TWI394610B - Purification program of zeaxanthin in algae-flavored flavonoids with high recovery rate from renewable adsorbent - Google Patents

Description

以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料中玉米黃素的純化程序

本發明主要是應用於以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料的技術上。

擬球藻(Nannochloropsis oculata)為真核單細胞藻類，直徑2-4 μm之小球體，主要發生於溫帶水域，外觀與綠球藻極相似。過去的研究顯示，擬球藻含有油脂、蛋白質、碳水化合物、葉綠素、類葫蘿蔔素、礦物質以及一些微量元素等有用成份。油脂成份含ω-3系列之二十碳五烯酸，具有抗氧化能力，類葫蘿蔔素主要有葉黃素和玉米黃素等成份，為一深具開發價值之天然營養來源。

大部分擬球藻當中富含類胡蘿蔔素，他們在植物體內扮演著一個重要的角色－保護植物免於光氧化作用。類胡蘿蔔素也為人體必要的營養之一，具有抗氧化能力與抗癌效果，也可降低心血管疾病發生的機率。在已發現的600餘種的類胡蘿蔔素中，僅少數被開發進行商業行為，主要應用食品添加劑，事實上尚有許多類胡蘿蔔素具有開發的潛質。玉米黃素(zeaxanthin)與葉黃素(lutein)是存在於水果與蔬菜中的一種類胡蘿蔔素，為構成人體視網膜中心黃斑部的色素，而黃斑部主要功能為調整視覺的相差、解析與色彩辨別。因此若人體眼球中缺少玉米黃素，易造成夜盲、視網膜退化…等有關的眼部疾病。許多研究亦顯示，「老年性黃斑部病變」，與玉米黃素有密切的關係。人體視網膜主要由玉米黃素與葉黃素兩種類胡蘿蔔素所組成，而負責我們最中心視力的黃斑部主要為玉米黃素所構成，因此也說明玉米黃素在人體眼球中扮演極重要的角色。

黃斑部除了負責視力樞紐外，尚可吸收與衰弱光線中高能量的藍光，避免過量與劇烈的光線破壞與氧化視網膜導致視力受損。儘管玉米黃素並非維持人體日常所必須之原素，但在維持人體氧化壓力的平衡上，也具有一定的貢獻，尤其又以避免視網膜遭受自由基的攻擊。玉米黃素除了可以過濾強光外，也能抑制、消除單態氧和自由基，避免黃斑部中的光受器不受傷害。除此之外玉米黃素具有長共軛鍵因此對於清除帶電荷自由基有一定的效果，從人體細胞實驗顯示，玉米黃素能消除視網膜脂質中的自由基，避免脂質細胞的過氧化進而導致治癌物的生成。

在一般日常生活飲食中皆可攝取玉米黃素與葉黃素，獲取到的葉黃素的量比玉米黃素多，玉米黃素比葉黃素約為1：7，且在所有類胡蘿蔔素中，僅僅只有玉米黃素與葉黃素存在於視網膜中，而黃斑部更是以玉米黃素為主，因此更突顯開發含有玉米黃素之眼部保健食品的必要性。

為了獲得高純度生化活性物質，許多物理及化學分離純化手段已被利用，如蒸餾、吸附、化學反應，以及層析法為常見分離純化技巧，然而現實中所面對的樣品多為基質極為複雜之樣品，因此液相層析技術往往最具學術與工業界所青睞。從液相層析技術發展到成熟的數十年間，發展出各式各樣的填充劑，應用於不同的純化系統，其中以silica-gel正相層析管柱最為普遍。由於傳統管柱分離純化方法常常需要大量吸附劑，且填充劑往往只使用一次後便須丟棄，縱使能得到高純度的純化產品，但對目標物的回收率卻不顯著，因此在商業的應用上僅僅只能拘限應用於高單價產品。

本發明人目前從事相關產品的製造、設計，累積多年的實務經驗與心得，有鑑於傳統管柱分離純化方法所既存的問題與缺失，積極地投入創新與改良的精神，所完成的以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料。

本具前瞻性的可再生正相吸附劑之純化系統克服了上述之限制條件：

一、對於吸附劑我們選擇PS100樹脂，在適當的使用環境與再生條件下，吸附劑能重複使用，大大減少設備成本與操作時間。

二、在低損失(小於20%)玉米黃素下，即回收率於80%以上，以乙醇/丙酮混合溶液系統作為沖提液，進行純化微藻粗萃物(玉米黃素含量在20 mg/g至40 mg/g)，最後得到80%以上的回收率且純度在300 mg/g至400 mg/g之玉米黃素固態產物。

為使專精熟悉此項技藝之人仕業者易於深入瞭解本發明的裝置內容以及所能達成的功能效益，茲列舉一具體實施例，詳細介紹說明如下：一種以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料中玉米黃素的純化程序，包含：步驟一，擬球藻先以高速離心與冷凍乾燥方式除水後，儲存於-80℃下備用；步驟二，取10g經步驟一冷凍乾燥後的擬球藻，加入1010mL的丙酮經超音波攪拌萃取迴流30分鐘，而後減壓濃縮至乾，得萃出物乾重0.48g；步驟三，將步驟二之萃出物回溶至乙醇中，以管柱層析進行純化分離，管柱之內徑為10cm，長度為30cm，其中管柱充填材質為聚苯乙稀樹脂(PS,100~230 mesh)，沖提液為乙醇和丙酮之混合液，待12小時後收集含有玉米黃素之分劃層，最後經高效能液相層析儀(HPLC)鑑定，玉米黃素的純度為30%至40%。

管柱純化玉米黃素

取PS100吸附劑緩慢的填入玻璃管柱中，將NCHU99之丙酮粗萃物回溶於乙醇中形成玉米黃素溶液，將回溶液緩慢加入玻璃管柱中並以不同的比例的乙醇與丙酮溶液進行沖堤，分三個分劃層進行收集，將管柱分離後的流析液進行減壓濃縮後，以HPLC進行類胡蘿蔔素的分析與定量。經由HPLC分析，玉米黃素滯留時間為22.0分鐘，根據波峰面積的計算，可得知在中段分劃層有較高濃度的玉米黃素。由此可知經由本純化製程可將丙酮粗萃物由2%含量的玉米黃素提升至30%，且在全部製程僅僅只損失10%總玉米 黃素。

以NCHU-268藻株萃出物進行管柱純化，取PS100吸附劑緩慢的填入玻璃管柱中，將超音波丙酮初萃物配製成玉米黃素甲醇溶液，並將溶液緩慢加入玻璃管柱中並以固定比例的甲醇與丙酮溶液沖提之後，分三個分劃層收集。將管柱分離後的流析液進行減壓濃縮後，以HPLC進行類胡蘿蔔素的分析與定量。經由HPLC分析，在450nm波長下，玉米黃素滯留時間為22.0分鐘，根據波峰面積的計算，可得知玉米黃素純度約41.03%，回收率為82.3%。

綜合上述所陳，本發明係在提供一種以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料，經過本發明人實際製作完成以及反覆操作測試之後，證實的確可以達到本發明所預期的功能效益；同時，又為目前坊間尚無見聞之「首先創作」，具有「產業上的利用價值」，誠然已經符合發明專利之成立要義，爰依專利法之規定，向 鈞局提出發明專利之申請。

Claims (1)

1. 一種以可再生吸附劑產製高回收率之藻類玉米黃素保眼原料中玉米黃素的純化程序，包含：步驟一，擬球藻先以高速離心與冷凍乾燥方式除水後，儲存於-80℃下備用；步驟二，取10g經步驟一冷凍乾燥後的擬球藻，加入1010mL的丙酮經超音波攪拌萃取迴流30分鐘，而後減壓濃縮至乾，得萃出物乾重0.48g；步驟三，將步驟二之萃出物回溶至乙醇中，以管柱層析進行純化分離，管柱之內徑為10cm，長度為30cm，其中管柱充填材質為聚苯乙稀樹脂(PS,100~230 mesh)，沖提液為乙醇和丙酮之混合液，待12小時後收集含有玉米黃素之分劃層，最後經高效能液相層析儀(HPLC)鑑定，玉米黃素的純度為30%至40%。