TWI363189B - Method and system for locating and focusing on fiducial marks on specimen slides - Google Patents

Description

1363189 i 1 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物標本之成像與分析，更特定言之，係 關於標本片上基準標記之定位及對焦。 【先前技術】 醫學專業人貝及細胞學技士常常在標本載體（例如片）上 製備生物払本，並檢視標本以分析病人是否具有或可能具 有一特定醫學狀況或疾病。例如，已熟知檢查細胞標本以 作為巴氏（Pap)塗抹測試及其他癌偵測測試之部分來偵測惡 性或惡變則之細胞。為了方便此檢視程序，自動系統使技 術人員之注意力集中於最相關之細胞或細胞群組，而丟棄 較不相關之細胞不作進一步檢視。過去有效使用的一熟知 自動成像系統係可從Cytyc公司（25〇 CampUs Drive， Marlborough，Massachusetts 01752)獲得之ThinPrep成像系 統。 圖1 一般解說一熟知生物篩檢系統丨〇，其係經組態用於 將位於載玻片14(如圖2所示）上之生物標本12呈現給技術人 員（例如細胞學技士），其接著可檢視位於生物標本12中之 所關注物體（001)。〇01係配置於覆蓋片14之部分的許多所 關注欄區（F0I)内’以便細胞學技士之注意力隨後可集中 於該等FOI内之〇〇〗上’而非集中於不相關之片區域上。 系統10可用於細胞學子宮頸或陰道細胞物質（例如通常在 Pap塗抹片上找到者）之呈現。在此情況下，該等〇〇1採用 個別細胞與細胞叢集之形式，對該等細胞與細胞叢集進行 I27632.doc 1363189 檢視以檢查是否可能存在異常狀況，例如惡性腫瘤或癌症 前兆。 通常將生物標本12作為薄細胞層放置於片14上。較佳將 —蓋片（圖1未顯示）黏附於標本12以將標本12固定於片丨4上 之合適位置處。可採用任何合適染色劑（例如巴氏染色劑） 來為標本12染色。

—成像台18係經組態用以使片14成像，片14通常係隨其 他片一起包含於一匣（圖1未顯示）中。成像程序期間，以串 列方式從個別匣取出片，使其成像並返回至匣。 —— 剛做视ζυ久一更動平

28。相機24透過顯微鏡26來拍攝片14之放大影像。相機 24可為各種習之相機之任一相機，例如可產生足夠解析度 之數位輸出以允許已拍攝影像之處理的相機。合適解析产 :為640><彻_素。各像素可視其光學透射比而轉換: 一八位元值（0至255)。「咖咖」丨「〇」之值係針對穿 過像素之最小數量之光所指派之值，而「⑴uui」或 255之值係針對穿過像素之最大數量之光所指派之 ::因此，「〇」值指示黑暗值(例如，基準標記之像辛)， ⑸」值指示明亮值（例如，空置像素）。 片14係黏著於電動平喜 域掃圹〜、， 臺28(其相對於顯微鏡26之觀看區 - ~描片14)上，而相機24 影像》藉由相機24拍攝^12之各區域上拍攝 X ^像時，電動平臺28會ϋ縱影像之 χ-y座標。可將若干編碼器 疋峨〜像之 別馬達以便追蹤成# M ”.、不）耦合至電動平臺28之個 便切成像期心Χ心方向行進之淨距離。 !27632^〇〇 1363189 參考圖2，相對於附加至片14之基準標記16來測量平臺 28所追蹤之X_y座標。基準標記16可為一矩形塗料補片； 在此情況下，該標記之一角落可視為標記之位置。檢視台 22亦使用此等基準標記16以確保檢視程序期間^之xy . 座標可：成像程序期間所獲得的片14之”座標相關聯。 . 更特定言之，各檢視台20包括一顯微鏡38與一電動平臺 4〇。片14(影像處理之後）係黏著於電動平臺4〇上，電動平 φ 臺4〇基於轉接計畫以及從記憶體36所獲得的！701之x_y座標 之變換相對於顯微鏡38之觀看區域來移動片14。使用附加 至片Μ(圖1所示）之基準標記16來將相對於成像台以之” 座標系統所獲得之此等x_y座標變換為檢視台2〇之座標 系統。以此方式，使檢視程序期間片14之x_y座標與成像 程序期間片14之X.y座標相關聯。電動平臺4〇接著依據⑽ 之已良換x-y座標移動’如轉接計畫所示。 雖然成像與檢視程序期間所使用之熟知基準標記與座標 • 系統在過去已得以有效使用，但可對其加以改善。特定言 之，存在氣泡時難以定位基準標記且存在灰塵與污屑時難 以對焦基準標記，如參考圖3至8所示。 圖3係一具有三個基準標記16之標本片14之俯視圖。在 標本12上方放置一蓋片5〇。圖4係圖3所示片14在蓋片％上 具有灰塵或污屑（一般而言灰塵52)時之俯視圖。圖4亦解說 蓋片50下方之氣泡54。圖5係圖4之側視圖，其進一步解說 盖片50頂部上之灰塵52以及片14之頂部與蓋片⑼之底部間 之氣泡54 » 127632.doc

* I 丄 參考圖6,將-蓋片50放置於片上時，蓋片5〇與 之黏著媒介60中可能會截獲一或多個氣泡…氣泡54或: 胞以與基準標記16重疊時’基準標記柯能看似為不同 形狀且其真輪廓可能難以定位。 此外，假定定位-基準標記16，則蓋片5〇頂部上之 與污肩52可能造成對焦誤差。-般藉由上下對焦來進行標 ^之自動對焦直到影像中之物體位於焦點上。參考圖7,

蓋片頂。卩上之灰塵52或其他污屑（例如指印）可造成自動 對焦系統或演算法對焦於灰塵52上，從而導致一錯誤平面 72 ’而非疋位與片上之樣本12(其係與基準標記Μ共面）相 對應之正確焦面70。 圖8之虛線80顯示用於在不同焦點高度處所獲取的一單 一顯微鏡攔區之一影像集的對焦或銳度I。該㈣區包含一 基準標記16且亦包含灰塵52βΓχ」軸表示離第一或真焦面 70之垂直距離（以微米計）。第二錯誤焦面係比第一焦面 70问約11〇微米；錯誤平面對應於灰塵52，其係位於蓋片 5〇(其厚度為約100微米）之頂部上。ry」軸表示影像之 Brenner分數之對數。Brenner分數係一熟知的量化影像銳 度之方法’且係各像素與其左邊相鄰兩像素之灰階值間之 差之平方和，其中將小於某一限定值之差從該和中排除以 降低影像雜訊之效應。較高「y」軸值指示影像更好地對 焦且與較低「y」軸值相比更銳利或更清晰。在所示範例 中，尋求最大化Brenner分數之自動對焦系統或演算法會 選擇錯誤焦面72’因為其分數高於真焦面7〇β 127632.doc 1363189 * t 因此，成像顯微鏡26可能對焦於錯誤焦面72十之灰塵” 上，而非真焦面70處之基準標記16上。若成像台18針對細 胞掃描此錯誤焦面72,而非真焦面7Q，則所獲取的樣本Η 之許多影像將離焦且成像軟體將遺漏所關注物體。 因此’需要具有在蓋片下面存在氣泡或其他污屬時可更 加有效地定位標本片上之基準標記且在蓋片頂部上存在灰 塵與污屑時可對焦於已定位基準標記之方法及系統。 【發明内容】

在-具體實施财，提供—種在—標本片之—影像内定 位-基準標記之-角落之方法’該影像具有複數個像素， 該方法包括選擇該複數個影像像素之—像素，該被選定像 素基於自該被選定像素延伸之線界定一區域基於該已界 定區域内之空置像素之一數目與該已界定區域之一或多個 尺度之-比來選擇該被選；^象素，該比滿限定值，該 方法進-步包括使用該被選定像素決定該基準標記之該角 落之-位置。#由-非限制性範例’該被選定像素與滿足 該限定值之其他影像像素相t匕可界定最大區域。藉由另一 非限制性範例，該等邊界線可為筆直的，且可從該被選定 像素延伸錢影像之-邊緣，而且各像素所界定之一區域 係-正方形或-矩形。藉由另—非限制性範例，該比可為 -（該被選定像素所界定之該區域内之空置像素之數目）對 (該被選定像素所界定之該區域之一或多個尺度）之比。 在另-具體實施例中，提供-種在—標本片之一影像内 定位-基準標記之-角落之方法，該影像具有複數個像 127632.doc 你該方法包括.將複數個像素識別為候選像素，各候選 像素係基於自_選像素延伸之線所界定卜限制内 之空置像素之一數目相蚪认斗 m 子於該已界定區域之一或多個尺户 進行識別；選擇—候選像素’其巾自該被選定像素延伸: 線與自其他候選像素延伸之線相比界定一最大限制區域； 及基於該被選;t候選像素決^該基準標記之該角落之_位 。、藉由非限制性範例，與該被選定像素相對應之該限制 區域與其他候選像素所界定之限制區域相比可包含最大數 目之黑暗像素。同樣地，藉由其他非限制性範例，該等線 可為筆直的，可從該被敎候選像素延伸至該影像之—邊 緣’且各候選像素所#定之限制區域係一框或一矩形。 可基於滿足一限定值之一比來識別該各候選像素，該比 包:自該被選定候選像素延伸之線所界定之該限制區域内 之空置像素之一數目對該限制區域之一或多個尺度之— 比。例如，可基於該限制區域内之空置像素之該數目對該 限制區域之一或多個尺度的一低於一限定值之比來選擇各 候選像素’且該比可為該限制區域内之空置像素之該數目 對该限制區域之周長的一比，例如該限制區域内之空置像 素之該數目對該限制區域之半周長的一比。 可視需要在存在一與該基準標記重叠之氣泡或污屑時執 行該方法，其中若一像素之一灰階值大於128，則可將該 像素視為一空置像素。此外，可視需要按多個灰階值限定 值來執行該方法，且其可進一步包括基於一第一限制區域 與一第一限制區域間之一差計算一焦點分數，例如其中該 127632.doc •10· 1J63189 t 差係該第一與第二限制區域 埤之角洛間之歐幾襄德距離 (Euclidean distance) ° 可視需要按多個灰階值限定值來執行該方法，其中使用 一第一空置像素限定值識別—坌rm r- ^ J第一限制區域以識別該基準 標記之該角落之一第一位置， 1直且使用一第二空置像素限定 值識別-第二限制區域以識別該基準標記之該角落之一第 二位置。該方法可視需要進—步包括基於該第一與第二限

制區域間之-距離計算一焦點分數，及基於該計算之焦點 分數自動對焦-影像裝置，例如，其中該距離係該第一與 第二限制區域之角落間之歐幾裏德距離。 【實施方式】 具體實施例在存在氣泡、灰塵及污屑時有利地定位及對 焦基準標記。具體實施例藉由為基準標記之角落之影像適 配-㈣，例如正方形、矩形、框或另一形狀(一般而 言’「限制框」或「限制區域」或「區域」），來達成此等 優點。可使用各種形狀之限制區域來實施具體實施例。依 據-具體實施例’ n由兩直線界定—邊界區域。該等線可 成各種角度。因此，邊界區域或框或矩形之參考係可利用 之某些邊界區域之範例。限制框之邊界使限制框之面積最 大化同時約束該限制框内之未標記或空置像素之數目。可 基於一灰階值截止將一影像之一像素界定為「黑暗」基準 標記像素或「明亮」空置像素。可藉由比較使用不同灰階 值截止所找到之限制區域來決定焦點設定或調整。 圖9解說在一影像之左上角落上延伸的一基準標記16之 127632.doc 1363189 -角落之影像。可將影像之左上角落指定為(〇, 〇)位置， 且可將基準標記16之右下角落指定為（x，y)位置。（χ，乂)位 置左上方之像素可視為基準標記16之部分。若基準標記16 之不同部分係可見的’則可利用其他座標指派。因此，圖 9解說基準標記16之右下角落為可見的且座標系統係基於 基準標記16之右下角落的一範例。

在所示範例中…水平邊界線94與_垂直邊界線％自一 點或像素!>延伸以界定一限制框96β此說明書指的係在自 點或像素延伸之線94與95界^限龍96而且藉由邊界線％ 與95本身界定限制框96之意義上藉由點或像素界定限制 框。在所示具體實施例中，邊界線94與95係筆直的且具有 「「〜與「y」尺度及2* (x+y)之周長。在所示範例令， 「χ」與厂y」尺度係相同的，不過在其他影像中，其可能 凡檟丞準標記16之程序 坩％、任 ^ n月π ，丞平標 “之邊緣92具有顯微鏡標度之不規則性。例如，如圖9 =示，基準標記16之邊緣92可具有非線性或波狀形狀。作 為該不規則邊緣形狀之結果，限制框96可包含某些空 在排除某些基準標記像素97，或兩者。黑暗像素Μ可 為基準標㈣之像素，㈣亮像素98可為空置像素。例 ’明免像素98可為超出基準標記16之邊緣92的空置像素 1 表不基準標記16之塗料中之間隙的像素。基於定位基準 Π6之目—的，-不包含空置像素97之限制框96將會太 小’一包含每-基準標記像素97之限制框96將會太大。因 127632.doc •12- 1^63189 此，應允許限制框96包含某些空置像素98,但不包含太多 空置像素9 8。 圖1〇Α與10Β解說在不同片位置處所獲取的相同基準標 記16之兩影像可能看上去怎麼樣。在㈣像中相對於標記 16之相同位置處選擇圖1〇Α之點ρι與圖ι〇β之點ρ2。點ρι ” P2藉由自個別點以與^延伸至影像邊緣之個別邊界線94 與9 5來界定個別限制矩形9 6。

圖所示二置像素98係標記16中從基準標記16之邊緣 92延伸至基準標記16中之不同深度之凹口。假定空置像素 98之凹口之深度係關於某一平均值與方差之隨機函數，則 =對最適_框96之預期空置像素98之數目係等於該平均 深度乘影像内可見之邊緣92之長度。

厂在所示範例中，圖1〇A之限制框96之邊緣之長度(即， 厂X」與「y」尺度之和）係圊1〇B之限制框96之邊緣之長度 (p x」與「y」尺度之和)的約兩倍。圖1〇A之限制框％ 與圖1〇B之框相比包含兩倍多的空置像素98。此解說一給 定限制框_之空置像素98之數目係與限龍96之邊緣之 長度(即’「X」與「y」尺度之和)成正比。 圖UA至D進—步解說此正比性。基準標記邊緣％中之 空置像㈣之凹σ在邊緣92之某些部分中可比其㈣分中 之凹…不過，凹口或像素98具有某一平均深度。可藉 由沿框96之周長分配空置區 _素或區域98直到空置配置限制框96内之 處。 巧置£域98均勻分配在此平均深度 127632.doc -13- 1363189 例如，三角形空置區段111可移至沿邊界線94與95延伸 之矩形區域内之對應區段112，且三角形區段112係處在某 一深度處。可針對空置像素98之其他凹口重複此程序直到 空置像素98沿基準標記之一邊緣分配在相同深度處。圖 11B顯示此程序之結果。可以類似方式重新組織圖11C所示 另一影像中之空置空間98，其結果係顯示在圖丨1D中。因 此，圖11A至D進一步解說，限制框96内之空置區域98之 面積等於空置區域98之平均深度乘以框96之邊緣之長度 (「X」與「y」尺度之和）。 本發明之具體實施例在存在氣泡54及其他與基準標記j 6 重疊之污屑時有利地利用此正比例變化（空置像素98之數 目相對於針對給定像素或點p藉由邊界線94與95所界定之 限制框96之尺度的變化）關係來更有效地定位基準標記 16本發明之具體實施例藉由透過選擇一點或像素p將基 準標記16定位於標本片14上來達成此等優點，該定位：^ 維持藉由像素P所界定之限制框96内之空置像素98之一可 接受數目（例如）低於一隨限制框96之尺度而變化之臨限數 目，及2.使限制框96之面積或大小最大化，其進而也可使 限制框96内之黑暗像素97之數目最大化。 更明確言之，參考圖12與13，依據一具體實施例，一定 位基準標記1 6之方法12〇包括在步驟n〇s中將一影像像素 130群組或子集識別為候選像素132。候選像素132係界定 區域或限制框96(基於自該像素延伸之邊界線94與95)之 像素’該限制框96包括針對該限制框96之尺度的可接受數 127632.doc •14- 1363189 * » 置像素98。依據—具體實施例，候選像素132係界 疋又J框96之像素，该限制框96包含與限制框％之周長成 正比或相對於限制框96之周具沾-τ拉二知 周長的可接党數目之空置像素 y 〇 ° 候選像素132可以為或可以尤炎6»处m 勹飞了以不為取終用以定位基準標記 ^素。視影像而可以存在―、若干或許多候選像 素。例如，-約兩百萬個像素之普通影像可包含約五

十萬個候選像素心因此’基於解說目的提供圖13以一 般顯不將-影像像素13〇子集識別為候選像素132。此外， 一為候ϋ像素132之像素可視（例如）心區分基準桿記或里 暗像素97與空置像素98之亮度值或截止而變化。 ”’、 已識別一候選像素132集或群組後，在步驟m中，選擇 一候選像素m以定位基準標記16之角落。依據_且體實 施例，該被選定候選像素134係界定最大限制框96(例如， 具有最大面積或最大周長之限制框96)之候選像素。

、在本發明之一具體實施例中，可執行步驟121與以便 首先識別所有候選像素132，然後選擇所有已識別候選像 素132之一候選像素134。在一替代具體實施例中，可藉由 逐個產生候選像素並僅將最好候選像素134儲存為目^被 選定候選像素134來組合步驟121與122。若一新候選像素 界定更大限制框96，則可以該新候選像素取代已儲存候選 像素134 〇 ' 參考圖14,依據本發明之一具體實施例之一方法14〇包 括在步驟141中選擇影像130之一像素。在步驟142中，決 127632.doc -15- 1363189 « 定自被選定像素延伸之邊界線94與95所界定之區域或邊界 框96之尺度。該尺度可為該限制框之周長或該周長之一部 分。例如，同樣參考圖9，在所示具體實施例中，一邊界 - 線94係長度為「χ」之水平線而另一邊界線95係長度為 「yj之垂直邊界線因此限制框區域之周長為2 * (x+y)。 • 在步驟143中，決定已界定限制框96内所包含之空置像素 98之數目或面積。步驟143可涉及（例如）計數限制框％内之 • 空置像素98之數目及/或計算空置像素98之面積。 在步驟144中，決定是否滿足一臨限空置像素98之數目 或空置面積。依據本發明之一具體實施例，步驟144涉及 計算-比並將該比與-限定值作比較。在—具體實施例 中，該比係（空置像素數）/(區域之周長），例如（空置像素 數）/(2(x+y))。因此’步驟144涉及決定該比值係大於或小 — 於某一臨限值。此等效於決定（空置像素數）/(x+y)是否大 於-兩倍高之臨限值。在步驟145中，若滿足該限定值， 籲 4如右（工置像素數）/(x+y)之值小於某一臨限值，則選擇 或識別該像素為候選像素132。若不滿足該限定值，則在 步驟146中，不選擇該像素為候選像素132並將其丟棄。 曰在步驟147中’決^是否應處理影像l3Q之額外像素。若 疋則可針對各額外像素重複步驟141至147。若否，且已 處理所有影像像素（或所有必需影像像素），則在步驟 中選擇該已識別候選像素132群組或集之一候選像素 該被選定候選像素134係用以定位基準標記16之角 洛依據一具體實施例，該被選定候選像素134係界定- 127632.doc •16· 1363189 具有最大面積之限制框96的候選像素。 因此，本發明之具體實施例可利用一比來識別在邊界線 94與95所界定之限制框96之大小上界定一約束之候選像素 132,以便該限制框96内所包含之空置像素98之數目應不 大於限制框96之周長（或其他尺度）之—倍數。被選定Ζ落 位置處之點應界定經受此「空置像素」約束的限制框之最 大面積。依據一具體實施例，此可藉由選擇使〜即，限 制矩形96之大小或面積）最大化而同時空置像素％之數目 小於某-值d*(x+y)(其中d係預期平均凹口深度 置來進行。 ，立 因此’針對影像之各像素，計數或計算—第—限制框中 之空置像素98之數目’計數或計算一第二限制框中 像素98之數目等等，以便可計算空置像素數相對於限制框 之大小或尺度之比以決^ —像素是否為候選像素⑴。— 決定空置像素98之數目之方法係手動計數從影像中之 二’ 點或料向上及向左延伸之邊界線界定之 一限制框96内之空置像素98之數目。此可針對各像素獨立 :行依與像素數目之平方成正比之時間量。或 -框9: !明之一具體實施例，某一點或像素所界定之 定之 ^置像素98之數目可基於一不同點或像素所界 得處理置像素98之計數來決定;㈣ 象責集所必需之時間量與像素數目(而非平 成正比，導致更有效分析。 十方數） 圖15至19解說本發明之一具體實施例，其中基於計算比 127632.doc • 17. 1363189 (空置像素數）/(x+y)之目的之空置像素98之數目係用以識 別候選像素132。圖15至1 9顯示一範例性影像，其包含一 像素格柵。使與基準標記16塗料相對應之像素變暗。當 _ (例如）未為一特定明亮像素98上塗料時，該明亮像素98可 = 為黑暗像素97所圍繞。在所示格柵中，對該等像素應用一 χ-y座標系統使得（0, 0)係處於影像130之左上角落處。 參考圖15，藉由（Xl，yl)識別一第一黑暗像素97之右下 Φ 角落處之第一點P1。自P1向上及向左延伸之水平與垂直邊 界線94(1)與95(1)所界定之限制區域96包括一像素，其係 黑暗像素97。P1左上方所界定之區域96中無空置像素98。 同樣地’’藉由（x2, y2)識別一第二點P2。自p2向上及向左 延伸之水平與垂直邊界線94(2)與95(2)所界定之限制區域 96包括兩像素…像素係先前參考點ρι所論述之黑暗像素 97。另一像素係選擇下一點？2時引入區域％中之「下一」 像素。該下一像素亦為一黑暗像素97。因此，P2左上謂 _ 界定之區域96中無空署/务_^_00 .. m mm此外’藉由（χ3, y3)識別 一第三點P3。P3所X令+ u τ 所界疋之水平與垂直邊界線94( 9 所界定之限制區域％包括三像素，其包括先、 、素。第三像素係選擇 〃 月1里之兩像 卜點Ρ3時引入區域96中 「 一 ,.^ 素亦為—黑暗像素97 »因此，？3左 上方所界疋之區域96中無空置像素。 如圖16至18所+ , ’、 可採用—數字（其表示一特定點尤 方之空置像素之數目} 心點左上 去诩☆呌筲* 來^不格拇单元。雖然可針對各偾 素獨立计异空置像素舛 Τ对各像 D數’但S，依據-具體實施例，一 I27632.doc 1363189 什數空置像素數目之方法伟俏 你便用先前空置像素之計數來進 行’其可明顯快於獨立計數，尤 尤其考慮到一影像可能具有 (例如）兩百萬個像素。 例如，參考圖16,可為[像素指派「〇」值以表㈣ 左上方無Μ像素98。同樣地，可為第二像素指派「〇」 值^表示Ρ2左上方無空置像素98，且可為第三像素指派 0」以表示Ρ3左上方盔空晉德各 …、Λ置像素9^此程序可針對該列 中之額外像素繼續。 _解說-鮮6，其界定自點p6延伸之邊界線94⑹與 (6)所界定之區域96。作為— 之選擇結果，區域 咐含五個黑暗像素97(其各指派有—「〇」值）及一額外或 下—像素。此像素與先前論述之像素相反係一空置 98。因此，點Ρ6左上方存在一 *晉 ” I ι置像素98’且可為此像素 曰/ 1」值。同樣地，對於Ρ7，ό phh 6. X金* 自Ρ7延伸之邊界線所 界疋之區域封閉六個先前分析 刀何芡黑暗像素（其中的五個係 曰/有一 〇」值；其中的一個传；古 「1 個係扣派有一「1」值）及一 新或下一像素。在此情況下， 一 97。因此，自 素糸一黑暗像素 因此’自點P7延伸之邊界線所界定之區域96中 新的空置像素98。因此，亦可為此第七像素指派-Γι Ϊ繼^空置像素計數保持相同。此程序針對影像之各像 圖17進-步解說可如何指派數字以表示空置像素計數 值。圖17基於解說與說明之 計數值a ㈣^不點P左上方之像素 找值。如圖17所示，從點P向左及向上延伸之邊界線％ 127632.doc • 19- 1363189. 與95界定一包括24個像辛之 徊诼京之&域96。此等24個 係空，像素98且，因此，為藉由點p所引入之下 二-二」值以指示自點P延伸之邊界線9 之： 域96中存在三個空置像素98。 吓介疋之區 同樣地’參考圖18,考量圖18中指 素。「下-點」上方或左邊之每去 點」之像 「下一點上方之德去十係包含於緊跟在 』」上方之像素或緊跟在「下一點」左邊之 界疋之區域内。若將此等兩 ” 仰州像京之空置計數 _ 起’則該和中將兩次包含「 3下一點」之對角線左上 素所界定之區域内之所有像素。因此，「下一 ： 之空置像素數目（不計數厂 ‘」上方 T歡下一點」）係等於「下

方之像素計數加上左邊之像辛 J ^ ^一 ，, 像素什數減去對角線像素計數。 方下—點」係空置的，則應向此和添加一額外值__ 19進—步解說圖18所示「下-點」分析。 採用更多數學術語，使Ε 辛左上方(，y)H座標（X，y)處之像 素方之二置像素數目；即空置像素（x，，y,)之數 此，Χ4χ且y,分）。若（x h 之數目（對 ，y)不為衫像内之一點，則 為零。因此，對於影像内之各 5 身為办罟P, m , y)右（x，y)處之像素本 身為二置，E(x，y)係等於E( 依據本發明之一具體實施例，一 準標記97之面積最大化之點或像辛^選擇一使黑暗或基 辛98之數目Km 點一戈像素同時維持空置或明亮像 數目（其係（例如）藉由上述方法來決定）低於竿一數 目來疋位基準標記16之方法可表示為： 〃 127632.doc 1363189 使 y)=影像中位於座標（x，y)處之像素之灰階值， 臨限灰階值，低於該值時將像素視為標記之部分， E(x，y)=像素（X，，/)之計數’對此，χ，<=χ、y·，<=y、且 I(x'，y·) >= Τ 〇 常數乘法器， 則基準標記角落係位於使x”yl最大化之座 處， 、，川 經受以下約束 E(xl，yl) < Μ * (xi+yi)或等效， Ε(χ1，yl) / (xl+yl) S Μ » 其中如下計算E (X，y): 使 若 I(x，y) >= τ，B(x，y)=l，否則為 ο， § X < 0 或 y < 〇 時，E(x，y) = 〇 當X >= 0且y >= 〇時， 則 E(x，y)=E(x_i，y)+E(x，y l)+B(x，y)。 因此，若逐列（y=0至y=影像高度）計算影像中之£值，則 藉由在各列内從左向右（x=〇至x=影像寬度）移動，表示空 置像素98之數目之各值可基於先前計算之值，藉此使計算 複雜性從像素數目之〇(n2)降為0(n)。 此係藉由以下偽碼以其他項來表示： bestX=0; bestY=0; 127632.doc •21 - 1363189 for y=〇 to (image height-1) for x=〇 to (image width-1) E(x, y)=E(x-l, y)+E(x, y-l)-E(x-l, y-l)+B(x, y); if E(x, y) < M * (χ+y) and x * y > bestX * bestY bestX=x； bestY=y； end if end for end for return (bestX, bestY); 採用上述方法，本發明之各種具體實施例可用以快速決 定一區域或限制框96内所包含之空置像素98之數目，從而 允許汁算（空置像素數）/(x+y)之比以決定一特定像素是否 為一候選像素132 ^儘管圖15至19解說一決定給定限制框 或區域96内之空置像素98之數目之方法，但亦可基於此目 的使用其他處理方法與技術。因此，基於解說與說明之目 的提供採用一類型之動態程式設計決定空置像素計數之範 例，且亦可使用其他合適方法來計數一給定區域或限制框 96内之空置像素數目。 已定位基準標記16後，具體實施例亦改善成像台18對焦 已定位基準標記16之方式。在基準標記16之已良好對焦影 像中，標記16之邊緣92係從黑暗突然過渡為明亮。不過， 若該影像不良對焦，則該過渡更多地具有一模糊漸進梯 度。此模糊梯度區域之寬度取決於離理想焦面之距離且因 127632.doc •22· 1363189. 此可用作一用於自動對焦程序之焦點分數。 依據一具體實施例，可藉由使用用於定位基準標記之具 體實施例（例如，圖14所示方法）並調整「標記:與「>空 置」像素間之強度限定值來決定模糊區域之寬度。更特定 言之’依據一具體實施例’ #由使用兩不同亮度或限定： 準（其表像素為—$置像素98或-基準標記像素97)執 行（例如）圖14所示方法14〇來實現對焦改善。例如，可基於 192之壳度或臨限值執行方法14〇以便具有小於或等於I” 之灰階值之像素係視為基準標記像素97而具有高於丨92之 灰階值之像素係空置像素98,此外’可按另—亮度或臨限 位準（例如64)執行方法14〇以便具有小於或等於以灰階值 之像素係視為基準標記像素97而具有高於64之灰階值之像 素係空置像素98。可利用其他亮度臨限值。 不同亮度或臨限值之使用導致一選擇不同候選像素之自 動對焦系統或程序’其進而導致分離-距離「d」之不同 限制框。此距離可用以指示焦點品質且允許選擇具有最好 焦點之影像。蓋片頂部上存在灰塵不影響污點之測量，即 使灰塵或其他污屑可非常清晰地對焦。 :此，參考圖20 ’在步驟2〇1中’ 一基準標記對焦方法 之-具體實施例包括處理期間以一第一空置像素亮度或臨 —•^從候選像素丨32群組或集中選擇一具有最大基準 標記：域之候選像素。在步驟2〇2中，基於該第一臨限位 準決定該被選定候選像素所界定之—邊界框或區域96。在 步驟203中’處理期間以—第二空置像素亮度或臨限位準 127632.doc -23· 1363189 從一候選像素132群組或集中選擇一具有最大基準標記區 域之候選像素。在步驟204令，基於該第二空置像素臨限 位準決定該被選定候選像素所界定之一邊界框或區域。接 著，在步驟205中，基於兩邊界框間之距離決定基準標記 16之離焦度。在步驟206中，可選擇具有最好焦點之影 像。必要時，在步驟207中，可調整成像顯微鏡26以進一 步改善基準標記16之焦點。

圖2 1至23解說可如何實施本發明之具體實施例以改善焦 點品質的一範例。在所示具體實施例中，利用以與Η]之 空置像素臨限灰階值，不過亦可利用其他值。參考圖Η， 藉由自使用較高空置像素限定值所選定之一候選像素延伸 之邊界線界定一内限制框210以便選擇較少像素作為「累 暗」像素97。藉由自使用較低空置限定值所選定之一不同 候選像素延伸之邊界線界定一外限制框212以便選擇更多 像素作為「黑暗」像素97。在所示範例中，内與外框21〇 與212係分離一小距離「d」。因此，在此範例中，不同空 置像素臨限值（64與192)不會明顯改變所得基準標記μ之位 置。不過’隨著基準標記16移得更遠而離焦，兩限制框間 之距離「d」會增加。 么、干你％ ίο之離焦程度更大。 内邊界框220對應於使用一較高空置像素限定值時所定位 之基準標記16以便選擇較少像素作為「黑暗」像素π。外 邊界框222對應於使用_較低空置像素限定值時所定位之 基準標記16以便選擇更多像素料「黑暗」像素97。比較 127632.doc -24. 1363189. 圖21與22，作為基準標記16之降低焦點品質之結果，框22〇 與222間之距離「dj係大於框210與212間之距離「dj。 同樣地，參考圖23，與圖21及22相比，基準標記16之離 焦程度會進一步更大，且基準標記16下方之灰塵52之對焦 程度更大。内邊界框230對應於使用一較高空置像素限定 值時所定位之基準標記16以便選擇較少像素作為「黑暗」 像素97。外邊界框232對應於使用一較低空置像素限定值 時所定位之基準標記16以便選擇更多像素作為「黑暗」像 素97。將圖23與圖21及22作比較，隨著基準標記16之離焦 程度越來越大，樞23〇與232間之距離「d」變得越來越 大。不過，即使對於圖23所示較大對焦灰塵微粒，基準標 記16底部附近之灰㈣也不影響焦點測量，因為具體實施 例有利地忽略除基準標記丨6角落之外的所有物體。 圖24(其係解說具體實施例如何改善基準標記之對焦程 序：曲線圖)進-步解說此等優點。在圖24中，虛線8〇包 括錯誤峰值⑽8)，其係使用熟知系統時作為灰塵52而非 準‘。己1 6之對焦結果而產生。本發明之具體實施例有利 地消=錯誤峰值8〇，如實線24〇(其表示使用一具體實施例 所獲付之改良焦點分數）所示。實線240在〇微米處（即正確 =70處）具有—峰值，不具有圖7(其解說使用熟知系統之 + '、、、）所示錯誤峰值72。 在本發明之另—具體實施例中，可藉由比較 暗限定值所測量之 ^ 之禚圯16位置或邊界來計算基準標記16之 ' ； 例如，參考圖24所示曲線圖，實線240係以64 127632.doc •25- 1363189 與192之限定值所測量之位置間 " 间之歐幾晨德距離，其已進 仃反轉及按比例縮放以與Brenner 八函數對齊。針對基準標 ^隹^ 距離，成像器顯微鏡26與檢視顯微鏡观 ^真基準標記16焦面上，而非對焦於灰塵與污屑训 造成之較高錯誤焦面72上。 【圖式簡單說明】 現在參考圖式’丨中所有圖式中之相同參考數字表示對 應部分且其t : 圖1解說一熟知生物篩檢系統，复 头包括一成像台與一檢 視台； 圖2解說一熟知載玻片，其載送— 標記； 物標本且具有基準 圖3解說一熟知載玻片，其載送—生物標本且具有基準 標記以及一蓋片； 屑； 圖5係圖4之側視圖，其一般解說位於標本片 氣泡； 圖4解說-熟知載玻片，在蓋片頂部上具有灰塵或污 上之灰塵及 圖6進一步解說鄰接基準標記之—部分的一氣泡； 圖7解說作為圖5所示灰塵或污屑之結果而產生之不同焦 面； 圖8係-曲線圖，其以圖形方式解說藉由灰塵或污屑所 產生之錯誤第二峰值； 圖9 一般解說一基準標記之一角落，該基準標記具有一 127632.doc •26- 與x-y座標系統對齊之邊緣以及自一點延伸之邊界線所界 定之一區域内所封閉之黑暗與空置像素； 圖10A至b解說一限制區域内所包含之空置像素數目係 與該矩形之周長成正比； 圖11A至D進一步基於沿該區域之一邊緣沿一平均深度 所分配之空置像素來解說圖10所示正比性； 圖12係依據一具體實施例之一基準標記定位方法之流程 圖； 圖13解說依據一具體實施例之一基準標記定位方法； 圖14係依據另一具體實施例之—基準標記定位方法之流 程圖； 圖15參考一 χ-y座標系統一般解說一具有成形邊緣之基 準標記之一角落； 圖16解說依據一具體實施例之一決定相對於一給定像素 之空置像素數目之方法； 圖17進一步解說依據一具體實施例之一決定相對於一給 定像素之空置像素數目之方法； 圖18進一步解說依據一具體實施例之一決定相對於一給 定像素之空置像素數目之方法； 圖19進一步解說依據一具體實施例之一決定相對於一 _ 定像素之空置像素數目並產生一空置像素映射之方法. 圖20係依據一具體實施例之一針對基準標記之影像計算 焦點分數之方法之流程圖； 圖21解說相對於一位於焦點上之基準標記作為不同黑暗/ 127632.doc •27· 丄允3189 明売臨限值之結果自 線； 一點延伸且界定 不同限制區域之邊界 圖22解說相對於與圖21相比— 不同黑暗，明亮臨限值之結果自作為 區域之邊界線； 延伸且界-不同限制 圖23解說相對於與圖21及22相比—較不對焦之基 作為不同黑暗/明亮臨限值之結果自—點延伸 a 己

限制區域之邊界線；及 不同 圖24係一曲線圖，其以圖形方式解說具體實施例如何肖 除一與灰塵或污屑相對應之錯誤第二峰值。 【主要元件符號說明】

10 熟知生物篩檢系統 12 生物標本/取樣 14 載玻片 16 基準標記 18 成像台 20 檢視台 22 檢視台 24 相機 26 顯微鏡 28 電動平臺 36 記憶體 38 顯微鏡 40 電動平臺 127632.doc -28 - 1363189.

50 蓋片 52 灰塵 54 氣泡 60 黏著媒介 70 正確焦面 72 錯誤平面 80 錯誤峰值 92 邊緣 94 水平邊界線 95 垂直邊界線 96 限制框 97 基準標記像素 98 空置像素 111 空置區段 112 三角形區段 130 影像 132 候選像素 134 被選定候選像素 210 内限制框 212 外限制框 220 内邊界框 222 外邊界框 230 内邊界框 232 外邊界框 127632.doc -29-

Claims (1)

1. 丄 丄

   2. 3. 4. 5. 6. 申請專利範圍： •種在一標本片之一影像内定位一基準標記之一角落之 方法，該影像具有複數個像素，該方法包含： &擇該複數個影像像素之一像素，該被選定像素基於 、〆被選定像素延伸之線界定—區域，基於該已界定區 域内之空置像素之一數目與該已界定區域之一或多個尺 度之一比來選擇該被選定像素，該比滿足一限定值；及 置使用該被選定像素決定該基準標記之該角落之一位 ::求項1之方法’其中該被選定像素與滿足該限定值 他影像像素相比界定一最大區域。 如請求項1之方法’其中該等邊#線係筆直的。 項1之方法中該等邊界線自該被選定像辛延 伸至該影像之一邊緣。 疋课京延 如請求項1之方法，並. 方形或一矩形。’、象素所界定之-區域係一正 如請求項1之太、土 #丄 之該區域内之空置像辛^數比目係;一（該被選定像素所界定 之該區域之1多個尺度對（該被選定像素所界定 -種在一標本片之一影像内定 方法，該影傻1古AM 土早‘ 5己之—角落之 场像具有複數個像素，該方法包含： 複數個像素識別為候選像素 該候選像切伸之線所界定之—像素係基於自 之一激曰4 i 之限制區域内之空署禮喜 之數目相對於該已界定工置像素 4多個尺度進行識 i27632.doc 其像素’其_自該被選定像素延伸之線與自 於選像素延伸之線相比界卜最大限制區域·及 位~被選疋候選像素決定該基準標記之該角落之-

   對應之該限 比包含一最 :求項7之方法’其中與該被選定像素才 J區域與其他候選像素所界定之限制區域4 大數目之黑暗像素。 9·如請求項7之方法，其 10.如請求項7之方法，其

   11 ·如睛求項7之方法 係一框或一矩形。 中該等線係筆直的。 中該等線自該被選定候選像素 延 其中各候選像素所界定之限制區域 12. 如請求項7夕*4., 方法，其中基於滿足一限定值之一比來識 別各候選像专，# ^ 4 Α & ° ^ '、該比包3自該被選定候選像素延伸之線 斤|定之該限制區域内之空置像素之一數目對該限制區 域之一或多個尺度之一比。 13. 如明求項12之方法，其中基於該限制區域内之空置像素 之該數目對該限制區域之_或多個尺度的—低於—限定 值之比來選擇各候選像素。 14. 如青求項13之方法，其中該比係該限制區域内之空置像 素之該數目對該限制區域之周長的一比。 15•如請求項14之方法’其中該比係該限制區域内之空置像 素之該數目對該限制區域之半周長的一比。 l27632.d〇c 16. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. ，.月求項7之方法，#係在存在一與該基準標記重疊之 軋泡或污屑時進行執行。 月求項7之方法，其中若-像素之-灰階值大於128, 則將該像素視為一空置像素。 '項7之方法，其係按多個灰階值限定值進行執 行。 如請求項18之方法，其進一步包含： 土於第一限制區域與一第二限制區域間之一差計 一焦點分數。 ° ，項19之方法，其中該差係該第一與第二限制區域 之角落間之歐幾裏德距離。 如請求項7·^·*·，+ u > 方法’其係按多個灰階值限定值進行執 行，其中 使用一第—空置像素限定值識別一第一限制區 別該基準標記之該角落之一第一位置，及 識 使用一第二空置像素限定值識別一第二限制區 別該基準標記之該角落之一第二位置。 —識 如請求項21之方法，其進一步包含 基於該第一與第二限制區域間之一距離 數。 “、、點分 如°月求項22之方法’其進-步包含基於該計算之焦點八 數自動對焦一影像裝置。 刀 如請求項22之方法，其中該距離係該第—與第二限 域之該等角落間之歐幾裏德距離。 ^ 127632.doc