端具有NdeI及BamHI識別序列的編碼PLVAP之胺基酸殘基51至442之cDNA片段且將其插入pET-15b(Novagen公司,San Diego,CA)中。由DNA定序驗證上述表現構築體。
表現及純化重組融合PLVAP 51-442 蛋白
為產生重組的經His標記之PLVAP51-442 蛋白(SEQ ID NO:2)(圖4)，藉由將感受態細胞與pET-15b-PLVAP51-442 質體DNA在冰上一起培育5分鐘，接著在42℃水浴中培育30秒，隨後再次於冰上培育2分鐘來使大腸桿菌(Escherichia coli)(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)(Novagen)轉型。在塗於選擇性培養基上之前，將轉型體在37℃下於250rpm振盪下與SOC培養基(0.5%酵母提取物、2%胰化蛋白(Tryptone)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2 、10mM MgSO4 、20mM葡萄糖)一起培育60分鐘。在30℃下用1mM異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷誘導經His標記之融合蛋白於Rosetta-gami2(DE3)pLysS大腸桿菌中之表現，歷時16小時。誘導後，藉由在補充有8M脲之平衡緩衝液(50mM磷酸鈉、300mM NaCl(pH 7))中音波處理使細菌細胞溶解且藉由以5,600×g離心30分鐘將其分離成可溶部分及不可溶部分。為進一步純化His-PLVAP51-442 蛋白，將可溶部分裝載於金屬親和樹脂(Clontech公司,Palo Alto,CA)上，用平衡緩衝液洗滌且用洗提緩衝液(50mM磷酸鈉、300mM NaCl(pH 7)、250mM咪唑)洗提。根據製造商之說明書，藉由凝血酶裂解(Novagen)移除經純化融合蛋白之His標記(參見圖5)。藉由針對PBS進行大量透析來回收所得PLVAP51-442 蛋白。為驗證重組PLVAP蛋白之身分，自Biodesign Insitute(Tempe,AZ)購得少量針對GST-PLVAP331-430 融合蛋白之小鼠抗血清。無His標記之重組PLVAP51-442 蛋白係由西方墨漬分析使用此抗體偵測，但其不與針對His標記之抗體反應。此等結果證實重組PLVAP蛋白之身分。
產生小鼠抗人PLVAP血清
使用於PBS中之經純化PLVAP51-442 重組蛋白使6週齡Balb/cByj小鼠免疫。在多個位點處經皮下注射於完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant)(Sigma公司,St Louis,MO)中之總共14μg PLVAP51-442 蛋白使各小鼠初始免疫。其後，使用於不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuvant)中之7μg PLVAP51-442 重組蛋白加強免疫，每兩週一次，共三次。最後一次加強免疫之後一週，自小鼠放血以製備抗血清。
酶聯免疫吸附檢定(ELISA) 試劑及溶液：
1.重組PLVAP蛋白
2.抗小鼠IgG鹼性磷酸酶結合物(目錄號AP124A，CHEMICON)
3.塗佈緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM磷酸二氫鉀、0.002%(0.3mM)疊氮化鈉，pH 7.2-7.4)
4.洗滌緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM磷酸二氫鉀、0.2% Tween 20(目錄號P1379，SIGMA)，pH 7.2-7.4)
5.阻斷緩衝液(0.137M氯化鈉、0.01M磷酸氫二鈉七水合物、2mM磷酸二氫鉀、2%牛血清白蛋白(目錄號82-045，PENTEX)、0.05% Tween 20(目錄號P1379，SIGMA)，pH 7.2-7.4)
6.碳酸鹽緩衝液(0.016M碳酸氫鈉、0.014M碳酸鈉、2mM氯化鎂、0.002%(0.3mM)疊氮化鈉，pH 9.6)
7.鹼性磷酸酶受質：溶解於40ml碳酸鹽緩衝液中之一片40mg磷酸酶受質錠劑(目錄號P5994，SIGMA)
程序：
使用ELISA測定抗PLVAP血清中之抗體力價。首先，在4℃下用50μl濃度在2.5μg/ml範圍內之溶解於含有0.002%疊氮化鈉之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)(亦即，塗佈緩衝液)中之PLVAP蛋白塗佈96孔ELISA板隔夜。用200μl洗滌緩衝液(含有0.05% Tween-20之PBS)洗滌三次後，在室溫下用150μl阻斷緩衝液(亦即，含有2%牛血清白蛋白之洗滌緩衝液)阻斷經塗佈板之各孔，歷時30分鐘。再洗滌三次後，在室溫下將各孔與50μl於稀釋緩衝液中製備之經稀釋抗血清(自1,000倍連續兩倍稀釋至128,000倍)一起培育45分鐘。其後，在室溫下將各孔與稀釋5,000倍之抗小鼠IgG鹼性磷酸酶結合物(Chemico公司，Temecula,CA)一起培育30分鐘。洗滌三次後，用100μl鹼性磷酸酶受質(Sigma公司,St Louis,MO)定量所結合之抗體且在培育25至40分鐘後使用ELISA板讀取器在405nm下進行吸光度量測。
免疫組織化學(IHC)偵測經福馬林固定組織中之PLVAP
自經福馬林固定組織之石蠟塊中切割6微米切片。將切片安置於SuperFrost plus防脫玻璃載片(Menzel Glaser GmbH,Braunschweig,Germany)上。隨後處理切片以在Benchmark XT自動染色儀器(Ventana Medical Systems公司,Tucson,AZ)中使用XT-iView-DAB-V.1方案在溫和CCI條件下對PLVAP進行免疫染色，歷時30分鐘，且將切片與經稀釋400倍之抗人PLVAP血清在37℃下一起培育36分鐘。用於偵測小鼠抗人PLVAP抗體之結合性的第二抗體及試劑係來自Ventana Medical Systems公司(Tucson,AZ)之iViewTM DAB偵測套組。所有試劑及緩衝液皆購自Ventana Medical Systems。
結果：
為測定HCC樣本中PLVAP之細胞來源，使用雷射捕捉顯微解剖(LCM)自樣本中解剖出HCC血管內皮細胞、肝細胞癌之腫瘤細胞及非腫瘤性肝細胞(包括內襯肝竇內皮細胞)。歸因於肝癌細胞與毛細血管內襯內皮細胞之間緊密對合(close apposition)，故在解剖期間努力避免將毛細血管內襯內皮細胞包括在內。使用自所解剖細胞提取之RNA進行兩步即時定量RT-PCR來測定PLVAP mRNA之相對量。研究兩名不同患者之試樣。表4及圖6A-C中所示之結果指示PLVAP係由HCC血管內皮細胞表現(圖6A)，而在鄰近非腫瘤性肝組織中未偵測到可偵測之PLVAP轉錄物(圖6B)。
為進一步研究PLVAP表現之組織及疾病特異性，針對人類PLVAP之胞外域(胺基酸51至442)產生用於免疫組織化學(IHC)研究之多株抗體。如圖7中所示，自經重組PLVAP51-442 蛋白免疫之Balb/c小鼠獲得之抗血清含有高抗PLVAP抗體力價。
隨後使用抗PLVAP抗血清測定PLVAP表現於患有肝細胞癌(n=7)(圖8A-F及圖9A-F)、局部結節性增生(n=4)(圖10A-F)、肝血管瘤(n=2)(圖11A及B)、慢性活動性B型肝炎(n=2)(圖12A及B)或慢性活動性C型肝炎(n=4)(圖13A-D)及轉移性癌症(n=4)(亦即，肝內膽管癌、轉移性結腸直腸腺癌或轉移性卵巢癌)(圖14A-D)之患者的組織切片中之定位。結果顯示僅肝細胞癌之毛細血管內皮細胞表現PLVAP蛋白(圖8A、C、E及圖9A、C、E、F)。包括硬化肝、局部結節性增生肝(圖10A-F)及慢性肝炎(圖12A及B；圖13A-D)之非腫瘤性肝組織之血管竇狀小管/毛細血管的內襯內皮細胞不表現PLVAP蛋白。肝血管瘤之內皮內襯細胞亦不顯示顯著PLVAP表現(圖11A及B)。此等結果證明PLVAP為對肝細胞癌具有特異性而對其他肝病不具特異性之血管內皮生物標誌。因此，可使用PLVAP作為HCC之診斷標誌及治療目標。
實施例3：產生特異性結合PLVAP之小鼠單株抗體及測定其特性 材料及方法： 免疫程序
用溶解於0.125mL磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中且乳化於等體積之完全弗氏佐劑中之20μg經純化重組PLVAP蛋白使5隻6週齡雌性Balb/cByJ小鼠初始免疫。將體積0.05mL之PLVAP-佐劑混合物注射至靠近腋窩及鼠蹊淋巴之小鼠腹側上之四個獨立皮下位點中之每一位點中以及位於肩胛骨之間的第五個皮下位點中。所有小鼠接受腹膜內注射20μg重組PLVAP蛋白三次，每兩週一次，以加強免疫。最後一次加強免疫後一週，獲取測試血樣以量測小鼠是否正產生足夠高的抗PLVAP抗體力價(>10,000倍)。使用固相酶聯免疫吸附檢定(ELISA)達成此目的。選擇產生最高PLVAP抗體力價之小鼠產生融合瘤。
開發鼠類單株抗PLVAP抗體
在產生融合瘤之排定融合實驗之前三天，將20μg重組PLVAP靜脈內注射至產生最高PLVAP抗體力價之小鼠。根據先前所述之方案(參見Unit 2.5 Production of Monoclonal Antibodies,Current Protocols in Immunology,Coligan JE,Kruisbeek AM,Margulies DH,Shevach EM及Strober W.編,John Wiley & Sons公司出版,New York,2001)並稍作修改，製備產生針對PLVAP之單株抗體(MAb)的融合瘤。詳言之，使用50%聚乙二醇1540使自經免疫小鼠收集之脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞以7.5:1(脾細胞：骨髓瘤細胞)之比率融合。將融合產物接種於96孔平底組織培養板中，且第二天添加次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)選擇性培養基。7至10天後，由ELISA針對抗PLVAP抗體之產生篩選生長陽性孔之上清液。擴充初始產生抗PLVAP MAb之融合瘤且再篩選。由限制稀釋法選殖顯示連續產生抗體之融合瘤。使用ELISA測定MAb同型。藉由蛋白質G親和管柱層析自腹水或培養基純化單株抗體(Unit 2.7 Purification and Fragmentation of Antibodies,Current Protocols in Immunology,Coligan JE,Kruisbeek AM,Margulies DH,Shevach EM及Strober W.編,John Wiley & Sons公司出版,New York,2001)。
ELISA檢定
如本文所述進行ELISA檢定(參見實施例2)。
測定結合親和力
在ANT Technology有限公司(Taipei,Taiwan)使用ANTQ300石英晶體微量天平技術(Lin S.等人,J Immunol Methods 239 :121-124(2000))量測KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體之結合親和力。
分離及培養人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC)
根據Baudin B,Brunee A,Bosselut N及Vaubourdolle M.Nature Protocols 2:481-485(2007)中所述之既定方案進行HUVEC之分離及培養。維持內皮細胞培養期間，使用溶解於磷酸鹽緩衝生理鹽水中之1%明膠(DIFCO公司)替換塗佈培養板或蓋玻片之膠原蛋白溶液。
由含Triton X-114(TX-114)之緩衝液提取HUVEC之疏水性膜蛋白
將50萬個HUVEC接種於10cm培養皿中，歷時24小時。隨後用40ng/ml人類VEGF再刺激細胞72小時。用5ml磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗滌經培養細胞兩次。隨後藉由將該等細胞與含有2mM EDTA之1ml PBS一起培育使其自培養皿脫離並提昇(lift)，將其置放於離心管中，且藉由以300×g離心來收集，歷時5分鐘。離心所產生之小球中存在約兩百萬個細胞。將細胞小球再懸浮於200μl含有5mM EDTA及0.5%(v/v)Triton X-114(TX-114)之冰冷0.05M Tris緩衝液(pH 7.4)中。在不定期輕緩渦漩下於冰上培育經溶解細胞之懸浮液。其後，在4℃下以10,000×g離心細胞懸浮液10分鐘以移除不可溶細胞碎屑。將上清液轉移至潔淨的微量離心管中且在37℃下培育5分鐘。培育期間，TX-114與水相分離。隨後在室溫下使微量離心管以1000×g離心10分鐘，使得TX-114離心至管底部。移除管上部之水相且將含有疏水性細胞蛋白質之TX-114小球溶解於2×SDS丙烯醯胺凝膠樣本緩衝液中，最終體積為50μl。使用15μl樣本進行SDS丙烯醯胺凝膠電泳。
SDS丙烯醯胺凝膠電泳，製備西方墨漬及免疫墨漬分析
程序與Kao KJ,Scornik JC及McQueen CF.Human Immunol 27:285-297(1990)先前所述之程序相同，僅稍作修改。使用鹼性磷酸酶化學發光受質及LAS-4000發光影像分析儀(Fujifilm公司)進行西方墨漬上抗體結合性之偵測。
免疫螢光顯微術 材料：
1)初級抗體：
a)溶解於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中之正常小鼠IgG(Sigma公司，目錄號I-5381)(1mg/mL)作為儲備溶液，使用前用PBS-0.5% BSA稀釋至5μg/mL之濃度；
b)單株小鼠抗人馮威里氏因子(von Willebrand factor，vWF)(DakoCytomation公司，目錄號M0616)，使用前用含有0.5% BSA之PBS稀釋50倍；
c)經純化KFCC-GY4及KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體，使用前用含有0.5% BSA之PBS稀釋至5μg/ml；
2)二級抗體：經FITC結合之山羊F(ab')2 抗小鼠IgG(H&L)(Serotec公司，目錄號Star105F)；
3)具有DAPI之VectaShield封固劑(Mounting Medium)(Vector Labs 公司，目錄號H-1200)；
4)100%甲醇(Merck公司，目錄號1.06009)；及5)漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)(Gibco公司，目錄號12065-056)，使用前稀釋至1倍。
程序：
為製備人類臍帶血管內皮細胞以供免疫螢光研究，將5萬個細胞置放於24孔培養板之各孔中，各孔底部置放1.5cm無菌圓形蓋玻片。各孔含有0.5ml補充有20%胎牛血清、1% L-麩醯胺酸、1%抗生素/抗黴素溶液、50μg/ml肝素及75μg/ml內皮細胞生長補充劑(Sigma公司，E0760)的M199培養基。用200μl於0.04%乙酸(v/v)中之0.4mg/ml小牛皮膠原蛋白(Sigma公司，C9791)預塗佈各蓋玻片隔夜。隨後用無菌1×磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)洗滌蓋玻片，接著風乾備用。培養細胞隔夜，隨後用40ng/ml血管內皮生長因子(VEGF)再刺激72小時。使用蓋玻片上之細胞進行免疫螢光程序。
為將細胞染色以進行免疫螢光顯微術，用0.5ml 1×HBSS洗滌各孔中生長於蓋玻片上之細胞。隨後將細胞固定且滲透於0.5ml冰冷甲醇中，歷時5分鐘。用0.5ml 1×PBS洗滌經固定之細胞三次，每次洗滌5分鐘。隨後在室溫下用0.5ml含有0.5% BSA之1×PBS阻斷經固定之細胞1小時。移出含有經固定之細胞的蓋玻片且置放於0.2ml含有5μg/ml正常IgG、KFCC-GY4或KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體或稀釋50倍之抗人vWF單株抗體的經稀釋初級抗體溶液上，使經固定之細胞朝下且與抗體溶液接觸。將抗體溶液置放在於經覆蓋之小塑膠容器中之一片石蠟膜上。藉由置放一小片用水潤濕之濾紙維持內部濕度。
在含濕容器中於37℃下培育1小時後，移出蓋玻片且用0.5ml PBS洗滌蓋玻片上之細胞三次，每次5分鐘。隨後如關於與初級抗體溶液一起培育所述，在37℃下將經固定之細胞與0.2ml稀釋200倍的經FITC結合之山羊F(ab')2 抗小鼠IgG二級抗體一起培育50分鐘。其後，如上所述，用PBS洗滌細胞3次。使用VectaShield防褪色溶液將經染色細胞安置於玻璃載片上。自蓋玻片邊緣移除過量封固劑且用指甲油將邊緣密封。使用螢光顯微鏡檢查經染色細胞。
結果
用重組人類PLVAP蛋白使Balb/cByJ小鼠免疫促使開發出產生識別人類PLVAP蛋白之單株抗體(mAb)的融合瘤。選擇兩種融合瘤以供進一步研究。此等融合瘤所產生之抗體命名為KFCC-GY4及KFCC-GY5。單株抗體KFCC-GY4及KFCC-GY5之VH 及VL 域及此等域之CDR的序列分別展示於圖15A及B以及圖16A及B中。
在ELISA(圖17)及免疫墨漬(圖18C及D)檢定中，KFCC-GY4與KFCC-GY5單株抗體均結合重組PLVAP蛋白。
在免疫墨漬檢定(圖19B及D)中，此等抗體亦與人類臍帶血管內皮細胞提取物中之PLVAP蛋白特異性反應。另外，免疫螢光染色實驗顯示KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體與表現PLVAP之人類血管內皮細胞結合(圖20C及D)。
使用ANTQ300石英晶體微量天平測定單株抗體對重組PLVAP蛋白之結合親和力(Kd )，對於KFCC-GY5mAb為0.41×10-7 M且對於KFCC-GY4mAb為0.6×10-7 M(Lin等人,J. Immunol. Methods 239 :121-124，2000)。
使用KFCC-GY4或KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體對兩名不同肝癌患者之肝臟的肝癌切片進行免疫組織化學實驗顯示，KFCC-GY5單株抗體(圖21A、C)在血管內皮細胞中產生強於KFCC-GY4單株抗體(圖21B、D)之信號。
使用KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體對來自四名隨機選擇之不同肝癌患者的樣本進行對同一患者之肝臟的鄰近肝癌及非腫瘤性肝組織切片所進行之免疫組織化學實驗。在肝癌組織之血管內皮細胞(圖22A、C、E及G)中偵測到PLVAP表現，而在鄰近非腫瘤性肝組織(圖22B、D、F及H)中未偵測到。
實施例4：PLVAP蛋白在血管內皮細胞表面上表現材料及方法 免疫螢光顯微術 試劑：
用於以下程序之試劑係如實施例3中所述，作出以下修改：
●1×HBSS洗滌緩衝液含有0.1%疊氮化鈉，用於防止結合於細胞表面之抗體發生胞吞；
●在具有0.1%疊氮化鈉之1×HBSS洗滌緩衝液中稀釋KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體。
程序：
如實施例3中所述進行人類臍帶血管內皮細胞(HUVEC)之免疫螢光染色，不同之處在於不使用甲醇固定及滲透細胞。實情為，在與抗PLVAP單株抗體一起培育後，洗滌細胞且在室溫下用4%三聚甲醛固定10分鐘。繼此培育後，洗滌細胞3次，隨後與經FITC結合之山羊F(ab')2 抗小鼠IgG一起培育。再洗滌三次後，如實施例3中所述處理細胞以進行免疫螢光顯微術。
結果
使用上述方法，僅可偵測到在細胞表面上表現之PLVAP蛋白。此等實驗之結果揭示KFCC-GY4與KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體結合於HCC血管內皮細胞之表面(圖23B、C)，表明PLVAP蛋白在此等細胞之表面上表現。此等研究結果表明以高親和力特異性結合PLVAP之抗體在注射至肝細胞癌腫瘤之血管中後將能夠結合於HCC血管內皮細胞之表面。
實施例5：抗人PLVAP單株抗體結合非人類靈長類物種中之PLVAP蛋白 材料及方法
首先根據製造商之說明書藉由在60℃下烘拷載片2小時以移除密封石蠟來製備組織陣列載片。其後，如實施例2中所述處理載片以進行免疫組織化學染色(IHC偵測經福馬林固定組織中之PLVAP )。唯一修改之處為在37℃下將載片與1μg/ml KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體一起培育48分鐘。
結果
為判定是否可使用非人類靈長類動物評估KFCC-GY4及KFCC-GY5 mAb以及源自此等mAb之其他抗體的藥物動力學、藥效學及毒性，使用KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體進行人類、恆河猴及食蟹獼猴之經福馬林固定之正常組織陣列的免疫組織化學染色(圖26)。KFCC-GY4及KFCC-GY5抗人PLVAP單株抗體以高相似度結合於人類與猴(食蟹獼猴及恆河猴)之不同組織中的毛細血管內皮細胞(圖26)。結合人類及猴正常腎上腺、腎、腦及肝切片之KFCC-GY5抗體的實例展示於圖27A-F2中。在人類組織切片上亦使用抗人CD34單株抗體作為陽性對照以突出(highlight)血管。此等結果指示恆河猴及食蟹獼猴適於在PLVAP抗體之臨床前試驗研究中使用。
實施例6：KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體結合人類PLVAP蛋白之C末端區中之胺基酸282與482之間的抗原決定基。 材料及方法 分子選殖
如下構築表現經His標記之人類PLVAP(胺基酸51-442)之胞外域之N末端(胺基酸51-292)或C末端(胺基酸282-442)部分的質體。用Eco RV及Stu I處理-T Easy-PLVAP51-442 ，自連接且產生所得質體-T Easy-PLVAP51-292 。為構築質體pET-15b-PLVAP51-292 ，自-T Easy-PLVAP51-292 切下在末端具有NdeI/BamHI識別序列的代表PLVAP之胺基酸殘基51至292之cDNA片段且插入pET-15b(Novagen)中。為構築pET-15b-PLVAP282-442 ，用Nde I及Sac I處理pET-15b-PLVAP51-442 ，接著使用T4 DNA聚合酶進行鈍端連接(blunt-end ligation)。藉由DNA定序驗證上述表現構築體且轉型於大腸桿菌(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)中。
重組蛋白表現及免疫墨漬分析
在30℃下用1mM異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷誘導經His標記之融合蛋白於大腸桿菌Rosetta-gami2(DE3)pLysS細胞中之表現，歷時16小時。誘導後，用Laemmli樣本緩衝液使細菌細胞溶解。由SDS-PAGE解析所得細胞溶解產物且使用標準方案及以下抗體對其進行考馬斯藍染色(Coomassie blue staining)及免疫墨漬分析：初級抗體：KFCC-GY4、KFCC-GY5、mAb 2A7-6、抗his mAb(LTK Biotechnology,Taiwan)。使用標準程序由來自Chemicon公司之針對小鼠IgG之鹼性磷酸酶結合二級抗體顯現免疫墨漬。
PCR擴增及文庫篩選
使用引子PLVAP Sac I F：5'-CTCCAAGGTGGAGGAGCTGGC-3'(SEQ ID NO:36)及PLVAP Stop Bam HI R：5'-GGATCCTGAGCATATCCCTGCATCCTCC-3'(SEQ ID NO:37)擴增編碼PLVAP(胺基酸282-442)胞外域之C末端部分的序列。使用以下熱循環進行PCR：94℃下歷時5分鐘，繼之以94℃下歷時30秒、56℃下歷時30秒及72℃下歷時60秒之35次循環。用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen,Surrey,UK)純化DNA，隨後根據製造商之說明書(Novagen,Merck Biosciences有限公司,Beeston,UK)用於構築PLVAP Novatope文庫。簡言之，在Mn2+ 存在下用DNAse I消化經純化之PCR產物且使用凝膠提取套組(Qiagen)對50-150個鹼基對(bp)之間的片段進行凝膠純化。使用T4 DNA聚合酶及Tth 聚合酶對DNA片段進行末端填充以在各3'末端添加單一dA殘基，隨後連接於pScreen 1b(+)T載體(Novagen)中，該載體經設計以將小插入物表現為與T7細菌噬菌體基因10衣殼蛋白之羧基末端融合物。將文庫轉型於NovaBlue(DE3)細胞中且塗於含有卡本西林(carbenicillin)(50μg/ml)及四環素(12.5μg/ml)之Luria-Bertani(LB)培養基板上。使用Novatope手冊中所述之以下方法篩選所得人類PLVAP cDNA文庫(各抗體約104 個群落)：藉由使硝化纖維素過濾器與表現PLVAP片段之群落接觸1分鐘將該等群落轉移至硝化纖維素過濾器中。藉由在密封氯仿蒸氣腔室中培育過濾器上之細菌群落15分鐘使該等細菌群落溶解。使蛋白質在群落變性溶液(20mM Tris(pH 7.9)、6M脲、0.5M NaCl)中變性15分鐘，且在於具有0.05%(v/v)Tween 20之TBS(TBS-T)中之1%(w/v)明膠中阻斷過濾器30分鐘。藉由用綿紙擦拭移除群落碎屑，隨後用於具有0.5%(w/v)明膠之TBS-T中之單株抗體KFCC-GY4及KFCC-GY5(1μg/ml)探測過濾器1小時。在具有0.5%(w/v)明膠之TBS-T中洗滌墨漬15分鐘，共兩次，隨後用山羊抗小鼠免疫球蛋白鹼性磷酸酶結合物(Chemicon)於具有0.5%(w/v)明膠之TBS-T中之1/5000稀釋液探測。洗滌後，使用溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium)(BCIP：33μg/ml；NBT：66μg/ml)受質(Sigma)顯現墨漬。將各次篩選之陽性群落塗於新鮮LB amp/tet板上，隨後用單株抗體再探測。將經證實之陽性群落用於DNA小規模純化，且使用T7終止引子對PLVAP基因插入物進行定序。
用於結合干擾研究之ELISA
用50μl於PBS中之5μg/ml濃度之KFCC-GY5抗PLVAP單株抗體塗佈ELISA板之各孔隔夜。阻斷及洗滌後，將50μl重組PLVAP蛋白(0.5μg/ml)添加至各孔中。在室溫下培育60分鐘後，洗滌各孔並將50μl不同濃度之經生物素標記之KFCC-GY4抗體二重複添加至各孔且培育30分鐘。洗滌三次後，用50μl經稀釋抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶結合物及受質使各孔顯色。在450nm下量測各孔之光密度。各值為兩份之平均值。
用於累加結合之ELISA
用50μl 0.25μg/ml重組PLVAP蛋白塗佈ELISA板之各孔。阻斷各孔且與50μl源自KFCC-GY4或KFCC-GY5之各人類化抗體(獨立地或一起)一起培育。各抗體之最終濃度為0.01μg/ml。值為兩份之平均值。
結果
為進一步測定KFCC-GY4 mAb及KFCC-GY5 mAb之特性，進行抗原決定基定位以測定PLVAP中由此等抗體中之各抗體結合之抗原位點。初始結果證明兩種抗體之抗原決定基位於PLVAP蛋白之胺基酸282與482之間的C末端區(圖28A、圖28B及圖28C)。KFCC-GY4 mAb與KFCC-GY5 mAb與PLVAP51-442 (第1道)及PLVAP282-442 (第2道)發生陽性反應，但不與PLVAP51-292 (第3道)或與PLVAP無關之人類CEACAM6蛋白(第4道)反應。結果指示兩種抗體之抗原決定基位於PLVAP之胺基酸殘基292與442之間的C末端。
更精細定位研究揭示KFCC-GY4 mAb與表現包括人類PLVAP之胺基酸431至442之肽的大腸桿菌純系反應，且KFCC-GY5 mAb與表現包括人類PLVAP之胺基酸378至404之肽的大腸桿菌純系反應。如表5中所描繪，此兩種mAb之抗原決定基不重疊。
在酶聯免疫檢定(ELISA)中KFCC-GY4 mAb及KFCC-GY5 mAb可各自結合人類PLVAP，而不干擾其他抗體之結合(圖29)。使用下文更詳細描述之完全人類化複合KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體亦觀測到無此類干擾(圖30)。
實施例7：產生特異性結合PLVAP之嵌合抗體及測定其特性 材料及方法
初始測定可變區序列
使用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)自2×107 個來自細胞系KFCC-GY4及KFCC-GY5之經培養融合瘤細胞中提取總RNA。遵循製造商之說明書，使用FirstChoice RLM-RACE套組(Ambion公司,Austin,TX)進行5'RACE以測定KFCC-GY4及KFCC-GY5之VH 及VL 域的編碼序列。簡言之，在37℃下用含有2μl 10×CIP緩衝液及2μl CIP之20μl總體積反應混合物中之小牛腸磷酸酶(CIP)處理10μg經提取之RNA1小時。用苯酚/氯仿提取後，用乙醇使RNA沈澱且再懸浮於11μl無核酸酶水中。在37℃下用含有1μl 10× TAP緩衝液及2μl TAP之10μl反應混合物中之煙草酸焦磷酸酶(TAP)處理5μl經CIP處理之RNA1小時。隨後在37℃下經由10μL反應混合物中之T4 RNA連接酶使2μl經CIP/TAP處理之RNA與300ng RNA接附子連接，歷時1小時。使用2μl經連接之RNA或對照RNA作為模板以在42℃下使用隨機十聚體(decamer)用M-MLV反轉錄酶合成cDNA歷時1小時。隨後藉由用Takara Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio公司,Osaka,Japan)使用正向5'RACE外引子5'-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'(SEQ ID NO:42)且分別用與編碼κ鏈恆定區之核苷酸序列互補之逆向引子(5'-TCAACGTGAGGGTGCTGCTCATGC-3')(SEQ ID NO:43)或與編碼重鏈CH1區之核苷酸序列互補之反置引子(5'-TTTCTTGTCCACCTTGGTGCTGCTGG-3')(SEQ ID NO:44)獨立地進行PCR來擴增對應於可變重鏈(VH )及可變輕鏈(VL )之cDNA。在94℃下培育PCR反應混合物5分鐘，繼之以35次擴增循環，該等循環包含在94℃下變性30秒，在57℃下黏接30秒及在72℃下延伸1分鐘。使反應在72℃下再延長7分鐘以確保完全延伸。分析PCR產物且使用Qiaquick凝膠提取套組(Qiagen,Mississauga,Ontario,Canada)自1.5%瓊脂糖凝膠純化。將經純化之PCR片段選殖於質體載體pGEM-T-easy(Promega,Madison,WI,USA)中。對各鏈最少5個獨立純系進行核苷酸定序分析。根據Kabat定義鑑別CDR(圖15A、B及圖16A、B)。
獨立證實可變區序列
自經冷凍之KFCC-GY4及KFCC-GY5細胞成功提取mRNA(Promega，目錄號Z5400)。使用簡并引子彙集庫對具有單一恆定區引子之鼠類信號序列進行RT-PCR。使用一組六個簡并引子彙集庫(HA至HF)擴增重鏈可變區mRNA，且使用一組七個簡并引子彙集庫(κA至κG)擴增輕鏈可變區mRNA，使用Roche Isostrip(Roche，目錄號493027001)對IgG進行單株同型分析揭示該兩者均為IgG1/κ同型。用重鏈及κ輕鏈引子彙集庫獲得擴增產物，證實輕鏈來自κ團簇。選殖各產物，且對各產物之數個純系進行定序。對於KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體，鑑別各抗體之單一功能性重鏈及輕鏈可變區序列。
表現嵌合抗體
將KFCC-GY4及KFCC-GY5可變區轉移至IgG4重鏈及κ輕鏈之表現載體系統(Antitope)中。經由電穿孔轉染NS0細胞且使用甲胺喋呤(methotrexate)進行選擇。鑑別許多抗甲胺喋呤群落且擴充對IgG表現呈陽性之細胞系。回收前導細胞系之基因組DNA且對其進行PCR及證實性定序。在蛋白質A瓊脂糖管柱(GE Healthcare，目錄號110034-93)上自細胞培養上清液純化IgG嵌合KFCC-GY4 IgG4及KFCC-GY5 IgG4，且使用基於預測胺基酸序列之消光係數Ec(0.1%)由OD280nm 定量，嵌合KFCC-GY4及KFCC-GY5分別使用1.484及1.334之Ec(0.1%)值。純化2mg以上抗體且由SDS-PAGE分析(圖31)。觀測對應於預測大小之重鏈及輕鏈之帶，無跡象表明有任何污染。
嵌合KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體與重組PLVAP之結合
在競爭ELISA中評估嵌合KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體與重組PLVAP蛋白之結合。將30μg/ml至0.014μg/ml(最終濃度)之嵌合抗體或對照抗體連續稀釋液與恆定濃度之經生物素標記之鼠類KFCC-GY4(最終濃度為0.3μg/ml)預混合，或將10μg/ml至0.004μg/ml(最終濃度)之嵌合抗體或對照抗體連續稀釋液與恆定濃度之經生物素標記之鼠類KFCC-GY5(最終濃度為0.1μg/ml)預混合，隨後在室溫下於預塗有1μg/ml於PBS中稀釋之重組PLVAP蛋白之Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板(Fisher，目錄號DIS-971-030J)上培育1小時。藉由用抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB受質偵測來測定經生物素標記之mAb的結合性。
結果
成功選殖並定序KFCC-GY4及KFCC-GY5小鼠抗PLVAP單株抗體之可變區。根據Kabat定義在各抗體中鑑別三個互補決定區(CDR)。由證實性研究對獲自融合瘤KFCC-GY4及KFCC-GY5之序列所進行的分析概述於表6及表7中。此等序列與初始特性測定所獲得之序列(圖15A、B及圖16A、B)匹配，不同之處在於KFCC-GY4輕鏈核苷酸序列中存在單一靜默錯配。在兩種細胞系中亦偵測到通常與融合瘤融合搭配物SP2/0相關之異常轉錄物(GenBank編號M35669)。
c 指示需要來源於人類序列區段之小鼠殘基的最大數目，其中括號中指示對親和力而言潛在地至關重要之數目
隨後使可變區基因與人類IgG4重鏈及κ輕鏈恆定區組合且於NS0細胞中表現以產生嵌合抗PLVAP抗體。為達成此目的，構築帶有KFCC-GY4嵌合重鏈及輕鏈以及KFCC-GY5嵌合重鏈及輕鏈之質體載體(圖32A-C，圖33A、B，圖34A-C及圖35A、B)。使用此等質體轉染NSO細胞。選殖經穩定轉染且產生嵌合抗體之細胞。
KFCC-GY4抗體之重鏈及輕鏈可變區與其最接近的人類生殖系序列顯示良好同源性(對於KFCC-GY4分別為64%及80%)，且個別構架序列在人類生殖系資料庫中具有接近的同源物。因此，此減小達成成功人類化抗體所需進行之工程改造的程度。對KFCC-GY4重鏈而言，將需要來源於人類序列區段之小鼠構架殘基的最大數目為13，其中4個限制性殘基可能對維持結合活性至關重要。對KFCC-GY4輕鏈而言，將需要來源於人類序列區段之小鼠構架殘基的最大數目為4，據信其中1個限制性殘基對活性至關重要(表6)。
KFCC-GY5抗體之重鏈及輕鏈可變區亦與其最接近的人類生殖系序列顯示良好同源性(對於KFCC-GY5分別為68%及80%)，且個別構架序列在人類生殖系資料庫中具有接近的同源物。因此，此減小達成成功人類化抗體所需進行之工程改造的程度。對重鏈而言，將需要來源於人類序列區段之小鼠構架殘基的最大數目為9，其中3個限制性殘基可能對維持結合活性至關重要。對輕鏈而言，將需要來源於人類序列區段之小鼠構架殘基的最大數目為2，據信該兩個殘基對活性均至關重要(表7)。Composite Human AntibodyTM 分析(Antitope;Cambridge,UK)揭示，可發現人類構架區段包括所有需要的小鼠殘基，且因此可自兩個模板構建完全人類化抗體。
使用競爭ELISA檢定證明嵌合抗體對PLVAP之結合效率與各別親本鼠類抗體之結合效率類似。嵌合IgG4-GY4抗體與鼠類KFCC-GY4抗體具有極類似的結合特徵，其IC50 值分別為0.80μg/ml及0.98μg/ml(圖36)。類似地，嵌合IgG4-GY5抗體與鼠類KFCC-GY5抗體亦具有極類似的結合特徵，其IC50 值分別為0.40μg/ml及0.49μg/ml(圖37)。因此，鑑別並選殖親本鼠類單株抗體之正確可變區序列。
亦使用Biacore system Bia T-100測定結合親和力。測定嵌合KFCC-GY4抗體與KFCC-GY5抗體對PLVAP之結合親和力均高於其各別親本mAb(表8)。兩種源自KFCC-GY4及KFCC-GY5之嵌合單株抗體在本文中亦分別稱為CSR01及CSR02。
實施例8：產生特異性結合PLVAP之完全人類化抗體及測定其特性 材料及方法 綜述
基於嵌合KFCC-GY4(CSR01)抗體之cDNA序列構築三種不同κ輕鏈及兩種不同重鏈。使用其轉染NSO細胞系以產生人類化複合抗體。產生5種不同細胞系來產生5種單株抗體。類似地，基於嵌合KFCC-GY5(CSR02)抗體之cDNA序列構築兩種不同κ輕鏈及兩種不同重鏈。獲得4種細胞系，其產生4種不同單株抗體。此等人類化重鏈及輕鏈之可變域之核苷酸序列概述於圖38A-E及圖39A-D中。衍生出嵌合抗體及完全人類化複合抗體之流程圖概述於圖40中。
設計人類抗體可變區序列
使用瑞士PDB產生小鼠KFCC-GY4及KFCC-GY5可變(V)區之結構模型且進行分析以鑑別小鼠V區中可能對抗體結合性質必不可少之重要「限制性」胺基酸。CDR內所含之殘基(使用Kabat與Chothia定義)以及許多構架殘基皆視為重要的。KFCC-GY4及KFCC-GY5之VH 與VK 序列含有典型構架殘基。而兩種抗體之CDR1及CDR2基元與許多鼠類抗體之CDR1及CDR2基元相當，應注意，兩種抗體之VH CDR3異常短。由以上分析認為，KFCC-GY4與KFCC-GY5之複合人類序列可用CDR外部寬範圍之替代物，但僅用CDR序列內部窄範圍之可能替代殘基產生。初步分析指示數種人類抗體之相應序列區段可組合產生與小鼠序列中之CDR相似或一致之CDR。對於CDR外部區及側接CDR之區，鑑別出作為新穎人類抗體可變區之可能組分的人類序列區段之廣泛選擇集合。
變異體之抗原決定基免除及設計
基於上述分析，選擇可用於產生KFCC-GY4與KFCC-GY5人類抗體變異體之大型初步序列區段組且使用分析肽與人類MHC第II類等位基因之結合性的iTopeTM 技術及使用已知抗體序列相關T細胞抗原決定基之TCEDTM (T細胞抗原決定基資料庫)(Antitope有限公司；Cambridge,UK)進行分析。棄去鑑別為顯著非人類MHC第II類結合肽或評定為顯著抵觸TCEDTM 的序列區段。此得以縮小區段組，且再次如上分析此等區段之組合以確保區段之間的接合點不含潛在T細胞抗原決定基。隨後組合所選區段以產生用於合成之重鏈及輕鏈可變區序列。對於各抗體，來構築5條重鏈及3條輕鏈，其等具有圖41A-E及圖42A-C(對於KFCC-GY5)以及圖43A-E及圖44A-C(對於KFCC-GY4)中詳述之序列及圖45及圖46中詳述之序列排比。
構築、表現及純化變異型抗體
使用一系列經黏接、連接及PCR擴增得到全長合成V區之重疊寡核苷酸來合成KFCC-GY4及KFCC-GY5之初始變異體1人類抗體VH 及VK 區基因。隨後使用長的重疊寡核苷酸及PCR且使用初始變異體1作為模板來構築人類抗體序列變異體。對於IgG4重鏈及κ輕鏈，隨後將經組裝之變異體直接選殖於pANT表現載體系統(Antitope有限公司；Cambridge，UK)中。經由電穿孔將複合重鏈及輕鏈之所有組合(亦即，總計15對組合)穩定轉染於NS0細胞中且使用200nM甲胺喋呤(Sigma，目錄號M8407-500MG)進行選擇。測試各構築體之抗甲胺喋群落的IgG表現量且選擇最佳表現細胞系且在液氮下冷凍。在蛋白質A瓊脂糖管柱(GE Healthcare，目錄號110034-93)上自細胞培養上清液純化KFCC-GY4及KFCC-GY5之IgG4變異體，且使用基於預測胺基酸序列之消光係數Ec(0.1%)(表9)由OD280nm 定量。純化2mg以上抗體且由SDS-PAGE分析(圖47A、B)。觀測對應於預測大小之重鏈及輕鏈之帶，無跡象表明有任何污染。
另外，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，編號11668-019)短暫轉染CHO-K1細胞。轉染後72小時，收集細胞培養基用於抗體純化。簡言之，在蛋白質A瓊脂糖管柱(Sigma，目錄號P3391-1.5G)上自細胞培養上清液純化來自短暫轉染之IgG4人類抗體變異體，且使用Fc捕捉/κ鏈偵測ELISA(Sigma，目錄號I6260及A7164)針對人類IgG4/κ標準物(Sigma，目錄號I4639)定量。廣泛觀測結果為與KFCC-GY5譜系純系相比，KFCC-GY4譜系純系之表現NS0純系之數目顯著較低。此外，亦應注意與KFCC-GY5相比，KFCC-GY4譜系純系之穩定與短暫產量均較低。在一些情況下，KFCC-GY4譜系之短暫產量不足以完全測定變異體之特性且因此使用穩定細胞系之NS0經純化物質進行所有後續分析。
變異型抗體與重組PLVAP蛋白之結合
在競爭ELISA中評估KFCC-GY4及KFCC-GY5人類抗體變異體與重組PLVAP之結合。將30μg/ml至0.014μg/ml(最終濃度)之變異型抗體或對照抗體連續稀釋液與恆定濃度之經生物素標記之鼠類KFCC-GY4(最終濃度為0.3μg/ml)預混合，或將10μg/ml至0.004μg/ml(最終濃度)之變異型抗體或對照抗體連續稀釋液與恆定濃度之經生物素標記之鼠類KFCC-GY5(最終濃度為0.1μg/ml)預混合，隨後在室溫下於預塗有1μg/ml於PBS中稀釋之重組「蛋白質P」之Nunc Immuno MaxiSorp 96孔平底微量滴定板(Fisher，目錄號DIS-971-030J)上培育1小時。藉由用抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB受質偵測來測定經生物素標記之mAb的結合性。用3M HCl終止反應後，在Dynex Technologies MRX TC II板讀取器上於450nm下量測吸光度，且針對小鼠參考標準比較測試抗體之結合曲線。
嵌合及完全人類化複合抗PLVAP單株抗體之PLVAP結合滴定
用50μl於PBS中之2.5μg/ml重組PLVAP蛋白塗佈ELISA板之各孔。洗滌及阻斷後，在室溫下將各孔與不同濃度之人類化單株抗體(0.5μg/ml至0.0025μg/ml)一起培育60分鐘。使用稀釋1000倍之小鼠抗人IgG4單株抗體(BD Pharmingen)之鹼性磷酸酶結合物來量測抗體與PLVAP之結合。
結果
IgG4-GY4及鼠類KFCC-GY4抗體之5種前導變異體具有極其類似之結合特徵(圖48)。5種前導變異體之IC50 絕對值及相對於KFCC-GY4 mAb之IC50 值展示於表10中。所展示之所有前導變異體係在原始鼠類單株抗體之兩倍範圍內。
類似地，IgG4-GY5及鼠類KFCC-GY5抗體之4種前導變異體具有極其類似之結合特徵(圖49)。5種前導變異體之IC50 絕對值及相對於KFCC-GY5 mAb之IC50 值展示於表11中。所展示之所有前導變異體係在原始鼠類單株抗體之兩倍範圍內。
自經NS0穩定轉染之上清液純化GY4 Composite Human AntibodyTM 變異體，且在與經生物素標記之KFCC-GY4 mAb的競爭檢定中進行測試。展現IC50 值，且亦針對參考KFCC-GY4 mAb之結合性進行標準化。
自經NS0穩定轉染之上清液純化GY5 Composite Human AntibodyTM 變異體，且在與經生物素標記之KFCC-GY5 mAb的競爭檢定中進行測試。展現IC50 值，且亦針對參考KFCC-GY5 mAb之結合性進行標準化。
源自嵌合KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體之複合人類化抗體能夠結合PLVAP蛋白(圖50)。嵌合KFCC-GY4(CSR01)之完全人類化複合抗體之結合能力弱於嵌合CSR01。相比之下，嵌合KFCC-GY5(CSR02)之完全人類化複合抗體之結合能力大體上與嵌合CSR02相當。
為證實KFCC-GY4(CSR01)及KFCC-GY5(CSR02)之完全人類化抗體可結合PLVAP而不干擾彼此之結合，進行試管內酶聯免疫檢定(ELISA)顯示CSR01及CSR02之一些完全人類化複合抗體與PLVAP之結合性實際上相累加(圖30)。
藉由免疫螢光研究來評估人類化抗體與在人類臍帶血管內皮細胞上表現之PLVAP蛋白的結合。此等研究中所測試之所有人類化抗體皆能夠結合內皮細胞(圖51A-C、圖52A-G及圖53A-E)。此等結果指示結合此兩種抗原決定基之人類化抗體可獨立地或必要時可就其累加效應而一起用作治療劑或診斷劑。
總之，本文實施例中所述之研究結果證明可開發出針對人類PLVAP蛋白之胞外域中之兩種明確定義之不同抗原決定基的鼠類單株抗體。已鑑別此兩種抗原決定基之胺基酸序列。此等抗體與PLVAP中之兩種經鑑別抗原決定基的結合彼此不干擾且可累加。因此，此等抗體及源自其之抗體可個別地或必要時就其累加效應而一起用作治療劑或診斷劑。已鑑別負責抗原結合之CDR。已成功利用此資訊對兩種抗PLVAP鼠類單株抗體進行人類化以治療人類個體之肝癌及降低抗原性。
實施例9：開發偵測血清中之PLVAP含量的診斷檢定材料及方法 PLVAP ELISA
1.用50μl 5μg/ml之 KFCC-GY4 mAb塗佈ELISA板之各孔隔夜。在含有0.02%疊氮化鈉之1×PBS緩衝液中製備抗體。
2.用200μl洗滌緩衝液(含有0.05% Tween-20之PBS)洗滌各孔三次後，在室溫下用200μl阻斷緩衝液(含有2%牛血清白蛋白之洗滌緩衝液)阻斷各孔30分鐘。
3.阻斷後，洗滌各孔三次。
4.將50μl PLVAP標準物及經稀釋之血清樣本二重複添加至所指定的孔中且在室溫下培育60分鐘。在阻斷緩衝液中稀釋標準物及血清樣本。
5.洗滌各孔三次且添加50μl 0.25μg/ml之經生物素標記之KFCC-GY5 mAb。
6.培育30分鐘後，洗滌所有孔三次。
7.將50μl經稀釋2500倍之抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化酶(Pierce公司，目錄號N100)添加至各孔中且在室溫下培育30分鐘。
8.洗滌三次後，添加100μl根據製造商之說明書製備之OPD受質(Sigma公司，目錄號O-6787)且培育一段最佳持續時間。
9.藉由添加50μl 0.18M H2 SO4 終止培育。
10.在570nm下進行OD量測。
結果
使用鼠類KFCC-GY4與KFCC-GY5抗人PLVAP單株抗體建立酶聯免疫檢定(ELISA)來量測血清中之PLVAP蛋白濃度。使用KFCC-GY4抗體塗佈ELISA板來捕捉血清中之PLVAP蛋白，且使用經生物素標記之KFCC-GY5抗體偵測KFCC-GY4抗體所捕捉之PLVAP蛋白。使用重組PLVAP蛋白作為參考標準。如PLVAP ELISA之標準曲線(圖54)所示，此檢定之靈敏度約為50ng/ml。當以兩種稀釋液(2倍及4倍)檢定兩名肝癌患者之兩個血清樣本時，兩者均具有可量測之PLVAP含量(450ng/ml及360ng/nl)且與標準曲線平行。在兩名健康個體之血漿中未偵測到可量測之PLVAP。因此，可在診斷應用中使用此檢定來檢定血清中之PLVAP含量。
本文所引用之所有專利、公開申請案及參考文獻之相關教示係以全文引用的方式併入本文中。
雖然已參考本發明之例示性具體實例特別展示及描述本發明，但熟習此項技術者應瞭解，在不脫離隨附申請專利範圍所涵蓋之本發明範疇的情況下可對本發明之形式及細節作出各種改變。
前述內容在參考以下更具體的本發明之例示性具體實例之描述後(如隨附圖式中所說明的)，會是顯而易見的。圖式中於所有不同的觀點中類似的參考記號係指相同部分。圖式未必按比例繪製，而是著重說明本發明之具體實例。
圖1為描繪用於鑑別在腫瘤與鄰近非腫瘤性組織之間顯示極端差異表現的基因之演算法的流程圖。
圖2為描繪如藉由使用Affymetrix基因晶片的mRNA轉錄物特徵測定所測定，在配對的HCC(PHCC)與鄰近非腫瘤性肝組織(PN)樣本(n=18)中、以及呈不配對的HCC樣本(n=82)之PLVAP基因表現強度的圖。
圖3A為描繪如藉由Taqman定量RT-PCR所測定，在配對的HCC(PHCC)與鄰近非腫瘤性肝組織(PN)樣本中之相對PLVAP表現量的圖。HCC中之PLVAP mRNA量相對於非腫瘤性肝組織顯著較高。
圖3B為描繪如微陣列分析所測定，在18個配對的HCC(PHCC)與鄰近非腫瘤性肝組織(PN)樣本中之PLVAP基因表現強度的圖。對所測試之所有個體而言，除一名個體以外，來自各個體之PLVAP轉錄物量在HCC中皆高於在鄰近非腫瘤性肝組織中。
圖4A及圖4B展示用於產生小鼠抗PLVAP多株抗血清之經His標記之人類PLVAP51-442 蛋白重組融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖5為描繪在凝血酶消化移除His標記之前及之後重組PLVAP蛋白之偵測的西方墨漬法影像。墨漬左側之箭頭指示墨漬上His-PLVAP及PLVAP之位置。墨漬左側之數字指示分子量標準物之位置。
圖6A為描繪如兩步即時定量RT-PCR所測定，在藉由雷射捕捉顯微解剖從兩個HCC組織樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))獲得之HCC內皮細胞中存在明顯相對量的PLVAP mRNA的曲線圖。虛線表示來自用於PLVAP mRNA之定量RT-PCR的相同樣品中之β-肌動蛋白mRNA之Taqman定量RT-PCR信號。結果指示經解剖內皮細胞中存在可易於量測之PLVAP mRNA(實線)。
圖6B為描繪如兩步Taqman即時定量RT-PCR所測定，在藉由雷射捕捉顯微解剖從兩個HCC樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))中鄰近HCC組織之非腫瘤性肝組織獲得之細胞中不存在明顯相對量的PLVAP mRNA的曲線圖。結果指示經解剖細胞中無可偵測(黑實線)及幾乎不可偵測(灰實線)之PLVAP mRNA。
圖6C為描繪如兩步Taqman即時定量RT-PCR所測定，在藉由雷射捕捉顯微解剖從兩個HCC組織樣本(樣本A(黑色)及樣本B(灰色))獲得之HCC腫瘤細胞中之PLVAP mRNA相對量的曲線圖。結果指示歸因於不可避免的來自附著於經解剖HCC細胞之血管內皮細胞之部分的輕微污染，在經解剖HCC細胞中存在極少量之PLVAP mRNA(實線)。
圖7為描繪如ELISA所測定，針對重組PLVAP51-442 蛋白產生之小鼠抗血清中之抗PLVAP抗體力價的曲線圖。
圖8A-F為展示來自三名肝細胞癌患者之經福馬林固定之配對的HCC(圖8A、C、E)與鄰近非腫瘤性肝組織(圖8B、D、F)之切片的影像，該等切片係使用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色以偵測PLVAP蛋白之定位。配對的組織展示於圖8A、B，圖8C、D，及圖8E、F中。僅在肝細胞癌之毛細血管內皮細胞中偵測到HCC影像中呈現為棕色染色(箭頭)之PLVAP蛋白(圖8A、C、E)。在非腫瘤性肝組織中不存在可偵測之PLVAP(圖8B、D、F)。
圖9A-F為展示來自另外三名肝細胞癌患者之經福馬林固定之HCC(圖9A、C、E、F)與非腫瘤性肝組織(圖9B、D)之切片的影像，該等切片係使用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色以偵測PLVAP蛋白之定位。圖9A、B及圖9C、D展示HCC與鄰近非腫瘤性肝組織之配對的組織樣本。僅在肝細胞癌之毛細血管內皮細胞中偵測到HCC影像中呈現為棕色染色(箭頭)之PLVAP蛋白(圖9A、C、E、F)。在非腫瘤性肝組織中不存在可偵測之PLVAP(圖9B、D)。
圖10A-F為展示來自六名不同患者之經福馬林固定之局部結節性增生組織之切片的影像，該等切片係使用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色以偵測PLVAP蛋白之定位。在局部結節性增生之非腫瘤性肝組織之血管竇狀小管/毛細血管的內襯內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。在膽管上皮細胞(圖10A、圖10D及圖10F)及門管區血管(圖10D及圖10F)中發現一些陽性染色(深灰色)，但在肝實質之內皮細胞中未發現。膽管上皮細胞之陽性染色係歸因於PLVAP抗血清中非特異性抗體之結合。
圖11A及圖11B為展示來自兩名肝血管瘤患者之經福馬林固定組織之切片的影像，該等切片係用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。肝血管瘤之內皮內襯細胞不顯示PLVAP蛋白之顯著表現。
圖12A及圖12B為展示來自兩名慢性活動性B型肝炎患者之經福馬林固定組織之切片的影像，該等切片係用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。在來自慢性B型肝炎患者之非腫瘤性肝組織之血管竇狀小管/毛細血管的內襯內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖13A-D為展示來自三名不同的慢性活動性C型肝炎患者之經福馬林固定組織之切片的影像，該等切片係用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。圖13B及圖13D中所示之組織切片來自同一患者。在來自慢性C型肝炎患者之非腫瘤性肝組織之血管竇狀小管/毛細血管的內襯內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖14A-D為展示來自三名不同的轉移性肝癌患者之經福馬林固定組織之切片的影像，該等切片係用抗PLVAP多株抗血清以免疫組織化學方法染色。該等組織切片來自轉移性結腸直腸腺癌患者(圖14A)、肝內膽管癌患者(圖14B及C)或轉移性卵巢癌患者(圖14D)。圖14B及圖14C中所示之組織切片來自同一患者。在轉移性癌症組織之血管竇狀小管/毛細血管之內襯內皮細胞中未偵測到PLVAP蛋白。
圖15A展示單株抗體KFCC-GY4之VH 域的核苷酸基因序列(上)(SEQ ID NO:3)及所推導的胺基酸序列(中)(SEQ ID NO:4)。亦指示CDR 1(SEQ ID NO:5)、CDR 2(SEQ ID NO:6)及CDR 3(SEQ ID NO:7)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖15B展示單株抗體KFCC-GY4之VL 域的核苷酸基因序列(上)(SEQ ID NO:8)及所推導的胺基酸序列(中)(SEQ ID NO:9)。亦指示CDR 1(SEQ ID NO:10)、CDR 2(SEQ ID NO:11)及CDR 3(SEQ ID NO:12)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖16A展示單株抗體KFCC-GY5之VH 域的核苷酸基因序列(上)(SEQ ID NO:13)及所推導的胺基酸序列(中)(SEQ ID NO:14)。亦指示CDR 1(SEQ ID NO:15)、CDR 2(SEQ ID NO:16)及CDR 3(SEQ ID NO:17)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖16B展示單株抗體KFCC-GY5之VL 域的核苷酸基因序列(上)(SEQ ID NO:18)及所推導的胺基酸序列(中)(SEQ ID NO:19)。亦指示CDR 1(SEQ ID NO:20)、CDR 2(SEQ ID NO:21)及CDR 3(SEQ ID NO:22)中之胺基酸殘基序列(下)。
圖17為描繪如ELISA所測定，於多種抗體濃度之KFCC-GY4(空心圓)及KFCC-GY5(實心圓)單株抗體與重組PLVAP蛋白之結合的曲線圖。
圖18為展示KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體可偵測5ng重組PLVAP蛋白之免疫墨漬。第1道：分子量標準物；第2道：KFCC-GY4單株抗體所產生之免疫墨漬；第3道：KFCC-GY5單株抗體所產生之免疫墨漬。重組PLVAP蛋白之分子量為45kD。
圖19A及圖19C為經考馬斯藍染色之SDS丙烯醯胺凝膠。第1道：分子量標準物；第2道：用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等人類臍帶血管內皮細胞在提取之前經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖19B為用KFCC-GY4單株抗體探測圖19A之第2道中所示之提取物的免疫墨潰。第1道：分子量標準物；第2道：用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等人類臍帶血管內皮細胞在提取之前經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖19D為用KFCC-GY5單株抗體探測圖19C之第2道中所示之提取物的免疫墨漬。第1道：分子量標準物；第2道：用TX-114自人類臍帶血管內皮細胞提取之疏水性膜蛋白，該等人類臍帶血管內皮細胞在提取之前經VEGF(40ng/ml)刺激72小時。
圖20A為描繪用對照正常小鼠IgG對人類血管內皮細胞(HUVEC)進行免疫螢光染色的螢光顯微照片。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。放大倍數=600倍。
圖20B為描繪用針對馮威里氏因子(VWF)之單株抗體對人類血管內皮細胞(HUVEC)進行免疫螢光染色的螢光顯微照片。VWF為人類血管內皮細胞之陽性標誌。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。放大倍數=600倍。
圖20C為描繪用針對PLVAP之KFCC-GY4單株抗體對人類血管內皮細胞(HUVEC)進行免疫螢光染色的螢光顯微照片。KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞發生陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。放大倍數=600倍。
圖20D為描繪用針對PLVAP之KFCC-GY5單株抗體對人類血管內皮細胞(HUVEC)進行免疫螢光染色的螢光顯微照片。KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞發生陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。放大倍數=600倍。
圖21A為包埋於石蠟塊中之經福馬林固定之肝癌組織之切片的光學顯微照片，該切片係用KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在肝癌血管內皮細胞中偵測到強PLVAP信號(深灰色染色)。放大倍數為100倍。
圖21B為來自與圖21A中所示之樣本相同之患者的經福馬林固定之肝癌組織之切片的光學顯微照片，該切片係用KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體染色。在肝癌血管內皮細胞中偵測到中等PLVAP信號(淺灰色染色)。放大倍數為100倍。
圖21C為來自與圖21A及圖21B中所示之樣本不同之患者的經福馬林固定之肝癌組織之切片的光學顯微照片，該切片係用KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在血管內皮細胞中偵測到強PLVAP信號(深灰色染色)。放大倍數為100倍。
圖21D為來自與圖21C中所示之樣本相同之患者的包埋於石蠟塊中之經福馬林固定之肝癌組織之切片的光學顯微照片，該切片係用KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體染色。在血管內皮細胞中偵測到中等PLVAP信號(淺灰色染色)，表明KFCC-GY4單株抗體與PLVAP抗原之結合性弱於KFCC-GY5抗體。放大倍數為100倍。
圖22A-H為來自四名隨機選擇之不同的肝癌患者之肝癌組織(圖22A、C、E及G)及鄰近非腫瘤性肝組織(圖22B、D、F及H)之切片的光學顯微照片。該等切片係用KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體染色。在肝癌組織之血管內皮細胞中偵測到PLVAP信號(灰色染色)，但在非腫瘤性肝組織之血管內皮細胞中未偵測到。放大倍數為100倍。圖22A與B、C與D、E與F、及G與H表示四組配對的肝癌與非腫瘤性肝組織。
圖23A為描繪用對照小鼠IgG染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)的螢光顯微照片。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。
圖23B為描繪用針對PLVAP之KFCC-GY4單株抗體染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)的螢光顯微照片。KFCC-GY4單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞之表面發生陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。
圖23C為描繪用針對PLVAP之KFCC-GY5單株抗體染色之人類血管內皮細胞(HUVEC)的螢光顯微照片。KFCC-GY5單株抗PLVAP抗體與人類血管內皮細胞之表面發生陽性反應。用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對核進行染色。
圖24展示人類PLVAP蛋白之胺基酸序列(Genbank編號NP_112600；SEQ ID NO:23)。
圖25A及圖25B展示全長人類PLVAP cDNA之核苷酸序列(Genbank編號NM_031310；SEQ ID NO:24)。
圖26為指示如使用KFCC-GY4及Gy5抗體藉由免疫組織化學所測定，人類及兩種非人類靈長類動物中之多種正常組織及器官中之血管內皮細胞中之PLVAP表現的表。
圖27A-F2展示用KFCC-GY4、KFCC-GY5及抗CD34單株抗體(mAb)以免疫組織化學方法染色之正常人類及猴組織。箭頭指向各別組織中表現PLVAP之毛細血管內皮細胞。
圖27A展示用KFCC-GY4 mAb染色之人類腎上腺組織的切片。圖27B展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腎上腺組織的切片。圖27C展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自食蟹獼猴的腎上腺組織的切片。圖27D展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自恆河猴的腎上腺組織的切片。
圖27E展示用KFCC-GY5 mAb染色之人類腎上腺組織的切片。圖27F展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腎上腺組織的切片。圖27G展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自食蟹獼猴的腎上腺組織的切片。圖27H展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自恆河猴的腎上腺組織的切片。
圖27I展示用KFCC-GY4 mAb染色之人類腎組織的切片。圖27J展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腎組織的切片。圖27K展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自食蟹獼猴的腎組織的切片。圖27L展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自恆河猴的腎組織的切片。KFCC-GY4 mAb使腎小管之間的毛細血管內皮細胞染色，但不使絲球體中之內皮細胞染色。相比之下，抗CD34抗體使腎小管之間及絲球體中之毛細血管內皮細胞陽性染色。
圖27M展示用KFCC-GY5 mAb染色之人類腎組織的切片。圖27N展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腎組織的切片。圖27O展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自食蟹獼猴的腎組織的切片。圖27P展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自恆河猴的腎組織的切片。如同KFCC-GY4 mAb，KFCC-GY5 mAb使腎小管之間的毛細血管內皮細胞染色，但不使絲球體中之內皮細胞染色。相比之下，抗CD34抗體使腎小管之間及絲球體中之毛細血管內皮細胞陽性染色。
圖27Q展示用KFCC-GY4 mAb染色之人類腦組織的切片。圖27R展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腦組織的切片。就CD34內皮標誌(箭頭)而言，腦血管內皮細胞被陽性染色。圖27S展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自食蟹獼猴的腦組織的切片。圖27T展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自恆河猴的腦組織的切片。人類與猴腦內皮細胞均不表現PLVAP。
圖27U展示用KFCC-GY5 mAb染色之人類腦組織的切片。圖27V展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類腦組織的切片。就CD34內皮標誌(箭頭)而言，腦血管內皮細胞被陽性染色。圖27W展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自食蟹獼猴的腦組織的切片。圖27X展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自恆河猴的腦組織的切片。人類與猴腦內皮細胞均不表現PLVAP。
圖27Y展示用KFCC-GY4 mAb染色之人類肝組織的切片。圖27Z展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類肝組織的切片。就CD34內皮標誌(箭頭)而言，腦血管內皮細胞被陽性染色。圖27A2展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自食蟹獼猴的肝組織的切片。圖27B2展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自恆河猴的肝組織的切片。KFCC-GY4 mAb在人類、食蟹獼猴及恆河猴中不與肝竇(細箭頭)及中央靜脈(粗箭頭)之內皮細胞反應。
圖27C2展示用KFCC-GY5 mAb染色之人類肝組織的切片。圖27D2展示用識別CD34(一種內皮細胞標誌)之抗人CD34 mAb染色之人類肝組織的切片。就CD34內皮標誌(箭頭)而言，腦血管內皮細胞被陽性染色。圖27E2展示用KFCC-GY4 mAb染色之來自食蟹獼猴的肝組織的切片。圖27F2展示用KFCC-GY5 mAb染色之來自恆河猴的肝組織的切片。KFCC-GY5 mAb在人類、食蟹獼猴及恆河猴中不與肝竇(細箭頭)及中央靜脈(粗箭頭)之內皮細胞反應。
圖28A展示來自1×108 個表現經His標記之PLVAP51-442 (第1道)、經His標記之PLVAP282-442 (第2道)、經His標記之PLVAP51-292 (第3道)、或經His標記之CEACAM6(第4道)的大腸桿菌之總蛋白質提取物的經考馬斯藍染色之SDS-PAGE凝膠。第M道中解析分子量蛋白質標準物。
圖28B展示用小鼠KFCC-GY4 mAb探測以偵測來自1×108 個表現經His標記之PLVAP51-442 (第1道)、經His標記之PLVAP282-442 (第2道)、經His標記之PLVAP51-292 (第3道)、或經His標記之CEACAM6(第4道)的大腸桿菌之總蛋白質提取物中之PLVAP蛋白的免疫墨漬。第M道中解析分子量蛋白質標準物。
圖28C展示用小鼠KFCC-GY5 mAb探測以偵測來自1×108 個表現經His標記之PLVAP51-442 (第1道)、經His標記之PLVAP282-442 (第2道)、經His標記之PLVAP51-292 (第3道)、或經His標記之CEACAM6(第4道)的大腸桿菌之總蛋白質提取物中之PLVAP蛋白的免疫墨漬。第M道中解析分子量蛋白質標準物。
圖28D展示用抗His標記抗體探測以偵測來自1×108 個表現經His標記之PLVAP51-442 (第1道)、經His標記之PLVAP282-442 (第2道)、經His標記之PLVAP51-292 (第3道)、或經His標記之CEACAM6(第4道)的大腸桿菌之總蛋白質提取物中之經His標記之PLVAP蛋白的免疫墨漬。第M道中解析分子量蛋白質標準物。
圖29為展示KFCC-GY4單株抗體(mAb)與先由KFCC-GY5 mAb捕捉之PLVAP結合的長條圖。研究使用ELISA。各值為二重複之平均值。
圖30為描繪源自KFCC-GY4(CSR01-VH5/VK2)及KFCC-GY5(CAS02-VH5/VK3)之完全人類化複合單株抗體與PLVAP蛋白之累加結合的長條圖。值為二重複之平均值。
圖31展示經蛋白質-A純化之嵌合KFCC-GY4及KFCC-GY5抗體在雙硫鍵還原後經考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠。第1道：Precision plus蛋白質標準物(Bio-Rad)；第2道：1.0μg嵌合KFCC-GY4抗體；第3道：1.0μg嵌合KFCC-GY5抗體；第4道：Precision plus蛋白質標準物(Bio-Rad)。
圖32A-G展示編碼KFCC-GY4 VH嵌合體的基於pANT12之質體載體之核苷酸序列及嵌合體之所推導的胺基酸序列。
圖33A-D展示編碼KFCC-GY4 VK嵌合體的基於pANT13之質體載體之核苷酸序列及嵌合體之所推導的胺基酸序列。
圖34A-F展示編碼KFCC-GY5 VH嵌合體的基於pANT12之質體載體之核苷酸序列及嵌合體之所推導的胺基酸序列。
圖35A-D展示編碼KFCC-GY5 VK嵌合體的基於pANT13之質體載體之核苷酸序列及嵌合體之所推導的胺基酸序列。
圖36為描繪KFCC-GY4抗體競爭ELISA之結果的曲線圖，在該ELISA中針對固定濃度之經生物素標記之GY4來測試嵌合及鼠類KFCC-GY4抗體之連續稀釋液與PLVAP之結合。經生物素標記之抗體的結合性隨嵌合及對照鼠類抗體之量增加而降低。
圖37為描繪KFCC-GY5抗體競爭ELISA之結果的曲線圖，在該ELISA中針對固定濃度之經生物素標記之GY5來測試嵌合及鼠類KFCC-GY5抗體之連續稀釋液與PLVAP之結合。經生物素標記之抗體的結合性隨嵌合及對照鼠類抗體之量增加而降低。
圖38A-E展示源自嵌合KFCC-GY4抗體CSR01之人類化抗體之重鏈及輕鏈可變域的核苷酸序列及胺基酸序列。圖38A展示κ輕鏈CSR01-VK1之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:59及60)。圖38B展示κ輕鏈CSR01-VK2之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:61及62)。圖38C展示κ輕鏈CSR01-VK3之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:63及64)。圖38D展示重鏈CSR01-VH4之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:65及66)。圖38E展示重鏈CSR01-VH5之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:67及68)。CDR之胺基酸序列加底線。經改變以減小潛在抗原性之胺基酸展示於方框中。
圖39A-D展示源自嵌合KFCC-GY5抗體CSR02之人類化抗體之重鏈及輕鏈可變域的核苷酸序列及胺基酸序列。圖39A展示κ輕鏈CSR02-VK2之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:69及70)。圖39B展示κ輕鏈CSR02-VK3之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:71及72)。圖39C展示重鏈CSR02-VH4之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:73及74)。圖39E展示重鏈CSR02-VH5之核苷酸序列及胺基酸序列(SEQ ID NO:75及76)。CDR之胺基酸序列加底線。經改變以減小潛在抗原性之胺基酸展示於方框中。
圖40為描繪自鼠類KFCC-GY4 mAb及KFCC-GY5 mAb衍生出完全人類化抗人PLVAP複合單株抗體(mAb)的流程圖。
圖41A描繪KFCC-GY5可變重鏈VH變異體1之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:77及78)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖41B描繪KFCC-GY5可變重鏈VH變異體2之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:79及80)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖41C描繪KFCC-GY5可變重鏈VH變異體3之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:81及82)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖41D描繪KFCC-GY5可變重鏈VH變異體4之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:83及84)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖41E描繪KFCC-GY5可變重鏈VH變異體5之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:85及86)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖42A描繪KFCC-GY5可變輕鏈VK變異體1之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:87及88)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖42B描繪KFCC-GY5可變輕鏈VK變異體2之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:89及90)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖42C描繪KFCC-GY5可變輕鏈VK變異體3之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:91及92)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖43A描繪KFCC-GY4可變重鏈VH變異體1之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:93及94)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖43B描繪KFCC-GY4可變重鏈VH變異體2之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:95及96)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖43C描繪KFCC-GY4可變重鏈VH變異體3之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:97及98)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖43D描繪KFCC-GY4可變重鏈VH變異體4之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:99及100)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖43E描繪KFCC-GY4可變重鏈VH變異體5之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:101及102)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖44A描繪KFCC-GY4可變輕鏈VK變異體1之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:103及104)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖44B描繪KFCC-GY4可變輕鏈VK變異體2之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:105及106)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖44C描繪KFCC-GY4可變輕鏈VK變異體3之核苷酸序列及所推導的胺基酸序列(SEQ ID NO:107及108)。CDR核苷酸序列及蛋白質序列稍加陰影。自原始融合瘤序列變化得到之變異型胺基酸加底線。
圖45A-B展示人類化KFCC-GY4抗體變異型重鏈與κ輕鏈之可變域序列的排比。
圖46A-B展示人類化KFCC-GY5抗體變異型重鏈與κ輕鏈之可變域序列的排比。
圖47A展示經純化之人類化KFCC-GY4抗體在雙硫鍵還原後經考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠。第1道：Precision Plus標誌(Biorad)；第2道：1.0μg VH4/VK2 IgG4；第3道：1.0μg VH4/VK3 IgG4；第4道：1.0μg VH5/VK1 IgG4；第5道：1.0μg VH5/VK2 IgG4；第6道：1.0μg VH5/VK3 IgG4；第7道：Precision Plus標誌。
圖47B展示經純化之人類化KFCC-GY5抗體在雙硫鍵還原後經考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠。第1道：Precision Plus標誌；第2道：1.0μg VH4/VK2 IgG4；第3道：1.0μg VH4/VK3 IgG4；第4道：1.0μg VH5/VK2 IgG4；第5道：1.0μg VH5/VK3 IgG4；第6道：Precision Plus標誌。
圖48為描繪PLVAP競爭ELISA之結果的曲線圖，其說明與固定濃度之競爭者經生物素標記之鼠類KFCC-GY4抗體混合的不同濃度之經純化變異型KFCC-GY4人類化抗體與PLVAP蛋白的結合。
圖49為描繪PLVAP競爭ELISA之結果的曲線圖，其說明與固定濃度之競爭者KFCC-GY5抗體混合的不同濃度之經純化變異型KFCC-GY5人類化抗體與PLVAP蛋白的結合。
圖50描繪說明如ELISA所測定，嵌合及完全人類化複合抗PLVAP單株抗體與PLVAP之結合的滴定曲線。
圖51A-C為免疫螢光研究中用鼠類KFCC-GY4及KFCC-GY5單株抗體染色之人類臍帶血管內皮細胞的影像。圖51A展示鼠類KFCC-GY4 mAb對人類臍帶血管內皮細胞之免疫螢光染色。圖51B展示鼠類KFCC-GY5 mAb對人類臍帶血管內皮細胞之免疫螢光染色。圖51C展示小鼠IgG對人類臍帶血管內皮細胞之免疫螢光染色，作為陰性對照組。
圖52A-G為免疫螢光研究中用嵌合或人類化KFCC-GY4(CSR01)抗體染色之人類臍帶血管內皮細胞的影像。圖52A：嵌合KFCC-GY4 mAb；圖52B：CSR01-VH4/VK2；圖52C：CSR01-VH4/VK3；圖52D：CSR01-VH5/VK1；圖52E：CSR01-VH5/VK2；圖52F：CSR01-VH5/VK3；圖52G：人類IgG。
圖53A-F為免疫螢光研究中用嵌合或人類化KFCC-GY5抗體染色之人類臍帶血管內皮細胞的影像。圖53A：嵌合KFCC-GY5(CSR02)mAb；圖53B：CSR02-VH4/VK2；圖53C：CSR02-VH4/VK3；圖53D：CSR02-VH5/VK2；圖53E：CSR02-VH5/VK3；圖53F：人類IgG。
圖54為描繪在兩個HCC患者血清樣本中及在經連續稀釋之PLVAP標準物(1000ng/ml至10ng/ml)中PLVAP蛋白之偵測結果的曲線圖。兩個正常血清樣本中未偵測到PLVAP。血清樣本獲自兩名肝細胞癌患者(HCC-63及HCC-82)及兩名正常成人(正常-13及正常-14)。血清樣本以稀釋2倍及4倍檢定。

Claims (55)

  1. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之單株抗體，其中該抗體包含：a)至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102；及b)至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108。
  2. 如申請專利範圍第1項之單株抗體，其中該抗體結合SEQ ID NO：38中所存在之抗原決定基。
  3. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之單株抗體，其中該抗體包含：a)至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86；及b)至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92。
  4. 如申請專利範圍第3項之單株抗體，其中該抗體結合SEQ ID NO：40中所存在之抗原決定基。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之單株抗體，其 中該單株抗體包含標記。
  6. 如申請專利範圍第5項之單株抗體，其中該標記係選自由放射性同位素及細胞毒性劑所組成之群組。
  7. 一種用於在哺乳動物個體中治療肝細胞癌之醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  8. 如申請專利範圍第7項之組成物，其中該抗體係與放射性同位素或細胞毒性劑結合。
  9. 如申請專利範圍第7或8項之組成物，其進一步包含至少一種化學治療劑。
  10. 如申請專利範圍第9項之組成物，其中該化學治療劑係選自由阿黴素(doxorubicin)、順鉑(cisplatin)、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬(tamoxifen)、索拉非尼(sorafenib)及奧曲肽(octreotide)所組成之群組。
  11. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之經分離蛋白，其包含：a)至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102；及b)至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：108。
  12. 如申請專利範圍第11項之經分離蛋白，其中該蛋白 為嵌合抗體。
  13. 如申請專利範圍第12項之經分離蛋白，其中該嵌合抗體結合SEQ ID NO：38中所存在之抗原決定基。
  14. 如申請專利範圍第12或13項之經分離蛋白，其中該嵌合抗體具有約4.06×10-7 M的對SEQ ID NO：23之結合親和力(Kd)。
  15. 一種特異性結合SEQ ID NO：23之經分離蛋白，其包含：a)至少一個選自由以下者所組成之群組的重鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、及SEQ ID NO：86；及b)至少一個選自由以下者所組成之群組的κ輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、及SEQ ID NO：92。
  16. 如申請專利範圍第15項之經分離蛋白，其中該蛋白為嵌合抗體。
  17. 如申請專利範圍第16項之經分離蛋白，其中該嵌合抗體結合SEQ ID NO：40中所存在之抗原決定基。
  18. 如申請專利範圍第16或17項之經分離蛋白，其中該嵌合抗體具有約9.78×10-10 M的對SEQ ID NO：23之結合親和力(Kd)。
  19. 如申請專利範圍第11或15項之經分離蛋白，其中該蛋白為抗體。
  20. 如申請專利範圍第19項之經分離蛋白，其中該抗體係選自由單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體及前述任一者之抗原結合片段所組成之群組。
  21. 如申請專利範圍第11至13項及第15至17項中任一項之經分離蛋白，其中該蛋白包含標記。
  22. 如申請專利範圍第21項之經分離蛋白，其中該標記係選自由放射性同位素及細胞毒性劑所組成之群組。
  23. 如申請專利範圍第12、13、15及16項中任一項之經分離蛋白，其中該嵌合抗體包含人類IgG4重鏈及人類IgG4 κ輕鏈。
  24. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體的用途，其係用於製造供在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC之用的醫藥品，其中該單株抗體在該個體之肝臟中抑制選自由腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成及腫瘤發展所組成之群組的活性。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該單株抗體係與放射性同位素或細胞毒性劑結合。
  26. 如申請專利範圍第24或25項之用途，其中該醫藥品係動脈內投予該個體。
  27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該醫藥品係經由選自由肝動脈輸注及動脈化學栓塞療法(transarterial chemoembolization，TACE)所組成之群組的程序動脈內投予該個體。
  28. 如申請專利範圍第24或25項之用途，其中該醫藥 品係與至少一種化學治療劑組合使用。
  29. 如申請專利範圍第28項之用途，其中該化學治療劑係選自由阿黴素、順鉑、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奧曲肽所組成之群組。
  30. 如申請專利範圍第24或25項之用途，其中該個體為人類。
  31. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體的用途，其係用於製造供在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC之用的醫藥品，其中該抗體在該個體之肝臟中抑制選自由腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成及腫瘤發展所組成之群組的活性，且其中該醫藥品係經由動脈內輸注投予該個體且與至少一種化學治療劑組合使用以在該個體中治療HCC。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該抗體係與放射性同位素、細胞毒性劑或其組合結合。
  33. 如申請專利範圍第31或32項之用途，其中該動脈內輸注係選自由肝動脈輸注及動脈化學栓塞療法(TACE)所組成之群組。
  34. 如申請專利範圍第31或32項之用途，其中該醫藥品係遞送至該個體之肝臟中之HCC腫瘤內部或周圍的血管之內皮細胞。
  35. 如申請專利範圍第31或32項之用途，其中該化學治療劑係動脈內投予。
  36. 如申請專利範圍第31或32項之用途，其中該化學 治療劑係選自由阿黴素、順鉑、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奧曲肽所組成之群組。
  37. 如申請專利範圍第31或32項之用途，其中該個體為人類。
  38. 一種如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體的用途，其係用於製造供在個體中活體內偵測肝細胞癌(HCC)之用的醫藥品，其中該醫藥品係經由動脈內注射投予該個體，其中該抗體包含放射性同位素，且其中在投予該醫藥品後，獲得該個體之肝臟的影像且偵測該抗體於該個體之肝臟中的累積以在該個體中偵測HCC。
  39. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該個體為人類。
  40. 一種用於在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC的醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體，其中該抗體在該個體之肝臟中抑制選自由腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成及腫瘤發展所組成之群組的活性。
  41. 如申請專利範圍第40項之醫藥組成物，其中該單株抗體係與放射性同位素或細胞毒性劑結合。
  42. 如申請專利範圍第40或41項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係動脈內投予該個體。
  43. 如申請專利範圍第42項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係經由選自由肝動脈輸注及動脈化學栓塞療法(TACE)所組成之群組的程序動脈內投予該個體。
  44. 如申請專利範圍第40或41項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係與至少一種化學治療劑組合使用。
  45. 如申請專利範圍第44項之醫藥組成物，其中該化學治療劑係選自由阿黴素、順鉑、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奧曲肽所組成之群組。
  46. 如申請專利範圍第40或41項之醫藥組成物，其中該個體為人類。
  47. 一種用於在需要治療肝細胞癌(HCC)之個體中治療HCC的醫藥組成物，其包含治療有效量之如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體，其中該抗體在該個體之肝臟中抑制選自由腫瘤形成、腫瘤生長、腫瘤血管形成及腫瘤發展所組成之群組的活性，且其中該醫藥組成物係經由動脈內輸注投予該個體且與至少一種化學治療劑組合使用以在該個體中治療HCC。
  48. 如申請專利範圍第47項之醫藥組成物，其中該抗體係與放射性同位素、細胞毒性劑或其組合結合。
  49. 如申請專利範圍第47或48項之醫藥組成物，其中該動脈內輸注係選自由肝動脈輸注及動脈化學栓塞療法(TACE)所組成之群組。
  50. 如申請專利範圍第47或48項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物係遞送至該個體之肝臟中之HCC腫瘤內部或周圍的血管之內皮細胞。
  51. 如申請專利範圍第47或48項之醫藥組成物，其中該化學治療劑係動脈內投予。
  52. 如申請專利範圍第47或48項之醫藥組成物，其中該化學治療劑係選自由阿黴素、順鉑、絲裂黴素、5-氟尿嘧啶、他莫昔芬、索拉非尼及奧曲肽所組成之群組。
  53. 如申請專利範圍第47或48項之醫藥組成物，其中該個體為人類。
  54. 一種用於在個體中活體內偵測肝細胞癌(HCC)之醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至6項中任一項之單株抗體，其中該醫藥組成物係經由動脈內注射投予該個體，其中該抗體包含放射性同位素，且其中在投予該醫藥組成物後，獲得該個體之肝臟的影像且隨後偵測該抗體於該個體之肝臟中的累積以在該個體中偵測HCC。
  55. 如申請專利範圍第54項之醫藥組成物，其中該個體為人類。
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