TWI382087B - 一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置及其方法 - Google Patents

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Description

一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置及其方法
本發明是有關於一種裝置及其方法，特別是有關於一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置及其方法。其中該裝置包含一固定拓樸異構酶之微液流晶片，可以做為篩檢拓樸異構酶抑制劑之平台。
為了要讓某些酵素能夠參與去氧核醣核酸轉錄或複製，必須先由螺旋酶將兩股DNA分離。而拓樸異構酶(topoisomerase)能切斷雙股超螺旋DNA(double-stranded supercoiled DNA)、改變DNA構形後再將之原來斷裂處接合。拓樸異構酶包括第一型拓樸異構酶(topoisomerase 1,Top1)及第二型拓樸異構酶(topoisomerase 2,Top2)。其中第一型拓樸異構酶係藉由破壞磷酸雙酯鍵的方式，將超螺旋雙股DNA之其中一股切斷，使其產生一小缺口，此時另一股完整DNA會穿過此缺口重新黏合。而第二型拓樸異構酶係將雙股DNA同時切斷，經改變DNA構形，再重新黏合。
於快速增殖期之細胞中，可發現拓樸異構酶濃度及活性相當高，故製藥商可開發抗癌藥物係藉由抑制拓樸異構酶活性，進而抑制或阻斷緩慢增殖及快速增殖之癌細胞生長。免疫細胞、致病性感染源例如病毒、細菌、原生蟲的細胞生命週期亦需仰賴拓樸異構酶的活性，若有抑制劑干擾拓樸異構酶的作用將影響上述細胞之命運。綜此，過去研究指出，拓樸異構酶抑制劑具有抗腫瘤、抗 病毒及細菌等感染源、抗發炎、及免疫調節之應用潛力，而拓樸異構酶抑制劑的合成與研發一直以來都是醫藥界致力研究的題目之一。
傳統上拓樸異構酶抑制劑活性分析經常需藉助電泳膠片技術或細胞反應來測試其能力，但是其缺點是耗時、耗力。或者可利用3D-分子模擬(computer-aided molecular modeling)分析酵素活性，但其並非為真實的酵素反應，因此所獲得結果與實際活性不一致。近年來應用晶片技術可快速有效的偵測拓樸異構酶抑制劑活性。利用晶片技術快速篩檢拓樸異構酶抑制劑為此一領域的研究增加了不少效能，特別是微液流體晶片的發展，使拓樸異構酶抑制劑的動力分析更加方便、快速。然而在本發明揭露之前，都是將核酸或待測抑制劑固定在晶片，以拓樸異構酶蛋白質作為流動相注入固定有DNA或抑制劑之檢測晶片內，其結果經常造成拓樸異構酶蛋白質大量的耗費。純化製備具活性之拓樸異構酶之步驟與其注意事項較萃取DNA步驟繁雜，故以拓樸異構酶作為流動相時，其結果必需連同純化製備酵素之變因一起考慮，相對的不易達到快速檢驗之目的，且蛋白質的保存不易，經常有降解之風險。此外，由於一段DNA經常有複數個拓樸異構酶蛋白質作用位置，拓樸異構酶作用在不同的位置上具有不同的親和力，因此，在動力分析時對於親和力常數計算增加多重變數，不易正確分析。孰悉此領域人士一直期望能有效解決此一障礙。
有鑑於上述習知技術之問題，本發明之目的就是在提供一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置及其方法，以達到方便快速篩檢抗拓樸異構酶之功效。
根據本發明之目的，係提出一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置，其包括一生物晶片及一拓樸異構酶，拓樸異構酶係固定於該生物晶片上。生物晶片可為微液流晶片(microfluid chip)，而拓樸異構酶可為第一型拓樸異構酶(Top1)，或第二型拓樸異構酶。拓樸異構酶來源可來自病毒、細菌、真菌、原生蟲、寄生蟲、動物細胞、植物細胞、或人類細胞。若固定於生物晶片上之拓樸異構酶為Top1，則其可篩檢出抗第一型拓樸異構酶之抑制劑，例如喜樹鹼(camptothecin,CPT)或其衍生物。
又，根據本發明提出一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之方法，包含下列步驟：加入一待測抑制劑於上述之裝置上，接著，藉由一表面電漿共振(SPR)分析測定待測抑制劑與去氧核醣核酸(DNA)及拓樸異構酶形成複合體之結合能力。
此外，本發明之裝置上的拓樸異構酶具有催化去氧核醣核酸(DNA)構型改變之活性，若去氧核醣核酸與待測抑制劑共同加入於上述之裝置上時，去氧核醣核酸與拓樸異構酶形成一拓樸異構酶-DNA斷裂複合體(Topoisomerase-DNA cleavage complex)。再者，藉由一表面電漿共振分析測定待測抑制劑是否接合於拓樸異構酶-DNA斷裂複合體(意即透過表面電漿共振分析所測得之共振單位(RU)的變化，確認待測抑制物是否具有 抗拓樸異構酶之活性)，若待測抑制物具有抗拓樸異構酶之活性時，其可應用於阻斷去氧核醣核酸之轉錄、複製或重組作用。
承上所述，本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置及其方法，可具有一或多個下述優點：
(1)因本發明之裝置係利用表面電漿共振篩檢是否為抗拓樸異構酶之藥物，故於待測物上無需標記任何螢光物質或放射線物質，且可即時(real-time)並直接地檢測待測物與其配體(ligand)之結合關係。
(2)本發明之裝置中的拓樸異構酶係具有DNA催化活性，包括可與超螺旋DNA結合，形成拓樸異構酶-DNA斷裂複合體，使待測抑制劑與其結合，進而得知待測抑制劑為抗拓樸異構酶之抑制劑。
(3)本發明之裝置係將拓樸異構酶固定在生物晶片上作為固定相，除了降低操作過程之蛋白質損耗外，在偵測位置點而言，同時間只有單數個作用位置，可降低計算參數之複雜度。
本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置包含生物晶片及拓樸異構酶，拓樸異構酶係固定於生物晶片上，且拓樸異構酶具有一去氧核醣核酸(DNA)催化活性。
當DNA與一待測抑制劑共同注入本發明之裝置時，使DNA與生物晶片上的拓樸異構酶結合，形成拓樸異構酶-DNA斷裂複合體。可藉由表面電漿共振(SPR)分析待測抑制劑 是否接合於拓樸異構酶-DNA斷裂複合體，意即透過表面電漿共振分析所測得之共振單位(RU)的變化，確認待測抑制物是否具有抗拓樸異構酶之活性。
拓樸異構酶可為第一型拓樸異構酶及第二型拓樸異構酶，而生物晶片之類型可配合表面電漿共振之測量作選擇，其可包括微液流晶片。而若生物晶片係固定第一型拓樸異構酶時，其可檢測抗第一型拓樸異構酶之抑制劑，例如喜樹鹼或其衍生物。而當生物晶片係固定第二型拓樸異構酶時，其則可檢測抗第二型拓樸異構酶之抑制劑，例如etoposide(VP-16)或其衍生物。
請參閱第1圖，其係為本發明之篩選拓樸異構酶抑制劑之裝置之一實施例之截面圖。圖中，生物晶片為微液流晶片11，第一型拓樸異構酶(Top1)12係固定於微流道111之表面上。Tpo1具有催化去氧核醣核酸構型改變之活性，因此當超螺旋DNA 13與待測抑制劑14共同注入本發明之裝置之微流道111時，Top1可誘導DNA構型改變，並形成Top1-DNA斷裂複合體(箭頭為待測物之流動方向)。藉由表面電漿共振分析所測得之共振單位(RU)，檢測待測抑制劑14是否具有結合Top1-DNA斷裂複合體之活性。若是，其待測抑制劑14則為抗Top1 12之藥物。
請參閱第2圖，其係為本發明之篩選拓樸異構酶抑制劑之方法之步驟流程圖。其步驟包括，步驟S21，加入一待測抑制劑於本發明之裝置上，再者，藉由一表面電漿共振(SPR)分析，檢測待測抑制劑與拓樸異構酶之結合能力(此結合能力由表面電漿共振分析所測得之共振單位RU值 變化所表示)。此外，DNA可與待測抑制劑共同加入本發明之裝置上，且本發明之裝置上的拓樸異構酶具有一DNA催化活性，使DNA與拓樸異構酶形成一拓樸異構酶-DNA斷裂複合體。再藉由表面電漿共振分析待測抑制劑是否接合於拓樸異構酶-DNA斷裂複合體。當待測抑制劑接合於拓樸異構酶-DNA斷裂複合體時，待測抑制劑係具有抗拓樸異構酶之活性，進而可應用於阻斷DNA之轉錄、複製或重組。
桿狀病毒表現系統(baculovirus expression system)是現今使用於大量表現外源蛋白質之表現系統之一，在此，利用此系統製造具有活性之Top1(本實施例以重組人類第一型拓樸異構酶(recombinant human top1)為例，以下皆簡稱為hTop1)。並以西方墨點分析法(Western blot analysis)証實所純化之蛋白質確實為hTop1之蛋白質，如第3圖所示(hTop1之蛋白質濃度由左至右分別為20、10及5 μg)。
本實施例中，待測抑制劑係以喜樹鹼為例，其抗癌機制主要穩定第一型拓樸異構酶-DNA酸斷裂複合體，使DNA無法重新接合(re-ligation)，進而抑制或阻斷染色體之合成及複製。又，於本實施例中，超螺旋雙股DNA係以pUC19質體DNA(pUC19 plasmid DNA)作驗證。
pUC19質體DNA為緊密環狀雙股超螺旋DNA，當pUC19質體DNA與Top1相互作用後，環狀超螺旋DNA之其中一股會因此而進行斷裂，解螺旋然後再度接合而形成較鬆散之結構(relaxed form)。本實施例藉由凝膠電泳(gel electrophoresis)之方法，檢測pUC19質體DNA是否由超螺旋DNA轉變為較鬆散之結構，並且亦加入喜樹鹼分析是否可抑制其現象。結果顯示於第4圖，超螺旋DNA在洋菜膠(agarose gel)上之遷移速度較鬆散之環狀DNA快，如第2圖中之第1及2道所示(分別為無加入喜樹鹼及hTop1、與僅加入hTop1，即為分別僅有pUC19質體DNA、與hTop1及pUC19質體DNA)。此外，圖中亦顯示，喜樹鹼抑制由hTop1所造成之鬆散結構，且喜樹鹼之濃度越高，無被hTop1催化之超螺旋DNA之含量越高，如第2圖之第3至6道所示(喜樹鹼之濃度分別為2、4、6及8 μM)。
以上結果證實，上述實施例中所純化之hTop1、pUC19質體DNA及喜樹鹼皆具有活性，故將hTop1固定於微液流晶片的羧甲基葡聚醣(carboxymethylated dextran)表面上(並不以此為限)。簡單而言，以0.05-0.5 M之N-羥基琥珀硫亞氨(N-hydroxysuccinimide)及0.1-0.5M n-乙基-N′-3-二甲氨基胺丙基(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl))並以流速25 μL/min流經微流道以活化微液流晶片之表面。hTop1利用10 mM醋酸鈉稀釋並調整其pH為3~10.0，較佳是5~8.5，或7.5，及以流速10~40 μL/min，較佳是25~30μL/min，或25 μL/min(溫度為20~40℃，較佳是25℃，共作用60~300秒，較佳是200~300秒，計約20~150 μL之hTop1)將hTop1固定於微液流晶片上。其後注入1M乙醇胺(ethanolamine,pH7-9之間)於其晶片之表片以將自由態之羧基(carboxylic group)去活化。再者，藉由 表面電漿共振(SRP)分析證實hTop1固定於微液流晶片上，如第5圖所示，其顯示約4000 RU(resonance unit)之處為hTop1固定於微流體晶片之最大量。進一步藉由加入抗hTop1之抗體於微液流晶片上，證實固定於微液流晶片上之蛋白質係為hTop1，如第6圖所示。圖中，曲線(A)、(B)、(C)、(D)、(E)及(F)所示之抗體濃度之倍數分別為空白試驗組、16X、8X、4X、2X及1X倍稀釋所獲得之結果，其顯示抗體濃度越高，共振單位越高，顯示其與hTop1之結合度具有濃度相關性(concentration-dependent)結合。
又，將pUC19質體DNA加至已固定hTop1之微液流晶片上，並利用表面電漿共振分析，檢測pUC19質體DNA與hTop1之結合親合力(binding affinity)，其結果如第7圖所示。圖中，第(A)、(B)、(C)、(D)及(E)圖所示之pUC19質體DNA其濃度分別為0、125、250、500及1000 ng/ml，當pUC19質體DNA濃度越高，其與hTop1之結合親合力越高。以上結果證實，已固定於微液流晶片上的hTop1仍具有與DNA結合之活性。
單獨加入喜樹鹼(0至250 nM)於微液流晶片上時，喜樹鹼並不會與微液流晶片上的hTop1結合，如第8圖所示。證實喜樹鹼僅與拓樸異構酶-DNA斷裂複合體結合。因此，利用不同濃度之喜樹鹼(0、62.5、125及250 nM)與pUC19質體DNA(1μg/ml)共同加入微液流晶片上作測試，其結果分別如第9圖之第(A)、(B)、(C)及(D)圖所示。因喜樹鹼係與拓樸異構酶-DNA斷裂複合體結合，故 當喜樹鹼濃度越高，於微液流晶片上之複合物之質量(mass)則越高，且RU值亦隨著喜樹鹼之濃度而上升。若以VP-16(Top2抑制劑)與pUC19質體DNA共同加入本發明之微液流晶片中，VP-16並無法結合於具有hTop1之微液流晶片上，顯示其微液流晶片具有極高之專一性。一具有立體構形蛋白質固定於晶片上後，其構形、作用活性尚能維待，且提共進一步的應用誠屬不易，本發明所揭露技術無法為熟悉此技藝人士依據本發明揭露之前的任何先前技藝教示實施，因此本發明具有突破性進步。
以上實施例皆使用表面電漿共振作分析，其優點包括：於待測物上可無需標記任何螢光物質或放射線物質、即時(real-time)並直接地檢測待測物與其配體(ligand)之結合關係等。因此，利用表面電漿分析檢測待測抑制劑與DNA之結合能力、或待測抑制劑與拓樸異構酶-DNA斷裂複合體之結合能力，於拓樸異構物、DNA或待測抑制劑上，皆無需標記任何幫助讀取數據之物質(例如螢光物質或放射線物質)。並且可即時判定是否為抗拓樸異構物之藥物。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
11‧‧‧生物晶片
111‧‧‧微流道
12‧‧‧第一型拓樸異構酶
13‧‧‧超螺旋DNA
14‧‧‧待測抑制劑
S21~S22‧‧‧步驟
第1圖係為本發明之篩選拓樸異構酶抑制劑之裝置之一實施例之截面圖；第2圖係為本發明之篩選拓樸異構酶抑制劑之方法之步驟 流程圖；第3圖係為本發明中所純化之重組人類第一型拓樸異構酶之西方墨點分析圖；第4圖係為本發明中喜樹鹼抑制所純化之重組人類第一型拓樸異構酶及pUC19質體DNA之DNA電泳圖；第5圖係為本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置之表面電漿共振(SPR)光譜圖；第6圖係為抗重組人類第一型拓樸異構酶之抗體注入本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置之表面電漿共振光譜圖；第7圖係為pUC19質體DNA注入本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置之表面電漿共振光譜圖；第8圖係為喜樹鹼注入本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置之表面電漿共振光譜圖；以及第9圖係為喜樹鹼與pUC19質體DNA注入本發明之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置之表面電漿共振光譜圖。
11‧‧‧生物晶片
111‧‧‧微流道
12‧‧‧第一型拓樸異構酶
13‧‧‧超螺旋DNA
14‧‧‧待測抑制劑

Claims (8)

  1. 一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置，其包含：一微液流晶片；以及調整至pH3.0~10.0之一拓樸異構酶(topoisomerase)，係以一流速10~40 μL/min作用60~300秒固定於該微液流晶片上。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置，其中該拓樸異構酶包括第一型拓樸異構酶(topoiosomerase 1)。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置，其中該拓樸異構酶為人類第一型拓樸異構酶(human topoiosomerase 1)。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之篩檢拓樸異構酶抑制劑之裝置，其中該拓樸異構酶抑制劑包括喜樹鹼(camptothecin)或其衍生物。
  5. 一種篩檢拓樸異構酶抑制劑之方法，包含下列步驟：加入一待測抑制劑於如申請專利範圍第1至4項之任一項之裝置上；以及藉由一表面電漿共振(SPR)分析測定該待測抑制劑與該拓樸異構酶之結合能力。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中加入該待測抑制劑之步驟更包括共同加入一去氧核醣核酸(DNA)於該裝置，使該去氧核醣核酸與該拓樸異構酶形成一拓樸異構酶-去氧核醣核酸斷裂複合體(topoisomerase-DNA cleavage complex)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其更包括藉由該表面電漿共振分析測定該待測物與該拓樸異構酶-去氧核醣核酸斷裂複合體之結合能力之步驟。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該結合能力由該表面電漿共振分析所測得之共振單位(RU)所表示。
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