TWI381051B - 一種Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌屬菌株以及其使用方法 - Google Patents

Description

一種 Bacillus 菌屬菌株以及其使用方法

本發明係關於一種Bacillus 菌屬之桿菌，特別是一種可以醱酵合成生物高分子之Bacillus cereus group之桿菌。

生物高分子(biopolymer)主要為自然生物個體(如微生物、真菌、昆蟲或蕈類)之部分構造或其代謝產物而來，如膠原蛋白(collagen)、褐藻膠(Alginate)或聚酯類等，普遍具有良好的生物相容性、生物分解性及細胞利用性；該生物高分子通常帶有一可水解之鍵結，如酯鍵(ester bonds)或醯胺基(amides)，可以由一生物因子(如微生物及酵素)作用，而於合理時間(數週至數月)內分解而成為普遍存在於自然界之元素(如碳、水等)。該生物高分子可以利用人工或自然方式合成，其開發與應用係目前各產業極為重視的一項科技發展；然而，利用化學法合成該生物高分子之人工手段具有合成材料成本高、合成生物高分子之種類受限(化學法合成無法生產一些具產業應用價值之生物高分子，如...)、能源消耗及合成產品無法分解(少數化學法合成之生物高分子，如PHB無法自然分解)等問題，不符合近代環衛發展之精神，故於產品推廣上容易遭遇瓶頸。

存在於自然界的少數微生物，可於生物體內合成並儲存一聚酯類高分子(如聚羥基烷酯類[PHAs，(polyhydroxyalkanoates)])；當環境中的碳源(如glucose、sucrose)過多而其他營養元素(氫、磷、硫或氧)缺乏時，該微生物因無法循正常代謝途徑產生能量(ATPs)而改走一醱酵合成途徑，累積產生該聚酯類高分子，以儲存過剩的碳源，待環境能源缺乏時，再分解利用該聚酯類高分子，作為營養源。已知可合成該聚酯類高分子之微生物如下所列：Ralstonia eutropha、Bacillus megaterium、Acinetobacter、Clostridium、Micrococcus、Sphaerotilus、Actinomycetes、Derxia、Microcoleus、Spirillum、Alcaligenes、Ectothiorhodospira、Microcystis、Spirulina、Aphanothace、Escherichia、Moraxella、Streptomyces、Aquaspirillum、Ferrobacillus、Mycoplana、Syntrophomonas、Azospirillum、Gamphosphaeria、Nitrobacter、Thiobacillus、Azotobacter、Haemophilus、Nitrococcus、Thiocapsa、Halobacterium、Nocardia、Thiocystis、Beggiatoa、Hyphomicrobium、Oceanospirillum、Thiodictyon、Beijerinckia、Lamprocystis、Paracoccus、Thiopedia、Caulobacter、Lampropedia、Photobacterium、Thiosphaera、Chlorofrexeus、Leptothrix、Pseudomonas、Vibrio、Chlorogloea、Methylobacterium、Rhizobium、Xanthobacter、Chromatium、Methylocystis、Rhodobacter、Zoogloea、Chromobacterium、Methylosinus、Rhodospirillum 等。

由第1圖所示，係上述微生物合成聚酯類高分子之示意圖，該微生物係將由一醣類經醣解作用(Glyscosis)而產生之乙醯輔助酶A[(a)Acetyl-CoA]聚合成一乙醯乙醯輔酶A[(b)Acetoacetyl-CoA]，再由一還原酵素1(reductase)作用將該乙醯乙醯輔助酶A(b)還原成一羥基烷酯類[(c)HAs，hydroxyalkanoates]；該微生物具有一聚合酵素2(synthase)，係該微生物可合成聚酯類高分子之作用關鍵，該聚合酵素2係以該羥基烷酯類之酯鍵為主要作用基質，催化使該羥基烷酯類聚合而形成一聚酯類高分子[polyester(d)]。依照該微生物種類之不同，所帶有之聚合酵素之分子結構也有所差異，因此，合成的聚酯類高分子也不同；舉例說明之，存在於Ralstonia eutropha 之聚合酵素係合成短鏈的聚羥基烷酯類[PHAs，(polyhydroxyalkanoates)]，而存在於Pseudomonas 之聚合酵素則可催化組成中鏈的聚羥基烷酯類。

另外，該微生物可利用不同的碳源而合成多種性質相異之聚酯類高分子，其中，該聚羥基烷酯類係目前商業應用較為廣泛的聚酯類高分子。如下方圖例所示，該聚羥基烷酯類係以該羥基烷酯類(HAs)為單元體而聚合，其中，n可以為1、2、3....，而側鏈(R)則可為飽和或、不飽和、直鏈或含側鏈取代基之烷類，舉例說明之，若該n=1，而側鏈(R)為methyl group，則係為一聚3-羥基鏈烷酸酯(PHB，poly(3-hydroxybutyrate)。

該聚羥基烷酯類可取代傳統的石化塑膠，為目前改善環保問題的主要策略之一，同時，該聚羥基烷酯類因具有良好的人體吸收性和分解性，可開發具有安全性的生醫材料或醫療用品，如替代性的生物組織、植入性的醫用材料等。

承上所述，由微生物合成聚酯類高分子的方式，不僅較符合自然法則，同時，所生產的聚羥基烷酯類可以取代過去造成廢棄物污染的各種石化塑料，具有促進生態保護及永續發展的意義；然而，目前利用微生物合成生物高分子的方式若應用於產業量產上需要較高的成本，並且，該生物高分子也可能在產物純化的過程上而裂解變質，因此，需要更進一步的研發技術；另外，該微生物由本身聚合酵素及提供碳源之差異，可以合成多種性質不一之聚酯類高分子，該不同性質之聚酯類高分子可用作不同之產品開發，如生物塑料、生物醫藥及生物農藥等，因此，需要廣為開發可以合成該生物高分子之微生物，以創造更高的科技價值，然而，在台灣卻少有相關微生物之篩選與開發，而在利用該微生物合成生物高分子，以製備生醫材料、生物塑料、組織工程材料與微膠囊之應用上，無法與歐美國家或日本、韓國互相抗衡。

本發明係針對上述問題進行改良，提供一種Bacillus 菌屬菌株，係由一活性污泥中篩選一微生物，該微生物係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC980012。

本發明次一目的係提供一種Bacillus 菌屬菌株用於合成聚酯類高分子之方法，係將由該活性污泥中篩選之微生物用於醱酵合成一聚酯類高分子，以應用於生物塑料、生醫材料、組織工程原料及微膠囊的製備。

為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段包含有：一種Bacillus 菌屬菌株，其係由一活性污泥中所篩選獲得，寄存編號為BCRC980012。

以及一種Bacillus 菌屬菌株用於合成聚酯類高分子之方法，係將該寄存編號為BCRC980012之Bacillus 菌屬菌株經發酵利用一碳源，合成一聚酯類高分子，該聚酯類高分子係用於環境保護、生醫材料、組織工程及微膠囊產業。

為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：本發明之一種Bacillus 菌屬菌株，係自一活性污泥中篩選一微生物分離株，寄存編號為BCRC980012，經財團法人食品科學研究所鑑定屬Bacillus cereus group，該微生物分離株可以將一碳源，經醱酵作用合成一聚酯化合物，用以生醫材料、生物塑料及微膠囊等產品之製備與開發。請參照第2圖所示，係本發明一種Bacillus 菌屬菌株的篩選及醱酵流程，係包含一分離步驟S1，一鑑定步驟S2、 一選殖步驟S3、一醱酵培養步驟S4及一萃取步驟S5。

該分離步驟S1 係採樣於一活性污泥，該活性污泥係一般工業上用以處理廢棄污水或廢棄物之介質，可將一般工廠所排放之污水或廢棄物所含之毒性高分子分解為普遍存在於自然界之小分子(如碳或氫)，該活性污泥應具有微生物活性，可為一良好的菌株篩選來源；本發明係將該活性污泥以一塗布法接種於一高分子培養基進行培養，該活性污泥中擬帶有至少一微生物係可分解利用該高分子培養基所含之高分子，該微生物可以存活於該高分子培養基，分解並利用該高分子培養基所含之高分子而形成數溶菌斑，挑選該溶菌斑以一劃線法轉而接種於一普通培養基進行培養，使該微生物可增殖於該普通培養基，將所增殖之該微生物再次接種於該高分子培養基培養，挑選所形成之溶菌斑，以進行尼羅河藍染色(Nile Blue A)分析試驗。

本實施例係由岡山地區的工業污水處理場所採樣之活性污泥，接種於本發明之高分子培養基，該高分子培養基係含有0.5~1.5克/單位體積(100ml)之氮源、0.5克/單位體積(100ml)之食鹽、1毫克/單位體積(100ml)之高分子及2克/單位體積(100ml)之瓊脂，詳細配方如第1表所示，將該高分子培養基於30℃之培養箱，靜置培養24小時，由此，可以挑選該高分子培養基上所形成之溶菌斑，篩選出該活性污泥中可以利用該高分子之微生物；將所篩選之微生物(溶菌斑)轉接於該普通培養基(詳細配方如下方第2表所示；同樣於30℃，培養24小時)，相較於該高分子培養基，其配方成分相近，僅未含該高分子，係使所篩選之微生物可以增殖培養於該普通培養基；將所增殖培養之微生物再次接種於該高分子培養基，以確認所篩選且增殖之微生物確實可以分解利用該高分子而在該高分子培養基上形成溶菌斑，挑出可形成溶菌斑之數微生物分離株以供尼羅河藍染色(Nile Blue A)分析試驗所用。

該尼羅河染色分析試驗，多用於活細胞之染色分析，係採用一親脂性染劑-尼羅河藍(Nile Blue A)，針對真核生物或原核生物所帶有之聚羥基烷酯(polyhydroxybutyrate，PHB)顆粒進行染色，再由螢光顯微鏡觀察，帶有PHB之真核生物或原核生物，則可在特定波長之螢光下激發產生螢光。請參照第3圖所示，本實施例係將所挑出之該微生物分離株置於一尼羅河藍(Nile Blue)染劑，於55℃染色10分鐘，之後以RO水清洗，並且浸泡於一醋酸溶液(重量百分比濃度為8%)1分鐘，以將多餘的染劑除去，經抽氣陰亁處理，以一倒立顯微鏡進行螢光觀察，而帶有PHB之該微生物分離株可於460nm的藍光激發下產生橘色螢光，選出帶有PHB之該微生物分離株，係為本發明之分離菌株。

請參照第4圖及附件一所示，該鑑定步驟S2 ，係將本發明所篩選之分離菌株委由台灣地區財團法人食品工業發展研究所(簡稱食科所)進行菌名鑑定；食科所之鑑定結果顯示，本發明之分離菌株係為一革蘭氏陽性桿菌(如第4圖)，可產生內生孢子，具有觸酶、氧化酶，不具有運動性，可於好氧或厭氧環境下生長。另外，該分離菌株之16S rDNA序列(請參考序列表)經序列比對後與Bacillus cereus 、Bacillus thuringienesis、Bacillus weihenstrphanensis、Bacillus mycoides、Bacillus pseudomycoides 及Bacillus anthracis 之16S rDNA序列相似度達98%以上(如附件一所示)，因此，據以判定本發明之分離菌株為Bacillus cereus group桿菌，即本發明之Bacillus 菌株，其寄存編號BCRC980012。

該選殖步驟S3 係將本發明之Bacillus 菌株接種於一氮源培養液進行放大培養；該氮源培養液含有大量氮源卻不含高分子，該Bacillus 菌株可於該氮源培養液中以指數倍率增殖，於一定時間(較佳係24小時)後收集所培養之菌液，將該培養菌液分別不同比例之甘油，以長久保存於一低溫環境。本實施例中，該氮源培養液係含有0.5~2.5克/單位體積(100ml)之氮源及0.5克/單位體積(100ml)之硫酸銨，詳細配方如下方第3表所示，將本發明之Bacillus 菌株於該氮源培養液增殖培養24小時(30℃)，為本發明之Bacillus 菌液，再以1：1或4：1之比例該Bacillus 菌液及甘油，分裝保存於4℃或-80℃之恆溫系統。

該醱酵培養步驟S4 係使所增殖之Bacillus 菌株於一碳源環境中行醱酵作用，生成醱酵產物。將分裝保存於4℃之Bacillus 菌液，均勻混合該氮源培養液，再於30℃的環境下震盪培養48小時，使該Bacillus 菌液中所含的Bacillus 菌株可以於該氮源培養液中大量增殖；將培養完成之Bacillus 菌液經一離心步驟將所增殖之Bacillus 菌株沉澱，移至一碳源培養液進行培養，該碳源培養液含有大量碳源卻不含氮源，可以限制該Bacillus 菌株之增殖而於該碳源培養液中行醱酵作用；該碳源培養液可另添加營養源及微量元素，以維持該Bacillus 菌株之健康狀態，使該Bacillus 菌株之醱酵作用可以順利進行。

本實施例中，該Bacillus 菌液係於該氮源培養液中，以180 rpm之轉速震盪培養，使該Bacillus 菌株可以大量增殖；所增殖之Bacillus 菌株以低溫(4℃)、低轉速(4000 rpm)之條件離心20分鐘，將所增殖之Bacillus 菌株沉澱，再改以該碳源培養液，同樣於30℃，180 rpm之轉速醱酵培養72小時；該氮源培養液係含有0.1~1.61公克之營養源、1公克之碳源及少量的微量元素，詳細配方請參閱第4表：

該萃取步驟S5 係將本發明Bacillus 菌株之醱酵產物由該Bacillus 菌體內萃取出。將醱酵培養之Bacillus 菌液經一沉澱處理，除去多餘的碳源培養液，加入酒精後再次沉澱，以藉由該酒精之揮發性除去殘餘的碳源培養液，得一沉澱產物，於50℃烘乾該沉澱產物，將所烘乾之沉澱產物磨碎，加入氯仿(chloroform)並加熱，以溶出所含之醱酵產物，將可溶出醱酵產物之氯仿倒入正己烷(Hexane)，使該醱酵產物可由沉澱而萃取出來，該氯仿及正己烷皆含有揮發性，可待其完全揮發而得到本發明之醱酵產物，該醱酵產物之回收率可由一公式計算。

本實施例中，係將該Bacillus 菌株於該醱酵培養步驟S4 所醱酵培養之菌液置於4℃以4000rpm離心20分鐘，使該菌液所含之Bacillus 菌體可以沉澱，保留該Bacillus 菌體與酒精均勻混合，再置於4℃以4000rpm離心20分鐘，放入一烘箱烘乾(50℃)使酒精揮發完全。將所烘乾之沉澱產物磨碎，加入氯仿均勻，以60~70℃隔水加熱0.5~1小時溶出醱酵產物，該醱酵產物係為聚3-羥基丁烷酸酯(PHB，poly(3-hydroxybutyrate)再倒入正己烷中沉澱進而萃取出該聚3-羥基丁烷酸酯。

本實施例係將所萃取出聚3-羥基丁烷酸酯之重量(Wa)與該烘乾之沉澱產物的重量(Wb)相除，再乘以百分比(100%)，即可得該聚3-羥基丁烷酸酯之回收率(Y)，其計算公式為：Y(wt%)=(Wa/Wb)×100%

由上所述，本發明之醱酵產物經進一步分析試驗(如核磁共振分析NMR)證實係一生物可分解性高分子-聚3-羥基丁烷酸酯(PHB，poly(3-hydroxybutyrate)，該聚3-羥基丁烷酸酯可於自然界中自行分解成二氧化碳和水，而再循環到環境中供其他生物使用；因此，由本發明之Bacillus 菌株，可以利用碳源，經醱酵合成一聚酯類高分子-聚3-羥基丁烷酸酯，該聚酯類高分子具有生物可分解性、生物可利用性及生物相容性，可應用於生醫材料及生物塑料的製備，開發組織工程所使用之材料，或是可用於農業或醫藥產業之微膠囊原料。

本發明一種Bacillus 菌屬菌株，係由活性污泥中篩選一寄存編號為BCRC980012之微生物，該微生物可以利用碳源，醱酵合成一聚酯類高分子；該聚酯類高分子具有生物相容性、利用性及分解性等生物特性，可應用於生醫材料、生物塑料的製備或作為組織工程、微膠囊材料之開發，為本發明之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

a．．．乙醯輔助酶A

b．．．乙醯乙醯輔助酶A

c．．．羥基烷酯類

d．．．聚酯類高分子

1．．．還原酵素

2．．．聚合酵素

第1圖：微生物合成聚酯類高分子之合成示意圖。

第2圖：本發明一種Bacillus 菌屬菌株之篩選及醱酵流程。

第3圖：本發明一種Bacillus 菌屬菌株之染色結果。

第4圖：本發明一種Bacillus 菌屬菌株之顯微照片。

附件一：本發明一種Bacillus 菌屬菌株之鑑定分析結果。

Claims (2)

1. 一種Bacillus 菌屬菌株用於合成聚酯類高分子之方法，係將寄存編號為BCRC980012之Bacillus 菌屬菌株以一包含酵母萃取液、蛋白腖及麥芽萃取液之氮源培養液培養後，再以含有酪酸(butyric acid)的碳源培養液培養，該菌株發酵利用該碳源培養液之酪酸而合成一聚酯類高分子，該聚酯類高分子係聚3-羥基鏈烷酸酯。
2. 依申請專利範圍第1項所述之一種Bacillus 菌屬菌株用於合成聚酯類高分子之方法，其中，該碳源培養液係包含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈣、檸檬酸及酪酸。