TWI413690B

TWI413690B - 具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症（ｆｔｌｄ－ｕ）之非人類動物模式

Info

Publication number: TWI413690B
Application number: TW99119133A
Authority: TW
Inventors: Che Kun James Shen; Kuen Jer Tsai
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2013-11-01
Also published as: TW201142023A

Description

具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)之非人類動物模式

本發明係關於一種神經退化之基因轉殖動物模式，特別是關於一種額顳葉退化症之基因轉殖動物模式。

TAR DNA結合蛋白-43(TAR DNA binding protein-43,TDP-43)係為一種多功能性的DNA/RNA結合因子，其功能主要與神經可塑性(neuronal plasticity)相關。有趣的是，TDP-43被證實為在眾多神經退化疾病中的細胞質包涵體(neuronal cytoplasmic inclusions,NCIs)特徵之主要組成份，此些神經退化疾病包括：具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions,FTLD-U)以及肌萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)。

由生化分析顯示出，在FTLD-U及ALS患者之大腦及脊髓影響區域中，TDP-43經過混亂地修飾/處理。特別是，在TDP-43(+)UBIs病理樣本中的尿素可溶性部分，由西方墨點法檢測到TDP-43衍生多肽，其包括了：1)多種高分子量之多泛素化TDP-43(poly-ubiquitinated TDP-43)；2)大約在45 kDa之磷酸化TDP-43；以及3)大約在25 kDa及35 kDa之TDP-43C端片段。同時，由FTLD-U及ALS患者病理樣本之免疫組織化學分析結果顯示出，該些樣本中之疾病細胞具有出現位於TDP-43耗盡細胞核周圍的細胞質包涵體(NCIs)。細胞核TDP-43的耗盡及UBIs的形成暗示了是造成TDP-43的功能喪失及細胞毒性的原因，因此導致了具有TDP-43(+)UBIs之FTLD-U及ALS的發病。

Wils等人(2010)利用Thy-1啟動子，製造出在中樞神經系統之神經元中過量表現人類TDP-43的基因轉殖鼠，且在其他細胞種類中Thy-1啟動子亦可被活化，包括：胸腺細胞、肌母細胞、上皮細胞及角質細胞。在此些基因轉殖鼠中觀察到，四肢癱瘓發病的ALS患者的皮質/脊髓運動元皆退化，以及FTLD患者的非運動元皮質及次皮質神經元特徵的退化。進一步地，細胞聚集物(NCIs及NIIs)包括泛素化及磷酸化的TDP-43，以及25 KDa的TDP-43片段，被檢測出和那些人類TDP-43過量表現的基因轉殖鼠之疾病發展及進展有關。

然而，儘管在TDP-43之分子及細胞特性方面有許多研究資料迅速地累積，並顯示出TDP-43和TDP-43(+)NCI或UBIs的形成有關，但是TDP-43在FTLD-U發病所扮演的角色仍然未明。因此，在該技術領域中需要對前述的缺失及不足予以闡明，特別是關於TDP-43在神經退化疾病所扮演的角色。

緣此，本發明之一目的即是提供一種具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)之非人類動物模式。

在一方面，本發明係關於一種基因轉殖鼠，其基因體中包括一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一神經元特異啟動子，該神經元特異啟動子可有效增加該轉殖基因在基因轉殖鼠大腦中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)之核苷酸序列，其中該基因轉殖鼠之大腦的TDP-43表現量增加。

在另一方面，本發明係關於一種用於評估一化合物之潛在治療功效之方法，該化合物係用於治療或預防及/或抑制哺乳類動物之具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions,FTLD-U)，其步驟包括：(a)將該化合物施予在一基因轉殖鼠，該基因轉殖鼠之基因體中包括一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一神經元特異啟動子，該神經元特異啟動子可有效增加該轉殖基因在基因轉殖鼠大腦中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)之核苷酸序列；以及(b)藉由鑑定該基因轉殖鼠在學習及記憶習慣及/或運動能力之改善，以決定該化合物之潛在治療效果。

在又一方面，本發明係關於一種鑑定治療或預防及/或抑制具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)之一候選藥劑之方法，其步驟包括：(a)測量前述基因轉殖鼠之TDP-43表現量；(b)對該基因轉殖鼠施予該候選藥劑；以及(c)測量該基因轉殖鼠之TDP-43表現量。

其中該基因轉殖鼠之TDP-43表現量在施予該候選藥劑後下降則確認該候選藥劑可作為用於治療或預防及/或抑制具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)之藥劑。

在又一方面，本發明係關於一種神經元細胞，其包括有一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一神經元特異啟動子，該神經元特異啟動子可有效增加該轉殖基因在該神經元細胞中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)核苷酸序列，其中該神經元細胞在其細胞質中表現出TDP-43蛋白質包涵體。

經由本發明之技術手段，已揭示在小鼠前腦中過量表現TDP-43轉殖基因會造成發展為相似於FTLD-U的已知分子、細胞、行為以及蛋白質病理學的特徵。由本發明揭露之基因轉殖鼠結果顯示，提升TDP-43蛋白質量可能是造成具有TDP-43(+)包涵體的神經退化疾發病的主要原因之一。對於在小鼠中提升TDP-43的表現量足以引起神經退化，提供了一個強力的支持，且其很有可能在人類TDP-43蛋白質病的神經退化疾病中，與此疾病的產生及發展有關。兩者皆證實了包含TDP-43的NCIs以及caspase-3的活化與神經元凋亡有關。再者，兩者在朝著此疾病發展的研究方向上，皆檢測出TDP-43的35KDa及25KDa之C端片段的出現。在本發明所使用的前腦神經元特異性之鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)啟動子，可允許檢測及追蹤從幼鼠到超過兩歲的小鼠之認知行為以及運動功能的疾病形成及發展。本發明的CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠較適於在未來進行FTLD-U的細部病理/臨床分析以及藥物/治療發展。

前述或其他的實施例將可由以下對較佳實施例之描述及圖式更為清楚，然而其改變或修飾並未脫離本發明揭露內容之精神、範圍及概念。

相關圖式係可說明一或多個本發明實施例，同時配合文字說明，可用於解釋本發明之概念。圖式中相同的元件符號係用於標示一實施例中的相同或相似元件。

定義

說明書中所使用的用語係在該領域中具有其一般定義，包括在本發明之說明內容，以及特定文字內容部份所使用的用語。以下將討論本發明所使用的特定用語，亦或說明書的其他部分，以作為實施者在實施本發明之導引。為了便利起見，某些詞彙將特別標記，例如使用斜體及/或引號標示。這些標記的使用，將不影響該用語的範圍或定義；該用語的範圍或定義在文中仍然是相同的，無論其是否有標記。相同的事物可用一種以上的方式描述。因此，在此將使用超過一種的其他用語及同義字，該些用語並無其他特殊含義，無論該些用語是否有特別解釋或闡述。在本文中使用了一些同義字，列舉一或多種同義字並不代表排除了其他未提及或列舉的同義字。在實施例或說明書中所使用的用語僅為用以說明，並非限定其本發明或實施例之範圍或定義。同樣地，本發明並非受限於說明書中的實施例。

除非另外定義，本文中所使用的技術上或科學上的用語，皆為該領域具有通常知識者所理解在本發明所涉及的一般定義。

本文中所述的「大約」「約略」或「近似地」一般係指20%，較佳為10%，最佳為5%的範圍內。本文中的數值係為近似值，在未明確定義的情況下可隱含「大約」「約略」或「近似地」之含義。

本文使用的用語「NSE」係為神經元特異烯醇酶(neuron-specific enolase)之縮寫。神經元特異烯醇酶啟動子已揭露於U.S.Pat.No.6,649,811及U.S.Pat.No.5,387,742；NCBI Reference Sequence：NC_000072.5；及Twyman et al.,(1997)“Sequences in the proximal 5’ flanking region of the rat neuron-specific enolase(NSE)gene are sufficient for cell type-specific reporter gene expression”Journal of Molecular Neuroscience,10 Vol.8(1)：63-73，此些文獻皆以其完整內容作為本文之一部分。

本文使用的用語「DIV」係指「day in vitro」。

本文使用的用語「表現量增加」及「過量表現」兩者可互換。一個轉殖基因的表現量增加一般係指和對照組比較之下，該轉殖基因之表現量具有在統計上顯著的增加。

本發明係關於一種可產生具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)的小鼠模式，包括利用CaMKIIα啟動子使TDP-43過量表現在其海馬迴、皮質與紋狀體。該些基因轉殖鼠會發展為學習/記憶能力不足以及運動能力損害之情形。此基因轉殖鼠的大腦特徵為海馬迴及神經膠的減少、以及出現TDP-43(+)、泛素(+)細胞質包涵體(ubiquitin(+)NCIs)。在發現FTLU-D患者的TDP-43表現量受到上調控的研究中，其顯示出TDP-43穩態濃度(homeostatic concentration)的改變，特別是在其蛋白質表現量的增加，在特定的細胞中可能成為導致FTLD-U形成的主要原因，且也可能與其他具有TDP-43(+)UBIs的神經退化疾病有關。

本發明係關於一種可產生具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)的小鼠模式(CaMKII-TDP-43 Tg)，在其前腦(包括海馬迴、皮質與紋狀體)過量表現TDP-43之表現型特徵，以模擬FTLU-D的情形。特別是，該些基因轉殖鼠會表現出學習/記憶能力不足、運動能力喪失，以及海馬迴萎縮之情形。此基因轉殖鼠之認知及運動能力的損害係伴隨著神經調節因子pERK及pCREB表現量的減少，以及大腦神經膠質的增加。進一步地，在基因轉殖鼠之大腦表現TDP-43(+)、ubiquitin(+)NCIs及缺乏TDP-43的細胞核，且呈現年齡依賴(age-dependent)的情形。由該些基因轉殖鼠所得到的資訊提供了一種直接證據，即在前腦過量表現TDP-43蛋白質足以造成TDP-43(+)、ubiquitin(+)NCIs及神經退化。此種FTLU-D小鼠模式有利於了解TDP-43在FTLU-D病理發生中所扮演的角色為何，以及設計對該疾病的有效醫療方法。

在一方面，本發明係關於一種基因轉殖鼠，其基因體中包括一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一神經元特異啟動子，該神經元特異啟動子可有效增加該轉殖基因在基因轉殖鼠大腦中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)之核苷酸序列。

在本發明之一實施例中，神經元特異啟動子係選自由下列所組成之群組：鈣調蛋白依賴性蚤白激酶IIα(Ca²⁺ /calmodulin-dependent kinaseIIα,CaMKIIα)啟動子、神經元特異烯醇酶(neuron-specific enolase,NSE)啟動子以及運動神經元特異基因Hb9 (motor neuron-specific geneHb9 )啟動子。

在本發明之另一實施例中，該神經元特異啟動子係為鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα啟動子。

在本發明之另一實施例中，該基因轉殖鼠表現出降低的或受損的學習及記憶能力。

在本發明之另一實施例中，該基因轉殖鼠表現出逐漸受損或降低的運動能力。

在本發明之另一實施例中，基因轉殖鼠之海馬迴及皮層，而非小腦及脊髓，表現出增加量的TDP-43蛋白質。

基因轉殖鼠可以是同合子基因轉殖鼠或半合子基因轉殖鼠，其中同合子基因轉殖鼠及半合子基因轉殖鼠表現具有相同量的TDP蛋白質。或是，相較於半合子基因轉殖鼠，同合子基因轉殖鼠表現出更多量的TDP-43轉錄物。

在本發明之另一實施例中，基因轉殖鼠之海馬迴及皮層，而非小腦及脊髓，表現出至少2倍的TDP-43蛋白質。

在本發明之另一實施例中，基因轉殖鼠之海馬迴及皮層表現出變動量之一蛋白質及/或一神經傳導物質，其係選自由磷酸化細胞外信號調節激酶pERK(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,pERK)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element-binding Protein,pCREB)、麩氨酸脫羧酸酶67(glutamic acid decarboxylase 67,GAD67)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)及半胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)所組成之群組。

在本發明之另一實施例中，該基因轉殖鼠之大腦表現出多泛素化TDP-43蛋白質。

在本發明之另一實施例中，該基因轉殖鼠之大腦的多泛素化TDP-43蛋白質係隨著年齡而增加。

在本發明之另一實施例中，基因轉殖鼠之大腦神經元表現出胞內TDP-43包涵體。

在本發明之另一實施例中，基因轉殖鼠之胞內TDP-43包涵體係為泛素陽性。

在本發明之另一實施例中，該基因轉殖鼠表現出腦萎縮、神經元喪失及學習記憶喪失。

在另一方面，本發明係關於一種分離或衍生自前述基因轉殖鼠之細胞或組織。

在又一方面，本發明係關於一種用於評估哺乳類動物之治療或預防及/或抑制具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(frontotemporal lobar degeneration with ubiquitin-positive inclusions,FTLD-U)之化合物之潛在治療功效之方法，其步驟包括：(a)將該化合物施予在一基因轉殖鼠，該基因轉殖鼠之基因體中包括一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一神經元特異啟動子，該神經元特異啟動子可有效增加該轉殖基因在基因轉殖鼠大腦中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)之核苷酸序列；以及(b)藉由鑑定該基因轉殖鼠在學習及記憶習慣及/或運動能力之改善，以決定該化合物之潛在治療效果。

在又一方面，本發明係關於一種鑑定治療或預防及/或抑制具有泛素陽性包涵體之額顳葉退化症(FTLD-U)之一候選藥劑之方法，其步驟包括：(a)測量該基因轉殖鼠之TDP-43表現量；(b)對該基因轉殖鼠施予該候選藥劑；以及(c)測量該基因轉殖鼠之TDP-43表現量。

在本發明之一實施例中，該神經元細胞在其細胞質中表現出TDP-43蛋白質包涵體。

實施例

以下將提供本發明的實施例，包括儀器、裝置及方法，以及依據該些實施例所得的結果。在實施例中使用的名稱及副名稱是為了方便閱讀，並非用以限制本發明的保護範圍。進一步地，在此所揭露的理論，無論其為正確或錯誤，只要發明能夠依據說明書所載據以實施，都不應限制本發明的保護範圍。

材料及方法 建構及生產CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠

為了建構基因轉殖鼠，將一個長1,245 bp的小鼠全長TDP-43 cDNA(NCBI GenBank NM_145556；SEQ ID NO：1)接入pNN265的EcoRV位置，此為一種修飾過的pcDNAI/Amp，係由Dr.Eric Kandel(Mayford et al.,1996)所提供。將一個分離自pNN265、長2.7 kb的NotI片段，接入包含有小鼠CaMKII啟動子區域(8.5 kb)的pMM403載體的NotI位置(同樣為Dr.Eric Kandel(Mayford et al.,1996)所提供)，之後得到pCaMKII-TDP-43。純化自pCaMKII-TDP-43的SfiI片段(11.2 kb)，將其送入FVB/N小鼠的單細胞胚胎中。將其後代進行基因定型分析，78個可能的基因轉殖個體中有10個被證實帶有該轉殖基因。這10個幼鼠由FVB/N小鼠哺養，且其中3個為種系傳承(germ-line transmitted)。藉由三個半合子種系的雜交得到三個同合子TDP-43基因轉殖鼠種系。其同合子的特性係經由西方墨點法(Western blotting analysis)確認，並將2個月大的小鼠前腦組織進行定量RT-PCR及西方墨點法而確認TDP-43的過量表現。所有小鼠皆由中央研究院分子生物研究所動物室[Animal Facility of the Institute of Molecular Biology(IMB),Academia Sinica,Taiwan]所飼養。小鼠飼養在室溫下，維持以12h/12h/日/夜的循環(日間由7：00 a.m.開始)，並持續地供給食物及水，其步驟是依照中央研究院分子生物研究所動物室的標準流程進行。

在進行幼鼠的基因定型時，同時進行南方墨點法分析以及聚合酶鏈鎖反應(PCR)。在進行南方墨點法分析時，尾部的基因體DNA先以KpnI分解以及將pGEMT-TDP-43(Promega)的NotI片段進行雜交。在南方墨點法中，由CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠的基因體DNA得到4.4 kb的片段。進行PCR時所使用的引子如下：正向引子：5'-GGC TTG AGA TCT GGC CAT ACA CT-3'(SEQ ID NO：2)以及反向引子：5'-TAA GAT CTT TCT TGA CCT GAA CCA TA-3'(SEQ ID NO：3)。在電泳結果可預期觀察到基因轉殖鼠的產物(523 bp)，而非野生型鼠或非基因轉殖鼠。育種試驗(breeding test)係用於確認基因轉殖鼠(+/+)的同合子特性。Kuen-Jer Tsai及Che-Kun James Shen“Elevated expression of TDP-43 in the forebrain of mice is sufficient to cause neurological and pathological phenotypes mimicking FTLD-U”submitted Oct.2009 toJournal of Experimental Medicine (在此將完整文獻內容作為本文之一部份。)

原位雜交(In situ hybridization)

原位雜交之實施方式係如先前文獻所記載(Tsai et al.,2002)，並經過小部份修正。由小鼠的大腦依序取寬度為20μm之冠狀切片，同時包含大腦的海馬迴及皮質。與TDP-43 mRNA(5'-GCT CTG AAT GGT TLG GGA ATG AAG ACA TCT ACC ACT-3'；SEQ ID NO：4)之序列互補的反義探針，以及在3端標定以α[³⁵ S]dATP的同義探針，分別與大腦切片在載玻片(Poly-Prep slides,Sigma)42℃下進行雜交24 hr。在多次洗滌後，將載玻片以乙醇脫水並在BioMax底片(Kodak)下曝光10天。原位雜交的訊號係藉由National Institutes of Health IMAGE program定量其相關區域的光學密度。

莫里斯水迷宮測試(Morris water maze task)

為測試其空間學習能力，進行如先前文獻所載的莫里斯水迷宮(Tsai et al.,2007)。將動物進行每天兩小節、每小節四個試驗，一小節在早上進行，另一小節在下午進行。完整測試之總和為3天，共6小節。各個小鼠到達水中平台的時間紀錄為其逃避時間(escape latency)。

新物件識別測試(Novel object recognition task)

實施步驟如先前文獻所記載(Cao et al.,2008)。簡言之，使各個小鼠在開放的箱子中三天使之習慣。在訓練課程中，兩個新的物件放在箱子裡，讓小鼠探索15分鐘。探索每個物件的時間都被記錄下來。在一小時回憶測試中，小鼠被放回相同的箱子裡，其中一個在訓練時的物件被替換成另一新物件，並允許小鼠再探索15分鐘。探索兩個原來物件(訓練課程)中的任何一個所耗費的時間或是探索新物件的時間，與探索兩物件的總時間之比例，可用於計算其辨識能力。

恐懼制約測試(Fear conditioning task)

恐懼制約測試係將小鼠放在恐懼制約箱中(10×10×15英吋)，同時配合以多參數活性監視器。條件刺激(conditioned stimulus,CS)係以85 dB的音量(2,800 Hz)，以及在攀爬腳施以0.75 mA電流作為非條件刺激(unconditioned stimulus,US)。

運動量測試(locomotor activity)

小鼠的活動皆由TRuScan Digiscan system(Coulbourn Instruments,Inc.)所監視，其利用紅外線偵測其水平及垂直運動。經電腦化處理產生其運動量的定量量測。每個小鼠放在箱中5分鐘使其習慣，接著記錄30分鐘的運動量。

四肢緊握觀察及滾輪測試

四肢緊握及滾輪測試係依據先前文獻所記載實施(Hara et al.,2006)。滾輪測試時，係將小鼠置於轉速為20 r.p.m.之滾輪，記錄小鼠由滾輪上掉下所需時間。若小鼠在滾輪上維持到2分鐘，則將時間紀錄為120秒。

西方墨點法(Western blotting)

在分析不同蚤白質的表現量(第1C圖及第4A圖)，由兩個月大的野生型鼠及雄性同合子基因轉殖鼠之大腦皮層、海馬迴、小腦及脊髓，在RIPA溶解液[Tris-HCl 50mM,NaCl 150mM,Igepal CA-630 1%,EDTA(pH8)2mM,20 Na3VO4 1mM,pepstain A 20μg/ml,leupeptin 20μg/ml,aprotinin 20μg/ml,PMSF 1mM,NaF 50mM]中進行均質化，以取得該些組織的萃取物。將該些萃取物以8-12% SDS-PAGE，以下列一或多個抗體進行墨點分析：自製的anti-TDP-43(Wang et al.,2008a)、anti-tubulin(Upstate),anti-CamKII(Chemicon)、anti-ERK(Upstate)、antipERK(Upstate)、anti-phosphorylated cAMP response element binding protein(pCREB)25(Upstate)、anti-GAD67(Chemicon)、anti-GAP43(Chemicon)、anti-GFAP(Chemicon)、anti-PKA(Chemicon)及anti-PGRN(R&D Systems)。各條帶(band)的相對強度皆以微管蛋白(tubulin)進行校正，並以平均值±標準差(means±SEM)的方式表示。

在序列生化分離分析時，將前腦組織切下、稱重，並以先前文獻所載(Neumann et al.,2006)的緩衝液，以強度漸增的方式依序萃取。簡言之，前腦依序以5 mL/g的比例，以低鹽緩衝液(10 mM Tris,pH 7.5,5 mM EDTA,1 mM,DTT,10% sucrose以及cocktail of protease inhibitors)，以及高鹽的Triton(TX)buffer(LS+1% Triton X-100+0.5M NaCl)、myelin floatation buffer(TX buffer containing 30% sucrose)以及sarkosyl(SARK)buffer(LS+1% N-Lauroyl-sarcosine+0.5 M NaCl)進行萃取。SARK非溶解物再進一步以0.25 mL/g urea buffer(7M urea,2M thiourea,4% 3-[(3-Cholamidopropyl)idopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate(CHAPS),30 mM Tris,pH 8.5)進行萃取。在尿素可溶性樣本中的蛋白質以Tris-glycine/12% SDS-PAGE解開為一級結構，轉至硝化纖維膜，並以先前文獻(Winton et al.,2008)使用過的anti-TDP抗體(Protein Tech Group)作為探針。

免疫染色(Immunostaining)

免疫染色係用於測定野生型及基因轉殖鼠的海馬迴神經元的TDP-43及GAD67蛋白質表現圖譜。先從E16.5的胚胎中取得細胞並培養在Neuralbasal培養基中，在細胞培養至DIV14時以4% paraformaldehyde(PFA)固定。在染色時，將細胞分別隔夜放置於抗GAD67(1：500)以及抗TDP-43 (1：100)的一級抗體中，於1%驢血清(D9663,Sigma)之PBS(phosphate buffered saline)中。

在對小鼠腦組織進行免疫螢光染色時，以4%PFA溶於PBS中對成鼠進行麻醉。將其大腦取下並隔夜浸泡在含有20%蔗糖的4%PFA溶液中。將厚度為12 μm的切片置於下列之一或多個抗體中：anti-TDP-43 antibody[由發明人的實驗室所製造(Wang et al.,2008b)，另一為購自Protein Tech Group)、mouse monoclonal anti-GFAP(Chemicon)、mouse monoclonal anti-ubiquitin(Chemicon)、mouse monoclonal anti-NeuN(Chemicon)以及Alex488-conjugated goat anti-mouse antibodies(Molecular Probe)。將切片置於DAPI中並覆蓋以mounting medium(Dako fluorescent mounting medium,Dakocytomation)。全部切片皆以雷射掃瞄共軛焦顯微鏡(LSM 510,Zeiss)進行檢測。

電生理學紀錄(Electrophysiological recordings)

製作2個月大的野生型及TDP-43基因轉殖鼠的大腦切片，以用於LTP實驗中。對取自野生型及TDP-43基因轉殖鼠進行培養的海馬迴神經元(DIV 12-15)，進行全細胞電壓箝片記錄(Whole-cell voltage clamp recordings)。簡言之，將2個月大的野生型及TDP-43基因轉殖鼠大腦取下並保存於緩衝液(cutting buffer)中。將海馬迴切成400μm的切片，浸入人工CSF緩衝液(aCSF)，在開始紀錄前持續浸泡1.5小時。將雙極性鎢刺激電極置於CA1區域的輻射層(stratum radiatum layer)中間，並藉由玻璃微電極記錄其胞外場電位(extracellular field potentials)。其脈寬為100μs，而測試反應由0.05 Hz(GS-3200；Gould,Cleveland,OH)引發。

LTP係由兩系列的100 Hz刺激所引發，每次刺激以每間隔20秒維持1秒進行。刺激強度係設定以最大值的40-60%提供場興奮性突觸後電位(fEPSPs)。當在CA1區測試雙刺激促進效果(Paired-pulse facilitation,PPF)時，刺激係以0.01 Hz的頻率以及20、50、80、100、200、300、400及500毫秒(ms)的刺激間間隔(ISIs)，以不銹鋼雙極性電極分別置於在梨狀皮質(piriform cortex)的分子層外部及內部。透過玻璃移液管(glass pipette)紀錄各層的fEPSPs，且在1 kHz之fEPSPs經過放大及過濾。PPF比例係以第一 fEPSPs除以第二fEPSPs所得。

全細胞電壓箝片記錄係將培養12-15天之海馬迴神經元，利用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices,Union City,CA)進行。在進行最小興奮性電流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)實驗時，在水浴中加入1 μM的河豚毒素(tetrodotoxin)以抑制其動作電位。僅考慮針對在實驗中靜止膜電位小於50 mV、穩定的電容及電阻之該些細胞。將記錄的資料以Digidata 1322A(Molecular Devices)進行數位化，並以Clampfit 9.2(Molecular Devices)進行分析。

GABA分析

為計算大腦GABA表現量，在冷凍切片板上將小鼠大腦製成冷凍切片，在冰上進行均質化(50 mg的組織以1 ml的400 mM HClO₄ 及50 μM EDTA)，並以100 mM的硼酸鹽緩衝溶液中和(1：10)。將均質物離心(14,000 rpm,15 min,4℃)，並以Ultrafree-MC centrifugal 30 filter units(Millipore,14000 rpm,1 min,4℃)過濾。GABA的濃度以HPLC測定。

核磁共振影像[Magnetic resonance imaging(MRI)measurement]

MRI係利用7.0 Tesla MRI system(Bruker Companies,Ettlingen,Germany)進行。各小鼠的全腦區域，係以高解析度T2加權影像(T2-weighted images,T2WIs)呈現，包括利用3D-RARE(Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement)，以200 x 150 x 100 mm³ 的視野(field of view)以及200 x 150 x 65 mm³ 的影像矩陣大小(matrix size)，產生的體素大小(voxel size)為100 x 100 x 154 μm³ 。重複時間(repetition time,TR)及各回波時間(echo time,TE)分別為2,500 ms及32 ms。海馬迴的區域係手動地選自各切片，其體積係以MATLAB的自製程式碼所算得。

神經元計數(Neural Counts)

為了定量及比較野生型鼠及基因轉殖鼠的皮層神經元數目，將源自隔紋狀體(septo-striatal)、隔間腦(septo-diencephalic)或尾間腦(caudal diencephalon)區域的大腦皮層切片，以抗神經標記NeuN的抗體(anti-NeuN)進行免疫染色。對在六個可比較區域(各區域的2-3個鄰近處)的神經元數目進行計數。基因轉殖鼠的神經元數目係以野生型鼠的神經元數目(100%)進行校正。

細胞凋亡檢測(TUNEL assay)

在進行TUNEL assay時，將胰蛋白酶處理過的大腦切片貼附於具有0.01%聚離氨酸(polylysine)的片子，以4%甲醛溶液固定，並依照DeadEnd fluorometric TUNEL system(Promega)的標準流程進行螢光染色。染色的樣本以螢光顯微鏡檢視，並以隨機選擇的視野計數螢光訊號。

存活分析(Survival Analysis)

野生型鼠及TDP-43 Tg(+/+)基因轉殖鼠係在2006年3月至2008年12月間出生，用於比較壽命/存活率。該些鼠以每籠五隻的數目並處在無病源環境下，飼養於中央研究院分子生物研究所動物室。每隻小鼠的出生日期及死亡日期皆被記錄。存活曲線係以Kaplan and Meier method繪製，並以對數等級檢定(Log-Rank test)進行比較。

統計分析

所有資料皆以平均值標準差(mean±S.E.M)的方式呈現。獨立實驗係以學生t檢測(Student’s t-test)進行比較。以星號標示的差異表示其具有統計上顯著意義(p <0.05)。

結果 基因轉殖鼠的建立

為了測試在前腦中TDP-43表現量的增加是否為造成各種疾病表現型的原因，例如在FTLD-U患者中所觀察到者。因此建立了一種帶有全長TDP-43 cDNA之基因轉殖鼠種系，且該cDNA係受一個8.5 kb的鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα(CaMKIIα)啟動子區域(Mayford et al.,1996)的轉錄控制，如第1A圖所示。利用PCR及南方墨點法進行基因型鑑定，以鑑定出轉殖基因陽性的小鼠及其後代，如第1B圖所示。由半合子(+/-)及同合子(+/+)基因轉殖鼠的DNA樣本中，在PCR的分析結果得到一個523 bp的片段，以及在南方墨點法分析結果得到一個4.4 kb的片段。在非基因轉殖鼠中得不到上述任一片段(如第1B圖所示)。同合子的基因轉殖鼠亦可經由與非基因轉殖鼠的飼養而確認(資料未示)。

建立三個獨立的基因轉殖鼠種系，以西方墨點法檢測出在其皮層及海馬迴部分，如CaMKII啟動子所致地，三個種系的TDP-43表現量大約相同(與非基因轉殖鼠相比其表現量約為2倍)，結果參見第1C圖上二圖所示。另一方面，小腦及脊髓的TDP-43蛋白質表現量與野生型鼠相比大致上是相同的，參見第1C圖下二圖所示。如原位雜交分析的結果所確認者，顯示出野生型鼠(WT)具有基本TDP-43表現量，然而在TDP-43基因轉殖鼠(Tg)的皮層及海馬迴具有較高的TDP-43表現量(第1D圖)。如預期地，由免疫組織染色結果顯示出，在海馬迴的內生性TDP-43蛋白質(第1E圖左方)及外生性TDP-43蛋白質(第1E圖右方)主要皆表現在神經元層。

第1A圖顯示用於前核顯微注射的CaMKII-TDP-43片段之物理圖譜。轉錄方向如圖中箭號所示。同時也指出源自腺病毒剪接供體(splice donor)、G免疫球蛋白剪接受體(splice acceptor)及SV40、SV40多腺苷添加序列[SV40 poly(A)addition sequence(pA)]的短融合內含子(intron)之位置。亦一併指出南方墨點法及PCR探針的正確位置。藉由南方墨點法分析結果的4.4 kb KpnI片段及PCR電泳結果的523 bp片段，確認了基因轉殖鼠的建立。在圖中的限制酶切點為：K,KpnI；E,EcoRV；N,NotI；S,SfiI。CaMKIIa的3端非轉錄區，係作用為在樹突的mRNA定位及轉譯之順式作用訊號。先前文獻已揭露了兩個調控內含子(Choi et al.,(1991)“A generic intron increases gene expression in transgenic mice”Mol Cell Biol 11：3070-3074)。

第1B圖顯示基因轉殖鼠的基因定型結果。以PCR(上圖)及南方墨點法(下圖)分析小鼠尾部的DNA。(+/+)及(+/-)分別代表同合子及半合子的基因轉殖鼠。NT代表非基因轉殖鼠樣本。

第1C圖分別顯示出取自野生型鼠(WT)、非基因轉殖鼠(NT)及基因轉殖鼠(Tg)之海馬迴、皮層、小腦及脊髓的蛋白質萃取物之西方墨點法結果。在基因轉殖鼠(Tg)之海馬迴及皮層的TDP-43蛋白質量較高、小腦及脊髓的TDP-43蛋白質量與WT含量相似。在Tg(+/-)及Tg(+/+)基因轉殖鼠之海馬迴或皮層的TDP-43蛋白質量相似，可能是因為回饋調節機轉所致。因為Tg(+/+)基因轉殖鼠之TDP-43 mRNA量比Tg(+/-)基因轉殖鼠高出大約2倍(如第8圖所示)。此觀察結果的細節仍有待後續研究。

第1D圖顯示出野生型鼠(WT)及TDP-43基因轉殖鼠Tg(+/+)大腦的TDP-43轉錄物之原位雜交結果。

第1E圖顯示出野生型鼠(WT)及TDP-43基因轉殖鼠Tg(+/+)大腦的TDP-43蛋白質免疫染色結果。CA1,CA1層；CA3,CA3層；DG,齒狀回突(dentate gyrus)。第1B-1E圖係為三個獨立實驗之結果。

第8A圖顯示大腦RNAs的RT-PCR分析之電泳結果，第8B圖顯示Tg(+/+)基因轉殖鼠及Tg(+/-)基因轉殖鼠相對於野生型鼠之大腦TDP-43 mRNA量的條狀圖。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為5。

TDP-43基因轉殖鼠(Tg)在莫里斯水迷宮測試及恐懼制約測試的表現下降

水迷宮測試係用於評估在海馬迴及皮層中過量表現TDP-43後是否會影響小鼠的學習/記憶。如第2A圖所示，兩個月大的(+/+)基因轉殖鼠顯示出在水迷宮測試中的表現顯著地下降。將基因轉殖鼠與野生型鼠比較(如第2A圖)，以及與非基因轉殖鼠比較(如第9圖)。由於具有相似TDP-43表現量的半合子(+/-)與同合子(+/+)基因轉殖鼠顯示出其學習/記憶能力的下降，因此將同合子(+/+)基因轉殖鼠用於後續所有的行為測試及其他實驗分析。如第2B圖所示，同合子(+/+)基因轉殖鼠之學習/記憶能力下降的情形，同樣出現在恐懼制約測試的結果中。因此，由這兩個認知試驗所得到資料顯示在海馬迴及皮層過量表現TDP-43將使小鼠的學習/記憶能力顯著地降低。

第9圖顯示出2個月大的小鼠進行水迷宮測試的結果。其學習/記憶能力係顯示如六小節試驗的逃避時間所示。在同時出生的Tg(+/-)或Tg(+/+)基因轉殖鼠之間的差異性不大。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為20。

TDP-43基因轉殖鼠在滾輪測試中顯示出異常四肢緊握及表現下降之情形

同時分析TDP-43基因轉殖鼠的運動能力在四肢緊握及滾輪測試。基因轉殖鼠在出生時為正常，且在兩個月大時其自發性活動能力也正常(參閱第2C圖)。然而，在六個月大時，抓住基因轉殖鼠之尾巴時出現了四肢握反射(limb-clasping reflex)的不正常現象，而對照組的小鼠則出現四肢伸展的情形。此種不正常的反射現象通常會出現在神經退化疾病的小鼠模式中，例如亨丁頓舞蹈症(the Huntington's Disease,HD)。進一步對六個月大的基因轉殖鼠進行滾輪測試，結果顯示出基因轉殖鼠出現運動協調功能、平衡及抓握強度嚴重下降的情形(N=10；p <0.05)，但在二個月大或四個月大時則無此情形(參閱第2E圖)。由第2C-2E圖結果顯示出此些TDP-43基因轉殖鼠在六個月大時發展漸進的運動行為缺失。由於此些六個月大的TDP-43基因轉殖鼠之運動能力缺失，因此進一步進行新物件識別測試。結果如第2F圖所示，如同兩個月大的TDP-43基因轉殖鼠，六個月大TDP-43基因轉殖鼠仍然具有學習/記憶能力缺失的情形。

第2A圖顯示2個月大的野生型鼠(WT)及TDP-43基因轉殖鼠之水迷宮測試結果。其學習/記憶能力係顯示如六小節試驗的逃避時間所示。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為20。第2B圖顯示出在恐懼制約測試中，2個月大的野生型鼠(WT)及TDP-43基因轉殖鼠之認知能力比較。第2C圖顯示2個月大的野生型鼠(WT)及TDP-43基因轉殖鼠之運動量測試結果。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為16。第2D圖顯示出，和野生型鼠相比之下，在抓住六個月大的基因轉殖鼠之尾巴時出現了異常的四肢緊握情形。本試驗為進行五次獨立實驗之結果。第2E圖顯示出野生型鼠與基因轉殖鼠進行滾輪測試之結果。試驗係紀錄三種不同年齡的小鼠由轉速為20 r.p.m.的滾輪上掉落的時間。結果顯示六個月大的基因轉殖鼠其運動能力漸進地喪失。第2F圖顯示出小鼠在進行一小時的新物件辨識測試之結果。結果顯示和野生型鼠相比，兩個月大及六個月大的基因轉殖鼠的學習/記憶能力皆有退化的情形[2-month(18%)及6-month(16%)]。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為10(*p <0.05)。

TDP-43基因轉殖鼠之電生理分析

在參照了TDP-43基因轉殖鼠之學習/記憶能力的下降後，進行其長期增益效應(Long-term potentiation,LTP)的電生理分析，並和野生型鼠進行比較。利用取自小鼠海馬迴切片的Schaffer氏側支(Schaffer Collateral)與主要CA1錐體神經元之間區域，量測其長期增益效應(LTP)。在學習/記憶測試的關聯性中(參閱第2圖)，取自野生型鼠的切片中，Schaffer氏側支的強直性刺激導致了robust LTP。然而，在TDP-43基因轉殖鼠的切片中，在誘發LTP後，其只維持較弱的LTP 60分鐘。

對DIV 12-15的培養中海馬迴神經元記錄其最小興奮性電流(mEPSC)(參閱第3B圖)。結果顯示其最小興奮性電流(mEPSC)的頻率並無顯著差異(WT 3.16±0.65；Tg 4.59±0.83,p =0.20，參閱第3B圖)。然而，比較野生型鼠及基因轉殖鼠，其mEPSC振幅具有顯著差異(WT 47.30±2.56；Tg 39.52±2.96,*p =0.03，第3B圖)。衰減時間常數(decay time constant)具有顯著差異(WT 3.18±0.30；Tg 4.99±0.25,***p =0.0006，參第3B圖)，而上升時間常數(rise time constant)則無顯著差異(WT 1.80±0.08；Tg 1.81±0.04,p =0.88，參第3B圖)。此些結果顯示出，受體的開闔特性導致了TDP-43基因轉殖鼠中EPSC振幅及衰減動力學的改變。

第3A圖顯示2個月大的CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之海馬迴LTP衰退之情形。在CA1區域的紋狀體輻射層(stratum radiatum layer)之強烈強直性刺激引起了LTP。而在TDP-43基因轉殖鼠中，LTP的引發及維持受到抑制。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且三個組中的N為8。第3B圖顯示所培養的TDP-43基因轉殖鼠之海馬迴神經元中mEPSC紀錄的變化。對培養(12-15 DIV)之野生型鼠及TDP-43基因轉殖鼠之海馬迴神經元進行全細胞電壓箝片記錄。神經元的mEPSC紀錄之軌跡係顯示如第3B圖上方。和野生型鼠相比，TDP-43(+/+)基因轉殖鼠具有較少量的主要波峰(箭頭處)。其頻率、振幅、衰減Tau及上升Tau，係分別顯示於四個圖表中(*p <0.05；***p <0.001)。兩個比例尺分別為50 pA及1 s。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且各組中的N為10。

在TDP-43基因轉殖鼠海馬迴及皮層的pERK及pCREB減少與GFAP、GAP67及GABA增加

在參照了TDP-43基因轉殖鼠之學習/記憶能力減退以及LTP下降後(第2、3圖)，在此確認了幾個已知在海馬迴及皮層中參與不同學習/記憶傳導路徑的主要蛋白質。TDP-43基因轉殖鼠與野生型鼠比較，其CaMKII、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、生長相關蛋白43(growth-associated protein 43, GAP43)、突觸素(synaptophysin,SYP)及突觸後密度蛋白95(postsynaptic density 95)之蛋白質量相似，而在TDP-43基因轉殖鼠中的pERK及其下游標的pCREB的蛋白質量較低，如第4A圖的西方墨點法結果所示。

其中應注意的是，在TDP-43基因轉殖鼠前腦的前顆粒蛋白(progranulin,PGRN)表現量與野生型鼠相同(參第4A圖)。不清楚在FTLD-U小鼠大腦的PGRN為何沒有增加，而其大腦的GFAP/gliosis則為增加。PGRN是表現在中樞神經系統的神經元及神經膠中，且其在神經膠增生時會增加。有趣的是，在最近的神經傷害小鼠模式中，軸索斷裂(axotomy)導致神經元中TDP-43的增加及PGRN的減少，然而PGRN的量在周圍活化的神經膠中則是增加。因此，有可能在基因轉殖鼠前腦之TDP-43過量表現的神經元中PGRN的減少，補償了在活化神經膠中PGRN量的增加。未來在研究上可能會進一步證實此點。

有趣的是，在TDP-43基因轉殖鼠的海馬迴及皮層中，GAD67及GFAP皆增加了將近兩倍。GAD67已知為一種在合成主要抑制性神經傳導物質GABA的主要酵素。藉由TDP-43基因轉殖鼠及野生型鼠的原代神經元培養之GAD67及TDP-43免疫染色分析，更確認了GAD67及TDP-43的增加(參第4B圖)。在免疫染色結果顯示，和野生型鼠相比，較高的GAD67主要同時表現在TDP-43基因轉殖鼠的神經元的細胞體(soma)及前導突起(process)(比較第4B圖右邊三圖及左邊三圖)，然而神經元特異性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)的量在TDP-43基因轉殖鼠及野生型鼠則是相似。與GAD67的免疫染色結果一致地，在TDP-43基因轉殖鼠前腦中的GABA神經傳導物質的釋出也是增加(第4B圖右下)。第4A-4B圖結果顯示，在TDP-43基因轉殖鼠中過量表現TDP-43降低了學習/記憶能力，可能是部分地藉由干擾ERK磷酸化，以及抑制性神經傳導物質GABA的上調控所致。

第4A圖顯示取自兩個月大的野生型鼠及TDP-43基因轉殖鼠之大腦皮層及海馬迴之萃取物，其不同蛋白質的西方墨點法分析結果。在TDP-43基因轉殖鼠海馬迴及皮層的pERK及pCREB的減少，與GFAP、GAP67及GABA的增加。其結果是由三個獨立實驗所得。第4B圖顯示GAD67表現量的免疫染色分析，以及GABA釋出的量測。野生型鼠(WT，左圖)以及TDP-43基因轉殖鼠(Tg，右圖)的原代神經元培養，係以anti-GAD67(綠色)及anti-TDP-43(紅色)進行雙染。比例尺長度係為50 μm。在TDP-43基因轉殖鼠的神經元中具有較高的GAD67及TDP-43之影像訊號。野生型鼠以及TDP-43基因轉殖鼠的GAD67-陽性細胞之GAD67相對強度，經統計比較後顯示如左方共軛焦影像圖的下方的圖表所示。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且各組中的N為20。位於右下方的圖則是經統計比較後的野生型鼠以及TDP-43基因轉殖鼠的GABA相對強度。平均來說，TDP-43基因轉殖鼠前腦的GABA量比野生型鼠高50%(N=5,p<0.05)。

TDP-43基因轉殖鼠大腦的神經病理學

除了第2-4圖所述，行為的、電生理的以及基因表現量的異常之外，TDP-43基因轉殖鼠也表現出某些和FTLD-U患者大腦相同的神經病理學特徵。首先，星狀神經膠標記GFAP的表現增加所產生的反應性神經膠質化，是FTLD-U的一種已知的主要病理學特徵。如西方墨點法結果所示，在TDP-43基因轉殖鼠中GFAP蛋白質量係為增加(第4A圖下方)。與此結果一致地，和野生型鼠相比，TDP-43(+/+)基因轉殖鼠的海馬迴(HP)及皮層(CX)的抗GFAP免疫染色結果皆顯示出GFAP量的增加(參閱第5A圖)。

第二，由西方墨點法結果亦顯示，6個月大的TDP-43基因轉殖鼠大腦萃取物的尿素可溶性樣本中，具有高分子量的TDP-43種類，推斷為多泛素化TDP-43(poly-ubiquitinated TDP-43)，以及25 kDa、35 kDa片段(參閱第5B圖)。此西方墨點法結果的圖譜在取自2個月大的TDP-43基因轉殖鼠大腦樣本中較不明顯，且在取自野生型鼠的樣本中則未觀察到此情形(參閱第5B圖)。第5A圖的anti-GFAP免疫螢光染色結果的影像顯示，和2個月大的野生型鼠對照組相比，TDP-43基因轉殖鼠的GFAP量(綠色)係為增加。細胞核以DAPI(藍色)標記。CA1,CA1層；CA3,CA3層；DG,齒狀回突(dentate gyrus)。比例尺長度為100 μm。第5B圖顯示西方墨點法結果的圖譜結果，其樣本分別為取自2個月大及6個月大的TDP-43基因轉殖鼠以及取自野生型鼠之皮層及海馬迴萃取物之尿素可溶性樣本。注意到高分子量的TDP-43種類(***)以及TDP-43的25 kDa(*)、35 kDa(**)片段，在6個月大的TDP-43基因轉殖鼠中較明顯，而在2個月大的TDP-43基因轉殖鼠中較不明顯。65 kDa片段的條帶(空心三角形)亦可在其他細胞株及患者淋巴細胞萃取物的免疫墨點結果中觀察到，但是其重要性目前仍未知。箭頭所指處為未修飾形式的TDP-43蛋白質。”Long Exp”代表長曝光；”Short Exp”代表短曝光。第5A-5B中的結果係由5個獨立實驗所得。

進一步進行免疫螢光染色，以檢測和野生型鼠相比之下，TDP-43(+/+)基因轉殖鼠大腦的TDP-43之次細胞組成。如第6A圖所示，透過對TDP-43(+/+)基因轉殖鼠大腦未影響的神經元進行anti-NeuN及DAPI的染色，可觀察到TDP-43被檢測到主要位在細胞核中。值得注意的是，然而，在具有泛素(+)細胞質包涵體的神經元的細胞核中並未觀察到TDP-43(第6A圖左下兩圖的箭頭處)。如第6A圖右方四圖所示，在野生型鼠大腦並未觀察到泛素(+)細胞質包涵體[TDP-43(+)NCIs]。綜合來說，TDP-43(+/+)基因轉殖鼠皮質中，大約有15-20%的神經元具有泛素(+)細胞質包涵體。

最終地，anti-ubiquitin免疫染色結果顯示，6個月大的TDP-43基因轉殖鼠大腦可檢測到泛素陽性的表現(參閱第6B圖)。整體而言，由TDP-43基因轉殖鼠的蛋白病理分析之圖譜，如第5B圖及第6圖所示，係明顯地相似於那些報載具有TDP(+)-UBIs的FTLD-U大腦病理樣本。

第6A圖顯示出，TDP-43基因轉殖鼠及野生型鼠的大腦切片，以anti-TDP-43(紅色)、anti-NeuN(綠色)及DAPI(藍色)進行共染的結果。可注意到TDP-43基因轉殖鼠大腦的TDP-43(+)NCIs之表現，如左下方二圖之箭頭所指處，然而其並未出現在野生型鼠的大腦(右方四圖)。在TDP-43(+/+)基因轉殖鼠及野生型鼠的樣本中各取一個神經元放大顯示於右下角(方格圈選處)。第6B圖顯示6個月大的TDP-43(+/+)基因轉殖鼠大腦切片的免疫染色圖譜結果，顯示其神經元中含有TDP-43(綠色)的NCIs同時對於anti-ubiquitin(Ub)染色(紅色)呈現陽性反應(如箭頭處)。分別在右下角以3個放大圖像，放大顯示圖中具有TDP-43(+)、UB(+)之NCIs的其中一個細胞。

基因轉殖鼠之大腦萎縮

為了檢測基因轉殖鼠的大腦是否會發展為如FTLD-U患者般的大腦萎縮，利用核磁共振影像(MRI)測量基因轉殖鼠的海馬迴體積。結果顯示6個月大的基因轉殖鼠的海馬迴體積比控制組小鼠減少約17%(各組的N=5，p <0.05)。此萎縮的範圍恰巧相似於FTLD患者額葉及顳葉萎縮的幅度。同時，也量測了小鼠的大腦重量與皮層神經元數目。由結果顯示，在6個月大的基因轉殖鼠具有神經元喪失的情形。平均來說，基因轉殖鼠的大腦重量比野生型鼠減少約12%(N=5，p <0.05)(參閱第7A圖)，而皮層的神經元數目減少約24%(參閱第7B圖)。神經元喪失可能導致了基因轉殖鼠大腦部分神經元的細胞凋亡。確實如此，TUNEL assay染色結果顯示，在6個月大的基因轉殖鼠大腦觀察到凋亡的細胞核(參閱第7C圖)，且伴隨著caspase-3總數與活化的caspase-3數目的增加(參閱第7D圖)。

第7A圖顯示出6個月大的基因轉殖鼠大腦重量的降低。小鼠的全腦被取下並進行秤重(N=5，p <0.05)。第7B圖顯示出基因轉殖鼠大腦皮層的神經元缺失。對6個月大的基因轉殖鼠及野生型鼠的橫向大腦切片以anti-NeuN進行免疫染色，如左方二圖所示。基因轉殖鼠大腦皮層的神經元數目與野生型鼠進行比較(右圖；各組的N=5，且p <0.05)。第7C圖顯示6個月大的基因轉殖鼠之細胞凋亡檢測(TUNEL assay)。綠色訊號代表細胞凋亡的細胞核(箭頭處)，而藍色係為DAPI染色。在野生型鼠或2個月大的基因轉殖鼠的大腦皮層中並未檢測到細胞凋亡的細胞核(資料未示)。第7D圖顯示在6個月大的基因轉殖鼠的caspase-3總數與活化的caspase-3數目的增加。將取自小鼠大腦的總萃取物(皮層+海馬迴)進行西方墨點法分析。

基因轉殖鼠的生命週期

測量小鼠的存活率。由第10圖資料顯示，和野生型鼠相比，基因轉殖鼠的具有較短的生命週期，其平均存活時間為495天，而野生型鼠的生命週期平均為632天。在第10圖中，小鼠的存活資料顯示於補充資料中。該些資料係以對數等級檢定(Log-Rank test)進行比較(X² =9.8,p <0.01)。和野生型鼠(632天)相比，基因轉殖鼠的生命週期(495天)明顯地減少。兩組中的N=60。

討論

本發明關於一種在中樞神經系統過量表現TDP-43的基因轉殖鼠，包括在海馬迴及皮層的部位，且利用CaMKII啟動子控制其表現。在先前技術中，CaMKII啟動子係可用於過量表現其他蛋白質以建立其他小鼠模式。然而，每個小鼠模式皆表現出獨特的表現型。例如，過量表現CREB或NR2b可增強小鼠的學習/記憶能力，這也和此些因子在學習/記憶中所扮演的已知角色一致。另一方面，過量表現甲基CpG結合蛋白2(methyl-CpG binding protein 2,MeCP2)可導致運動功能失調的表現型，但對於小鼠的認知功能沒有影響。值得注意的是，CaMKII啟動子導致的過量表現並非必需性地影響到小鼠的行為，例如磺醯尿素受體(sulfonylurea receptor,SUR)的基因轉殖鼠研究。在TDP-43的案例中，其過量表現導致了小鼠在分子、細胞及表現型的大量改變。這些改變包括了學習/記憶能力退化、運動神經元功能的喪失、由電生理測得的LTP異常、海馬迴體積減少，以及TDP-43(+)-UBI相關的蛋白質病理學特徵(參閱表1)。此些改變在CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠中明顯地相似於FTLD-U的神經學及病理學特徵。在表1中係為和野生型鼠相比，TDP-43(+/+)基因轉殖鼠的分子、細胞、行為改變的摘要內容。

基因轉殖鼠顯示出呈現年齡依賴(age-dependent)的運動功能喪失。關於此點，FTLD及運動神經疾病或是MND，似乎涵蓋了某些層級，且FTLD患者同時具有MND的臨床特徵。應注意到在此只有部分的FTLD患者會發展為MND。在6個月大的TDP-43基因轉殖鼠的運動行為缺陷發展上(第2D及2E圖)與FTLD患者的運動功能喪失具有相關性。在不同的MNDs研究中，包括肌萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)，MNDs可經由某些徵狀及徵候以在臨床上證實，包括運動皮層的上位運動神經元(upper motor neurons)的退化、腦幹或脊髓的下位運動神經元(lower motor neurons)的退化。然而，基因轉殖鼠脊髓的運動神經元大小及數量與野生型鼠相比並無顯著不同(第11圖)。在參閱我們使用的CaMKII啟動子之前腦神經元特異性，此情形並不令人驚訝。因此，CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之運動功能失調，最有可能是導因於前腦神經迴路之傷害，其包含了由CaMKII啟動子所致TDP-43過量表現引起，尚未明確定義的大鼠運動皮層(rodent motor cortex)以及皮質脊髓束(corticospinal tract)。有可能地，但也相對上較不可能地是由CaMKII啟動子特異性，使基因轉殖鼠在肌肉的某些缺陷所致的運動失調。未來在CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之細節分析中，可進一步釐清及區分上述的可能性。

↑：增加；↓：減少；↑↑↑：明顯增加；+：表現；-：無表現；~：與野生型相似；na：未分析

在第10A圖中，利用蘇木素伊紅染色(HE staining)分析6個月大的野生型鼠及TDP-43(+/+)基因轉殖鼠腰椎脊髓的冠狀切片。比例尺為100μm。上方二圖顯示對野生型鼠及基因轉殖鼠在單一解剖層次的脊髓。下二圖係為上二圖中特定區域的放大圖。可注意到野生型鼠及基因轉殖鼠係具有相似的染色圖譜。結果係由三個獨立實驗所得。第10B圖顯示野生型鼠及基因轉殖鼠腰椎脊髓之運動神經元數目之條狀圖。用於選擇得分的運動神經元之項目包括：具有圓形/開放/白色的細胞核，其半徑在30-45 μm之間。對各個小鼠而言，針對超過25個腰椎脊髓之L1至L5切片進行計數。野生型鼠及基因轉殖鼠之脊髓神經元(MN)的數目係為相近的(p >0.05)。結果以三次獨立實驗的平均值±標準差(mean±SEM)呈現，且各組中的N為5。

CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠的認知功能亦表現出退化的情形，例如莫里斯水迷宮測試(第2A圖)、恐懼制約測試(第2B圖)、新物件識別測試(第2F圖)及LTP電生理紀錄(第3圖)之結果所示。與此相關的是，FTLD患者的學習/記憶能力受損是導致其社交行為及語言失調的主要原因。作為一個以過量表現TDP-43在影響認知功能之分子及細胞基礎初步研究而言，在本發明中檢測了一些神經可塑性的分子標記之表現程度。第4圖的結果指出，過量表現TDP-43會導致p-ERK及p-CREB表現量減少，且可能導致其下游標的減少，例如腦衍生神經滋長因子(Brain-derived neurotrophy factor,BDNF；Kandel,2001)。進一步地，在基因轉殖鼠身上觀察到的神經膠細胞增生的增加(第5A圖)，已知會降低學習/記憶能力。由於過量表現TDP-43會影響到一些細胞培養的生化活性，例如轉錄、選擇性剪接以及細胞週期的進展等，因此預測基因轉殖鼠的表現型是由於在其皮層及海馬迴過量表現TDP-43引起多重生理功能的改變或修飾之失調所導致。在此應注意到在發明人的其中一篇先前文獻中顯示，TDP-43會分布在培養的海馬迴神經元且呈現為顆粒/RNA顆粒。然而，發明人也檢測出取自基因轉殖鼠或野生型鼠之海馬迴神經元細胞的TDP-43顆粒的分布型態並無顯著不同(資料未示)。

除了行為的表現型之外，TDP-43基因轉殖鼠也表現出其神經病理學與FTLD-U相似的情形，但不包含45kDa之磷酸化TDP-43的缺乏(第5圖)。特別是，在6個月大的基因轉殖鼠大腦切片的神經元中，出現細胞核缺乏TDP-43、細胞質TDP-43(+)、泛素(+)包涵體(UBIs)的情形，然而在2個月大的基因轉殖鼠中並未檢測到此情形(第6A、6B圖及表1)。此年齡依賴的免疫組織染色分析結果與免疫染色分析結果具有良好的相關性，由取自6個月大的基因轉殖鼠的大腦萃取物的尿素可溶性部分之結果，顯示出具有高分子量的TDP-43種類，推論是多泛素化TDP-43以及25kDa及35kDa的TDP-43片段(第5B圖及表1)。因此，在小鼠模式中，似乎是不可溶的TDP-43(+)UBIs造成運動能力喪失，但並非造成認知功能喪失的原因。另一方面，在6個月大的基因轉殖鼠中，NCIs的表現可能是次要的、年齡依賴的現象，且部分負責運動失調功能的過程仍待進一步證實。可用於區別其關連性的基礎，以及其是否存在於發展為人類FTLD-U案例的過程中，則有待進一步研究。

整體而言，本發明已揭示在小鼠前腦中過量表現TDP-43轉殖基因會造成發展為相似於FTLD-U的已知分子、細胞、行為以及蛋白質病理學的特徵。值得注意地，在FTLD-MND患者的大腦TDP-43 mRNA量高於正常對照組。在整體基因表現研究中顯示，PGRN-突變陽性FTLD-U(PGRN-mutation positive FTLD-U)之某些案例中，其TDP-43 mRNA表現量較高。值得注意地，由免疫染色分析結果亦顯示出，和正常對照組相比，取自ALS病理樣本以及具有TDP-43(+)包涵體之肌肉疾病樣本中的溶質，皆具有較高的TDP-43蛋白質量。因此，在此揭露關於CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠的資料，顯示出提升TDP-43蛋白質量可能是造成具有TDP-43(+)包涵體的神經退化疾發病的主要原因之一。

將本發明之結果與Wils et al.(2010)在幾個方面作比較可得到下列幾點結論。首先，將兩者的資料綜合來看，對於在小鼠中提升TDP-43的表現量足以引起神經退化，提供了一個強力的支持，且其很有可能在人類TDP-43 蛋白質病的神經退化疾病中，負責此疾病的產生及發展。其次，兩者皆證實了包含TDP-43的NCIs以及caspase-3的活化與神經元凋亡有關。再者，兩者在朝著此疾病發展的研究方向上，皆檢測出TDP-43的35KDa及25KDa之C端片段的出現。最終，在Wils et al.(2010)利用Thy-1啟動子在小鼠中過量表現TDP-43，其可在許多不同種類的細胞中活化，包括中樞神經系統的神經元、肌肉細胞、免疫T細胞等等。其主要藉由基因轉殖鼠證實了運動神經失調、肌肉缺陷等相關病理及行為表現型，例如痙孿性麻痺(spastic paralysis)、肌肉萎縮(muscle wasting)及行動遲緩(reduced movement)等。另一方面，在本發明所使用的前腦神經元特異性CaMKII啟動子，可允許檢測及追蹤從幼鼠到超過兩歲的小鼠之認知行為以及運動功能的疾病形成及發展。另外，在基因轉殖鼠中可觀察到部份FTLD-U的特性，包括認知失調、海馬迴萎縮，以及在罹病前腦的尿素可溶性部分中漸進地出現TDP-43高分子量種類及其35KDa及25KDa片段(表1)。因此，雖然Wils et al.(2010)建立的小鼠較適合進行ALS的神經退化研究，然而本發明的CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠較適於在未來進行FTLD-U的細部病理/臨床分析以及藥物/治療發展。

所有在此引用的參考資料皆以其完整內容作為本文之一部分。

本發明所提供之基因轉殖鼠確具產業上之利用價值，惟以上之敘述僅為本發明之較佳實施例說明，凡精於此項技藝者當可依據上述之說明而作其它種種之改良，惟這些改變仍屬於本發明之精神及以下所界定之專利範圍中。

在本發明之實施說明所引用及探討的部分參考文獻，可包括專利、專利申請書及不同的公開文獻。該些參考文獻的引用及/或討論僅係用於釐清本發明的敘述，而非允許該些參考文獻可當作本發明的先前技術。所有在說明書中引用及討論的參考資料皆以其完整內容作為本文之一部分。

參考文獻列表

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第1A-1E圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之製造及其特徵；第2A-2F圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之習性表現；第3A-3B圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之電生理分析結果；第4A-4B圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之學習/記憶相關蛋白質表現量變化；第5A-5B圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠之大腦神經退化結果；第6A-6B圖係顯示以免疫螢光染色分析CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠大腦的TDP-43蛋白質分布情形；第7A-7D圖係顯示CaMKII-TDP-43基因轉殖鼠大腦的神經元喪失及細胞凋亡情形；第8A-8B圖係顯示TDP-43 Tg(+/+)及TDP-43 Tg(+/-)基因轉殖鼠與野生型鼠(WT)比較下的TDP-43表現量；第9圖係顯示CaMKII-TDP-43 Tg(+/-)基因轉殖鼠與野生型鼠(WT)、非基因轉殖鼠(NT)及TDP-43 Tg(+/+)基因轉殖鼠比較下的水迷宮測試結果；第10圖係顯示TDP-43 Tg(+/+)基因轉殖鼠與野生型鼠(WT)之存活曲線；第11A-11B圖係顯示TDP-43 Tg(+/+)基因轉殖鼠之組織學分析結果。

<110> 中央研究院

<120> 具有泛素陽性包涵體(FTLD-U)之額顳葉退化症之非人類動物模式

<130> 10011-00083

<140> 99119133

<141> 2010-6-11

<150> 1.61/183,327；2.12/785,653

<151> 1.2009-06-12；2.2010-05/24

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 414

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於原位雜交的探針序列

<400> 4

Claims

一種與一鈣調蛋白依賴性蛋白激酶IIα(Ca²⁺ /calmodulin-dependent kinaseIIα,CaMKIIα)啟動子操作地連結之轉殖基因用於誘導大腦TDP-43表現量增加之用途，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)之核苷酸序列，其中該CaMKIIα啟動子可有效增加該轉殖基因在一基因轉殖鼠大腦中的表現量；且造成該基因轉殖鼠認知神經功能喪失。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠表現出降低的或受損的學習及記憶能力。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠更表現出逐漸受損或降低的運動能力。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之海馬迴及皮層，而非小腦及脊髓表現出增加量的TDP-43蛋白質。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該基因轉殖鼠係為同合子基因轉殖鼠或半合子基因轉殖鼠，其中該同合子基因轉殖鼠及半合子基因轉殖鼠表現具有相同量的TDP蛋白質。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之海馬迴及皮層，而非小腦及脊髓表現出至少2倍的TDP-43蛋白質。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之海馬迴及皮層表現出變動量之一蛋白質及/或一神經傳導物質，其係選自由磷酸化細胞外信號調節激酶pERK(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,pERK)、磷酸化cAMP反應元件結合蛋白(phosphorylated cAMP response element-binding Protein,pCREB)、麩氨酸脫羧酸酶67(glutamic acid decarboxylase 67,GAD67)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)及半胱胺酸蛋白酶-3(caspase-3)所組成之群組。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之大腦表現出多泛素化TDP-43。
如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之大腦的多泛素化TDP-43係隨著年齡而增加。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之大腦神經元表現出胞內TDP-43包涵體。
如申請專利範圍第10項所述之用途，其中該胞內TDP-43包涵體係為泛素陽性。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠表現出腦萎縮、神經元喪失及學習記憶喪失。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之神經元細胞，在與分離或衍生自非基因轉殖鼠之一神經元細胞相比較之下，該神經元細胞具有較高的TDP-43 mRNA表現量。
如申請專利範圍第13項所述之用途，其中該基因轉殖鼠之該神經元細胞在其細胞質中表現出TDP-43蛋白質包涵體。
一種神經元細胞，包括有一轉殖基因，該轉殖基因可操作地連結於一鈣調蚤白依賴性蛋白激酶IIα(Ca²⁺ /calmodulin-dependent kinaseIIα,CaMKIIα)啟動子，其中該CaMKIIα啟動子可有效增加該轉殖基因在一基因轉殖鼠之該神經元細胞中的表現量，該轉殖基因包括一編碼有TAR DNA結合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)核苷酸序列，且該神經元細胞在其細胞質中表現出TDP-43蛋白質包涵體，且造成該基因轉殖鼠認知神經功能喪失。