TWI309260B - A novel strain of shewanella isolate and it' s apply - Google Patents
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Description
1309260 ty'μ 年愿·自修(更)正替換頁
九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一録# Μ地/V # 種新穎ii株分離株。更特別的，本於 :係關於-種具染劑脫色同時發電功能之新穎菌株分離 株。 【先前技術】 *料77子^為料族結構化合物，其發色_基大部分為 偶氮類型（R1-N=N-R2 1，且古氆— * )具有私疋的化學特性，利用一般 活性污泥法無法降解該染料分子。過去二十年來，許多科學家 齡、_續發展絲物則t學及生物處财面的脫色技術，由 於生物處雜具轉效益。因此生物處理技術愈來愈受重視。 Schliephake等人(2000)利用真菌的吸附作用和氧化酵素以 及細菌的吸附作用和厭氧下偶氮還原作用來進行染整廢水生 物技術脫色處理，雖然真菌處理脫色效果不錯，但因真菌生長 • 環境之PH較低且生長速率缓慢。因此，目前大部分的生物脫 色疋以細痛為主（Chang等人，2004 ; Sponza與isik 2004)。 ’ 值得注意的是，在大部分的生物脫色研究報告中指出，染 料在厭氧或缺氧之生物處理雖在色度方面有不錯的效果，但部 份的偶氮染料本身或經由厭氧分解所產生的代謝物仍具有毒 、 性且對健康具有潛在的致癌性風險（Sweeney等人.， ' 1994)，除了一些以羥基或羧基的基團形式存在之芳香胺於厭 氧下可被分解之外（Razo-Flores等人，1997)，一般芳香胺在
P060043-TW 5 1309260 厭氧環境下不能被分解，因而會累積在廢水中（〇 Nei丨丨等人， 2000)。因此，有必要針對偶氮染料經厭氧作用後所產生的代 謝物作更進-步的分解。針對此問題，Β_與 ⑽7)及Fie丨d等人（1995)提出利用後續之好氧程序將這 些中間代謝產物分解成較無害的最終產物之可行處理方式。
微生物燃料電池(l\/ncr〇bja| fue| ce||，MFC)，是一種利用微 生物為催侧，將可生物無之受f (bjQG_ertib|e _她) ^解並直魅线細裝置。雜翻軸早在七Q年代已被 提出，喊騎近’才改良絲可以有強力能源輸出，並被 認為是有實用潛力的技術。MFC _理，是運恥高陽極電 位差的環境時可以姻呼吸鏈反應進行氧化代謝作用， 因此電子就在NADH錢_ehydlOgenase)、_及細胞色 ^等順序的傳遞後，因為電位差改變，而產生電流。不過科學 豕發現，在自然狀態下細8體⑽呼吸作用存在許多的抑制因 子’因此使用氧化鱗酸化反應，可提高MFC能源效率約肪％。 除了介質杖電流誠生外，陽極物位也會影響效率， =有各種的代謝途徑，目祕氧、厭氧g等都有^利用在 MFC 卜。 目前相關於微生物生物電池技術，無論是純菌株或混合菌 全部，是以有機物碳源作為基質進行生物發電研究，因此部分 由、、、菌株進行包此生成之微生物燃料電池，在電能產生的過程 =夕卜=機物質’若以—般工業廢水作為有機碳源進行發 电之成生物祕電池，所使狀微生物來剩 於事業廢水通常具有-絲性，所以不利於單—進行=
NT〇-P〇6〇〇43-TW 1309260 ^ I年说曰修(更)正替換頁 此日讀常會使用混合菌株進行除廢產電，作曰今夕 而大打折扣，另一方面目3方面，會因為微生物間之傳遞 間的電子傳遞有很大_，通常=: 二二2 $子接$者的金屬還願具有較大優勢，因為微生 物此夠直接將電子傳導至電 5為微生 質，而且間接的電外添加昂貴之電子傳遞介 π电千傳遞也使產電效能降低許多。 ^ . A 7人滿思地，本發明所使用之新穎分離菌株可谇 =處__水之魏反應射，對於錄; 屬作為電子接心， 方面，該本菌株能利固態金 U 偶㈣料脫色過程產生電子傳遞_，將電子傳 立-:】=，此種特性應用於微生物燃料電池上，可建 兼：=Γ亦進行資源再生(產生電流)的系統， 录/、減廢及此源再利用的顯著功效。 【發明内容】 本發日m料提供—輯穎之8株分轉。更特別的， π;、九ti: 一種困株分離株’其係用於偶氮染劑、三齡甲 烧私劑與蔥S昆染劑脫色及微生物燃料電池之應用。 t明之希萬氏菌（娜瞻^ΡΝ·υ為經 回水系統、熱交換冷卻循環系統等之沈積物水樣 心液且賴化培叙分轉，其為料於食品工業研究
P060043-TW 7 I3〇926〇 ..y·.. 1 ^ 丨 月嘀修(更)正替換頁 所蝙號BCRC910321之菌棟s ——-------------
本發明之希萬氏菌（S/7ewaA7e//a sp_ NT0U1)由 NCBl資料庫比對屬於s/7ewaA?e//a菌屬，其為一株兼性 厭氣菌菌株’菌體大小約為0·25-〇.3〇μΓη(寬）χ1·5-2.〇μΓη (長）’生長pH值為ρΗ5-9,廣鹽性之菌株，經16S「DNA (1148 bp)以及gyr B (1〇〇3 bp)基因序列鑑定屬於革蘭 氏陰性菌。
—本發明之一目的為利用該分離株將染劑廢水中之偶 氮染料進行染劑脫色。 、本發明之另一目的為利用該分離株使用金屬離子做 為电子接受者且將電子傳遞至電極產生電流而製作一微 生物燃料電池。 曰為使本發明之上述何其他目的、特徵、和優點能更 月顯易懂，下文特舉數個較佳實施例，並配合所附圖式， 作詳細說明如下。 【實施方式】 一雖然本發明可表現為不同形式之實施例 ，但附圖所 丁者及於下文巾說明者係為本發明可之較佳實施例，並請 :解本文所揭示者係考量為本發明之-_，且並非意圖 Μ將^發明限制於圖示及/或所描述之特定實施例中。 本叙明之希萬氏菌（S/7ew/arje//a sp_ NTOLM )為經由 =薇回水系統、熱交換冷卻循環純等之沈積物水樣混 口攻且經純化培養之分離株，其為寄存於食品卫業研究所
P060043-TW 8 1309260 丨年縣峡_).:: 編號BCRC咖21之菌株。經由响丨::〜! Shewane//a菌屬，μ：九坡* _貝料庫比對屬於 大㈣乂 兼性厭氧菌菌株。 本^之-目的為利用該分離株在 劑廢水中之偶氮染料進行染劑脫色。 狀心下將木 夜能2 it:兔:的為利用該分離株使用多種固態或 ^金f離子做為電子接受者且將電子傳遞至電極產生 電OIL而‘作一微生物燃料電池。
實施例一菌株分離 r广ί 由:Γ集回水系統、熱交換冷卻循環系統、水 塔底層廢水系統之進流水等之沈積水樣混合液，並 以一氧化杈父換氣後保持厭氧狀態。
準備了]態培養基（-酸二· Q 5公克，氯化錢 H硫酸鈉2.9公克，氣_ 2 〇公克，氯化納— 公克，酵母畔取物彳.0公克，7Q%級溶液3 5毫升， 硫化鐵古0.5,克，硫代硫酸納〇1公克，海藻酸納〇」公 克’ 1毫克/毫升刃天青（Resazurin )i 〇毫升洋菜（〇x〇jd 公司M5.0公克’水（蒸顧水）1Q公升）晝線培養以純 化各採點水體或沈積物中之菌。 分離後之菌株保種於-20¾及-8CTC冰箱中。 實施例二生化生理及基因鑑定 活化保存於冰箱中之分離菌株並進行PCR放大培 養。
P060043-TW 9 1309260 菌株細胞結構鑑定：革蘭氏染色，利用光學顯微鏡 觀看染色情況，並利用穿透式電子顯微鏡（TEM)觀察 鞭毛及細胞膜負染情形；細胞大小及外在構造，利用掃瞄 式電子顯微鏡（SEM)觀察；細胞色素，利用分光光度 計（U-2001，Hitachi’曰本）分析；菌株最適生長溫度， 鹽度與pH值分析。 其結果顯示：本發明分離之菌株為革蘭氏陰性菌， 菌體大小約為 0·25-0·30μηι (寬）χΐ ·5-2·0μΓη (長），生 長pH值為ρΗ5-9，鹽度0-5.5%間之菌株。 基因鑑疋.卒取保種於-20 C及-80°C冰箱中各分離菌 株之DNA並以eubacteria引子進行PCR及對各菌株之 16S rDNA與gy「B基因序列鑑定及比對（國際生物技術 資訊中心；NCBI) ’並繪製16S rDNA與gy「B之類源關 係樹（BioEdit，DNASTAR and MEGA3)。 其結果顯示：本發明分離之菌株為革蘭氏陰性菌株γ . -proteobacteria’屬 S/?evi/aA7e//asp·屬之鐵還原菌株；163 rDNA與gyrB之類源關係樹如圖一及圖二所示。該菌株 型態如第三圖所示’其基本生理生化鑑定表如表一所示。 表一 基本生理生化鑑定表 特性 ---------- G + C含量（莫耳％) --- 50.3 最適生長溫度（°c) 25-30 於4°C下生長 —. ^i〇°C下生長 + 顏色 ----- 淡粉色
10 NTO-P060043-TW J309260 可利用 ~~ D-丰乳糖 ---------------- 蔗糖 N-乙醯葡萄糠胺 + 固醇 + L精胺酸 + L-組胺酸 ~~'~~ + L-白胺酸 + Db乳酸鹽 + 甲酸鹽 + 氫氣 --——. + 醋酸鹽 + 硫 + 氣化鐵還原 ____ + 實施例三染劑脫色測試 將活化保存於-2CTC冰箱中之分離株以陸瑞爾_貝爾 塔尼（Luria-Bertani)培養基（胰化蛋白1〇公克/公升， 酵母萃取物5公克/公升，氯化鈉5公克/公升
，並以1N 鹽酸調整pH值至ΡΗ7·0)進行大量培養，測試菌株在厭 氧條件下培養對偶氮染劑與三酚曱烷染劑脫色。 取一血·清瓶（117毫升）’將50毫升經滅菌及厭氧處 理（以二氧化碳：氮=20%:80%氣瓶換氣）之陸瑞爾-貝 爾塔尼（Luria-Bertani)培養基加入至該血清瓶中，該血 清瓶之上層氣體同樣以二氧化碳：氮=20%: 80%氣瓶換氣 以保持厭氧狀態；利用針筒將該分離菌種接種於血清瓶 中；分別以針筒加入濃度1〇〇、200、500、1000及1500 宅升/公升之不同的偶氮染劑與三酚甲烷染劑；以分光光
11 NTO-P060043-TW
度計偵測 Ο、12、24、36、48、60 » , + Λ to◦及72小時後顏色變 13〇926〇 化。其結果如表二至人所示，係分別為不同濃度之剛果紅 (Congo「ed )、甲基橘（Methyl 0「ange)、及酸性橘 7( Add orange 7)、蘇蘭黑（suran black)、橘 g (〇range G)、 甲基紅（Methyl red)以及結晶紫（Crysta丨vj〇丨et )之 取*色率。
表"一不同》辰度剛果紅脫色率 時間（小 時)100毫克/公升 200毫克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升 1500毫克/公升 0 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 12 65.7 % 17.9 % 20.1 % 0 % 13.7 % 24 85.5 % 24.7 % 20.7 % 6.8 % 20.0 % 36 95.2 % 78.5 % 45.8 % 16.7 % 19.6 % 48 100 % 85.7 % 49.2 % 17.3 % 31.7 % 6〇 100 % 92.8 % 65.4 % 37.0 % 36.5 % 72 ''''^ _ 100 % 100 % 73.7 % 47.2 % 36.1 % S---- --- 袅三不同澧度甲基橘脫色率 時間h 時)100毫克/公升 200毫克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升 1500毫克/公升 0 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 12 72.3 % 57.1 % 30.8 % 42.2 % 66.6 % 24 100 % 81.4 % 86.5 % 84.4 % 91.0 % 36 100 % 100 % 99.6 % 99.5 % 99.0 % 48 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 6〇 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 、 100 % 100 % 100 % 100 % 100 % 12
P060043-TW 1309260 ^四 不同濃度酸性橘7脫多，率 時：、時) 12 24 36 48 60 0 % 84.6 % 100 % 100 % 100 % 100 % 0 % 77.1 % 100 % 100 % 100 % 100 % 0 % 24.8 % 58.6 % 70.6 % 89.3 % 97.3 % 0 % 37.5 % 62.8 % 81.2 % 92.7 % 94.4 % 0 % 42.5 % 68.2 % 81.7 % 87.4 % 91.2 % 72 100 % 100 % 100 % 95.3 % 93.1 % ~-——狂不同濃度蘇蘭黑脫氙率 時間（小時） 100毫克/公升 200毫克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升 1500毫克/公升 0 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 12 1.4% 45.8 % 43.3 % 36.2 % 40.5 % 24 23.3 % 44.4 % 57. 8 % 62.3 % 44.7 % 36 47.9 % 48.6 % 62.2 % 61.8 % 48.4 % 48 50.7 % 47.2 % 52.2 % 64.8 % 61.1 % 60 53.4 % 43.1 % 58.3 % 60.1 % 58.4 % 72 — 53.4 % 59.7 % 62. 8 % 64.6 % 63.2 % —_ 表六 不同濃度橘G脫色率 時間(小時J 100毫克/公升 200毫克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升 1500毫克/公升 0 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 12 74.2 % 10.9 % 28.9 % 11.4 % 8.9 % 24 91.1 % 56.9 % 30.5 % 31.9 % 34.6 % 36 100 % 89.7 % 61.0 % 64.2 % 64.7 % 48 100 % 100 % 89.8 % 92.0 % 92.4 % 60 100 % 100 % 97.3 % 100 % 100 % 72 100 % 100 % 100 % 100 % 100 %
13 NTO-P060043-TW J3〇926〇
100毫克/公升 200毫克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升1500¾克/公升 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 100 % 85.7 % 9.7 % 0 % 0 % 100 % 100 % 32.1 % 0 % 0 % 100 % 100 % 37.3 % 0 % 0 % 100 % 100 % 42.5 % 0 % 0 % 100 % 100 % 55.0 % 0 % 0 % 100 % 100 % 64.9 % 0 % 0 % 表八不同濃度結晶紫脫色率 )10Q毫克/公升200 ξ克/公升 500毫克/公升 1000毫克/公升1500亳克/公升 0 % 0 % 0 % 0 % 0 % 52.2 % 37.3 % 3.6 % 0 % 0 % 51.8 % 51.6 % 12.7 % 0 % 0 % 57.6 % 65.7 % 23.7 % 0 % 0 % 60.8 % 75.7 % 28.7 % 0 % 0 % 61.6 % 80.5 % 33.5 % 0 % 0 % 63.1 % 82.5 % 37.0 % 0 % 0 % ο 12 24 36 48 鲁 60 72 如表二所示：本發明分離之菌株對濃度100毫克/公 升之剛果紅作用24小時後其脫色效果可達85·5%，於 48小時後可完全脫色；濃度2〇〇毫克/公升之剛果紅作用 48小時後其脫色效果可達85 7%，於72小時後可完全 脫色。如表二所示：本發明分離之菌株對濃度亳克/ 公升之甲基橘作用24小時後其脫色效果達1〇〇% ;作用 濃度·毫克/公升24小時後其脫色效果可達81 4%，
NTO-P060043-TW 14 1309260 於36小時後可完全脫色；作用濃度5〇〇、1000及15〇q 宅升/公升36小時後其脫色效果可達99.0%以上，於48 小時後可完全脫色。而如表四所示：本發明分離之菌株辦 濃度100及200毫克/公升之酸性橘7作用12小時後其 脫色效果達77.0%以上，於24小時後可完全脫色；作用 濃度500毫升/公升6〇小時後其脫色效果可達97.3%， 於72小時後可完全脫色。如表五所示：本發明分離之菌 .株對不同濃度之蘇蘭黑，於作用時間48小時後，其脫色 率可達約50%或以上。表六所示：本發明分離之菌株對 濃度100及200毫克/公升之橘G作用約36小時即可達 完全脫色；而當作用濃度介於500〜1500毫克/公升時， 於72小時後可達完全脫色。另如表七所示：本發明分離 之菌株對濃度100及200毫克/公升之曱基紅作用於24 小時内即可達完全脫色；當作用濃度為5〇〇毫克/公升 時，於72小時後’其脫色率可達約65%。表八所示：本 ， 發明分離之菌株對濃度2〇〇毫克/公升之結晶紫，於作用 時間6〇小時後，其脫色效果可達80%以上；而當作用濃 度為500毫克/公升時，於72小時後，亦可達37%之脫 色效果。 實施例四產電測試
將活化保存於-20°C冰箱中之分離株以陸瑞爾_貝爾 塔尼（Luria-Bertani)培養基（胰化蛋白1〇公克/公升， 酵母萃取物5公克/公升，氣化納5公克/公升，並以1N
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撕存1^)母替換頁I 鹽酸調整pH值至PH7.0)進^^^^^試該 株於微生物燃料電池中產生電流纟士果。 (a)微生物燃料電池之製作 生物燃料電池資料設計_微生物燃料電 )。本發明設計之生物燃料電池結構包含以 離子父換膜（140)分隔二相連接之第— 體⑽，_，-陽極（_)置於該第一槽體=〇槽 中丄一陰極（160)置於該第二槽體（13〇)中，一 電(11G)連接該陽極及該陰極。其結構如 圖所示。 * (b_)分離株發電 將陸瑞爾、貝爾塔尼（Luria_Bertani)培養 生物燃料電池之第-槽體中，並將一緩衝溶液置^ 該生物燃料電池之第二槽體中，該緩衝溶液可為（但 不限制為）磷酸緩衝液及磷酸_氰化鐵緩衝液；將第 • —槽體中之陽極以氮氣幫浦連接陽離子選擇性膜， 以將空氣中之細菌過濾去除，並讓氮氣進入培養液 中進行曝氣，將第二槽體中之陰極以空氣幫浦連接 陽離子選擇性膜，以將空氣中之細菌過濾去除，並 讓空氣進入缓衝液中進行曝氣；曝氣後將保存於 _2〇1冰箱Luria-Bertani培養基中之分離株液接種 於該第一槽體之培養基中；再將測試液添加於第一 槽體之培養液中以觀察分離菌株產電能力。 該測試液包含：1〇 mM葡萄糖、50 mM葡萄糖、200
P060043-TW 16 J309260 毫克/公升甲基紅染劑、35G毫升/公升剛果紅染劑。 第五圖為上述該測試液被該分離株分解產電圖，在 的產電測試中，顺液為1G _葡萄糖及如 Μ =糖（第〇及26〇小時時）時，電流伏特數為〇_， 測減液為200毫克/公升曱基紅染劑及35〇毫升/公升 ，染劑（第50及160小時時）時，其電流伏特數為 抶及27~37mV，其結果顯示’葡萄糖無法使該菌 電’但曱基紅及剛果紅染劑可以經由菌株分解產生 流。 电 ^雖然本發明已以前述較佳實施例揭示’然其並非用以 限，本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神 ^範圍内，當可作各種之更動與修改。如上述的解釋，都 可以作各型式的修正與變化，而不會破壞此發明的精神。 因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者 為準。
17 NTO-PQ60043-TW 1309260 !................. '…^*V 一 ..................ί 【圖式簡單說明】 ......................—―:................................................. 第一圖本發明分離菌株之16SrDNA類源關係樹； 第二圖本發明分離菌株之gyrB之類源關係樹； • 第三圖本發明分離菌株之電子顯微鏡圖（放大倍率3萬 ' 倍）； 第四圖根據本發明一具體實施例之微生物燃料電池結構 圖， 第五圖根據本發明一微生物燃料電池具體實施例之分離 B 株分解產電圖。 【主要元件符號說明】 100 生物燃料電池 110 電流計 120 第一槽體 130 第二槽體 140 陽離子選擇性膜 150 陽極 160 陰極
18 P060043-TW
Claims (1)
- 1 一種希萬氏菌（S/?ei/i/ane//a sp. NT〇U1)經純化培養之 分離株，其具有寄存於食品工業研究所編號 BCRC910321之菌株之所有辨識特徵。 2. —種產電系統，其包含如申請範圍第1項之希萬氏菌為 培養菌及一微生物燃料電池裝置。 3. 如申請專利範圍弟2項之產電糸統’其中係將該培養囷 置於該微生物燃料電池中。 4. 如申請專利範圍第2項之產電系統，其中該微生物燃料 電池裝置包含： 一陽極，一陰極，一種培養基置於該陽極周圍及一陽離 子選擇性膜介於該陰極及該陽極間。 5. 如申請專利範圍第4項之產電系統，其中該培養菌係置 於該培養基中。 6. 如申請專利範圍第4項之產電系統，其中該陰極周圍佈 滿填酸缓衝液。 7. 如申請專利範圍第4項之產電系統，進一步包含一染劑 置於該培養基中。 8. 如申請專利範圍第7項之產電系統，其中該染劑為一偶 氮染劑、一三曱基酚類染劑及一蔥醌染劑。 9. 如申請專利範圍第7項之產電系統，其中該染劑可為剛 19 P060043-TW •1309260 . 果紅、蘇蘭黑、曱基橘、酸性橘7、橘G、甲基紅等偶 氮染劑及結晶紫等三曱基酚類染劑所組成之群組之一。 10. —種染劑脫色組成物，其包含一如申請範圍第1項之 ' 希萬氏菌及一培養基，可將染劑廢水脫色。 11. 如申請專利範圍第10項之染劑脫色組成物，其中該 染劑廢水為一偶氮染劑、一三曱基驗類染劑及一蔥酸染 劑所組成之群組之一。20 P060043-TW
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| CN102315471A (zh) * | 2010-07-07 | 2012-01-11 | 广东省微生物研究所 | 基于脱色希瓦氏菌的微生物燃料电池及其使用方法 |
| CN102315469B (zh) * | 2010-07-07 | 2013-07-31 | 广东省微生物研究所 | 微生物燃料电池及其在降解偶氮染料污染物上的应用 |
| CN102315472B (zh) * | 2010-07-07 | 2013-07-31 | 广东省微生物研究所 | 一种微生物燃料电池及其在降解多溴联苯醚中的应用 |
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2006
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