TWI415638B - Composite material for repairing cartilage tissue and preparation method thereof - Google Patents
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Description
本發明係關於一種用於軟骨組織工程之生醫材料，尤其係關於一種用於修復軟骨組織之複合材料。
軟骨(cartilage)是一種無血管、無神經的結締組織，主要由細胞外基質(extracellular matric)及少量的軟骨細胞(chondrocytes)所組成，軟骨細胞外基質係由80%之膠原蛋白(collagen)以及20%之蛋白多醣(proteoglycans)所組成，其中膠原蛋白又以第二型膠原蛋白(type II collagen)為主。當軟骨組織因疾病或其他原因而產生缺損時，其自行修補的能力有限，因此可藉由軟骨組織工程(cartilage tissue engineering)，利用軟骨細胞結合人工合成基材或是天然基材，製造出具有活性及功能的組織，取代人體中的病損組織，由根本上解決軟骨組織缺損所致的功能障礙問題。
軟骨組織工程的三要素為細胞、支架(scaffold)以及訊息因子(signal)。其中，支架可視為人工的細胞外基質，提供立體空間及足夠的機械強度來維持軟骨細胞貼附生長所需的空間，使軟骨細胞在支架內發揮正常的功能以及調控特徵表現、行為與反應，進一步在適當時機給予軟骨細胞正確的訊息因子例如生長因子、貼附因子或分化因子之化學因子刺激，可促使軟骨細胞的活化或是特定路徑的再次啟動，而達到軟骨組織修復之目的。
細胞來源主要有同種自體(autologous)、同種異體(allogeneic)或異種異體(xenogeneic)，臨床上應用最廣的是由病患身上之正常軟骨塊而萃取得之自體軟骨細胞，其具有無免疫排斥和疾病傳染之優點，但增殖培養過程中，易因軟骨細胞的型態發生改變，使軟骨細胞去分化(dedifferentiation)，而無法持續分泌第二型膠原蛋白，造成軟骨細胞凋亡之問題；此外，萃取得之自體軟骨細胞約只有數十萬個，在體外培養過程中，常會產生不易維持其活性及功能性的問題，且自體軟骨細胞移植面積有所限制，範圍越大，血管增生越不易，增加壞死的機率。而同種異體具有組織相容性以及供應源不足等問題，異種異體則仍存有異體排斥與感染等問題。
另一方面，軟骨組織工程使用之支架材料可分為合成材料及天然材料，其中合成材料具有良好的機械性質及可調控的降解時間，但其細胞相容性較天然材料差；天然材料具有極佳的親細胞性質及特殊生物活性，可幫助軟骨細胞生長及分泌基質，但其具有降解過快和機械強度不佳等缺點。此外，傳統的支架製備方法有製造過程不協調、無韌性、致孔劑(hole forming agent)的使用、形狀限制等之缺點，大幅局限支架於軟骨組織工程上的應用性，且影響組織修復之成效。
為達到最好的修復效果，軟骨組織工程需考量細胞來源、機械性質、生物安全與相容性以及訊息因子等因素，且各因素需能互相配合，因此，若能研發結合有適當之細胞、支架與訊息因子之生醫材料，將有助於臨床上軟骨組織之修復成效。
為解決傳統軟骨組織工程所致問題及缺點，本發明之目的為提供一種用於修復軟骨組織之複合材料，包含：一包覆有細胞之組成物，係包含一人類胎盤間葉幹細胞(human Placenta-derived mesenchymal cells)以及一褐藻膠(alginate)。
本發明之另一目的為提供一種用於修復軟骨組織之複合材料的製備方法，步驟包含：混合一人類胎盤間葉幹細胞(human Placenta-derived mesenchymal cells)與一褐藻膠(alginate)，以形成一包覆有細胞之組成物。
該複合材料及其製備方法中，藉由一轉化生長因子-β，可誘導該人類胎盤間葉幹細胞分化為軟骨細胞。其中，該轉化生長因子-β係為轉化生長因子-β3
；且該轉化生長因子-β可包含於包覆有細胞之組成物中。
該複合材料係進一步包含一聚乳酸-聚甘醇酸(PLGA)精密支架(precision scaffold)。該複合材料之製備方法中，係進一步包含將該包覆有細胞之組成物與一聚乳酸-聚甘醇酸(PLGA)精密支架結合。
此外包覆有細胞之組成物可進一步包含一具有RGD(Arginine-Glycine-Aspartate)貼附序列之胜肽(RGD-containing peptide)與生醫陶瓷顆粒。其中具有RGD貼附序列之胜肽可為胺基酸序列之纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)；生醫陶瓷顆粒可為奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nano-calcium deficient hydroxyapatite)，且其係為生醫陶瓷(bioceramics)中的生物相容性(biocompatibility)陶瓷，且該轉化生長因子-β係可吸附於生醫陶瓷顆粒。
本發明用於修復軟骨組織之複合材料及其製備方法中，可達較佳細胞外基質分泌量及修復效果之各組成濃度分別為：CBD-RGD之濃度為10mg/g，人類胎盤間葉幹細胞之濃度為1×106
cells/scaffold，奈米化缺鈣氫氧基磷灰石之濃度為50-1000ppm，褐藻膠之濃度為1.2%，轉化生長因子-β3
之濃度為0.01μg/μl。此外，PLGA精密支架係藉由冷凍擠壓成型方式(liquid-frozen deposition manufacturing,LFDM)製備而得，且PLGA精密支架之纖維直徑(nozzle aperture)為0.2mm，中纖距(intervalbetween adjacent fibers)為0.7mm。
另一方面，本發明用於修復軟骨組織之複合材料於誘導分化時，可於誘導分化之軟骨分化培養基(Chondrogenic induction medium)中再加入該轉化生長因子-β3
(濃度約10ng/ml)，藉以促進人類胎盤間葉幹細胞分化為軟骨細胞；且經21天之誘導分化可產生約6μg/scaffold之第二型膠原蛋白以及約80μg/scaffold之葡萄糖胺聚合醣，藉此細胞外基質之分泌，達成軟骨細胞新生及修復受損軟骨組織之目的。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
本發明實施例之用於修復軟骨組織之複合材料係為一包覆有細胞之組成物，並可進一步結合PLGA精密支架，再利用轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)例如TGF-β3
誘導軟骨生成及分化。其中，包覆有細胞之組成物係包含有幹細胞以及褐藻膠(alginate)，並可進一步包含一具有RGD貼附序列之胜肽(RGD-containing peptide)例如CBD-RGD，且轉化生長因子-β可吸附於生醫陶瓷顆粒例如奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nano-calcium deficient hydroxyapatite,下述以nCDHA稱之)或包含於該包覆有細胞之組成物中。
本發明實施例之用於修復軟骨組織之複合材料係藉由分析軟骨細胞生成數量以及軟骨細胞產生之細胞外基質：蛋白多醣與第二型膠原蛋白之表現，進而確認其誘導軟骨生成(chondrogenesis)及分化的效果。其中，葡萄糖胺聚合醣(GAG)係為蛋白多醣內主要的成分，因此蛋白多醣的分析係以偵測葡萄糖胺聚合醣(GAG)的表現為主，其分析方法包含阿爾襄藍染色法(Alcian Blue stain)、蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin-eosin,H＆E)以及葡萄糖胺聚合醣分析；第二型膠原蛋白之表現則係利用第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析以及酵素連結免疫吸附法(ELISA)分析之。
軟骨細胞生成數量分析方面，係將經誘導分化之軟骨細胞以冷凍乾燥法乾燥後，加入1.5ml之分解液(分解液內含55mM之去水檸檬酸三鈉【trisodium citrate dehydrate,Showa】、150mM之氯化鈉【sodium chloride,Sigma】以及5mM之半胱胺酸鹽酸【cysteine HCl,Sigma】與5mM之乙二胺四乙酸二鈉【Na2
EDTA,Sigma】，於使用前再取1mg之木瓜酵素【papain,Sigma】溶於21ml之分解液中)，置於60℃下反應24小時。以分解液將細胞液調整成6個濃度梯度做為標準品；取出0.5ml之軟骨細胞液樣品及標準品，加入5ml之螢光染劑(將Hoechst 33258染劑【Sigma】添加於內含10mM之Tris-HCl【Riedel-de，Germany】、1mM之乙二胺四乙酸二鈉【Na2
EDTA,Sigma】、0.1mM之氯化鈉緩衝溶液中，調整pH=7.4，該染劑之最終濃度為0.1μg/ml)，混和均勻後避光靜置1小時。使用螢光光度計(F2500,Hitachi)測定吸收值(Em：458nm、Ex：365nm)，以標準品製作檢量線，再以此檢量線來定量軟骨細胞數。
組織切片製作及染色方面，將經誘導之細胞以10%之甲荃(formaldehyde)固定48小時後，置入包埋匣(embedding cassette)，進行梯度酒精脫水、二甲苯置換與石蠟浸潤，再進行石蠟包埋，得到樣品臘塊。利用滑動式切片機，以組織切片機切取5μm厚的切片，以二甲苯進行脫蠟，再以梯度酒精溶液進行水合，所得試片便可進行阿爾襄藍染色(Alcian Blue stain)以及蘇木紫-伊紅染色(Hematoxylin-eosin,H＆E)。
阿爾襄藍染色法之染色原理係基於阿爾襄藍(Alcian blue)為可將葡萄糖胺聚合醣(glycolsaminoglycan,GAG)染成藍色之染劑，且此葡萄糖胺聚合醣(GAG)係為蛋白多醣內主要的成分。其染色方法為先以3%醋酸水溶液溶解1克之阿爾襄藍(sigma)，並將pH值調至2.5。將經誘導之細胞組織切片浸染於阿爾襄藍染劑中30分鐘，再經流水清洗2分鐘後，置於0.1%之核固紅(nuclear fast red)染劑中作用5分鐘，經流水清洗1分鐘，依序置於80%、90%與100%酒精溶液作用各3分鐘，進行脫水步驟，最後置於二甲苯溶劑中，以非水溶性封片膠進行封片，再以正立式光學顯微鏡觀察染色結果。
蘇木紫-伊紅染色是組織病理常用之染色法，蘇木紫(Hematoxylin)能將細胞核染成藍色，伊紅(Eosin)可將細胞質染成粉紅色，藉以觀察組織構造及細胞外形。將經誘導之細胞組織切片浸泡於二甲苯溶劑中作用5分鐘，溶掉多餘石蠟，再進行水合步驟，切片依序在100%、95%、90%、80%與70%酒精溶液中，各浸泡30秒，經流水清洗1分鐘，去除多餘水分，置於蘇木紫(Merck,Germany)溶液作用2分鐘，進行細胞核染色，再經流水清洗1分鐘，置於伊紅(Sigma,Canada)溶液作用1分鐘，進行細胞質染色，依序置於70%、80%、90%、95%與100%之酒精溶液，作用各1分鐘，進行脫水步驟，最後置於二甲苯溶劑中，以非水溶性封片膠進行封片，即完成染色，並以正立式光學顯微鏡觀察染色結果。
葡萄糖胺聚合醣分析方法包含將經誘導之細胞冷凍乾燥後，加入1.5ml如前述之分解液，置於60℃下反應24小時。以分解液為溶劑，配製chondrotin 6-sulfate C sodium salt(Sigma)之標準品；取0.5ml之樣品及標準品，加入5ml DMMB(1,9-Dimethyl-methylene blue)染劑，混合均勻。以可見光/紫外光光譜儀(U200,Hitachi,Japan)於525nm波長下測定吸收值，並以標準品結果繪製檢量線，再以此檢量線來定量樣品中的GAG含量。
第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析係利用免疫化學染色試劑，以免疫抗體結合第二型膠原蛋白，並藉由綠色螢光的呈現，而偵測得軟骨細胞外基質中第二型膠原蛋白的表現。其方法為將經誘導之細胞組織切片置於70℃烘箱15分鐘，使組織切片緊黏於玻片上。將組織切片浸泡在二甲苯溶劑中作用5分鐘，溶掉多餘石蠟，再進行水合步驟，試片依序在100%、95%、90%、80%、70%之酒精溶液中，分別各浸泡各5分鐘，以磷酸鹽緩衝溶液(phosphate-buffered saline,PBS)清洗後，將試片浸染於3%之H2
O2
中15分鐘，以PBS清洗5分鐘；於試片上滴覆2%之BSA反應30分鐘後，以PBS清洗後；在試片上滴覆第二型膠原蛋白之一級抗體(Mouse anti human type II collagen monoclonal antibody,Neomarkers,Fremont,CA,USA，該一級抗體係以PBS依1:100的比例稀釋之)反應1.5~2小時，以PBS清洗；在試片上滴覆第二型膠原蛋白之二級抗體(fluoresceinisothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse antibody,Gt×Ms IgG Fluor,Temecula,CA，該二級抗體係以PBS依1:500的比例稀釋之)反應1小時，以PBS清洗；以非水溶性封片膠進行封片，即完成染色，以正立式光學顯微鏡觀察染色結果，其中陽性染色為綠色螢光反應，代表第二型膠原蛋白之分泌合成情况。
第二型膠原蛋白之含量係利用ELISA assay kit(ASB-5000-EX,RheumeraTM
,Japan)分析之，其實驗步驟依照該套組織操作手冊進行。
前述該些分析結果係以平均值±標準差表示之，並使用t檢定(t-test)作統計數據分析，當p值小於0.05則具有統計上意義的差異性。
經由該些分析，結果顯示本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料，經過21天之較佳誘導時間後，其軟骨細胞之生長數目、葡萄糖胺聚合醣(GAG)與第二型膠原蛋白等細胞外基質的分泌量係高於僅包含人類胎盤間葉幹細胞與PLGA精密支架以及包含人類胎盤間葉幹細胞、褐藻膠與PLGA精密支架之實驗組別；且在組織切片染色上，本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料之成熟軟骨的表徵：陷窩(lacunae)也較為明顯且完整。另外，本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中之人類胎盤間葉幹細胞的葡萄糖胺聚合醣(GAG)之表現量顯著多於人類骨髓間葉幹細胞，因此本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料可應用於骨組織工程，以有效達成軟骨組織修復之目的。
首先將細胞密度為1×106
cells/ml之幹細胞與適量之CBD-RGD混合均勻，另一方面，取適量之nCDHA並加入濃度為0.01μg/ml之TGF-β3
混合均勻，將此混合液置於37℃、5% CO2
培養箱中反應1小時，使nCDHA吸附TGF-β3
，將此兩混合液混合均勻後再加入褐藻膠溶液，而獲得包含幹細胞、CBD-RGD蛋白質、吸附有TGF-β3
之nCDHA以及褐藻膠之包覆有細胞之組成物。包覆有細胞之組成物中各組成之製備及分析，茲分述如下：
本發明實施例之包覆有細胞之組成物係以人類骨髓間葉幹細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)或人類胎盤間葉幹細胞(human Placenta-derived mesenchymal cells,hPDMCs)作為細胞來源。
將懷孕38-40週健康人類母體於分娩後之胎盤剪成小片段，經由PBS清洗後，以0.25%之trypsin酵素於37℃下消化10分鐘，並分離得人類胎盤間葉幹細胞之初代細胞。另一方面，骨髓組織由45歲病人之腸骨嵴取得，經適當處理後，獲得人類骨髓間葉幹細胞之初代細胞。
將人類胎盤間葉幹細胞與人類骨髓間葉幹細胞之初代細胞分別培養於75 T-flask(，BD Biosciences，USA)之培養皿，該培養皿係放置有880ml/L之DMEM低糖培養液(Dulbecco’s Modified eagle’s Medium,low glucose,Gibco)、100ml/L之胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,HyClone)、10ml/L之盤尼西林-鏈黴素(Penicillin-streptomysin,Biological Industries)以及10ml/L之濃度為200mM的L-麩醯胺酸(L-Glutamine,Tedia)。當該些初代細胞培養至細胞密度為8分滿後，以0.25%之trypsin/EDTA(Gibco/BRL，Grand Island，NY，USA)培養並置於37℃、5% CO2
之細胞培養箱進行繼代，取代數為5~12代之細胞進行後續試驗。
此外，為便於區分後續實驗中使用之不同個體來源的幹細胞，取自一患者之人類骨髓間葉幹細胞係給予C1008之編號，取自另一患者之人類骨髓間葉幹細胞係給予HSC-1之編號：同時，取自一患者之人類胎盤間葉幹細胞係給予C081127之編號，取自另一患者之人類胎盤間葉幹細胞係給予C080520之編號。
本發明實施例係利用流式細胞儀(flow cytomerty)分析該些幹細胞之表面蛋白(surface marker)特徵。首先分別將人類胎盤間葉幹細胞(編號為C081127)與人類骨髓間葉幹細胞(編號為C1008)從培養盤取下，計數細胞濃度為5×105
cells/ml後，以PBS清洗3次，離心收集細胞塊；加入100μl之PBS回溶細胞塊後，在細胞液中加入8μl含螢光之抗體包含：CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD106、CD166-conjugated fluoresceinisothiocyanate FITC、CD29、CD31以及CD73-conjugated phycoerythrin，避光反應30分鐘，之後以PBS清洗3次，移除未反應之抗體，再離心收集細胞塊，最後加入500μl之PBS回溶細胞塊，上述步驟保持在4℃下操作。接著，使用流式細胞儀(FACScan,BD,USA)分析，以僅含有螢光之細胞做為背景，含抗體之細胞為對照組，判斷細胞表面蛋白之表現分化群標記(cluster of differentiation marker,CD marker)，結果如第一圖所示。
由細胞表面蛋白之表現分化群結果可知，人類胎盤間葉幹細胞(C081127)與人類骨髓間葉幹細胞(C1008)之CD29、CD44、CD73、CD90與CD105呈現陽性反應(如第一圖所示)，而該些幹細胞之CD31、CD34、CD45、CD166則呈陰性反應(結果未示)，此結果顯示人類胎盤間葉幹細胞與人類骨髓間葉幹細胞可表現相同之表現分化群標記(CD marker)。
為証實本發明實施例所製備之幹細胞具有軟骨分化能力，係以含有TGF-β3
生長因子之軟骨分化培養基(Chondrogenic induction medium)進行幹細胞培養，在分化培養後3週取樣進行細胞外基質染色。
本發明實施例係利用轉移盤(transwell)及前述之染色分析測試幹細胞經誘導而分化生成軟骨細胞之能力。將20μl含有約4×105
細胞量之人類胎盤間葉幹細胞(C081127)液置於一聚酯材料製成之24孔(24-well，孔徑為0.4mm)轉移盤(transwell)中，將轉移盤(transwell)於37℃培養箱中培養4小時，使細胞聚集形成細胞團塊，加入過量(亦即添加量需超過轉移盤底部薄膜)之可誘發軟骨分化生成的軟骨分化培養基，此培養基包含DMEM培養液(Dulbecco’s Modified eagle’s Medium,Gibco)、濃度為10ng/ml之TGF-β3
(CytoLab/PeproTech,Rehovot,Israel)、濃度為10ng/ml之皮質類固醇激素(Dexamethasone,Sigma)、濃度為50μg/ml之L-抗壞血酸-2-磷酸酯(L-Ascorbate-2-phosphate,Sigma)、濃度為40μg/ml之L-脯氨酸(L-Proline,Sigma)以及濃度為10μl/ml之胰島素-轉鐵蛋白-硒酸鈉混合物(Insulin-Transferrin-Selenium premix,100X,Sigma)，進行21天之培養，且培養期間每三天更換一次培養液，其中培養基所添加之TGF-β3
(10ng/ml)係具有維持滲透壓，而可達到均勻分化之目的。接著，將經培養21天之誘導後細胞分別進行阿爾襄藍染色法(Alcian Blue stain)以及第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析，其結果如第二A與二B圖以及第三A與三B圖所示。
軟骨細胞之分化初期，間葉細胞(mesenchymal cells)聚集形成一含少量細胞外基質的細胞簇(cell cluster)，此細胞簇稱為胚質(blastema)；排列緊密的胚質細胞開始分泌細胞外基質，細胞外基質中的膠原纖維被一種嗜鹼性物質所圍繞，此時期的細胞稱為軟骨母細胞(chondroblasts)；軟骨母細胞會分泌細胞外基質將自己包覆，最後大量的細胞外基質將細胞區隔開來，形成稱為陷窩(lacunae)的空間。
請同時參閱第二A與二B圖，該些圖係分別為本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中，人類胎盤間葉幹細胞以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之不同放大倍率的阿爾襄藍染色分析結果圖。由圖中可觀察到，細胞之間有許多絲狀纖維、葡萄糖胺聚合醣(GAG)的累積，細胞團聚集現象以及細胞周圍分泌胞外基質形成之陷窩(lacuna)，此結果顯示人類胎盤間葉幹細胞具有軟骨分化的能力。
請同時參閱第三A與三B圖，該些圖係分別為本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中，人類胎盤間葉幹細胞以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之不同放大倍率的第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析結果圖。由圖中可觀察到有綠色螢光分佈，並且分佈範圍不均一，球體靠近表面處的螢光強度比中心內部較強，亦即可觀察到第二型膠原蛋白的表現，顯示人類胎盤間葉幹細胞具有軟骨分化的能力。
具有RGD(Arginine-Glycine-Aspartate)貼附序列之胜肽(RGD-containing peptide)係可促進細胞貼附與生長。本發明實施例係以纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)蛋白質進行試驗。
RGD(Arginine-Glycine-Aspartate,RGD)貼附序列係為纖維連接蛋白(fibronectin)中促進細胞貼附的最小功能單位，可促進細胞的貼附與維持細胞分化；纖維素結合功能區域(cellulose binding domain，CBD)係為真菌(Tricoderma konigii)的纖維素水解酶(cellulobiohydrolase I,CBH I)N端之一段36個胺基酸大小之序列片段，並具有纖維素親和力，本發明實施例之纖維素結合功能區域(CBD)係進一步經由聚合酵素連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)將其基因中第五個胺基酸密碼tyrosine改為tryptophan，藉以提高纖維素結合功能區域(CBD)對纖維素的親和力。
接著將RGD貼附序列與經胺基酸密碼修正之纖維素結合功能區域(CBD)相結合，以形成可促進細胞吸附於纖維素上的雙功能CBD-RGD蛋白質，且此蛋白係具有如SEQ ID NO:1所示胺基酸序列，分子量為25kDa。
氫氧基磷灰石(hydroxyapatite)、缺鈣氫氧基磷灰石(CDHA)、奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nCDHA)等生醫陶瓷顆粒，其組成中含有能通過人體正常的新陳代谢並進行轉換的鈣(Ca)、磷(P)等元素，或含有能與人體組織產生鍵結的氫氧基(-OH)等基團，具有良好的生物相容性以及可於生物體內降解等特性，且可用以吸附蛋白質。本發明實施例係以奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nCDHA)吸附CBD-RGD蛋白質。
nCDHA係為一種經奈米化之生醫陶瓷(bioceramics)材料，其化學結構為Ca10- x
(PO4
)6- x
(HPO4
) x
(OH)2- x
，，形態上長為20-80nm，直徑為5-10nm之core-shell結構，nCDHA之鈣磷比例(Ca/P)為1.5，與骨組織的礦化物成分與結構相同，並具有良好的生物相容性；且nCDHA的比表面積(specific surface)大，可利於細胞貼附。此外，nCDHA係具有可吸附並緩慢釋放蛋白質例如生長因子、蛋白質藥物等之特性，並能藉由生長因子或藥物釋放機制以達到特定的治療影響，本發明實施例中nCDHA係吸附有TGF-β3
生長因子，當此nCDHA與經褐藻膠包覆之幹細胞結合後，可透過擴散作用釋放TGF-β3
，直接對幹細胞誘導分化。此外，本發明實施例中可有效吸附蛋白質之nCDHA使用濃度為50-1000ppm，較佳為500ppm。
幹細胞在培養過程中需添加與軟骨發育相關的生長因子來誘導細胞趨向軟骨分化，其目的是為了在體外模擬體內軟骨細胞的發育生長的微環境，達到誘導分化效果。TGF-β例如TGF-β1
、TGF-β2
與TGF-β3
對軟骨細胞的分化和功能具有雙向調節作用，促進未分化或分化早期軟骨細胞之DNA合成、增殖及細胞外基質合成，亦能抑制介白素-1之作用，減緩軟骨基質的分解代謝，使基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)表現量增高，而抑制基質金屬蛋白酶的表現，提高修復能力。本發明實施例中係以TGF-β3
進行試驗，且可有效促進軟骨細胞分化之TGF-β3
使用濃度為0.1~10ng/ml，較佳為10ng/ml。
褐藻膠係為常用於軟骨細胞的載體，其可提供一低細胞毒性的包覆作用，完整維持細胞之立體構形、活性及功能性。本發明實施例中係藉由褐藻膠包覆幹細胞以維持細胞的球狀立體形態，再行分化，且可包覆生長因子，促進軟骨細胞的生長，維持軟骨細胞的表型。
取0.8775克之氯化鈉(sodium chloride,Sigma)與1.2克之褐藻酸鈉(sodium alginate,Hanawa,Japan，分子量為110,000，M/G=1/2)，溶於100ml之二次水中，攪拌至完全溶解；以高溫高壓法滅菌，將此1.2%之褐藻膠溶液冷卻後置於4℃下保存，以備用之。
為找出適當之CBD-RGD蛋白質添加濃度，本發明實施例係分析包覆有細胞之組成物中不同濃度之CBD-RGD蛋白質對幹細胞誘導軟骨生成之影響。請參閱表一，分別針對人類骨髓間葉幹細胞(C1008)與人類胎盤間葉幹細胞(C081127)，以10與20mg/g不同濃度之CBD-RGD蛋白質為實驗組，並以不含CBD-RGD蛋白質為對照組。
首先將細胞密度為1×106
cells/ml之人類骨髓間葉幹細胞(hBMSCs)與人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)分別與10mg/g、20mg/g之CBD-RGD蛋白質混合後，再加入已吸附TGF-β3
(1μg/100ml)之nCDHA，於此混合液(含幹細胞、CBD-RGD以及吸附有TGF-β3
之nCDHA)中再加入褐藻膠溶液，最後將此混合液裝入無菌針筒中。在6孔培養盤中加入適量之濃度為102mM的氯化鈣(calcium chloride)溶液，以29號針頭將細胞液滴入6孔培養盤中形成直徑約2mm之褐藻膠微珠(alginate bead)，靜置10分鐘待凝膠完全後，以塑膠滴管小心移除氯化鈣溶液，加入適量0.15M之氯化鈉溶液清洗褐藻膠微珠後，加入軟骨分化培養基(Chondrogenic induction medium)，置於37℃、5% CO2
培養箱中培養21天，每隔三天更換一次培養液。於培養21天後，將褐藻膠微珠以PBS清洗兩次，再將樣品浸泡於55mM之檸檬酸鈉溶液中10分鐘，待褐藻膠微珠完全溶解後離心收集細胞，並進行葡萄糖胺聚合醣(GAG)之含量分析、阿爾襄藍染色以及蘇木紫-伊紅染色。結果如第四圖、第五圖與第六圖所示。
請參閱第四圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖。由圖中可觀察，由於CBD-RGD蛋白質可活化細胞並促進細胞增生，進而分泌更大量的細胞外基質，因此，葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量會隨著CBD-RGD蛋白質濃度的增加而增加，但在CBD-RGD蛋白質濃度為10mg/g時，人類骨髓間葉幹細胞(hBMSCs)與人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)所分泌的細胞外基質有顯著性的差異(p
<0.001)。
請同時參閱第五圖與第六圖，其中，第五圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的阿爾襄藍染色結果圖，第六圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的蘇木紫-伊紅染色結果圖。於阿爾襄藍染色之組織切片可觀察到人類骨髓間葉幹細胞(hBMSCs)於無CBD-RGD蛋白質以及兩種不同濃度的CBD-RGD蛋白質之條件下進行軟骨誘導分化時，並無顯著差異性且無陷窩(lacunae)的生成；且於蘇木紫-伊紅染色結果中，僅CBD-RGD蛋白質濃度為10mg/g時，才可觀察到黑色小點細胞聚集的現象，此為細胞趨向軟骨成熟化的表徵。
另一方面，人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)誘導軟骨生成之阿爾襄藍染色與蘇木紫-伊紅染色結果中，當無CBD-RGD蛋白質時，也可生成陷窩，但當CBD-RGD蛋白質濃度為10mg/g時，其陷窩分佈較廣、較為完整並且數量也較多。
該些結果顯示，於三維空間的褐藻膠培養過程中，人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)係較人類骨髓間葉幹細胞(hBMSCs)更能趨向誘導軟骨生成，且當CBD-RGD蛋白質濃度為10mg/g時，其誘導幹細胞進行軟骨生成之效果為最佳。
此外，本發明實施例用於修復軟骨組織中僅含有人類胎盤間葉幹細胞、TGF-β3
與褐藻膠之包覆有細胞之組成物以前述注射方式，即可達成修復軟骨之功效。
首先製備聚乳酸聚-甘醇酸(poly lactic-co-glycolic acid,以下以PLGA稱之)精密支架(precision scaffold)，將20克PLGA(50/50，Kyoto)溶於80克之1,4-dioxane(Tedia)以製備得20%之PLGA，接著以冷凍擠壓成型方式(liquid-frozen deposition manufacturing,LFDM)製作成4個角度(0°/45°/90°/135°)結構之精密支架(請同時參閱第七A與七B圖)，該精密支架之外觀為直徑6.5mm且厚度為2.5mm，其纖維直徑(nozzle aperture，Φn)為0.2mm，中纖距(intervalbetween adjacent fibers，dh)為0.7mm，且該精密支架細微結構如第八A與八B圖之掃描式電子顯微鏡(SEM)圖片所示。此外，此精密支架係具有高的孔隙度、高的比表面積、孔洞間完全通透、可控制孔隙率以及孔徑獨立控制等優點。
接著將包含有幹細胞、CBD-RGD蛋白質、吸附有TGF-β3
之nCDHA以及褐藻膠之包覆有細胞之組成物加入PLGA精密支架中，以製備成本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料。
為找出適當之幹細胞誘導培養天數，本發明實施例係分析用於修復軟骨組織之複合材料於不同培養天數對幹細胞誘導軟骨生成之影響。請參閱表二，將僅含人類胎盤間葉幹細胞(C080520)、含人類胎盤間葉幹細胞(C080520)與褐藻膠以及含人類胎盤間葉幹細胞(C080520)、褐藻膠、CBD-RGD蛋白質與已吸附TGF-β3
之nCDHA，分別與PLGA精密支架結合，進行為期1、7、21與36天之培養時間試驗。
實驗組A係將培養至第6代之人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)以實施例1所述DMEM低糖培養液配製成細胞濃度為1×106
cells/scaffold(亦即一個PLGA精密支架含有1×106
個人類胎盤間葉幹細胞)之細胞液，將30μl細胞液(約含1×106
人類胎盤間葉幹細胞)滴入PLGA精密支架中，置於37℃、5%CO2
培養箱中2小時，使細胞貼附於支架上，再將細胞與支架混合物移至12孔培養盤中。
實驗組B係將培養至第5代之人類胎盤間葉幹細胞(hPDMCs)以1.2%之褐藻膠溶液配製成細胞濃度為1×106
cells/scaffold之細胞液，將30μl細胞液(約含1×106
人類胎盤間葉幹細胞)滴入PLGA精密支架中，使細胞液充滿整個支架，將製備完成的細胞與支架混合物放入6.5mm之轉移盤(transwell,Corning)中，並於102mM氯化鈣溶液浸泡約10分鐘，待凝膠後，加入適量氯化鈉溶液清洗後，以培養液清洗，再將細胞與支架混合物移至12孔培養盤中。
實驗組C係將細胞濃度為1×106
cells/scaffold之人類胎盤間葉幹細胞與濃度為10mg/g之CBD-RGD蛋白質(亦即10mg CBD-RGD/g褐藻膠)混合後，加入已吸附TGF-β3
之nCDHA(於500ppm之nCDHA加入濃度為0.01μg/ml之TGF-β3
混合均勻，將此混合液置於37℃、5% CO2
培養箱中反應1小時而得)，再加入1.2%之褐藻膠溶液以形成一細胞混合液(亦即包覆有細胞之組成物)，將30μl之細胞混合液滴入PLGA精密支架中，使細胞混合液充滿整個支架，將製備完成的細胞與支架混合物放入6.5mm之轉移盤(transwell)中，並於102mM氯化鈣溶液浸泡約10分鐘，待凝膠後，加入適量氯化鈉溶液清洗，再以培養液清洗，再將細胞與支架混合物移至12孔培養盤中。
分別將實驗組A、B與C以實施例1所述含有10ng/ml之TGF-β3
生長因子之軟骨分化培養基培養1天、7天、21天、36天，並於此誘導分化期間，每3天更換一次培養液，此外，各組實驗係重複進行三次(n=3)。誘導分化時間結束後，將支架以PBS清洗兩次，並經冷凍乾燥後，進行細胞數量分析、葡萄糖胺聚合醣(GAG)之含量分析、第二型膠原蛋白之含量分析、蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析以及第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析。其結果如第九至十四圖所示。
請參閱第九圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養1、7、21與36天後之軟骨細胞生成數量結果圖，由圖中可知，於培養第一天時，本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中大約保留有最初植入幹細胞數量之60~70%的細胞量，隨著培養時間增加，各實驗組之細胞數量皆呈現增加趨勢，其中，由於實驗組B與C具有褐藻膠可將細胞包裹於精密支架中，因此細胞的生長數量係隨培養時間相對增加，而實驗組A不具褐藻膠，故其大部分細胞會隨著培養液之更換而流失，因此實驗組A於培養第7天之細胞數有下降趨勢。另一方面，在培養7天與21天時，相較於實驗組A與B，實驗組C係具有最多之細胞數量，且此細胞數量與實驗組A與B有顯著差異性。
請參閱第十圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖，由圖中可知，培養第7及21天時，實驗組C細胞分泌之細胞外基質中葡萄糖胺聚合醣(GAG)的含量係顯著高於實驗組A與B(p
<0.05)，並且於培養至第21天期間，各實驗組之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量係隨著培養時間的增加而呈上升趨勢，而於培養第36天時，各實驗組之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量係明顯較培養第21天減少許多，但實驗組C之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量仍為該些實驗組中最高者。
請參閱第十一圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之第二型膠原蛋白含量分析結果圖，該圖結果顯示，在分化培養後的第7天及第21天，實驗組A皆無偵測到第二型膠原蛋白的表現，相較於實驗組A，實驗組B與C皆偵測到第二型膠原蛋白的表現，且於第7天的表現量可持續維持至第21天，而於培養第36天，實驗組B與C兩組之第二型膠原蛋白的表現量明顯地減少(p
<0.001)。
請參閱第十二圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之蘇木紫-伊紅染色分析結果圖，由該圖中細胞在精密支架內部生長情形的結果顯示，實驗組A於培養第7與21天僅可觀察到精密支架的存在，而無偵測到細胞表現，於培養第36天後可觀察到有細胞的表現；實驗組B與C於培養第7、21與36天後，皆可觀察到細胞貼附在精密支架周圍的表現情形，亦出現軟骨陷窩(lacunae)現象，其中實驗組C於培養第36天時，呈現明顯的顏色較深之陷窩表現。
請參閱第十三圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之阿爾襄藍染色分析結果圖，該圖結果顯示，實驗組A於培養第7與21天皆無細胞外基質的表現，僅可觀察到白色支架的存在，實驗組B與C於培養第7、21與36天之切片染色，都可發現葡萄糖胺聚合醣(GAG)累積貼附於精密支架周圍的表現情形，並有明顯且深色之陷窩(lacunae)，以及中間有代表細胞之藍色小點出現。
請參閱第十四圖，該圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果圖，由該圖可知，於培養第7與21天，實驗組B與C皆有第二型膠原蛋白之表現，而實驗組A則無偵測到第二型膠原蛋白之表現；於培養第36天，三組實驗組皆偵測到第二型膠原蛋白之表現，且於實驗組B與C中可觀察到第二型膠原蛋白多貼附於精密支架周邊，而精密支架之纖維與纖維間則較少分布第二型膠原蛋白。
請同時參閱第九至十一圖，實驗組C於培養第7天時細胞數量達到最高並持續維持到21天，且其葡萄糖胺聚合醣(GAG)係於培養第21天才達最高值，此說明實驗組C具有提早促進幹細胞誘導分化形成軟骨細胞之功效且其軟骨生成期為第7~21天之間，同時由於實驗組C中吸附有TGF-β3
之nCDHA可透過擴散機制釋放TGF-β3
，直接使幹細胞誘導分化，因此可避免分化不均之情況；實驗組B之細胞數量以及葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量皆於培養第21天達最高值，此代表實驗組B之細胞同時進行生長與分化，但一般而言，細胞之生長與分化應於不同時期進行，故實驗組B有分化不均的現象。
請同時參閱第十二至十四圖，實驗組C具有細胞團簇(cell clusters)並且有陷窩(lacunae)為軟骨成熟的表徵，並無分化不均的現象，而實驗組B則出現遠離精密支架纖維之細胞外基質的分佈反而較靠近精密支架纖維之細胞外基質更為完整且明顯之分化不均的現象。此外，該些結果顯示，人類胎盤間葉幹細胞經過軟骨分化培養基誘導分化後之第7天至第21天為軟骨基質分泌時期，第21天後軟骨基質分泌則趨向軟骨生成之成熟化，因此較佳之誘導分化培養時間為21天。
另一方面，由該些結果可知實驗組B雖無加入nCDHA與CBD-RGD，但其仍可誘導軟骨細胞分化及促進細胞外基質之分泌，而實驗組C因nCDHA與CBD-RGD之加入，則具有較佳之分化效果。此說明包含有人類胎盤間葉幹細胞、TGF-β3
與PLGA精密支架之本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料即可達成誘導軟骨細胞分化而修復受損軟骨組織之功效，且藉由nCDHA與CBD-RGD之添加，可進一步促進修復效果。
本發明實施例進一步分析用於修復軟骨組織之複合材料中不同種類之幹細胞對幹細胞誘導軟骨生成之影響。請參閱表三，實驗組A、B與C皆含有幹細胞、褐藻膠、CBD-RGD蛋白質、已吸附TGF-β3
之nCDHA以及PLGA精密支架，其中實驗組A之幹細胞為人類骨髓間葉幹細胞(HSC-1)、實驗組B之幹細胞為人類骨髓間葉幹細胞(C1008)、實驗組C之幹細胞為人類胎盤間葉幹細胞(C081127)。
實驗組A、B與C係分別將細胞濃度為1×106
cells/scaffold之人類骨髓間葉幹細胞(HSC-1)、人類骨髓間葉幹細胞(C1008)及人類胎盤間葉幹細胞(C081127)與濃度為10mg/g之CBD-RGD蛋白質混合後，加入已吸附TGF-β3
之nCDHA(取適量之nCDHA並加入濃度為0.01μg/ml之TGF-β3
混合均勻，將此混合液置於37℃、5% CO2
培養箱中反應1小時而得)，再加入1.2%之褐藻膠溶液以形成一細胞混合液，將30μl之細胞混合液滴入PLGA精密支架中，使細胞混合液充滿整個支架，將製備完成的細胞與支架混合物放入6.5mm之轉移盤(transwell)中，並於102mM氯化鈣溶液浸泡約10分鐘，待凝膠後，加入適量氯化鈉溶液清洗後，再以培養液清洗，再將細胞與支架混合物移至12孔培養盤中。以實施例1所述含有10ng/ml之TGF-β3
生長因子之軟骨分化培養基培養21天，並於此誘導分化期間，每3天更換一次培養液，此外，各組實驗係重複進行三次(n=3)。誘導分化時間結束後，將支架以PBS清洗兩次，並經冷凍乾燥後，進行細胞數量分析、葡萄糖胺聚合醣(GAG)之含量分析、第二型膠原蛋白之含量分析、蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析以及第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析。其結果如第十五至十八圖所示。
請同時參閱第十五至十七圖，其係分別為本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞種類於誘導軟骨生成之軟骨細胞生成數量結果圖、葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖與第二型膠原蛋白含量分析結果圖，由該些圖示結果可知，經過21天培養後，實驗組C之細胞生長數目(p
<0.05)以及細胞外基質葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量(p
<0.001)皆較實驗組A與B多，尤其於葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量部分，實驗組C顯著較實驗組A與B高出約兩倍。
請參閱第十八圖，其係為本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞種類於誘導軟骨生成之蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析與第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果圖，由該圖示結果可知，實驗組A、B與C皆可觀察到葡萄糖胺聚合醣(GAG)與第二型膠原蛋白之表現，且葡萄糖胺聚合醣(GAG)大都貼附於精密支架週邊，並有陷窩(lacunae)的形成，其中，實驗組A之葡萄糖胺聚合醣(GAG)與第二型膠原蛋白組大都分佈在精密支架之纖維與纖維中間，在精密支架之纖維邊緣上有明顯的空隙，而實驗組C之葡萄糖胺聚合醣(GAG)與第二型膠原蛋白的分佈較為完整與平均，且其染成藍色之細胞外基質中的深藍色的細胞團小點較為明顯。
另一方面，實驗組A與B雖同為人類骨髓間葉幹細胞(HSC-1、C1008)，但其第二型膠原蛋白之表現量卻呈現差異性，此代表人類骨髓間葉幹細胞之細胞外基質分泌量會隨幹細胞來源個體之不同而有差異性，比較來自不同個體之人類胎盤間葉幹細胞(C081127、C080520)的第二型膠原蛋白表現情況，於誘導21天後，其第二型膠原蛋白之表現量皆約為6μg/scaffold，並無顯著差異(請同時參閱第十一圖與第十七圖)，此外，於誘導21天後，來自不同個體之人類胎盤間葉幹細胞(C081127、C080520)的葡萄糖胺聚合醣(GAG)表現量皆約為80μg/scaffold(請同時參閱第十圖與第十六圖)，此顯示人類胎盤間葉幹細胞的來源個體並不影響其細胞外基質之分泌量。
因此，該些結果顯示，相較於人類骨髓間葉幹細胞，本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料所使用之人類胎盤間葉幹細胞係具有更佳之誘導分化能力，且更穩定不因幹細胞之來源個體的不同而影響其誘導分化能力。
第一圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中幹細胞之流式細胞儀細胞表面蛋白分析結果圖。圖中(a)~(e)為人類骨髓間葉幹細胞，(f)~(j)為人類胎盤間葉幹細胞。
第二A圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中人類胎盤間葉幹細胞，以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之阿爾襄藍染色分析結果圖。圖中放大倍率為100倍，E：細胞外基質(extracellular matric)、L：陷窩(lacuna)。
第二B圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中人類胎盤間葉幹細胞，以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之另一阿爾襄藍染色分析結果圖。圖中放大倍率為200倍，E：細胞外基質(extracellular matric)、L：陷窩(lacuna)。
第三A圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中人類胎盤間葉幹細胞，以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析結果圖。圖中放大倍率為100倍，箭頭所指處為第二型膠原蛋白。
第三B圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中人類胎盤間葉幹細胞，以含轉化生長因子(TGF-β3
)之軟骨分化劑誘導分化成軟骨細胞之另一第二型膠原蛋白之免疫螢光染色分析結果圖。圖中放大倍率為200倍，箭頭所指處為第二型膠原蛋白。
第四圖係本發明實施例用於修復軟骨組織中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖。圖中＊代表p
＜0.05，＊＊＊代表p
＜0.001。
第五圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的阿爾襄藍染色結果圖。圖中(a)~(c)依序為結合有0、10、20mg/g之CBD-RGD蛋白質之人類骨髓間葉幹細胞染色結果，(d)~(f)為依序為結合有0、10、20mg/g之CBD-RGD蛋白質之人類胎盤間葉幹細胞染色結果。放大倍率為200倍，C：細胞(cell)、E：細胞外基質(extracellular matric)、L：陷窩(lacuna)。
第六圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中結合有不同濃度CBD-RGD蛋白質之包覆有細胞之組成物的蘇木紫-伊紅染色結果圖。圖中(a)~(c)依序為結合有0、10、20mg/g之CBD-RGD蛋白質之人類骨髓間葉幹細胞染色結果，(d)~(f)為依序為結合有0、10、20mg/g之CBD-RGD蛋白質之人類胎盤間葉幹細胞染色結果。放大倍率為200倍，E：細胞外基質(extracellular matric)、L：陷窩(lacuna)。
第七A圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中PLGA精密支架之結構示意圖。
第七B圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中PLGA精密支架之另一結構示意圖。。
第八A圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中PLGA精密支架之掃描式電子顯微鏡(SEM)正面示意圖。
第八B圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中PLGA精密支架之掃描式電子顯微鏡(SEM)剖面示意圖。
第九圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養1、7、21與36天後之軟骨細胞生成數量結果圖。圖中＊代表p
＜0.05，＊＊＊代表p
＜0.001。
第十圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖。圖中＊代表p
＜0.05，＊＊＊代表p
＜0.001。
第十一圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之第二型膠原蛋白含量分析結果圖。圖中＊代表p
＜0.05，＊＊＊代表p
＜0.001。
第十二圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之蘇木紫-伊紅染色分析結果圖。圖中(a)~(c)依序為培養第7天之實驗組A、B與C的染色結果，(d)~(f)依序為培養第21天之實驗組A、B與C的染色結果，(g)~(i)依序為培養第36天之實驗組A、B與C的染色結果。放大倍率為100倍，L：陷窩(lacuna)，S：PLGA精密支架。
第十三圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之阿爾襄藍染色分析結果圖。圖中(a)~(c)依序為培養第7天之實驗組A、B與C的染色結果，(d)~(f)依序為培養第21天之實驗組A、B與C的染色結果，(g)~(i)依序為培養第36天之實驗組A、B與C的染色結果。放大倍率為100倍，L：陷窩(lacuna)，S：PLGA精密支架。
第十四圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料於培養7、21與36天後之第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果圖。圖中(a)~(c)依序為培養第7天之實驗組A、B與C的染色結果，(d)~(f)依序為培養第21天之實驗組A、B與C的染色結果，(g)~(i)依序為培養第36天之實驗組A、B與C的染色結果。放大倍率為100倍，S：PLGA精密支架，T：第二型膠原蛋白。
第十五圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞之軟骨細胞生成數量結果圖。圖中＊代表p
＜0.05。
第十六圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞之葡萄糖胺聚合醣(GAG)含量分析結果圖。圖中＊＊＊代表p
＜0.001。
第十七圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞之第二型膠原蛋白含量分析結果圖。圖中＊代表p
＜0.05。
第十八圖係本發明實施例用於修復軟骨組織之複合材料中不同幹細胞之組織切片染色分析結果圖。圖中(a)~(c)依序為人類骨髓間葉幹細胞(HSC-1)之蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析與第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果，(d)~(f)依序為人類骨髓間葉幹細胞(C1008)之蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析與第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果，(g)~(i)依序為人類胎盤間葉幹細胞(C081127)之蘇木紫-伊紅染色分析、阿爾襄藍染色分析與第二型膠原蛋白免疫螢光染色分析結果。放大倍率為100倍，L：陷窩(lacuna)，S：PLGA精密支架，T：第二型膠原蛋白。
Claims (23)
- 一種用於修復軟骨組織之複合材料，包含：一包有細胞之組成物，係包含一人類胎盤間葉幹細胞(human Placenta-derived mesenchymal cells)、一褐藻膠(alginate)以及奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nano-calcium deficient hydroxyapatite，nCDHA)；其中，該包覆有細胞之組成物藉由一轉化生長因子-β(transforming growth factor-β)誘導該人類胎盤間葉幹細胞分化為軟骨細胞，且該奈米化缺鈣氫氧基磷灰石係吸附有該轉化生長因子-β。
- 如申請專利範圍第1項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其進一步包含一聚乳酸-聚甘醇酸(PLGA)精密支架(precision scaffold)。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該包覆有細胞之組成物進一步包含一具有RGD(Arginine-Glycine-Aspartate)貼附序列之胜肽(RGD-containing peptide)。
- 如申請專利範圍第3項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該具有RGD貼附序列之胜肽係為具有如SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)。
- 如申請專利範圍第4項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該纖維素結合功能區域-RGD貼附序列之濃度約為10mg/g。
- 如申請專利範圍第1項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該轉化生長因子-β係含於該包覆有細胞之組成物中。
- 如申請專利範圍第1項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該奈米化缺鈣氫氧基磷灰石之濃度約為50-1000ppm。
- 如申請專利範圍第1、2或6項任一項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該轉化生長因子-β係為轉化生長因子-β3 。
- 如申請專利範圍第8項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該轉化生長因子-β3 之濃度約為0.01μg/ml。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該人類胎盤間葉幹細胞之濃度約為1×106 細胞/支架(cells/scaffold)。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其中該褐藻膠之濃度約為1.2%。
- 如申請專利範圍第2項所述之用於修復軟骨組織之複合材料，其經21天之誘導分化可產生約6μg/scaffold之第二型膠原蛋白以及約80μg/scaffold之葡萄糖胺聚合醣。
- 一種用於修復軟骨組織之複合材料的製備方法，步驟包含：混合一人類胎盤間葉幹細胞(human Placenta-derived mesenchymal cells)、一褐藻膠(alginate)以及奈米化缺鈣氫氧基磷灰石(nano-calcium deficient hydroxyapatite)，以形成一包覆有細胞之組成物；以及該包覆有細胞之組成物藉由一轉化生長因子-β(transforming growth factor-β)誘導該人類胎盤間葉幹細胞分化為軟骨細胞，且該奈米化缺鈣氫氧基磷灰石係吸附有該轉化生長因子-β。
- 如申請專利範圍第13項所述之方法，其步驟進一步包含將該包覆有細胞之組成物與一聚乳酸-聚甘醇酸(PLGA)精密支架(precision scaffold)結合，再進行誘導分化。
- 如申請專利範圍第13或14項所述之所述之方法，其中該人類胎盤間葉幹細胞係先與一具有RGD(Arginine-Glycine-Aspartate)貼附序列之胜肽(RGD-containing peptide)混合。
- 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該具有RGD貼附序列之胜肽係為具有如SEQ ID NO：1所示胺基酸序列之纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)。
- 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該纖維素結合功能區域-RGD貼附序列之濃度約為10mg/g。
- 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該人類胎盤間葉幹細胞係與該轉化生長因子-β混合後，再加入該褐藻膠。
- 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該奈米化缺鈣氫氧基磷灰石之濃度約為50-1000ppm。
- 如申請專利範圍第13、14或18項任一項所述之方法，其中該轉化生長因子-β係為轉化生長因子-β3 。
- 如申請專利範圍第20項所述之方法，其中該轉化生長因子-β3 之濃度約為0.01μg/ml。
- 如申請專利範圍第13或14項所述之方法，其中該人類胎盤間葉幹細胞之濃度為1×106 細胞/支架(cells/scaffold)。
- 如申請專利範圍第13或14項所述之方法，其中該褐藻膠之濃度為1.2%。
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| Jui-Chih Chang et al., "The promotion of chondrogenesis in adipose-derived adult stem cells by an RGD-chimeric protein in 3D alginate culture", Biomaterials 30 (2009) 6265-6275。 * |
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