TWI429906B - Quantitative method for microfluidic particles - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種用於微粒定量方法，特別是指一種用於微流體晶片之微粒定量方法。
我們的生活週遭存在著數目龐大且複雜的環境微生物(如細菌、黴菌等)，其中許多具有嚴重影響人類健康之特殊致病性或衛生性。獲得傳統微生物檢測結果報告通常需耗時數天，因此對於檢驗結果通常無法獲得即時性資訊。
近年來，隨著微流體晶片技術的不斷突破，具分選、捕捉濃縮等功能之微流體晶片亦陸續被開發出來，目前這類微流體晶片使用時，雖然具有捕捉濃縮之功能，但是對於所捕捉縮之微粒(生物微粒或非生物微粒)的定量，則通常無法立即在同一微流體晶片上完成，有些研究是將分選並濃縮之微粒置於另一計數晶片中，在計數晶片之微流道內以電場或流場控制的方式，將粒子聚焦成排列成一束地通過其檢測區域，然後利用檢測區域之阻抗變化或螢光的強度變化來計數微粒。此方法雖可達到計數之目的，但因流體速度無法太快，以至於其定量時間相當長，此外，以阻抗與螢光的差異來檢測，需克服環境的背景訊號，才能得到具代表性的結果。
因此，本發明之目的，即在提供一種可快速對微流體晶片收集之微粒進行定量的方法。
於是，本發明用於微流體晶片之微粒定量方法，微流體晶片設有一微流道，且微粒在連續流體帶動下，於微流道中之預定區域聚集堆疊成微粒團簇，該微粒定量方法包含以下步驟：(a)俯視或仰視擷取微流體晶片中之微粒團簇影像；(b)分析微粒團簇影像各單位畫素之透光性，而計算出微粒團簇各單位畫素的堆疊高度，並由各單位畫素之堆疊高度與單位畫素面積大小估算出微粒團簇之總體積；及(c)由微粒團簇總體積、單一微粒體積、流體流速與微粒聚集時間，定量出微粒濃度。
本發明之功效：透過擷取已被集中之微粒團簇影像，且依據微團簇影像各單位畫素之透光性估算各單位畫素之微粒堆疊高度的影像分析方法，可於微流體晶片進行微粒分選捕捉過程中，即時進行微粒之定量，可大幅縮短微粒定量所需的時間，且可應用於高流速之微流體晶片。
有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之一個較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。
如圖1、2所示，本發明用於微流體晶片之微粒定量方法的較佳實施例，可用以定量出微流體晶片3所聚集濃縮之微粒4濃度，在本實施例中，該微流體晶片3為三維介電泳微流體晶片，但實施時不以此為限，該微粒4可以是生物微粒，例如血球、細胞或微生物，或非生物微粒，例如乳膠微粒。
該微流體晶片3具有一微流道31，及分別設置於微流道31中之分選電極32與捕捉電極33，該微流道31具有一分選段311與多數連通於分選段311末端之捕捉段312，該等分選電極32是沿分選段311長度方向間隔排列地上下對稱設置於分選段311上、下側，該等捕捉電極33是分別沿該等捕捉段312長度方向間隔排列地上下對稱設置於該等捕捉段312上、下側，且該等上下對稱之分選電極32與捕捉電極33可分別被通以預定頻率之交流電，而分別於分選段311與捕捉段312中產生吸引或排斥具預定介電特性之微粒4的介電泳力。
如圖1~4所示，該微粒定量方法包含以下步驟：
步驟(一)捕捉聚集微粒4。將含有預定微粒4之檢體混合於預定體積之介電泳液(圖未示)中，並以預定之流速將含有微粒4之介電泳液注入分選段311中，以連續介電泳液持續將微粒4輸送通過該等分選電極32，使該等微粒4在該等分選電極32之介電泳力的作用下，依據其介電特性，隨著介電泳液的流動被分離至預定之捕捉段312中，並分別被捕捉段312中之捕捉電極33的介電泳力捕捉擋住，且在持續流經之介電泳液的帶動下，於該等捕捉電極33前方開始聚集堆疊成微粒團簇40。
步驟(二)擷取微粒團簇40影像。於微粒4開始聚集一預定時間後，以影像擷取裝置(圖未示)俯視擷取該捕捉段312位於該等捕捉電極33前方區域的微粒團簇40影像。
步驟(三)建立三維灰階柱狀分布圖。以三維影像分析方式，依據微粒團簇影像各單位畫素之透光性，將各單位畫素之影像轉換成灰階值的三維柱狀圖(如圖3所示)，理論上，影像的顏色愈深其灰階值則愈小，而影像顏色愈淺其灰階值則愈大，在微流道中，微粒團簇堆疊的高度愈高，則透光性愈差，故其影像顏色愈深，並將影像顏色最深時的高度設定等同於微流道的高度(h
)。接著，將上述所得三維柱狀分布圖影像的灰階值反轉(如圖4所示)，使得微粒4堆疊的高度與其灰階值成正比，亦即影像顏色越深表示微粒4堆疊高度越高。
步驟(四)估算微粒4濃度。依據步驟(三)反轉後之三維柱狀分布圖的高度與每單位畫素之面積，由下式(1)估算出三維柱狀分布圖之總體積，亦即微粒團簇40之總體積，其中，V trap
為被捕捉電極捕捉之微粒團簇40的總體積，X
、Y
為單位畫素之長、寬尺寸，h
微微流道之高度，L max
為單位畫素之最大灰階值，Li
為每單位畫素之灰階值。
V trap
=(X
×Y
)×Σ(h
/L max
)L i
(1)
於計算出微粒團簇40之總體積後，便可再以下式(2)計算出微粒初始濃度，其中，C
為微粒的濃度，V p
為每個微粒4體積，FR
為流體之流量，T
為微粒40被捕捉的時間，f D
為檢體樣本被稀釋的倍率。
C
=[(V trap
/V p
)/(FR
×T
)]×f D
(2)
如圖5~10所示，以下是以乳膠微粒之定量為例說明本發明微粒40定量方法之測試結果。
在以下測試例中，流體速度分別為0.75，1.00和1.25μm/s，流量分別為0.6，0.8和1.0μl/min，施加於該等捕捉電極33之電壓為20Vp-p
，頻率為10MHz，介電泳液為去離子水。將配製濃度為1.7*107
particles/ml，粒徑為2μm的乳膠微粒導引至微流道之捕捉段312後，捕捉擋止於該等箭頭狀之捕捉電極33前方，每隔二分鐘擷取其乳膠微粒堆積構成微粒團簇40的影像，觀察其變化，分別如圖5、7、9所示，並將前述三個微粒團簇影像經三維影像灰階值轉換成三維灰階柱狀分布圖，如圖6、8、10所示，經換算之後可得到其微粒的總體積與濃度。
如圖11、12所示，在不同的流體速度條件下，被捕捉微粒的數目是呈線性的成長，並且其微粒的數量與流速是成正比。濃度隨時間變化的曲線，在乳膠微粒堆積初期，因為乳膠微粒在微流道尚未達到飽和的狀態，所以計算的結果會比原始的濃度較高。但在5分鐘之後，充填密度已接近飽和，因此濃度就也趨於穩定，經估算後，微粒濃度約為2.0*107
particles/ml，與原始的配置濃度1.7*107
particles/ml十分接近，準確率相當高。
在本實施例中，是以仰視方式擷取微流體晶片3中之微粒團簇40影像進行分析處理與估算微粒4濃度，但實施時，亦可改採由上往下的方式，俯視擷取微流體晶片3中之微粒團簇40影像進行分析與估算，同樣可達到本發明之目的。
綜上所述，透過擷取已被集中之微粒團簇40影像進行三維影像分析，且依據微團簇影像各單位畫素之透光性建立三維灰值柱狀圖，使得微粒團簇影像之各單位畫素的灰階值與微粒4堆疊高度成正比的影像分析方法，可於微流體晶片3進行微粒4分選捕捉過程中，即時進行微粒4之定量，定量準確度高，且可大幅縮短微粒定量所需的時間，並可應用於低流速或高流速之微流體晶片3中，此定量方法對於食品或飲用水中的細菌量化具有相當不錯的發展潛力。因此，確實可達到本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
3．．．微流體晶片
31．．．微流道
311．．．分選段
312．．．捕捉段
32．．．分選電極
33．．．捕捉電極
4．．．微粒
圖1是本發明用於微流體晶片之微粒定量方法之一較佳實施例搭配使用之微流體晶片的俯視示意圖；
圖2是該較佳實施例之步驟流程圖；
圖3是該較佳實施例進行微粒定量時所擷取之微粒團簇的三維灰階柱狀分布圖；
圖4是類似圖3之視圖，說明三維灰階柱狀圖經灰階值反轉後之視圖，並說明灰階值與微粒堆疊高度成正比的情況；
圖5是該較佳實施例於微流體晶片開始捕捉聚集微粒時(1分鐘時)所擷取之微粒團簇影像；
圖6是圖5微粒團簇影像轉換成之三維灰階值柱狀分布圖；
圖7是類似圖5之視圖，說明已捕捉聚集微粒3分鐘時的微粒團簇影像；
圖8是類似圖6之視圖，是圖7微粒團簇影像轉換成之三維灰階值柱狀分布圖；
圖9是該類似圖5之視圖，說明已捕捉聚集微粒5分鐘時的微粒團簇影像；
圖10是類似圖6之視圖，是圖9微粒團簇影像轉換成之三維灰階值柱狀分布圖；
圖11是該較佳實施例針對微流體晶片於不同時間所捕捉之乳膠微粒所估算微粒團簇體積的曲線圖；及
圖12是該較佳實施例針對微流體晶片於不同時間所捕捉之乳膠微粒所估算之微粒濃度的曲線圖。
Claims (3)
- 一種用於微流體晶片之微粒定量方法，微流體晶片設有一微流道，且微粒在連續流體帶動下，於微流道中之預定區域聚集堆疊成微粒團簇，該微粒定量方法包含以下步驟：(a)俯視或仰視擷取微流體晶片中之微粒團簇影像；(b)分析微粒團簇影像各單位畫素之透光性，而計算出微粒團簇影像各單位畫素的堆疊高度，並由各單位畫素之堆疊高度與單位畫素面積大小估算出微粒團簇之總體積；及(c)由微粒團簇總體積、單一微粒體積、流體流速與微粒聚集時間，定量出微粒濃度。
- 依據申請專利範圍第1項所述之用於微流體晶片之微粒定量方法，其中，步驟(b)是以不同之影像灰階值定義微粒團簇影像各單位畫素之透光性。
- 依據申請專利範圍第2項所述之用於流體晶片之微粒定量方法，其中，步驟(b)是先依據各單位畫素之透光性將微粒團簇影像轉換成三維灰階柱狀分布圖，並使單位畫素之灰階值與微粒堆疊高度成正比，而計算出微粒團簇各單位畫素的堆疊高度。
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| TW98121016A TWI429906B (zh) | 2009-06-23 | 2009-06-23 | Quantitative method for microfluidic particles |
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| TW201100797A TW201100797A (en) | 2011-01-01 |
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| TWI507803B (zh) * | 2013-08-02 | 2015-11-11 | Univ Nat Cheng Kung | 介電微粒操控晶片與其製造方法和操控介電微粒的方法 |
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