TWI344370B - Composition for treating cancer and use thereof - Google Patents
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Description
1344370 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種包含RRXR基序的環狀胜狀。本發明亦關 於一種組合物，包含上述環狀胜肽以及醫藥上可接受之載 體。本發明另關於一種治療癌症的方法。 【先前技術】 神經纖維因子-l(Neuropilin bNRPl)最初被鑑定為在胚胎發 育期間居中調節軸突伸長的一種神經信號蛋白3A (neuronal semaphorin 3A)受體。之後又被發現存在於内皮細胞和肺細 胞’在發育期間分別居中調節血管新生和控制肺分枝過程 (Roche J, et al·，Adv Exp Med Biol 2002, 515:103-114)。NRP1 為第一型跨膜糖蛋白(type I transmembrane glycoprotein)，它 是信號蛋白/抑制因子(semaphorins/collapsins)和血管内皮生
長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF ; Ferrara N，et al” NatMed2003, 9:669-976)這兩種胞外配體的副受體。VEGF 居中調節惡性腫瘤的血管新生，並經由惡性腫瘤内的
VEGF/VEGF 受體(VEGFR)自迴分泌環(autocrine loops)直接 促進腫瘤生長(Dias S，et al” Proc Natl Acad Sci USA 2001， 98:10857-10862)。NRP1 會與 Flt-l(VEGFRl)及 Flk-l/KDR (VEGFR2)形成複合體而加強VEGF〗6〗和其受體VEGFRs的 結合，並進而促進VEGF!65-中介的惡性腫瘤血管新生、癌細 胞遷移以及惡性腫瘤生長(tumorigenicity) (Murga M，et al.， Blood 2005, 105:1992-1999)。 ’ NRP-1已在癌細胞内被觀察到，包括PC3前列腺癌細胞、轉 移性的MDA-MB-231乳癌細胞以及數種其它類型的癌細胞 (Lee M” Mol Cancer Ther 2006，5:1099-1107)。過量表現 NRP -1會促進活體内的惡性腫瘤血管新生以及惡性腫瘤生長 6 (Klagsbrun M，et al” Adv Exp Med Biol 2002, 515: 33-48)。許 多不同的人類惡性腫瘤中皆出現NRPd之表現(EUis LM. Mol
Cancer Ther 2006, 5:1099-1107)，此外，它也隨著腫瘤侵略性 和微血管增生(neovascularization)的提高而被分離出來；然 而，目前對於其作用的方式仍尚未全盤了解。 肺癌是造成癌症死亡最常見的原因，在所有由癌症造成的死 亡案例中’ 17%係肺癌所導致(shibuya K，et al.，BMC Cancer 2002，2:37)。非小細胞肺癌(N〇n_smaii ceu iung carcinoma j NSCLC)是肺癌的主要型式(Hoffman PC, et al.，Lancet 2000, 355:479-485)。癌細胞轉移是造成治療失敗及癌症死亡的主要 原因(KwongYL,etal.，Chest 1997, 112: 1332-1337)。鑑定出癌 細胞轉移的增強子(enhancer)以及其訊息傳遞路徑或許可增 進我們對於癌細胞轉移過程的了解，並提供未來對NSCLC 病人的標的性治療。 【發明内容】 以cDNA生物晶片確認在肺癌細胞株模式中，nrpi的表現 與癌細胞的知襲能力呈現正相關(Chen JJ，et al., Genomics 1998, 51:313-324)。然而NRP1在NSCLC病人的癌症發展過 程中所扮演的角色仍未被全然理解。本發明闡明NRP1在惡 性腫瘤侵襲、轉移及血管新生上扮演著增強子(enhancer)的角 色，同時亦說明其訊息傳遞路徑、預後的重要性(progn〇stic significance)及治療癌症之潛力。 本發明指出NRP1是惡性腫瘤侵襲和血管新生的增強子，同 時也是NSCLC病人癌症復發與低存活率的一個獨立預測指 標。抑制NRP1訊息傳遞會抑制惡性腫瘤侵襲、惡性腫瘤生 長、血·管新生及活體内轉移。NRP1的惡性腫瘤生長前期效 應(protumorigenic effect)涉及 VEGF、PI3K 及 Akt 路徑。本發 明鑑定出兩段合成的、具有抗NRP!效力的胜肽(DG1及 DG2)，其能阻斷NRP1的訊息傳遞路徑，進而抑制惡性腫瘤 士長二癌症侵襲以及血管新生。NRPi因此被預期成為用以 筛選高風險NSCLC病人以進行輔助性化學治療(adjuvam chemotherapy)、抗血管新生治療(antiangj〇genes 丨 s therapy)或其 匕目彳示性的治療之潛在生物標記(bi〇marker)。如此使得對於 高風險病人的潛在治療助益得以盡可能地增加，並同時使低 風險病人免於接受不必要的治療或毒性。在本發明中，證明 NRP1會與VEGFR2作用而中介VEGF誘導的惡性腫瘤侵 襲。VEGF經由不需要内皮細胞的路徑（en(J〇thelial cell-independent pathway)直接作用於其受體而中介了惡性腫 瘤的血管新生並促進惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲本 身則已被證明會經由一種不需VEGFR2的方式中介乳癌細胞 遷移。此外，活體外實驗則顯示在大腸直腸癌細胞中， VEGFR1被VEGF-A或VEGF-B所活化會導致細胞遷移和侵 襲的增加。VEGF會與信號蛋白3A (semaphorin 3A)競爭和 NRP1/叢狀蛋白A1 (plexin A1)複合體進行結合的機會而經由 自迴分泌路徑增進乳癌遷移。NRPi也會獨立於信號蛋白3a (semaphorin 3A)而抑制胰腺癌細胞的遷移。dgi和dG2會以 濃度依賴方式特異性地抑制VEGFR2上之Tyr1214基被 VEGF165所誘導產生的磷酸化。胃丨在增強惡性腫瘤^管 新生及惡性腫瘤生長所扮演的角色說明在惡性腫瘤細胞中拮 抗NRP1的活性也許是一種可行的抗癌策略。在本發明中， 數丰又具有共有RRXR序列功能區域（c〇nsensus sequence motif)的胜肽會特異性地阻斷_丨訊息傳遞並抑制 癌細胞知襲、惡性腫瘤生長及惡性腫瘤血管新生。合成的 NRP1結合胜肽DG1於其最少量時，可在不影響細胞存活的 狀✓兄下抑制知襲活性及活體内癌細胞血管新生。Dgi可抑制 钉游訊息傳遞及vegfr2魏化。即使在這 發現帶有淨正電荷及具有連接半胱胺__ 構形之胜狀對於結合]Sj^pi是不可或缺的。 NRP1是癌細胞侵襲與血管新生的增強子。瓣！也是nsclc 病人癌症紐及低存科_立賴子。腑丨在透過 VEGF、PI3K及Akt路徑所造成之惡性腫瘤 ，，管新生上扮演重要的角色。NRP1對於NsS：而 °疋個具有潛力的新治療標的。合成之具有RRXR序列 功能區域驗NRP1職可_觀丨訊息傳遞路徑，並抑 制惡性腫瘤生長、癌症侵襲及血管新生。 是以’本發明提供一種具有RRXR功能區域之環狀胜肽，其 中R係精胺酸而X係任何胺基酸。 、 本發明之較佳實施例t ’該環狀胜狀係具有如SEQID Ν〇:ι 所不之胺紐序刺DG1或具有如SEQ ID Να2所 酸序列的DG2。 本發明亦提供-齡合物’其包含如上·之概胜肽以及 -醫藥上所能接受之_。該環狀胜肽較佳為⑽或⑽。 本發明更進-步提供療癌症之方法，包含對主體 上述組合物。該癌症係乳癌、大腸直腸癌、食道癌、膽囊癌、 神經膠質癌(glioma)、神經母細胞癌(n⑽_〇ma)、肺癌、 騰臟癌或前列腺癌。較佳為肺癌。更佳為非小細胞肺癌。 本發明之雛實_巾，該主難祕。更佳為哺乳動物。 最佳為人類。 本發明之癌症治療涉及對癌細胞侵襲、惡性腫瘤生長及惡性 腫瘤血管新生的抑制作用。 【實施方式】 以下實施例僅用以代表本發明多種相貌之一部份，並非限制 本發明之範圍。 材料 細胞與試劑 人類肺癌細胞株CL1-0、CL1-1、CL1-5及CL1-5-F4係由篩 選自無性繁殖的人類肺腺癌細胞株CL1 (Chu YW，et al.，Am J Respir Cell Mol Biol 1997, 17:353-360)中侵襲性漸增的細胞族 群所建立。人類臍血管内皮細胞(Human umbilical vascular endothelial cells ; HUVEC)及培養基購自 Cell Applications, Inc.。細胞培養試劑則來自Invitrogen。人類VEGF165來自 PeproTech, Inc.。人類抗磷酸 VEGFR2 抗體 (anti-phospho-VEGFR2 antibody 來自 Calbiochem。抗 VEGFR2 (sc-504)抗體來自Santa Cruz Biotechnology。碌酸酷氨酸之小 鼠抗體(無性繁殖系4G10)來自Upstate Biotechnology Inc.。抗 磷酸 Akt(Anti-phospho-Akt)抗體、抗 Akt(anti-Akt)抗體、渥 曼青霉素(wortmannin)以及 LY294002 來自 New England Biolabs。其它試劑則來自 Sigma-Aldrich。含有 His6 及 c-Myc 功能區塊標記的重組可溶性NRPl(sNRPi)蛋白質合成於 NIH-3T3鼠類纖維母細胞。兩環狀胜肽dg1(CRRPRMLTC ; SEQ ID NO: 1)及 DG2 (CRSRRIRLC ; SEQ ID NO: 2)則由
Digitalgene(台灣)合成。反轉錄聚合酶鍵式反應€RT_peR>與即 時聚合酶鏈式反應(real_time PCR)之引子顯示於表2。 病人與組織樣本 本發明所採用之樣本為六十個自1994年9月1日至1998年 4月30曰止，在台大醫院接受NSCLC治療手術的連續病患 (consecutive patients)。此調查係在台大醫院人體試驗委員答 的認可下進行。沒有任何病人在手術前#接受㈣助化學二 ，或放射線治療。在手術時取得之肺癌組織樣本立即以液^ 氮急凍，並保存於-80°C直到要使用時。每個惡性腫瘤的術^ 病理期別(postsurgieal pathologic stage)係依據國際腫瘤分期 法(international tumor-node-metastasis classification ; Mountain CF. etal.，Chest 1997, 111: 1710-1717)進行分類。病人的人口 統計學特徵如表1所示。 表1. 60位NSCLC病人的臨床病理特微 特徵 年齡(平均值±30)，年 NRP1表現量 低的病人(％) ^2_^ 64.4±11.5 NRP1表現量 高的病人(％) n=30 ------------ 62·2±11.ι Ρ 0.435* 性別 男性 21(70) 15(50) 0.187# 女性 9(30) 15(50、 1 時期 I和II 20(67) _ 12(40)] 0.069# III 和 IV 10(33) 18(60) 組織 腺癌 14(47) 22(73)叫 0.064# 形態 鱗狀細胞癌 16(53) 8(27) *t檢定 # 費雪精確檢定(Fisher’s exact test) 1344370 方法 NSCLC病人之惡性腫瘤樣本中的NRPl mRNA表現 依據TaqMan方法，並使用ABI PRISM 7900序列偵測系統 (Applied Biosystems; Heid CA 等人，Genome Res 1994，6: 986-994)，以即時定量反轉錄聚合酶鏈式反應(real-time quantitative RT-PCR)測量NSCLC病人之惡性腫瘤樣本中的 NRP1表現。
表2.引子與siRNA序列以及複製出的DNA產物長度
基因 前置引子 反置引子 產物 NRP1 GGCACACTCAGGGTCAAACT ATGCCAACAGGCACAGTACA (SEQ ID NO:3) (SEQ ID NO:4) Sema3A AGGAACTTGTCCC AGCAAM ATGCAGCTCAGACACTCCTG 1190 (SEQ ID NO:5) (SEQ ID NO:6) VEGFR2 CTGGCATGGTCTTCTGTGAAGCA AATACCAGTGGATGTGATGCGG 793 (SEQ ID NO：7) (SEQ ID NO:8) PLxA1 AACCTGGAGAGCAAGAACCA GACTTGGTGAAG GTGGAGGA 602 (SEQ ID NO:9) (SEQIDNO:10) G|3 TACTGA TAACTTCTTGCTTC GTATGGAACCTGGCTAACTG 304 (SEQ ID NO：11) (SEQ ID NO:12) VEGF GTGAATGCAGACCAAAGAAAG AAACCCTGAGGGAGGCTC 96, 228 (SEQ ID NO: 13) (SEQIDNO:14) NRP1(r) CAGAAAAGCCCACGGTCAT CAGCCAAATTCACAGTTAAAACC (SEQ ID NO:15) (SEQIDNO:16) TaqMan probe, (FAM)-ACAGCACCATACAATCAGAGTTTCCCA CATA -(TAMRA). (SEQIDNO:17) TBP(r) CACGAACCACGGCACTGATT TTTTCTTGCTGCCAGTCTGGAC (SEQIDNO:18) (SEQ ID NO:19)
TaqMan probe (FAM)- TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA-(TAMRA). _(SEQ ID NQ:20)_ *非抑制性 siRNA AATTCTCCGAACGTGTCACGT (SEQ ID NO:21) *NRP1 siRNA#1 AACACCTAGTGGAGTGATAAA (SEQ ID NO:22) *NRP1 siRNA#2 AACAGCCTTGAATGCACTTAT (SEQ ID NO:23) *去鹽類的小干擾RNA (siRNA)雙鏈(duplexes)係由Qiagen合成，並且依照標準實驗規程進行黏著 (annealing)。使用 RNAiFect Transfection Reagent (Qiagen)並依照使用指示將 siRNAs 進行轉染。
12 組織的NRP1 mRNA相對表現量以TATA-box結合蛋白之 mRNA 進行標準化(normalized)，並以-ΔΟΓ = _ CTVtbpJ表示之。當-ACT值為〇· 32(中間值）或更高時，該病 人會被規類到高表現量組。引子探針組以AppliedBiosystems 設計及合成。本發明所使用之引子序列及小干擾处JAs (siRNA)序列如表2所示。 活體外侵襲試驗 使用改良的伯頓小室系統(Boyden chamber system)研究分別 經由篩選的胜肽、sNRPl及NRP1的siRNA處理後之CL細 胞的侵襲能力(Chu YW，et al.，Am J Respir Cell Mol Biol 1997, 17: 353-360)。在Transwell inserts的聚碳酸醋樹脂膜（包含 8-μηι孔洞)上塗佈Matrige卜細胞則懸浮在含有l〇%NuSerum (Life Science)的 RPMI 1640 中；每個小室(chamber)的上槽 (叩?6[一^1)放入2.5><104個細胞。在37°(：的環境下培養48小 時之後，將Transwell膜以曱醇在室溫下固定1〇分鐘，並以 50pg/mL之碘化丙啶溶液(Sigma)在室溫下染色30分鐘。之 後，使用 Analytical Imaging Station 軟體套件(imaging Research Inc.)在50倍的顯微鏡下計算每層膜上的細胞數量。 每個樣品皆重復試驗三次。 以嗔菌想呈現技術(phage display)鑑定出NRP1結合胜狀 使用呈現隨機環狀胜肽的噬菌體胜肽資料庫（來自New England Biolabs 之 Ph.D.C7C)進行 NRP1 之生物掏洗 (biopanning)。將重組人類sNRPl蛋白質覆蓋於聚苯乙烯％ 槽盤之孔槽上，並與原始資料庫中之2X1011溶菌斑形成單位 一起培養。結合之噬菌體以甘胺酸-氣化鈉(pH值2.2)沖提 出，並以大腸桿菌(ER2738)來進行複製增強。生物掏洗步驟 總共重複四回合’其中Tween 20在沖提溶液中之濃度由〇. 1 〇/0 逐次增加至0.7%。由四回合的生物掏洗中隨機篩選出之噬菌 體株接下來則進行定序。 表面電漿子共振技術(Surface p丨asmon resonance) 篩選出的胜肽與NRP1結合之動力學資料以表面電漿子基於 共振的測量系統(Biacore AB)於25 °C環境中進行測試。使用 胺偶合套組(Biacore)依據其使用指示，將重組NRPi在4〇〇 反應單位(400 response units)下以胺偶合法(amine coupling^ 定於CM5感應晶片（sensor chips)上。在以流速；30μΐ7ηιίη注射 不同濃度之胜肽後以共振單元(resonance units)彳貞測結合狀 況。結合與分離之 Sensograms 以 BIAevaluation software 3,0 (BiacoreAB)進行記錄。 VEGFR酪胺酸之蛾酸化 VEGFR2 磷酸化依文獻(Soker S，et al.，J Cell Biochem 2002, 85:357-368)所述方法評估。簡言之，CL1-5細胞以hVEGF及 sNRPl混合物在冰上處理30分鐘’接著在37t處理7分鐘。 細胞溶解產物以抗VEGFR2抗體進行免疫沉澱。在進行西方 墨點分析時，膜先以抗Flk-Ι抗體探測，接著以去墨點緩衝 液(deblotting buffer)脫洗(strip)掉訊號後，再以抗磷酸化 VEGFR2抗體2/3(pc460)進行再探測(reprobed)。在抗血管新 生試驗(antiangiogenesis assay)中，HUVECs 先以胜狀進行 1〇 分鐘之預處理’接著以VEGF處理5分鐘之後細胞立即以裂 解緩衝液進行萃取。Flk-1 /KDR之活化作用則經由以下步驟 決定之：首先以抗Flk-Ι抗體對細胞萃取物(cell extract)進行 免疫轉潰分析（immunoblotting)接著以去墨點緩衝液 (deblotting buffer)脫洗(strip)掉膜上之訊號後，再以抗磷酸化 VEGFR2 抗體(pTyr1214)進行再探測(reprobed)。 1344370 磷酸肌醇-3-激酶活性試驗 鱗酸肌醇-3-激酶(Phosphoinositide-3-kinase)之活性依先前文 獻(Lin MT，et al.，J Biol Chem 2001，276: 48997-49002)敘述之 方式加上部份改良進行試驗。簡言之，將CL1-5細胞萃取物 與抗填酸化齡胺酸抗體一起培養，接著以A-Sepharose蛋白 質進行免疫共沉殿。此免疫複合體(immunocomplexes)以鱗酸 肌醇-4,5-P2 (phosphatidylinositol_4,5-P2 ; Sigma)進行預培養 (preincubated) ’且激酶活性經由在反應緩衝液中加入1〇 μ(：ί 之[γ·32Ρ]ΑΤΡ 15分鐘來啟動。磷脂則以TLC進行分離並以 踏酸化顯像技術(phosphorimaging)來顯現之。 傷口癒合 細胞遷移以活體外刮傷疲合試驗(scratch wound healing assay) 測定之(Tamura M, et al.，Science 1998, 280: 1614-1617)。 CL1-5細胞以24 nmol/L之siRNA-1在12孔槽盤中進行轉 染。轉染後24小時，以黃色移液管尖端刮劃細胞，並分別於 刮劃後18、21及24小時進行攝影。在〇、18、21及24小時 之細胞遷移則經由計算從傷口邊緣移動之細胞數量來鑑定。 織維肌動蛋白染色 將細胞接種於24孔槽盤之玻片上並容許細胞在含有1〇〇/0 FCS之培養基中接觸24小時。接著將細胞在0.1% Triton-X 中進行固定、沖洗及透性化(permeabilized)。將細胞以5 units/mL 之玫紅共輥鬼筆環肽（rhodamine-conjugated phalloidin ; Molecular Probe)培養 30 分鐘並使用 FluorSave 試 劑(Calbiochem)固定於玻片上。玻片使用Zeiss Axioplan 2顯 微鏡分析。 15 1344370 活體内試驗性轉移 將細胞沖洗並再懸浮於PBS中。接著，將在〇1齓 中含有106個細胞之單細胞懸浮液注射進入六個月大 重複合型免疫缺乏症(SCID)小鼠（由國立台灣大學醫學 物中心提供)_尾靜财。五週後觀顿，謂 g 出、稱重及在·福馬林中固定，以進行進一步之轉移= 試驗。在解剖顯微鏡下計算肺部惡性腫瘤株的數量。所有;
物試驗皆依據中央研究院生物醫學科學研究所之動物指 針來進行。 活體内血管新生試驗 所有，物作業皆依據國立台灣大學醫學院實驗祕管理與 用委員會認可之實驗方案進行。如Passaniti等人所述之方法 (Passamti A，et al.，Lab Invest 1992, 67: 519-528)，於鼠類血管 新生模式中以Matrigel栓塞試驗(Matrigd piug assay)評估^ 狀對於活體内血管新生之效力。 活體内惡性腫瘤生長試驗 CL1-5 =胞(2xl〇6)與胜肽混合或不與胜肽混合，接著植入六 個月大帶紐重複合型免疫缺乏症(SCID)小鼠之魏(flanks) 内。注射後的小鼠每5〜7天接受一次檢查，觀察是否有惡性 ，瘤出現2’並且丨卡尺(ealiPefs)所4得之長⑻及寬(b)代入公 式V = ab2/2來估計惡性腫瘤的體積。小鼠實驗係由中央研究 院生物醫學科學研究所實驗動物中心所認可。 統計分析 所有數據皆以至少三次實驗之平均值及95%信賴區間(95〇/〇 CI)呈現。所有統計分析皆由SAS統計程式(9.1版；SAS Institute lnc·)完成。統計上之顯著性使用單因子變異數分析 16 1344370 (one-way ANOVA)或如前所述之方法來決定之。費雪精確檢 定(Fishers exact test)則用來測試共變數(covariates> NRpl 之間的關聯性以付到離散數據(categ〇rical data)，而學生t檢 疋則被用來測驗連續變項(continuous variables)。存活曲線來 自Kaplan-Meier方法。具有低度NRP1表現及高度NRIM表 現的病人之無病存活率(disease_free surviva丨)及整體存活率 (overall survival)以指數系列檢定(丨〇g_rank test)分析之。以整體 存活率或無病存活率做為反應變數來完成多因素c〇x比例風 險性回 (Multivariate Cox prOportioiial_hazards regression)。# P<0.05時，則認為具有統計上的顯著差異。 實施例1 NRP1表現與肺癌細胞侵兼能力相關 五株具有逐漸侵襲性之不同肺癌細胞株已先行建構出來。生 物晶片分析顯示NRP1在高度侵襲性的NSCLC細胞株： CL1-5及CLl-5-F4(圖1A)中受到正調控。NRP1及其副受體 (coreceptor)VEGFR2 只在高度侵襲性之cl 1-5 及CL1-5-F4 細 胞中表現。NRP1之配位子：信號蛋白3A之表現則和 相反而為負調控。在此細胞組合中之VEGF或叢狀蛋白A1 (plexinAl)之表現則沒有差異(圖1B)。 實施例2 NRP1之mRNA表現與NSCLC病人之癌症復發及存活相關 使用即時定篁聚合酶鏈式反應(real_time quantitative 決定來自60位NSCLC病人之肺癌組織的NRP1轉錄數量。 f們自行使用中位數來做為區分高表現量及低表現量的分類 標準。60位NSCLC病人之臨床病理學特徵顯示於表〗。具 17 有高度NRP1表現之病人相較於低度NRPi表現之病人，其 無病存活率(Ρ=〇·〇162)及整體存活率(P=〇 〇164)較低(圖2)。多 因素Cox比例風險性回歸分析顯示低Ν^ρι表現與nsclc 病人之整體存活率相關，此現象獨立於臨床病理學階段、年 齡、性別及細胞種類[低NRP1表現與高NRP1表現各自為〇 與1 ;風險比(hazard ratio，HR)為2.37 ; 95%信賴區間為 U5-4.9 ; P=〇.〇196]。同樣地，無病存活率之風險比只有在 NRP1表現的部份保持顯著(HR為2.38 ; 95%信賴區間為 1.15-4.91 ； P=0.0195) ° 實施例3 剔除内生的NRP1表現抑制癌細胞侵襲 兩單獨針對NRP1基因的siRNAs被轉染進入NRP1-陽性的 CL1-5肺癌細胞以剔除NRP1表現。結果顯示，siRNA-Ι及 siRNA-2達成了顯著抑制NRP1表現之效果(圖3A)。相較於 非抑制性siRNA(nonsilencing siRNA)的控制組，兩NRP1之 siRNAs皆劑量依存(dose-dependent)地降低了 CL 1 -5細胞的侵 襲能力（圖3B)。為了檢驗該NRP1特定的siRNAs之抗侵襲 活性是否與抑制細胞移動相關，而進行NRP1特定的siRNAs 對細胞遷移能力之影響上的分析。CL1-5細胞以siRNA-1或 控制組之非抑制性siRNA進行轉染，並以刮傷癒合試驗測定 細胞遷移能力。結果為NRP1 siRNAs可抑制CL1-5細胞的遷 移，而遷移能力則經由刮傷癒合試驗顯示（圖3C)。 NRPl-siRNAs在第24小時顯著地抑制CL1-5細胞的遷移(圖 3D)。 實施例4 可溶解的NRP1抑制癌細胞侵襲及絲狀足形成 重組sNRPl被表現於於人類纖維母細胞讲jh-3T3)中並分泌 至培養基内。sNRPl蛋白質先以硫酸銨沉澱法並接著以快速 蛋白液相層析系統(FPLC system)上的Ni-NTA管柱純化法自 5周整培養基(conditioned medium)中純化出來。重組snrpi對 於VEGF】65之結合親和性以表面電漿子共振分析技術測定 之。人類VEGF丨65與sNRPl結合之平均分離常數(diss〇dati〇n constant ; KD)為125 nmol/L，與以往使用此技術測得之結果 (Dias S, et al., Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98: 10857-10862) 相符合。sNRPl之表現不同於完整的NRpi並且似乎是 VEGF,65之拮抗物。在以sNRpi處理後，CL1_5細胞之侵襲 能力呈劑量依存(does-dependent)地下降(圖3E)°CLl-5細胞 之F-肌動蛋白以玫紅共軛鬼筆環肽染色並以螢光顯微鏡檢 驗。結果顯示sNRPl以劑量依存方式抑制CL1_5細胞中之 F-肌動蛋白的聚合作用及絲狀足的形成(圖3F)。 實施例5 剔除内生的NRP1表現抑制活體内癌症轉移 以shRNA慢病毒(lentivirus)剔除CL1-5細胞内生的NRP1表 現顯著地降低了 50%的侵襲活性(圖3G)。注射CLl-5/shNRPl 細胞的小鼠比注射CLl-5/shLuc細胞的小鼠明顯生長出較少 的肺腫瘤轉移結節(pUlmonaiy metastatic nodules)(圖 3H)。 實施例6 NRP1訊息傳遞路徑涉及VEGFR2、PI3K及Akt活性 為確認受NRP1影響之訊息傳遞路徑，將CL1-5細胞以 VEGF165依不同時間長短進行處理並分析訊息中間物 (signaling intermediates)。CL 1-5 細胞以 VEGFi65 及 sNRPl 處 理’而VEGFR2之磷酸化則先以抗VEGFR2抗體進行免疫沉 澱再以抗磷酸化VEGFR2抗體進行西方墨點分析來決定之。 sNRPl使vEGFi65誘導的VEGFR2活性以劑量依存方式下 降，而在高濃度sNRPl的狀況下，VEGFR2活性會完全地被 抑制住(圖4A)。VEGF165誘導的PI3K活性在30分鐘時磷酸 化達到最高，而在60分鐘時又回復到基準點。磷酸化PI3K 之下游中介物Akt牽涉到NRP1調節之VEGF作用。於sNRPl 存在的狀況下，CL1-5細胞中由VEGF165誘導的在Akt之 Ser473處的磷酸化下降至小於三分之一（圖4C)。兩PI3K抑 制物渥曼青霉素及LY294002皆會使CL1-5細胞之侵襲能力 下降(ANOVA :渥曼青霉素，P<〇.〇〇l ; LY294002，P<0.001 ; 圖4D及E)。 實施例7 含有RRXR之胜肽可抑制NRP1中介之VEGFR2磷酸化 為續έ忍是否有任何新的特徵功能區域(signature motif)可結合 並抑制NRP1中介之侵襲，以表現於哺乳類細胞的nrpi蛋 白質為僻(bait)由隨機的環狀7肽胜肽(cyclic 7-mer peptide)資 料庫中篩選出NRP〗結合胜肽。使用一包含1〇ιι組隨機環狀 7胺基酸胜肽的Ph.D. C7C噬菌體呈現資料庫來進行生物掏 洗。經過四回合的篩選之後，共有63株噬菌體株被分離出 來。DNA定序顯示出幾乎所有篩選出來的胜肽都包含精胺酸 ⑻基。在經由MULTALIN程式進行比對(alignment)後，發現 有九株噬菌體株含有一致的功能區域-κκχκ_(表3)。兩最有 f力之胜肽(環狀9肽胜肽，DG1及DG2)被篩選出來並化學 合成，^進行更進一步關於其結合動力學狀況及NRPi抑制 作用之分析。表面電漿子共振技術被用來測量含有j^r—之 1344370 胜肽與NRPI的gpB夺結合與雜。DG1及DG2結合麵^ 之平均分離f數(kd)分勒i 4G±G 23及5 37±G 49 μιη‘（表 4)。DG1對NRP1稍微較高之結合親和力係源於較適合的怂 值。至於固定的VEGFR1或VEGFR2感測晶片（sensor chips) 則並未發現有任何結合的狀況。DG1及DG2以濃度依存方式 (concentration-dependent manner)具有特異性地抑制 VEGF 丨65
誘發的VEGFR2於Tyr1214位置之磷酸化，在濃度為4(^m〇i/L 時出現顯著的效力，並在濃度為12〇μιη〇ι/ι^時產生幾乎完全 抑制的效果(圖5Α)。
表3.經由結篩選出的胜肽之RRXR功能區璏 胜肽編號 序列 4-1 RRPRMLT 4-2 QLRRQRR 4-3 HSRRMRK 4-5 RSRRIRL 4-9 MKRRPRK 4-28 RRLRRRR 4-40 PIRRQRL 4-43 RRSRQSR 4-53 HKRRIRQ 一致區域 -RRXR- 表4.篩選出的胜肽與NRP1交互作用之動力學常數 胜肽 KD，μιηοΙ/L ka > (mol/L)1 Ad x 10's·1 DG1 1.40 ±0.23 1,229 ±246 17.2 士 2.25 DG2 5.37 ±0.49 123.4 ±24 6.63 士 0.81 註：動力學常數如同材料與方法所述，使用Biacore系統來決定之。 21 1344370 i ； 實施例8 含有RRXR之胜肽抑制癌細胞侵襲、惡性腫瘤生長及惡性腫 瘤血管新生 使用高度侵襲的CL1-5細胞進行活體外侵襲試驗以調查DG1 及DG2對肺癌細胞侵襲性之影響。以DG1或DG2胜肽處理， 會依照劑量依存方式抑制CL1-5細胞的侵襲(圖5B)°DG1減 少70%之癌細胞侵入Matrigel的數量，而DG2則減少50%之 . 癌細胞侵入數量。此現象說明胜肽與NRP1之交互作用與 _ NRP1中介之癌細胞侵襲相關。此處理不具細胞毒性，說明 此減少之侵襲的細胞數量係由於含有RRXR之胜肽對於侵襲 表現型之抑制效應所造成。為了解DG1是否可降低血管新生 或惡性腫瘤生長，而進行活體内血管新生試驗及異種移植惡 性腫瘤試驗(xenograft tumor assay)。DG1抑制活體内惡性腫 瘤血管新生(圖5C)。來自DG1處理過的CL1-5細胞，其惡性 腫瘤微血管計數(75±4 ;在200倍的視野中)明顯地低於未處 理惡性腫瘤細胞之微血管計數(227±33 ;在200倍的視野中）。 此DG1處理過的CL1-5細胞之惡性腫瘤血管新生活性明顯地 較未處理過之惡性腫瘤細胞下降3倍。DG1對於活體内惡性 • 腫瘤生長之效應以異種移植惡性腫瘤試驗來檢驗之。在^種 CL1-5細胞21天後，dgi處理降低小鼠的惡性腫瘤體積至 60.1mm3 (95% CI，27.6-92.6mm3) ’ 相較之下未經 DG1 處理 之惡性腫瘤體積則為 464.1 mm3 (95% CI，200 1-728 2 mm3 · 卜〇.〇〇3)(圖 5D)。 . · mm , 【圖式簡單說明】 2顯示NRP1在高度侵略性的人類肺腺癌細胞株中被正 調控。A:微陣列影像的近照，顯示在高度侵略性之cu 5 和CU-5-F4細胞中NRP1之向上調控；箭頭所指為神經纖維 22 【：S ) 因子(neuropilin)。B :在每個CL1細胞株中，NRP1、信號蛋 白 semaphorin 3A(Sema3A)、Flk-1/KDR、PLxAl、VEGFM5 及VEGF121差別性表現的rt_pcr分析結果。類GP基因用以 做為内部控制組。 圖2顯示非小細胞肺癌病人的Kaplan-Meier生存分析圖，其 分類係依據NRP1 mRNA之表現量。NRP1 mRNA之相對總 量(以TATA-box結合蛋白之mRNA總量為基準進行標準化) 以-Δ〇τ = [Ct^rpu -Ct(tbp)]表示之，其中Ct為比較起始循環 數(threshold cycle)。- ACp為0.32(中位數)或更高的的病人即被 歸類到高表現量組。A :高表現量組病人與低表現量組病人 間的無病存活率具有顯著差異(p = 0.0162)。註記：病人於最 後一次追縱時無復發B:高表現量組病人與低表現量組病人 間的整體存活率具有顯著差異(p = 〇.〇丨64)。註記：病人於最 後一次追縱時仍存活。所有統計分析皆為雙邊。 圖3顯示抑制nrpi的表現會抑制CL1_5細胞的侵襲和遷移 能力。A :分別以NRPl-siRNA-1、NRPl-siRNA2或非抑制 性siRNA (nonsilencing siRNA)轉染癌細胞，並以西方墨點法 分析NRP1的表現;N代表非抑制性siRNAaB:NRPl siRNAs 抑制CL1-5細胞的侵襲活性。細胞的侵襲活性以侵襲試驗法 (invasion assay)進行偵測。將CL1-5細胞(2.5xl04)接種於覆有 30pg Matrigel 的 Transwells 上，以 NRpi-siRjsjn、 NR^l-siRNA2或非抑制性siRNA進行轉染並培養48小時。 接著計算已侵襲膜的細胞數量。將數值常態化為試劑控制組 (reagent control)的相對侵襲活性。每次試驗皆重複三次並 進行二次獨立試驗。ANOVA分析結果顯示以不同濃戶之 siRNAs (SiRNA_l或siRNA-2)處理的細胞，其侵襲活性 統计上之顯著差異(siRNA-Ι組：p < 〇 〇〇1 ; siRNA_2組：p = 1344370 )C 以到傷癒合试驗(scratch wound healing assay)測定 RP1_S1RNA對癌細胞遷移的抑制效果。CL1_5細胞以 siI^NA-1轉染24小時’之後將細胞以黃色移液管尖端刮劃。 白攝刮劃後之傷口’並計算缺口區(gap area)内之細胞數量。 在〇、18、21及24小時的代表性試驗圖片顯示於此。〇 : NRPl-siRNA在不同時間對癌細胞遷移的抑制。刮劃後計算 . 在缺口區内遷移細胞的數量。圓柱：四次獨立試驗的平均值； 長條SE.表示p<〇.〇5 ’與非抑制的細胞(n〇nsiience(j ceus) • 相較之下具有顯著差異。E :侵襲試驗顯示出 sNRPl對癌細 鲁胞侵襲能力的抑制效果。以不同濃度之sNRP1處理的細胞， 其相對侵襲能力以ANOVA分析顯示具有統計上的顯著差異 (P=0‘002) ° F : sNRPl對CL1-5細胞中F-肌動蛋白聚合作用 及絲狀足形成的抑制作用。紅色：F-肌動蛋白。 圖3續。G :將細胞感染shLuc或shNRPl慢病毒(ientivims)， 接著以含有0.75 pg/mL嘌呤黴素(puromycine)的培養基培養 一星期以進行篩選。左圖：細胞溶解產物(cell lysate)的西方 墨點分析。右圖：處理後細胞的侵襲性(invasiveness)。Η :尾 部血管注射CLl-5/shLuc細胞的小鼠比尾部血管注射注射 Φ CLl-5/shNRP-l細胞的小鼠明顯生長出較多肺腫瘤轉移結節 (pulmonary metastatic nodules)。肺部腫瘤轉移結節以學生t 檢定(Student’s t test)進行記錄與分析(P=0,0063)。 圖4顯示VEGF165-誘導NRP1訊息傳遞係牽涉VEGFR2磷酸 化、PI3K活化以及Akt填酸化。A : sNRPl抑制VEGFR2的 磷酸化。先以抗VEGFR2之抗體進行免疫沉澱後，接著以抗 碟酸化VEGFR2(anti-phospho-VEGFR2)的抗體進行西方墨點 分析來測定VEGFR2的磷酸化。VEGFR2總量以抗vegfju 抗體由西方墨點法測定之。B : NRPl-siRNA對於PI3K活性 24 1344370 之影響。CL1-5細胞經由siRNA-l(NRPl)轉染48小時後，以 含有1.3 nmol/LVEGF165的RPMI-SF培養基依指示的時間進 行處理。PI3K活性的偵測方法如實施例所述。C :在CL1-5 細胞中，sNRPl對Akt磷酸化的抑制作用。CL1-5細胞在⑻ 含有或(b)未含有10 nmol/L sNRPl的情況下以1.3 nmol/L VEGF〗65依指示時間進行處理。Akt及墙酸化的Akt以西方墨 . 點法偵測。填酸化Akt相對於Akt總量的比例以Akt-p/Akt 表示之。D :以不同漢度之渥曼青霉素(wortmannin)處理的細 • 胞’其侵襲能力在ANOVA的分析下具有統計上的顯著差異 鲁 （P<0.001)。E :以不同程度之LY294002處理的細胞，其侵襲 能力在ANOVA的分析下具有統計上的顯著差異(p<0.001)。 圖5顯示活體内環狀7肽胜肽(cyclic 7-mer peptides)結合 NRP1並抑制CL1-5侵襲及血管新生。A :挑選出的胜肽降低 VEGFR2的磷酸化。HUVECs以胜肽預先處理10分鐘，接著 以VEGF處理5分鐘。VEGFR2的鱗酸化以抗鱗酸化VEGFR2 抗體進行西方墨點分析測定之。VEGFR2的總量則以抗 VEGFR2抗體進行西方墨點分析測定之。B :胜肽對於CL1-5 細胞侵襲活性的影響。細胞的侵襲活性以侵襲試驗法 • (invasion assay)進行偵測。將CL1-5細胞(2·5χ104)接種於覆有 3(^g Matrigel 的 Transwells 上，並與 DG1 或 DG2 胜肽一起 培養48小時。接著計算已侵襲膜的細胞數量。將數值常態化 為未處理之控制組細胞的相對侵襲活性。每次試驗皆重複三 次’並進行三次獨立試驗。在DG1和DG2處理的細胞中， 不同的DG1或DG2處理濃度之侵襲活性在AN0VA的分析 下具有統計上的顯著差異(DG1, P < 0.001; DG2, P = 〇.〇11)。 C :活體内’胜肽對於血管新生的影響。Matrigd栓⑦匕幻切 片以抗CD31抗體進行免疫組織化學染色顯示在含有DG1胜 狀的检(plug)中之CD31陽性血管相較於控白處理的检 25 (mock-treatedplug)有明顯減少之現象。原始倍率為χ2〇〇。計 算腫瘤群(tumor nests)周圍的微血管數。D :胜肽對於活體内 惡性腫瘤生長(tumorigenesis)的影響。來自控制組CL1-5細胞 的腫瘤體積(▲)以及來自以DG1處理之細胞的腫瘤體積(_) 在實施例中所述之指示時間進行測量。圖上顯示平均值及 95%信賴區間(n=每組5隻小鼠）。E :簡易圖解顯示VEGF⑹ 可結合NRP1並觸發NRP1/VEGFR2/PI3K/Akt訊息傳遞路徑 而導致腫瘤血管新生、癌細胞侵襲以及腫瘤生長。合成的 DG1/DG2胜肽則可特定地阻斷此訊息傳遞路徑而具有治療 的潛力。
Claims (2)
1344370 » ， 丨晚日修正本丨丨公·舌 甲請補无修if之B"期丫 2011年2月16臼 十、申請專利範圍： 1. 一種環狀胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2所示。 2. —種組合物，其包含申請專利範圍第1項之環狀胜肽以及一 醫藥上可接受之載體。 公告本 申請補充修正---- 2011年2月16日 1344370 ______________Ί .- 丨ίΑ/年、月丨1 Η修正不-! 十一、圖式： 圖1 A CL1-0 CL1-1 CL1-5 CLt-5-F4 ♦
B Sema3A VEGFR2 NRP-1 PLxA-1
VEGF165 + VEGPI21 + 1344370
申請補充修正之口期: 2011年2月16日 低 NRP1 表現(n=30) Ρ=0.01β2 高 NRP1 表現(η=30) 10 so 1 70 月 B nu
,* HH 低 NRP1 表現(n=30) 0-2-
高 NRP1 表現(n=30) P»0.0164 10 20 30 50 fl〇 η 月 2 00- 1344370 申請補充修正之Η期： 2011年2月16曰
A slRNA-1 slRNA.2
㈣WRP1肌動蛋白 B
Μ 12 1β SA If Ιβ 非抑制性 siRNA-1 siRNA-2 siRNA
If 111 翁hr 1344370 申請補充修正之I〗期: 2011年2月16日 M40«to續 Ο 3 圖 P-0.016 U非抑制性siRNA □ * 購咿 1)
p= 0,002 -«-*-*-0-a--p ο ο ο ο ο ο ο ο 4 2 0 6 6 4 2 1 if i— Ε
控制組 0.θηΜ 9ηΜ 18ηΜ SNRP1 4 1344370 申請補充修正之日期： 2011年2月16日 圖3續 F ύ nM sMRPI 5nM eNRP1 10nMeNRP1 20 nM eNRP1
CLI-e/thLuc CL1-5iehNRP1 CLl-S/shltic CLl-S/shNRPl
CL1-5 / shLi«c CL1-5?shNRP1 1344370 申請補充修正之曰期： 2011年2月16日
A 1 2 3 4 5 6 鱗酸化 VEGFR2 ' 塵_ + - "^fBrpTI
VEGFR2 1 ΝίΤ 4, VEGF + sNRPI (10πΜ) 2 VEGF(1 3ηΜ) 5 VEGF + sNRPl (20nM)
3. VEGF + sNRP1 (1nM) 6. VEGF + sNRP1 (50nM) B 非抑制性siRNA
iiRNA-1(NRP1) a SF+1.3nM VEGF 0 5 10 15 30 45 90 (min) AKT473P
C AKT AKT473P/AKT 比值 .1 0.5 2.4 1I.B 34.8 66.1 54.8 b SF+1.3nM VEGF + 10nM sNRPt AKT473P AKT
AKT473P/AKT 比值 1 0.6 0.9 1.2 4.2 19.5 17.0 6 1344370 申請補充修正之日期: 201丨年2月16曰 圖4續 D
DMSO 0 B 1 2 渥曼青霉素 oooooo 2^8642 4f {ί Ε (％)笮越蜱蟛
DMSO 10 20 ίΥ294002(μΜ) 7 1344370 f 4 申請補充修正之日期： 201丨年2月16曰 圖5 A
P-VEGFR2VEGFR2 B m _______ ** p<0.001 * p=0,011
控制組 I 40μΜ 80μΜ 120μΜ 40μΜ 80μΜ 120μΜ DG1 DG2 8 1344370 申請補充修正之日期： 20ll年2月16日 續 5 圖 C
ck); <200X)
DG1(120pM)： <200X)
DG1(20%MM2W»Q :r：.l „1 ‘IL D m 惡性腫瘤移植21天後 _ • w/o DG1 W/DG1 m psQ.003
無 n= D( n=
DG1處理 :5 處理 E
VE
OG1〇
;P1 NRP1 Γ WeNR ΕΠΕΕ^ΠΠΏΕΕΠίφΕΠΒΪοΐ^Ί 1 JITtSSS i s 血管新生 惡性腫瘤生長 侵襲
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2008
- 2008-01-31 TW TW97103616A patent/TWI344370B/zh not_active IP Right Cessation
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