1361447 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 β本發明為一種電子顯微鏡充電冷凍式試片裝置，特別 :·疋冑可盛裝各式生物材料以作為電子顯微鏡觀察用之生 • 物試片裝載台。 【先前技術】 目剐人類雖已進入了後基因時代，卻只能對於少量的 • 蛋白質結構，即數量不到〇.⑽比例的蛋白質結構有所研究 =了=。但對於蛋白質結構，特別是對於奈米尺寸的生物 刀子、構分析，在疾病防治、基因複製、修復等領域的議 題上卻非常重要。 “而在傳統技術上，能夠解開蛋白質結構的技術方法， 多半依賴X光（X ray)結晶繞射技術或是核磁共振（nmr ) 技術。但能被結晶的蛋白質，且可使用X光結晶繞射技術 以分析之蛋白質畢竟只有少量部分’且並非所有的蛋白質 • 都可以產生結晶。此因蛋白質結晶的困難度過高，對於其 餘高達99. 5%比例的蛋白質皆難以成功產生結晶。且每種 蛋白質結晶的過程都是高難度技術，而結晶後的蛋白質之 自然原型（Native Form)都會被破壞。而傳統上的核磁共 : 振（NMR)技術只能適用在小分子的觀察上’無法適用於全 部的蛋白質。 此外，亦可利用冷;東電子顯微技術（Cry〇-Eiectiron Microscopy)進行蛋白質結構之觀察。冷凍電子顯微術不 需要進行蛋白質結晶之過程，且受觀察之生物材料可被快 5 1361447 速冷凍’之後以包埋方式在非結晶態的冰裏面以成為可觀 察之試片。故比起前述之X光技術及核磁共振（NMR)技術 等技術，此種冷凍電子顯微技術已可提供相當多的優點。 但冷凍電子顯微技術卻無法提供原子級的解析度，主要因 為冷凍電子顯微技術所產生之電子輻射具有之 =射;的電子劑量會造成生物材料之傷害。 且因受釦射傷害的分子片段會 像模糊而失去原子解折炉力„ t造成其影 有良好實用性。析月b力’故而冷旅電子顯微技術未具 之結二 二時:解為了能瞭解更多的蛋白質 鏡的碟有其必要性展之生物分子電子顯微 於生物材料、蛋白質等利對 域之發展與進歩。 之觀察促進自然科學領 【發明内容】 本發明為一 褒各式生物；種電冷束式試片裝置，可盛 台。 料電子顯微鏡觀察用之生物試片袭載 凍。且圍繞在徵’即對生物試片施以充電與低溫A 個推雜充電^/片㈣冰也财所摻雜，才可以^ 為，藉此進行電的4:二包埋試片而變成接彻 本發明觀察。 主要包含 子顯微鏡之充電冷凍試片裝置， 6 1361447 了以下的各元件組合部份： 電原〜似器’藉由電線連接電阻，經由試片棒連接至
盘真空絕熱瓶’其中具有真空絕熱瓶内膽’在 真工絕熱瓶與該真空絕熱瓶内膽之間成為真空區域，在真 空絕熱瓶^中裝填有低溫液態介質，如液減或液態氣 以作為液態冷卻介I且真空絕減㈣連接試片棒。 本發月之種使用電子顯微鏡充電冷凌試片裝置的 方法，包含了以下步驟： ° 首先進行真空處理。再進行低溫處理，係經由試片 ，傳導低溫，試片棒载台。跟著，裝載試片柵網於充電冷柬 ?片裝置的4片棒载台上，而試片柵網中已裝载了生物材料 =片。然後，將充電冷;東試片裝置送入電子顯微鏡内。接著， 提供適當H對生物材料試肢行充電程序。最後，以電 子顯微鏡進行觀察該生物材料試片。 本發明可以大幅降低電子束對於生物材料試片的輻射 傷害’故可錢觀察生崎料原型。 &本發明可使得電子顯微鏡技術突破其關鍵技術，得以 能夠成功發展具原子解析度的生物分子電子顯微鏡。 本發明可以節省成本方式，提升電子顯微鏡技術之解 析度且’、而發展相關關鍵技術，即可對任何電子顯微鏡 提升其解析度。 本發明之重要優點，因元件製作容易，故可觀察不同 蛋白質’故可應用於生物、醫學、生物化學等相關領域。 故而，關於本發明之優點與精神可以藉由以下發 7 1361447 明詳述及所附圖式得到進一步的瞭解。 【實施方式】 ^本發明將由以下實施例之說明而得充分瞭解，亦使熟 習本技藝之人士可據以完成之，惟本案之實施並非由下列 實施案例而所限制其實施型態。 本發明為一種電子顯微鏡充電冷凍式試片裝置，可盛 裝各式生物材料以作為電子顯微鏡之生物試片裝載台，可 鲁直接適用於各式電子顯微鏡（Electron Microscope)。本 發明使彳于各式電子顯微鏡不需經過任何改良，在裝設本發 明之電子顯微鏡冷凍充電式試片裝載台後，即可直接成為 具有原子解析度的生物分子顯微鏡（Bi〇_m〇lecular Microscope)° 請參考第1圖所示，為本發明之電子顯微鏡充電冷凍 式試片裝載台裝置（Cryo-Charging Specimen Holder)組 成示意圖，包括以下各元件所組成： φ 在第1圖圖示之電子顯微鏡充電冷凍式試片裝載台裝 置實施例中，各組件如下所述，分別為： 電源供應器（Power Supply ) 11，藉由電線12 (Electrical Wire)連接電阻（Resistor) 13，且電線 1 12經由試片棒（Specimen Rod) 14，一直連接到試片棒載 台15。 真空絕熱瓶（如習用之杜瓦瓶）16具有真空絕熱瓶内 膽17，在真空絕熱瓶16與真空絕熱瓶内膽17之間成為真 空區域18，在真空絕熱瓶内膽17中裝填有低溫液態冷卻 8 1361447 介質19，如液態氮或液態氦，以作為液熊a 空絕熱瓶内膽17直接連接試片棒14，二令却介質19。真 使得液態冷卻介質19之低溫能藉試片椽t，直接接觸’ 14傳到試片棒載 台15。
而如第2圖所示，將第1圖試片槔 ^戰台15部份進行 分解放大之圖示’其十各組件分別為： 六角環嫘絲（Hexring Screw) 21，| θ >、具有固定功能。 鐵氟龍墊圈（Telfon Washer) 22,其具有固定與絕 緣功能。 試片柵網（Specimen Grid) 23,其具有裝載試片功 能。 電線凹槽（Groove) 24，其具有電線通道功能。 鐵氣龍塾圈（Telfon Washer) 25 ’其具有固定與絕 緣功能等元件之組合。 在第2圖之較佳實施例中，可將已進行過預先處理程 序的試片柵網23放入試片棒載台15後，以鐵氟龍塾圈22 及鐵氟龍墊圈25進行上下的固定與絕緣，而電線12可經 由通過電線凹槽（Groove) 24直接到達試片位置，接者將 六角環螺絲21向下鎖緊兩片鐵氟龍墊圈使電線12可以直 接緊密接觸試片栅網23。 於第1圖所示電子顯微鏡充電冷凍式試片裝載台裝置 之較佳實施例申’其操作方式如下詳述： 首先’試片裝置需進行真空處理。 接著，灌入液態冷卻介質19，如液態氮或液態氦，以 9 1361447 作為液態冷卻介質19於内膽中，並經由試片棒14傳導低 溫至試片棒載台15以進行低溫處理。 接著，放置已進行過預先處理程序之試片柵網23，亦 即放置已裝載有生物材料之試片栅網23於試片棒載台 15，並進行固定之。 然後，將該試片棒載台15送入電子顯微鏡中。 繼續，以電源供應器11，藉由電線12所連接的電阻 13，提供適當電流以對試片進行充電程序。 最後，以電子顯微鏡進行觀察攝影。 而本發明之預先處理程序，在本實施例中包括了： 先將欲待觀察之生物分子加入氣化納水溶液中，意即 將蛋白質等生物分子材料浸入摻雜有適當濃度之氯化鈉 (NaC 1)液體水溶液中，而其氣化納液體水溶液濃度於1 uM 至lOOmM之間。前述的鈉離子經摻雜於液體水溶液後，其 液體溶液至少包含了導通能階接近費米能階之液體溶液。 而此導通能階又可稱之為最低未填滿分子軌域（Lowest Unoccupied Molecular Orbital, LUM0)° 再將此含有生物分子之氯化鈉水溶液，滴入試片柵網 23中。 然後以濾紙除去多餘溶液，接著以低溫液態乙烷 (Ethane)進行急速冷卻至約絕對溫度77K，使得含有生物 分子之氯化鈉水溶液成為非晶質冰的狀態，成為被冷凍之 生物材料試片。 且如第3圖所示，將試片柵網（Specimen Grid) 23 丄 ％1447 之橫切面（Cross-section)放大圖示，生物材料試片31 存放於試片柵網（Specimen Grid) 23之間。而該試片柵 網為多孔洞（Holey Carbon Film)形狀，以碳纖維膜所製 成，而其碳纖維膜外部表面上濺鍍有約5奈米厚（nm)的 金（Gold)膜或其他金屬膜。 此被冷凍在試片柵網23之生物材料試片接著需被轉 移並固定於試片棒載台15，此時試片棒載台15亦須維持 • 於絕對溫度約77K 。之後，再將整個試片棒載台15轉移 送入電子顯微鏡。 接著，對被冷凍之生物材料試片進行充電（Charging) 後，再進行電子顯微鏡之取像程序。 在上述之急速低溫冷卻步驟後，試片與液體水溶液會 產生凍結成玻璃狀冰（Vitrified Ice)的現象，成為像是 種非晶質冷凍液體（Amorphous Fr〇zen Liquid)。而所 鳙摻雜之氣化鈉（NaCl)水溶液，如第4圖所示，其中具有 如鈉（Ν〇離子和氯（C1-)離子的成對電子和電洞結構， ;本發明中，水或是非晶質冰（Am〇rph〇us ice)在摻雜鈉 離子^Na+)，且經低溫冷凍後，能帶（Energy Gap)會減 -'小，形成像是一個具有良好導電性質的半導體。 _ 4片經以電子顯微鏡顯像觀察，若使用4kx4k影像感 測元件（CCD)顯像’在放大倍率達1〇〇, 〇〇〇倍⑴時， 影像解析度可達約0.25埃/每像素（per pixei) ，故具有 解像度可直接成為具有原子解析度的生物分子電子 1361447 顯微鏡。 如第5A圖所示’因為當水或是非晶質冰摻入離子雜質 後’即所謂的少量離子摻雜，其濃度可從幾個“Μ到幾個 • · mM不等’所冷凌的試片會變成類似摻雜非晶態的有機半導 •.體’但若離子雜質的濃度太高（>l〇〇mM)，則會影響電子顯 • 微鏡的解析度。在本發明中所採用的摻雜離子，例如鈉與 氣離子均非重金屬元素，且其濃度需控制在約100mM以下 以避免影響顯微鏡成像之對比與解析，而被冰包埋的試片 Φ 厚度也需盡量控制在約l〇〇nm以下以避免電子發生多重散 射而影響顯微鏡之解析度。又如圖第5A所示，原本未摻雜 任何離子的水或是非晶質冰其能帶至少為6 9eV ,但因摻 入之納離子與水分子間的作用會使得能帶縮小到1電子伏 特（eV)，且因為鈉離子所占據的最低未填滿分子軌域 (LUM0)非常靠近費米能階（Fermi Level, E〇，且又非 吊罪近水的最面填滿分子軌域（Highest Occupied _ Molecular Orbital, HOMO)’故摻雜一定量納離子後的非 晶質冰（Amorphous Ice)會產生與導體相同的性質。而其 他如氫氧根離子（0Η )，氫離子（矿），酸根離子（fj3+〇)其 :-·所在之能階都離此費米能階（ΕΡ)很遠，所以可知其中負^ L 導電的是鈉離子。而圖中EVac所示為真空之能階位準。 此外’如第5B@所^ _金屬做為與非晶質冰的介 面為例’紹金屬其功函數值為4, 2eV，而納離子之功函數 值為2. 6eV (此數值非常靠近換有鈉離子之非晶質冰 米能階），在熱平衡下介面左h端材f之#米能 1361447 齊^在與非晶質冰介面上幾個分子的輯（2〜5mn) —"面偶極矩（Interfacial Dip〇les)，此介
^幅降低介面能障（在此例中銘金屬與_ = "面偶極矩社於等於UeV)，故因能” 面能障大補約為o.3ev。再者，在進 ^ 質冰時，從金屬電極注入的電子可以透過有機 在著許多介面能階（InterfaCial如㈣ ^ :式或f隨一方式跨越約u電子伏 進入所摻雜的非晶質冰内。 此障 而如第6圖所示，為以電子波函數機 距離鈉離子中心之半徑為橫轴作圖。束縛於鈉子 波函數半㈣H)奈米㈤’故當鈉離子間之平均間距Z 等於20奈米（此時鈉離子濃度約在，M左右），電函 數間的遮蓋（Overlap)情形必然會較大，而較大之子 ^數遮蓋會使得摻賴離子的非晶質冰產生與導體接近的 而以束縳能來看，當電子動能大於包埋在冰中鈉離子 對電子的束縳能（〇· 7 mev)時，即使在低溫77K下，因電子 動能在此溫度下為6meV，故電子依然可以進行自由運動， 且電子之波函數可以以行進波（Traveling Waves)方式描 述。再者，相鄰電子波函數間可有較大之遮蓋，使得自由 電子在摻雜的非晶質冰（Doped Amorphous Ice)中之導電 率（Conductivity)可與導體相接近。所以當被冰包埋之生 物試片受電子束照射而產生輻射傷害時，摻有鈉離子之非 13 1361447 而也+内的自由電子可以隨時補充並立即修復受輻射傷害 4 1電子的帶電分子#段。另外’在本發明之充電程序 =如圖5B所示，自由電子要逃出摻雜的非晶質冰幾乎是 =能的，因為在低溫77K下電子動能㈣6χΐ()_3電子伏 叙=)’遠小於0.3電子伏特（eV)之介面能障，故電子 …、越介面崎，因此可以被長時間地保留在鈉離子摻 雜的非晶質冰内。而此鐘儲存麵子㈣的非晶質冰内 之自由電子會均勻分佈於鈉離子所占據的最低未填滿分子 軌域⑽Q)之能階上，若不考慮電子自旋方向，被儲存在 非晶質冰内之自由電子數目即等於摻雜離子數目的多寡。 第7A圖所示為所冷凍的含水去氧核醣核酸（Frozen Hydrated DMA)在受到電子束照射下所產生的帶電分子片 段，當沒有離子摻雜於冷;東之非晶質冰時，電子與電洞轉 移的修復僅只能發生在小尺度範圍的去氧核醣核酸（麵） 之叢集中（叢集區域為圖形中虛線所示；叢集直徑大小約 4-5nm)，所以因電子輻射傷害所產生之自由基與帶電分子 片段並無法全數被修復，但若於非晶f冰中摻雜適量離子 (例如Na+和Π·離子等），壯圖7B所^，當去氧核釀核酸 分子受到輻射傷害時，電子和電洞即可由叢集外的 Na+和0Γ離子立㈣人叢集内來修復受輻射傷害而失去電 子或電洞的帶電分子歧，以消除去氧核醣核酸分子受輕 射傷害所產生之自由基或帶電分子片段。 故而第8圖所示，當鈉離子間之平均間距控制在小於 等於20奈米時（此時納離子濃度約在5〇⑽左右），束缚於 1361447 鈉離子之電子波函數半徑範圍（如圖中虛線圓圈所示）或電 ^可進行同調穿遂之範圍即會涵蓋到蛋白質分子生物材 料，此時蛋白質分子生物材料就如同被包埋在一接近導體 的環境中，故當被非晶質冰包埋的蛋白質分子受電子束照 射產生輻射傷害時，摻有鈉離子之非晶質冰内的自由電子 可以隨時穿遂進入蛋白質分子並即時修復因轄射傷害而失 去電子的帶電分子片段，而進入蛋白質分子的電子或電洞 亦可藉由穿遂（Tunnel)或跳躍（HQp)方式來修復蛋白質内 的帶電自由基分子片段。故以充電方式所儲存在有離子換 雜之非晶質冰内的自由電子可以隨時地補充因輕射傷宝而 失去電子的帶電分子諸，如此—來即可大幅降低或甚至 消除因電子賴射而對生物分子所造成之輻射傷害，換言 =本發明可以大幅提高生物分子耐輻射照射之輕射劑量並 能藉此有效提®電子賴鏡對於生物分子之解析能力至 原子級的解析度。 於本發明中，當離子雜質摻雜到一定濃度後，冷凍試 片即會變成導體，而儲存在導體内之自由電子即可隨時補 充並修復因輻射傷害而失去電子的帶電分子片段，以消除 因電子束照射㈣生物分子所造成之輻射傷害。在本發明 較佳實施例中，所使用的摻雜離子，如Na+、C1-或是κ+、 Br I Mg、ca等等離子；或是帶電之氨基酸；或是 5的;或是其他具有—定程度電子親和力的分 ，或=摻雜物本身㈣提供多—個電子的施體原子或分 子或疋摻雜能夠提供多一個電洞的受體的原子或分子。 15 束，it明之主要特徵’即對生物試片施以充電斑低、田 整個换園繞在生物試片外的冰也必須有所摻雜，才^皿今 為。是=充電後的冰，得以包輯片而變成接近=使 質冰内的自由電子，可以隨時 =雜之非晶 的帶電八工… 心補充因輻射傷害而失去 輪私復 進而可使得電子束對生物試片所、 、傷害能夠大幅降低，且有利於電子頻 k•成之 物材料試片。 利於電子顯微鏡進行觀察生 示 中 定本^1所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以 精神之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭限 ^申下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之 專利範圍内。 【圖式簡單說明】 第1圖所示為本發明之較佳實施例組成示意圖。 第2圖所示為本發明之較佳實施例分解示意圖。 第3圖所不為本發明之較佳實施例橫切面放大圖。 第4圖所示為本發明之鈉離子和氣離子的成對電洞結構 圖。 第5A圖所示為本發明之鈉離子摻雜非晶質冰的能帶圖。 第5B圖所示為本發明之鈉離子摻雜非晶質冰與金屬之接 觸介面能障圖。 ' 第6圖所示為本發明之束縛於鈉離子周圍之電子波函數機 率分佈圖。 1361447 =7A圖與帛7B目所不為本發冷凌含水絲核醋核酸 忒片在受電子束輻射過針其叢㈣ 移過程之狀態圖。 电轉 第8圖所示為本發明之納離子周圍電子波函數半徑範圍可 涵蓋到被非晶質冰包埋的蛋白質生物分子材料。 【主要元件符號說明】 U電源供應器 • 12電線 13電阻 14試片棒 15 s式片棒載台 16真空絕熱瓶 17真空絕熱瓶内膽 18真空區域 19液態氤 • 21六角環螺絲 22鐵氟龍墊圈 L · 23試片柵網 • 24電線凹槽 25鐵氟龍塾圈 17