TWI419687B - 作用於微小管抗癌藥物２’,５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ衍生物之合成與活性評估 - Google Patents

作用於微小管抗癌藥物２’,５’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｃｈａｌｃｏｎｅ衍生物之合成與活性評估 Download PDF

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Univ Kaohsiung Medical
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Description

作用於微小管抗癌藥物2',5'-dimethoxychalcone衍生物之合成與活性評估
本案係關於一種抗癌藥物及其製備方法，尤其係關於一種微小管抗癌藥物2',5'-dimethoxychalcone衍生物及其製備方法。
微小管(microtubule)主要由微管蛋白(tubulin)所組成，微小管在有絲分裂及細胞分裂等細胞活動上扮演重要角色。許多抗有絲分裂的藥物藉由干擾微管蛋白本身的動力學、聚合作用、解聚合作用而抑制癌細胞生長。
例如汰癌勝(paclitaxel)藉由防止微管蛋白的解聚合作用而穩定微小管，而長春花生物鹼及秋水仙素抑制微管蛋白的聚合作用。微管蛋白動力學的破壞導致細胞週期靜止於G2/M週期且導致細胞凋亡。目前抗有絲分裂的藥物(例如紫杉烷、長春花生物鹼)在臨床應用上的主要問題是這些藥物發展出抗藥性，因此，需要找出及研究有效的用於治療多抗藥性癌症的微管蛋白抑制劑。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「作用於微小管抗癌藥物2',5'-dimethoxychalcone衍生物之合成與活性評估」，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。
為了研發新的抗有絲分裂藥劑，本案合成出新的查酮類化合物。查酮(chalcone)係為具有芳香環的酮類，具有抗發炎、抗瘧疾、抗原蟲、抗菌、抑制一氧化氮、抑制酪氨酸酶、細胞毒殺、抗利什曼原蟲及抗氧化活性等生物活性。新合成的2' ,5' -dialkoxylchalcone查酮類衍生物的B環的第4號碳上具有羰基(carbonyl group，C=O)或胺甲醯基(carbamoyl group，─R-CONH2)取代基。實驗證實本案的化合物能有效毒殺與泌尿道系統有關的癌症細胞，對正常細胞沒有顯著的細胞毒殺作用。然而，本案亦能應用於其他癌症細胞的細胞毒殺作用上。
本案的第一目標是提供一種抗癌藥物組合物，其包含如式I所示結構的查酮類化合物：
其中當R2為氧基時，R1可為羥基(─OH)、C1 -C6 之烷氧基(─OCn H2n+1 )、芳基烷氧基、雜環烷氧基、烯氧基(─OCH2 CH=CHCn H2n+1 ，1n6，或─OCH2 CH=C(Cn H2n+1 )-Cm H2m+1 ，1m,n6)、烷胺基(─NR-R'，R及R'為氫、C1 -C6 飽和碳氫基團或C2 -C6 不飽和碳氫基團)、C3 -C6 環烷胺基、雜環胺基及─N(Cm H2m+1 )-Cn H2n OH基團(1m6，1n6)。或者，當R2為環丙烷亞胺基時，R1為環丙烷胺基。
本發明的第二目標是提供一種抗癌藥物組合物及其製備方法，其包含如式II所示結構的查酮類化合物：
其中該查酮類化合物係將2,5-二甲氧基苯乙酮(2,5-dimethoxyacetophenone)與5-醛基-2-噻吩甲酸(5-formyl-2-thiophenecarboxylic acid)在鹼性溶液下進行縮合反應，再以酸性溶液進行中和反應而得。
本發明的第三目標是提供一種製備抗癌藥物組合物的方法，包括步驟：(a)將2,5-二甲氧基苯乙酮與4-甲醯基苯甲酸甲酯(methyl 4-formylbenzoate)進行縮合反應，獲得4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮(4-carboxyl-2',5'-dimethoxychalcone)。步驟(a)係在鹼性溶液下進行反應，再以酸性溶液進行中和反應。
根據上述構想，該方法還包括：(b1)將4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮與鹵烷類化合物反應，獲得如上述式I所示的化合物，其中R2為氧基時，R1可為羥基(─OH)、C1 -C6 之烷氧基(─OCn H2n+1 )、芳基烷氧基、雜環烷氧基及烯氧基(─OCH2 CH=CHCn H2n+1 ，1n6，或─OCH2 CH=C(Cn H2n+1 )-Cm H2m+1 ，1m,n6)。
根據上述構想，其中步驟(b1)更詳細之步驟還包括：(b11)將4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮、鹵烷類化合物及碳酸鉀溶液進行反應，獲得一混合物；(b12)濃縮該混合物；(b13)以酸性溶液中和該混合物；以及(b14)以二氯甲烷萃取該混合物，以獲得該化合物。
根據上述構想，該方法還包括：(b2)將4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮與胺類化合物反應，獲得如上述式I所示的化合物，其中R2為氧基時，R1可為烷胺基(─NR-R'，R及R'為氫、C1 -C6 飽和碳氫基團或C2 -C6 不飽和碳氫基團)、C3 -C6 環烷胺基、雜環胺基及─N(Cm H2m+1 )-Cn H2n OH基團(1m6，1n6)。
根據上述構想，其中步驟(b2)更詳細之步驟還包括：(b21)將4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮、1-羥基苯三氮唑(hydroxybenzotriazole,HOBt)及1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcafbodiimide hydrochloride,EDCl)溶於二氯甲烷，獲得一混合物；(b22)將該混合物與該胺類化合物進行反應，獲得一反應物；(b23)濃縮該反應物；以及(b24)以乙酸乙酯結晶該反應物，以獲得該化合物。
本案所提出之「作用於微小管抗癌藥物2',5'-dimethoxychalcone衍生物之合成與活性評估」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。
實驗方法 一、合成化合物1～18 1.合成化合物1 (4-carboxyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將2,5-二甲氧基苯乙酮(2,5-dimethoxyacetophenone,450.0 mg,2.5 mmol)及4-甲醯基苯甲酸甲酯(methyl 4-formylbenzoate,410.4 mg,2.5 mmol)溶於50 mL甲醇，再加入50 mL的8%氫氧化鉀水溶液。反應混合物於室溫攪拌24小時，並以100 mL的10%鹽酸溶液中和形成黃色沈澱物，該黃色沈澱物經過濾及適量水清洗，粗產物使用乙酸乙酯/正己烷(2:1)的色層分析法純化，並以乙酸乙酯/正己烷(1:4)結晶，獲得黃色固體的化合物1 (4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮,491.6 mg,63.0%)，化合物1 之反應方程式如下所示。
化合物1 的性質如下：IR(KBr): 1681,1597 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 )：δ 3.82(3H,s,OCH3 ),3.89(3H,s,OCH3 ),6.96(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.06(1H,dd,J =9.0,3.2 Hz,H-4'),7.23(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.55(1H,d,J =16.0 Hz,H-α),7.68(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.69(2H,dd,J =8.8,1.6 Hz,H-2 and 6),8.13(2H,dd,J =8.8,1.6 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.8(C-1'and 4'),119.8(C-α ),128.3(C-2 and 6),129.3(C-3 and 5),130.2(C-4),140.4(C-1),141.0(C-β ),152.8(C-5'),153.7(C-2'),171.0(－COOH),191.8(C=O)；ESIMS:m/z 313[M+H]+ ；Anal. Calcd for C18 H16 O5 : C,69.22;H,5.16.Found: C,69.10;H,5.18。
2.合成C-4酯類化合物2～7 的方法A
將溶於丙酮的化合物1 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及鹵烷類化合物(alkyl halide,0.38 mmol)。反應混合物於室溫攪拌以製備化合物2～4 或是迴流整夜以製備化合物5～7 。混合物於減壓下濃縮乾燥，以10%鹽酸溶液中和，並以二氯甲烷萃取。將有機層以硫酸鈉乾燥、過濾及真空濃縮獲得粗產物。粗產物使用乙酸乙酯/正己烷的色層分析法純化，再以丙酮/正己烷(1:4)結晶獲得純化產物。化合物2～7 具有如式I所示的結構式，其中R1及R2官能基請參閱表1所記載。
以下為化合物2～7 之詳細說明。
3.合成化合物2 (4-methoxycarbonyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物1 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及碘甲烷(methyl iodide,0.38 mmol)。將混合物以上述的方法A合成出黃色固體的化合物2 (58.2 mg,92.8%)，其性質如下：IR(KBr): 1721,1598 cm-1 .1 H NMR(CDCl3 ):δ 3.81(3H,s,OCH3 ),3.87(3H,s,OCH3 ),3.92(3H,s,COOCH3 ),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.21(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.64(2H,d,J =8.0 Hz,H-2 and 6),7.65(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.05(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 52.2(COOC H3 ),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.6(C-1' and 4'),119.6(C-α ),128.1(C-2 and 6),128.9(C-3 and 5),130.0(C-4),139.5(C-1),141.2(C-β ),152.8(C-5'),153.6(C-2'),166.5(COOCH3 ),191.8(C=O)；ESIMS:m/z 327[M+H]+ ；Anal. Calcd for C19 H18 O5 : C,69.93;H,5.56. Found: C,69.95;H,5.62。
4.合成化合物3 (4-ethoxycarbonyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物1 (100 mg,0.32 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(88.5 mg,0.64 mmol)及碘乙烷(ethyl iodide,0.64 mmol)。將混合物以上述的流程A合成出黃色固體的化合物3 (50.0 mg,45.9%)，其性質如下：IR(KBr): 1715,1599 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.34(3H,t,J =7.2 Hz,CH3 ),3.81(3H,s,OCH3 ),3.87(3H,s,OCH3 ),4.38(2H,q,J =7.2 Hz,COOCH2 －),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.21(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.64(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.65(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.06(2H,dd,J =8.4,1.6 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 14.3(CH3 ),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),61.1(COOC H2 －),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.6(C-1' and 4'),119.6(C-α ),128.1(C-2 and 6),128.8(C-3 and 5),130.0(C-4),139.4(C-1),141.3(C-β ),152.8(C-5'),153.6(C-2'),166.0(COOCH2 －),191.9(C=O)；ESIMS:m/z 341[M+H]+ . Anal. Calcd for C20 H20 O5 ‧1/2H2 O: C,68.75;H,6.06. Found: C,68.71;H,6.49。
5.合成化合物4 (propoxycarbonyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物3 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及1-碘丙烷(propyl iodide,0.38 mmol)。將混合物以上述的流程A合成出黃色油狀的化合物4 (27.8 mg,40.8%)，其性質如下：IR(KBr): 1715,1602 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.04(3H,t,J =7.2 Hz,CH3 ),1.80(2H,m,CH 2 CH3 ),3.81(3H,s,OCH3 ),3.88(3H,s,OCH3 ),4.29(2H,t,J =6.4 Hz,COOCH2 －),6.95(1H,d,J =9.2 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =9.2,3.2 Hz,H-4'),7.22(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.65(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.66(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.06(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 10.5(CH3 ),22.1(C H2 CH3 ),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),66.7(COOC H2 －),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.7(C-1' and 4'),119.7(C-α ),128.1(C-2 and 6),128.8(C-3 and 5),130.0(C-4),139.4(C-1),141.3(C-β ),152.8(C-5'),153.7(C-2'),166.1(C OOCH2 －),191.9(C=O)；ESIMS:m/z 355[M+H]+ ；Anal. Calcd for C21 H22 O5 : C,71.17;H,6.26. Found: C,71.15;H,6.39。
6.合成化合物5 (4-isopropoxycarbonyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物3 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及2-碘丙烷(isopropyl iodide,0.38 mmol)。將混合物以上述的方法A合成出黃色油狀的化合物5 (58.2 mg,85.6%)，其性質如下：IR(KBr): 1711,1603 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.37(6H,d,J =6.0 Hz,CH3 ×2),3.81(3H,s,OCH3 ),3.87(3H,s,OCH3 ),5.26(1H,m,COOCH (CH3 )2 ),6.95(1H,d,J =9.2 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.21(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.64(2H,d,J =8.8 Hz,H-2 and 6),7.66(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.05(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 21.9(CH3 ×2),55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),68.6(COOC H(CH3 )2 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.7(C-1' and 4'),119.7(C-α ),128.1(C-2 and 6),128.8(C-3 and 5),130.0(C-4),139.3(C-1),141.4(C-β ),152.8(C-5'),153.7(C-2'),166.1(C OOCH(CH3 )2 ),191.9(C=O)；ESIMS:m/z 355[M+H]+ ；Anal. Calcd for C21 H22 O5 ‧1/4H2 O: C,70.28;H,6.32. Found: C,70.64;H,6.26。
7.合成化合物6 (4-benzyloxycarbonyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物3 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及α-溴甲苯(benzylbromide,0.38 mmol)。將混合物以上述的方法A合成出黃色油狀的化合物6 (67.7 mg,87.6%)，其性質如下:IR(KBr): 1717,1601 cm-1 ;1 H NMR(CDCl3 ):δ 3.81(3H,s,OCH3 ),3.87(3H,s,OCH3 ),5.38(2H,s,COOCH2 －),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.22(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.35(5H,m,－C6 H 5 ),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.64(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.66(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.09(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5);13 C NMR(CDCl3 ):δ 55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),66.9(COOC H2 －),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.7(C-1' and 4'),119.7(C-α ),128.2-128.3(三級芳基碳×5),128.6(C-2 and 6),129.0(C-3 and 5),130.2(C-4),135.9(四級芳香碳×1),139.6(C-1),141.2(C-β ),152.8(C-5'),153.7(C-2'),165.8(C OOCH2 －),191.8(C=O)；ESIMS:m/z 403[M+H]+ ；Anal. Calcd for C25 H22 O5 : C,74.61;H,5.51. Found: C,74.63;H,5.63。
8.合成化合物7 (4-(3-methyl-but-2-enyloxycarbonyl)-2',5'-dimethoxychalcone)
將溶於丙酮的化合物3 (60 mg,0.19 mmol)溶液加入碳酸鉀溶液(52.5 mg,0.38 mmol)及1-溴基-3甲基-2-丁烯(1-bromo-3-methyl-2-butene,0.38 mmol)。將混合物以上述的方法A合成出黃色油狀的化合物7 (62.5 mg,85.5%)，其性質如下：IR(KBr): 1714,1600 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.78(3H,s,CH3 ),1.79(3H,s,CH3 ),3.81(3H,s,OCH3 ),3.88(3H,s,OCH3 ),4.83(2H,d,J =7.2 Hz,COOCH2 －),5.47(1H,m,CH =C(CH3 )2 ),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.21(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.51(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.63(2H,d,J =8.0 Hz,H-2 and 6),7.65(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),8.06(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 18.1(CH3 ),25.8(CH3 ),55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),62.1(COOC H2 －),113.4(C-6'),114.4(C-3'),118.5(C H=C(CH3 )2 ),119.7(C-1' and 4'),119.7(C-α ),128.1(C-2 and 6),128.8(C-3 and 5),130.1(C-4),137.1(CH=C (CH3 )2 ),139.4(C-1),141.4(C-β ),152.8(C-5'),153.7(C-2'),166.1(C OOCH2 －),191.9(C=O)；ESIMS:m/z 381[M+H]+ ；Anal. Calcd for C23 H24 O5 : C,72.61;H,6.36. Found: C, 72.60;H,6.48。
9.合成C-4酯類化合物8～17 的方法B
將化合物3 (156 mg,0.5 mmol)、1-羥基苯三氮唑(hydroxybenzotriazole(HOBt),135.1 mg,1.0 mmol)及1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCl),191.7 mg,1.0 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入胺類化合物(1.0 mmol)，並於室溫攪拌2小時。將反應混合物以真空濃縮獲得粗產物，該粗產物使用乙酸乙酯/正己烷進行色層分析純化，再以乙酸乙酯結晶獲得純化產物。化合物8～17 具有如式I所示的結構式，其中R1及R2官能基請參閱表1所記載。
以下為化合物8～17 之詳細說明。
10.合成化合物8 (4-methylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (156 mg,0.5 mmol)、HOBt(135.1 mg,1.0 mmol)及EDCl(191.7 mg,1.0 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入甲胺(methylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色固體的化合物8 (82.3 mg,50.6%)，其性質如下：IR(KBr): 3326,1652,1546 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 3.10(3H,d,J =4.8 Hz,NHCH3 ),3.80(3H,s,OCH3 ),3.86(3H,s,OCH3 ),6.39(1H,br s,CONH－),6.94(1H,d,J =9.2 Hz,H-3'),7.04(1H,dd,J =9.2,3.2 Hz,H-4'),7.19(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.47(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.61(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.62(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.78(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 26.9(NHCH3 ),55.8(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.5(C-1' and 4'),119.5(C-α ),127.4(C-2 and 6),128.4(C-3 and 5),135.7(C-4),138.0(C-1),147.5(C-β ),152.7(C-5'),153.6(C-2'),167.5(CONH－),192.0(C=O)；ESIMS:m/z 326[M+H]+；Anal. Calcd for C19 H19 NO4 : C,70.14;H,5.89;N,4.31. Found: C,69.23;H,5.95;N,4.21。
11.合成化合物9 (4-ethylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (156 mg,0.5 mmol)、HOBt(135.1 mg,1.0 mmol)及EDCl(191.7 mg,1.0 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入乙胺(ethylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色固體的化合物9 (81.0 mg,47.8%)，其性質如下：IR(KBr): 3326,1641,1544 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.25(3H,t,J =7.2 Hz,CH3 ),3.50(2H,m,NHCH 2 －),3.80(3H,s,OCH3 ),3.86(3H,s,OCH3 ),6.26(1H,br s,CONH－),6.94(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.04(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.20(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.47(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.62(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.63(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.78(2H,d,J =8.0 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 14.8(CH3 ),35.0(NHCH2 －),55.8(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.5(C-1' and 4'),119.5(C-α ),127.4(C-2 and 6),128.4(C-3 and 5),135.9(C-4),138.0(C-1),141.5(C-β ),152.7(C-5'),153.6(C-2'),166.7(CONH－),192.0(C=O)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 339(100)；Anal. Calcd for C20 H21 NO4 : C,70.48;H,6.24;N,4.13. Found: C,69.87;H,6.28;N,4.07。
12.合成化合物10 (4-propylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (156 mg,0.5 mmol)、HOBt(135.1 mg,1.0 mmol)及EDCl(191.7 mg,1.0 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入正丙胺(propylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色油狀的化合物10 (52.9 mg,30.0%)，其性質如下：IR(KBr): 3329,1641,1544 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 0.99(3H,t,J =7.6 Hz,CH3 ),1.65(2H,m,CH 2 CH3 ),3.43(2H,m,NHCH 2 －),3.81(3H,s,OCH3 ),3.87(3H,s,OCH3 ),6.27(1H,br s,CONH－),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.02(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.20(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.48(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.63(2H,d,J =8.8 Hz,H-2 and 6),7.64(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.78(2H,d,J =8.8 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 11.4(CH3 ),22.9(C H2 CH3 ),41.8(NCH2 －),55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.6(C-1' and 4'),119.6(C-α ),127.4(C-2 and 6),128.4(C-3 and C-5),136.0(C-4),138.0(C-1),141.5(C-β ),152.7(C-5'),153.7(C-2'),166.8(CONH－),192.0(C=O)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 353(100)；Anal. Calcd for C21 H23 NO4 ‧1/2H2 O: C,69.58;H,6.68;N,3.87. Found: C,70.60;H,6.68;N,3.85。
13.合成化合物11 (4-(2-methylethyl)carbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入異丙胺(isopropylamine,1.0 mmol),並以上述的方法B合成出黃色固體的化合物11 (68.7 mg,60.7%),其性質如下：IR(KBr): 3320,1638,1538 cm-1 ;1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.26(6H,d,J =6.4 Hz,－CH(CH 3 )2 ),4.29(1H,m,NHCH (CH3 )2 ),6.02(1H,d,J =7.6 Hz,CONH－),6.94(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.04(1H,dd,J =9.0,3.2 Hz,H-4'),7.20(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.47(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.62(2H,d,J =8.0 Hz,H-2 and 6),7.63(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.77(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5);13 C NMR(CDCl3 ):δ 22.8(CH3 ),29.7(CH3 ),42.0(NHCH(CH3 )2 ),55.8(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.5(C-1' and 4'),119.5(C-α ),127.4(C-2 and 6),128.4(C-3 and 5),136.1(C-4),138.0(C-1),141.5(C-β ),152.7(C-5'),153.6(C-2'),165.9(CONH－),192.0(C=O)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 353(100)；Anal. Calcd for C20 H23 NO4 : C,71.37;H,6.56;N,3.96. Found: C,71.57;H,6.68;N,3.86。
14.合成化合物12 (4-dimethylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入二甲胺(dimethylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色油狀的化合物12 (53.0 mg,48.8%)，其性質如下：IR(KBr): 3485,1633 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 3.09(6H,m,－N(CH3 )2 ),3.81(3H,s,－OCH3 ),3.86(3H,s,－OCH3 ),6.94(1H,d,J =9.2 Hz,H-3'),7.03(1H,dd,J =9.2,3.2 Hz,H-4'),7.19(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.44(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.45(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.51(2H,d,J =8.0 Hz,H-3 and 5),7.63(1H,d,J =16.0 Hz,H-β )；13 C NMR(CDCl3 ):δ 35.3 and 39.5(N(CH3 )2 ),55.8(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.5(C-1' and 4'),119.5(C-α ),127.6(C-2 and 6),128.3(C-3 and 5),136.3(C-4),137.7(C-1),141.8(C-β ),152.7(C-5'),153.6(C-2'),170.9(CONH－),192.0(C=O);EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 339(100);Anal. Calcd for C20 H21 NO4 : C,70.48;H,6.24;N,4.13. Found: C,70.10;H,6.45;N,4.16。
15.合成化合物13 (4-cyclohexylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入環己胺(cyclohexylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色固體的化合物13 (84.0 mg,66.7%)，其性質如下：IR(KBr): 3312,1637,1540 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.24(2H,m,－CH2 －),1.44(2H,m,－CH2 －),1.66(2H,m,－CH2 －),1.76(2H,m,－CH2 －),2.04(2H,m,－CH2 －),3.81(3H,s,OCH3 ),3.94(3H,s,OCH3 ),3.98(1H,m,),6.00(1H,d,J =7.6 Hz,CONH－),6.95(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.05(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.21(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.48(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.63(2H,d,J =7.6 Hz,H-2 and 6),7.64(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.77(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 24.9(－CH2 －×2),25.5(－CH2 －×1),33.2(－CH2 －×2),48.8(),55.9(OCH3 ),56.5(OCH3 ),113.4(C-6'),114.4(C-3'),119.6(C-1' and 4'),119.6(C-α ),127.4(C-2 and 6),128.4(C-3 and 5),136.2(C-4),138.0(C-1),141.5(C-β ),152.7(C-5'),153.7(C-2'),165.8(CONH－),192.0(C=O)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 393(100)；Anal. Calcd for C24 H27 NO4 : C,73.26;H,6.92;N,3.56. Found: C,73.31;H,7.03;N,3.55。
16.合成化合物14 (4-diethylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入二乙胺(diethylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色油狀的化合物14 (115.5 mg,98.2%)，其性質如下：IR(KBr): 3568,1627 cm-1 ;1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.12(3H,m,CH3 ),1.24(3H,m,CH3 ),3.25(2H,m,NCH2 －),3.54(2H,m,NCH2 －),3.80(3H,s,OCH3 ),3.86(3H,s,OCH3 ),6.94(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.03(1H,dd,J =9.2,3.2 Hz,H-4'),7.19(1H,d,J =2.8 Hz,H-6'),7.39(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.44(1H,d,J =15.6 Hz,H-α ),7.60(2H,d,J =8.0 Hz,H-3 and H-5),7.63(1H,d,J =15.6 Hz,H-β )；13 C NMR(CDCl3 ):δ 12.9(CH3 ),14.2(CH3 ),39.3(NCH2 －),43.2(NCH2 －),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),113.3(C-6'),114.4(C-3'),119.4(C-1' and 4'),119.4(C-α ),126.9(C-2 and 6),128.4(C-3 and 5),135.9(C-4),138.7(C-1),141.9(C-β ),152.6(C-5'),153.6(C-2'),170.5(－CONH－),192.1(C=O)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 367(100)；Anal. Calcd for C22 H25 NO4 ‧1/4H2 O: C,71.04;H,6.91;N,3.77.Found: C,71.23;H,6.93;N,3.65。
17.合成化合物15 (4-tetrahydropyrrolylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入吡咯啶(pyrrolidine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色油狀的化合物15 (80.0 mg,68.4%)，其性質如下：IR(KBr): 3466,1619 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 1.89(4H,m,－CH2 CH2 －),3.42(2H,m,NCH2 －),3.60(2H,m,NCH2 －),3.79(3H,s,OCH3 ),3.85(3H,s,OCH3 ),6.94(1H,d,J =8.8 Hz,H-3'),7.02(1H,dd,J =8.0,3.2 Hz,H-4'),7.18(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.44(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.52(2H,d,J =8.0 Hz,H-2 and 6),7.59(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and 5),7.62(1H,d,J =16.0 Hz,H-β )；13 C NMR(CDCl3 ):δ 24.3(－C H2 CH2 －),26.3(－CH2 C H2 －),46.2(NCH2 －),49.5(NCH2 －),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),113.3(C-6'),114.3(C-3'),119.4(C-1' and 4'),119.4(C-α ),127.6(C-2 and 6),128.1(C-3 and 5),136.5(C-4),138.5(C-1),141.8(C-β ),152.6(C-5'),153.5(C-2'),168.9(CONH－),192.0(C=O)；EIMS(70 eV)m /z (% rel. int.): 365(97),295(100)；Anal. Calcd for C22 H23 NO4 ‧1/4H2 O: C,71.43;H,6.40;N,3.79. Found: C,71.67;H,6.71;N,3.63。
18.合成化合物16 (4-(2-hydroxyethyl)methylcarbamoyl-2',5'-dimethoxychalcone)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入N -甲基乙醇胺(N -methylethanolamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色油狀的化合物16 (93.6 mg,79.1%)，其性質如下：IR(KBr): 3403,1610 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 2.45(OH),3.05(3H,s,NCH3 ),3.10(1H,m,NCH H－),3.42(1H,m,NCHH －),3.71(2H,m,CH 2 OH),3.80(3H,s,OCH3 ),3.85(3H,s,OCH3 ),6.93(1H,d,J =9.2 Hz,H-3'),7.03(1H,dd,J =8.8,3.2 Hz,H-4'),7.19(1H,d,J =3.2 Hz,H-6'),7.45(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),7.46(2H,d,J =8.0 Hz,H-2 and 6),7.61(2H,d,J =9.2 Hz,H-3 and 5),7.62(1H,d,J =16.0 Hz,H-β )；13 C NMR(CDCl3 ):δ 38.6(NCH3 ),51.0(NCH2 －),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),60.6(－CH2 OH),113.3(C-6'),114.4(C-3'),119.5(C-1' and 4'),119.5(C-α ),127.8(C-2 and 6),128.3(C-3 and 5),136.7(C-4),137.0(C-1),141.6(C-β ),152.7(C-5'),153.6(C-2'),172.5(－CON－),192.0(C=O);EIMS(70 eV)m /z (% rel. int.): 369(31),295(100)；Anal. Calcd for C21 H23 NO5 : C,68.28;H,6.28;N,3.79.Found: C,66.78;H,6.52;N,3.45。
19.合成化合物17 (N -cyclopropyl-4-[3-cyclopropylimino-3-(2',5'-dimeth-oxy-phenyl)-propenyl]-benzamide)
將化合物3 (100 mg,0.32 mmol)、HOBt(86.5 mg,0.64 mmol)及EDCl(122.7 mg,0.64 mmol)的混合物溶於二氯甲烷並攪拌10分鐘。該混合物再加入環丙胺(cyclopropylamine,1.0 mmol)，並以上述的方法B合成出黃色固體的化合物17 (95.3 mg,76.2%)，其性質如下：IR(KBr): 3286,1640,1536 cm-1 ；1 H NMR(CDCl3 ):δ 0.60(2H,m,－CH 2 CH2 －),0.84(4H,m,－CH 2 CH 2 －),0.96(2H,m,－CH2 CH 2 －),2.67(1H,m,NHCH －),2.87(1H,m,=NHCH －),6.28(1H,br s,CONH－),6.42(1H,d,J =16.0 Hz,H-α ),6.70(1H,d,J =2.4 Hz,H-6'),6.95(2H,m,H-3' and 4'),7.12(1H,d,J =16.0 Hz,H-β ),7.42(2H,d,J =8.4 Hz,H-2 and 6),7.66(2H,d,J =8.4 Hz,H-3 and H-5)；13 C NMR(CDCl3 ):δ 6.8(－CH2 －×2),9.9(－CH2 －),10.0(－CH2 －),23.1(－NHCH－),36.2(=NCH－),55.8(OCH3 ),56.4(OCH3 ),112.6(C-6'),114.5(C-3'),115.0(C-1' and 4'),125.7(C-α ),127.1(C-2),133.5(C-5 and C-6),133.7(C-3),135.6(C-1),139.6(C-β ),150.5(C-5'),153.6(C-2'),164.6(C=N－),168.3(CONH－)；EIMS(70 eV)m/z (% rel. int.): 390(31)；Anal. Calcd for C24 H26 N2 O3 ‧1/4H2 O: C,72.98;H,6.76;N,7.09. Found: C,73.01;H,6.69;N,7.10。
20.合成化合物18 (3-(3-thiophene)carboxyl-1-(2,5-dimethoxyphenyl)prop-2-en-1-one)
將化合物1 (450.0 mg,2.5 mmol)及5-醛基-2-噻吩甲酸(5-formyl-2-thiophenecarboxylic acid,化合物20,390.4 mg,2.5 mmol)溶於50 mL甲醇，再加入50 mL的8%氫氧化鉀水溶液(50 mL)。反應混合物於室溫攪拌72小時，並以100 mL的10%鹽酸溶液中和形成黃色沈澱物，該黃色沈澱物經過濾及適量水清洗，粗產物使用乙酸乙酯/正己烷(2:1)的色層分析法純化，並以乙酸乙酯結晶，獲得黃色固體的化合物18 (469.6 mg,59.1%)，化合物18 (式II)之反應方程式如下所示。
化合物18 的性質如下：1 H NMR(CD3 OD):δ 3.80(3H,s,OCH3 ),3.90(3H,s,OCH3 ),7.12(1H,m,H-3'),7.14(1H,m,H-4'),7.15(1H,m,H-6'),7.40(1H,d,J =15.6 Hz,H-α),7.42(1H,d,J =3.2 Hz,H-5),7.70(1H,d,J =15.6 Hz,H-β),7.71(1H,d,J =3.2 Hz,H-4)；13 C NMR(CD3 OD):δ 56.2(OCH3 ),56.9(OCH3 ),114.8(C-6'),115.5(C-3'),120.7(C-4'),129.1(C-α ),132.8(C-5),135.1(C-4),135.8(C-β ),147.5(C-1),154.3(C-5'),155.2(C-2'),193.2(C=O)；ESIMS:m/z 319[M+H]+ ；Anal. Calcd for C16 H14 O5 S: C,60.37;H,4.43;S,10.07. Found: C,60.09;H,4.42;S,10.27。
二、細胞存活率/增殖之實驗
本發明的細胞株為自行建立之人類膀胱癌細胞株(NTUB1)，及購自美國ATCC之人類前列腺癌細胞株(PC3)、人類肺腺癌上皮細胞株(A549)及人類泌尿道上皮SV-40低引癌化細胞株(SV-HUC1)，然而應用於本發明的細胞株包括但不限於NTUB1、PC3、A549及SV-HUC1細胞，其他具有相同特性或不盡相同特性的細胞株均可應用於本發明。以RPMI 1640培養液培養NTUB1、PC3及A549細胞，以F12培養液培養SV-HUC1細胞，培養液並添加10%胎牛血清、100 unit/mL盤尼西林G、100 μg/mL鏈黴素及2mM L-麩醯胺酸(L-Glutamine)。細胞培養於37℃、5% CO2 培養箱。
本發明的化合物1～18 及順鉑(cisplatin，陽性對照組)對細胞株的細胞毒殺作用係以MTT法(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay)進行試驗。簡言之，細胞以1800cells/well密度植入96孔盤，並隔夜培養於37℃。再將不同濃度的化合物1～18 及順鉑分別加入孔洞，再將細胞培養於37℃、72小時。之後加入50 μL MTT(2 μg mg/mL in PBS)至孔洞中反應3小時。再以1000 g離心96孔盤10分鐘後，移去培養液並加入150 μL DMSO，以540 nm波長測量存活細胞的吸收光譜，以存活細胞相對控制組的比例計算細胞存活率，每組的IC50 值以半數效應分析計算，單位為平均±標準差。
三、細胞週期分析
細胞的DNA含量係以碘化丙啶對細胞進行染色而測定。簡言之，將6×105 個細胞植入孔洞，並以20 μM順鉑及不同濃度之化合物13 及17 分別處理細胞24小時。細胞經蛋白質水解酵素(trypsin)處理而加以收集，以PBS清洗細胞，並於-20℃以冰冷甲醇固定細胞。經過隔夜處理，以PBS清洗細胞，再加入50 μg/mL碘化丙啶及50 μg/mL RNase A，於室溫處理30分鐘。以流式細胞儀分析不同細胞週期的細胞。
四、免疫螢光染色法
簡言之，將NTUB1植入覆滿血清的蓋玻片上，以2%甲醛/PBS固定細胞20分鐘，再以冷甲醇滲入細胞3分鐘。以PBS清洗細胞2次，每次5分鐘。再以α -微管蛋白初級抗體隔夜處理細胞。以PBS清洗細胞3次，每次5分鐘。再加入羊抗兔rhodamine次級抗體及1 μg/mL 4'-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)，於室溫反應1小時。以PBS清洗蓋玻片，並封存於80%甘油/PBS的封存液中，以顯微鏡取得細胞影像。
五、α -微管蛋白之西方點漬分析
將1×106 個NTUB1細胞種入100 mm2 培養盤，並以所欲測試之化合物處理細胞6小時。以冷PBS清洗細胞，並以裂解緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 6.8),1 mM MgCl2 ,2 mM EGTA,20 g/mL aprotinin,20 g/mL leupeptin,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride,1 mM orthovanadate,0.5% Nonidet P-40)裂解細胞。將細胞裂解物(lysate)以15,000 g、4℃離心10分鐘。可溶性徵管蛋白及組裝性徵管蛋白分別存在於上清液及沈澱物(pellet)中。將上清液及沈澱物以習知的SDS-PAGE實驗方法進行解析。以抗微管蛋白單株抗體及鍵結horseradish peroxidase的二級抗體偵測轉漬至硝化纖維膜的蛋白。以β -actin為控制組。以西方點漬化學冷光試劑偵測免疫反應性訊號。
實驗結果
請參閱表2，其顯示化合物3 及其衍生物大多對NTUB1細胞具有顯著的細胞毒殺作用，而化合物18 對NTUB1細胞不具顯著的細胞毒殺作用。化合物3 的第4號碳─COOH的酯化作用增強了對NTUB1及PC3細胞之細胞毒殺作用。而化合物3 的第4 號碳的胺化作用可增強對癌細胞的細胞毒殺作用，而化合物10、11 及15 顯著地增加對NTUB1及PC3細胞的細胞毒殺作用。在表2中，具有4-丙基(4-propyl)、4-(2-甲基乙基)(4-(2-methylethyl))及4-四氫吡咯胺甲醯基(4-tetrahydropyrrolyl carbamoyl)取代基的化合物對NTUB1及PC3細胞具有顯著的細胞毒殺作用。
請參閱第1圖，化合物15 對NTUB1及PC3細胞的細胞毒殺作用比對A549細胞更顯著，其顯示出化合物15 對泌尿道系統的癌細胞具有專一的細胞毒殺作用。而化合物15 對人類正常泌尿道上皮細胞SV-HUC1的細胞毒殺作用較NTUB1及PC3細胞差，其顯示化合物15 可作為治療與泌尿道相關之癌症化學治療藥物。
接著，再以陽性控制組(順鉑)、化合物11 及15 處理癌症細胞，分析其對癌症細胞之細胞週期影響，控制組表示未施加藥物。如第2圖所示，以20 μM順鉑處理NTUB1細胞24小時導致細胞停滯於G1及S週期，伴隨sub-G1週期的細胞增加。NTUB1細胞分別暴露在1 μM化合物11 及15 下24小時導致細胞進入G1週期，並分別使凋亡細胞增加。如第3圖所示，以20 μM順鉑處理PC3細胞24小時導致細胞停滯於S週期，並使凋亡細胞增加。PC3分別暴露在1 μM化合物11 及15 下24小時導致細胞進入S及G1週期，並分別使凋亡細胞增加。而PC3分別暴露於3 μM化合物11 及15 下24小時導致細胞分別進入G1及G2/M停滯週期，且使凋亡細胞增加。前述結果顯示低劑量的化合物11 及15 使NTUB1細胞停滯於相同細胞週期，但高劑量的化合物11 及15 使PC3細胞停滯於不同細胞週期。
此外，以不同濃度的化合物15 處理NTUB1細胞24小時顯示出更多的NTUB1細胞死亡且呈現圓形(結果未示出)。由於微小管在細胞分化上扮演重要角色，若微小管功能受化學物質或化合物(例如汰癌勝)阻斷，細胞分化將被阻斷且無法進入正常的細胞週期。由免疫螢光顯微照相得知：化合物15 誘導NTUB1細胞的微小管束的形成，且具有類似汰癌勝的功能。以1 μM及0.3 μM化合物15 處理NTUB1細胞後證實：高劑量化合物15 使更多NTUB1細胞於細胞分裂時停滯，且影響微小管形成(結果未示出)。在化合物15 結合至α -微管蛋白後，其抑制微小管的動態不穩定性、G2/M細胞週期轉變、細胞分裂靜止，以及NTUB1細胞經過細胞凋亡過程而死亡(如第2圖所示)。
請參閱第4圖，以500 nM汰癌勝及不同濃度的化合物15 處理NTUB1細胞6小時，並分別收集上清液及沈澱物進行西方點漬分析。作為陽性對照組的汰癌勝確實穩定了微管蛋白的組裝。上清液中的微管蛋白隨化合物15 濃度增加而降低，然而沈澱物中的微管蛋白隨化合物15 濃度增加而增加，其顯示化合物15 能以類似汰癌勝之方式影響微管蛋白的組裝。
因此，本發明由2,5-二甲氧基苯乙酮與4-甲醯基苯甲酸甲酯合成出之4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮及其2',5'-dimethoxylchalcone衍生物對泌尿系統相關的癌症細胞NTUB1及PC3具有細胞毒殺作用，其中以在B環第4號碳位置的胺甲醯基取代基之化合物15 對NTUB1及PC3具有最強的細胞毒殺作用，且對正常細胞SV-HUC1及肺腺癌細胞A549不具顯著性的細胞毒殺作用，因此，化合物15 專一性地抑制泌尿系統癌症細胞之生長。而查酮類化合物B環第4號碳之胺甲醯基取代基在結合至微管蛋白上扮演重要角色。化合物15可作為針對微小管的微管蛋白聚合藥劑(microtubule-targeted tubulin-polymerizing agents(MTPA))。
本案所合成的2',5'-dimethoxylchalcone衍生物之R1及R2取代基包括但不限於化合物1～17 之取代基，本領域技術人員亦可應用具有如發明內容所述之取代基的衍生物合成出其他2',5'-dimethoxylchalcone衍生物。
本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附權利要求所要保護的範圍。
第1圖為化合物15 對NTUB1、PC3、A549及SV-HUC1細胞的細胞毒殺作用。
第2圖為NTUB1細胞分別以不同濃度之化合物11 及15 處理24小時之細胞週期分布。
第3圖為PC3細胞分別以不同濃度之化合物11 及15 處理24小時之細胞週期分布。
第4圖為NTUB1細胞的α -微管蛋白之西方轉漬結果。

Claims (6)

  1. 一種抗癌藥物組合物，其包含如式I所示結構的查酮類化合物： 其中當R2為氧基時，R1係選自由羥基(-OH)、C1 -C6 之烷氧基(-OCn H2n+1 )、芳基烷氧基、烯氧基(-OCH2 CH=CHCn H2n+1 ，1n6，或-OCH2 CH=C(Cn H2n+1 )-Cm H2m+1 ，1m,n6)、烷胺基(-NR-R'，R及R'為氫、C1 -C6 飽和碳氫基團或C2 -C6 不飽和碳氫基團)、C3 -C6 環烷胺基、含氮雜環及-N(Cm H2m+1 )-Cn H2n OH基團(1m6，1n6)所組成的群組其中之一；或當R2為環丙烷亞胺基時，R1為環丙烷胺基。
  2. 一種製備如式I所示結構之查酮類化合物的方法， 其中R2為氧基時，R1係選自由羥基(-OH)、C1 -C6 之烷氧基(-OCn H2n+1 )、芳基烷氧基及烯氧基(-OCH2 CH=CHCn H2n+1 ，1n6，或-OCH2 CH=C(Cn H2n+1 )-Cm H2m+1 ，1m,n6)所組成的群組其中之一，該方法包括步驟：(a)將2,5-二甲氧基苯乙酮(2,5-dimethoxyacetophenone)與4-甲醯基苯甲酸甲酯(methyl 4-formylbenzoate)進行反應，獲得4- 羧基-2',5'-二甲氧基查酮(4-carboxyl-2',5'-dimethoxychalcone)；以及(b)將該4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮與一鹵烷類化合物在一碳酸鉀溶液中反應，獲得該查酮類化合物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中步驟(a)係在一鹼性溶液下進行反應，再以一酸性溶液進行中和反應。
  4. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中步驟(b)還包括：(b1)濃縮含有該查酮類化合物的混合物；(b2)以一酸性溶液中和該混合物；以及(b3)以二氯甲烷萃取該混合物，以獲得該查酮類化合物。
  5. 一種製備如式I所示結構之查酮類化合物的方法， 其中R2為氧基時，R1係選自由烷胺基(-NR-R'，R及R'為氫、C1 -C6 飽和碳氫基團或C2 -C6 不飽和碳氫基團)、C3 -C6 環烷胺基、含氮雜環及-N(Cm H2m+1 )-Cn H2n OH基團(1m6，1n6)所組成的群組其中之一，該方法包括：(a)將2,5-二甲氧基苯乙酮(2,5-dimethoxyacetophenone)與4-甲醯基苯甲酸甲酯(methyl 4-formylbenzoate)進行反應，獲得4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮(4-carboxyl-2',5'-dimethoxychalcone)；以及(b)將該4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮與一胺類化合物反應，獲得該查酮類化合物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中步驟(b)還包括：(b1)將該4-羧基-2',5'-二甲氧基查酮、1-羥基苯三氮唑(hydroxybenzotriazole(HOBt))及1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCl))溶於二氯甲烷，以獲得一混合物；(b2)將該混合物與該胺類化合物進行反應，獲得一反應物；(b3)濃縮該反應物；以及(b4)以乙酸乙酯結晶該反應物，獲得該查酮類化合物。
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